Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение термоиндуцированной замедленной флуоресценции хлорофилла фотосистем 1 и 2 мембран термофильных цианобактерий Synechococcus elongatus

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение термоиндуцированной замедленной флуоресценции хлорофилла фотосистем 1 и 2 мембран термофильных цианобактерий Synechococcus elongatus"

V . о О п ... { ^ .

московски!! ордша ленина, ордена октябрьской революции и ордена трудового красного знании государственный • университет имени М.В.ломоносова

Биологически» факультет

На правах рукописи УДК 577.355

АКСИЮВА Галина Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ТЕРМОИНДУ ЦИР0ВА1ГНОЙ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА ФОТОСИСТЕМ I И 2 МЕМБРАН ТЕРМОФИЛЬНЫХ ЦИАНОЕАКТЕРИИ. БУМЕСНОСОССиЗ сш&лтиз.

03.00.02 - биофизика

. Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

. Москва - 1990

х-} »

Работа выполнена на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессо]

И.И.Иванов

Научный консультант - кандидат биологических наук

Ю.Н.Кауров

Официальные оппоненты - доктор физико-математических наук,

профессор А.К.Кукушкин - кандидат биологических наук Н.Г.Бухов

Ведущее учреждение - Институт фотобиологии АН. БССР /Минск/

Защита состоится "J.&" <?¿¿¿¿t^SXo- 1990 года в /¿Г часов на заседании Специализированного Совета К.053.05.68 по присуаде нию ученой степени ка)1дидата наук по специальности "биофизика" в Московском государственном университете им.М.В.Ломоносова по адресу: II9899, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан

Ученый секретарь

Специализированного Совета К.053.05.68

кандидат биологических наук

Б.А.1Уляев

•«. л

ОЩЛЛ ХАРАКТЕРИСТИКА РАШШ

Актуальность томи. Уимодлоинаи (]шуоросцоиц1Ш /31>/ хлорофилла прпдстанляот собой упипорсялыюо лнлонио, свойственное как эукмриотичооким, так и нрокариотичоским фогосинтотическим организмам, котоооо обусловлено рокомбинициой риздолонных зарядов в реакционных центрах фотосинтеза. Исследошшио ЗФ даот обширную информацию о скоростях решсци(1 прямого и обратного транспорта элоктронов, эффективности стабилизации поглощенной энергии свети, физиологическом состоянии клоток и цолих фОТОСИНТвТИЧвСКЛХ ОРГШШЯМои / тШшь , 1977; Рубин и др., 19Ь7/. Один из под-хопон к исследованию опоИотн фотосинтетического шшарата о помощью этого мотода состоит п изучении томпоритурних зависимостей стационарного уровня УФ. Утот метод применяется цля исследования • натипннх клоток и тканой и используется в основном в прикладном плшю для оценки холодо- и термоустойчивооти фотосинтетичоокого шшапага высших растений /ВосоловскиМ, Ьесолова, 1090/. Информативность этого метода значительно снижается из-за трудности ин-теряретации результатов, полученных на сложных системах - клетках и тканях. Использование же субклеточных препаратов крайне ограничено из-за их низкой термостабильности.

1 Темпоратурныо зависимости Зф прокариотичоских организмов, в частности цианобактерий, изучены значительно меньше. II то же время использование цианобактерий, в первую очередь термофильных, в качостве объекта такого рода исследований представляет особый интерео. Цианобактерии, несмотря на прокариотическую природу, имеют фотосинтетичеокий аппарат в основном аналогичный аппарату высших растений, при этом у термофильных видов он обладает исключительно высокой устойчивостью, Зто позволяет изучать 34 в широком интервале температур и, как показано в настоящей работе, да-

ч-срТЛЦИМ

от возможность использовать субклеточные препараты раз-шщ^гп С(?Р~ пени дозинтеграции. Таким образом имеются широкие возмохшости. для исследования природы термошдуцированных изменений' интенсивности ЗФ, а также способов оценки состояния и свойств, фояосинте-тического аппарата исходя из характеристик температуршос зависимостей ЗФ. Следует ожидать, что в результате эхах исследований будут выявлены как общие закономерности для зеленых растений и цианобактерий, так и закономерности, отражающие структурно-функциональную специфику фотосинтетического аппарата цианобактерий.

Пель паботи. Цель настоящей работи состояла в исследовании температурных зависимостей стационарного уровня ЗФ изолированных

При отом были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное исследование термоиндуцированных 'изменений интенсивности ЗФ изолированных мембран, целых клеток

и фотосистемой 2 /£С2/.

2. Оценить природу процессов, обуславливающих параметры температурных кривых ЗФ <6С1.

3. Исследовать свойства ЗФ ФС2 в широком интервале вариаций химического состава и свойотв ореды инкубации.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование температурных зависимостей ЗФ на субклеточных препаратах термофильных цианобактерий. Показано, что изолированные мембраны термофильных цианобактерий, в отличив от субклеточных препаратов высших растений, сохраняют общую форму температурной зависимости ЗФ, характерную душ целых клеток.

Обнаружен не опиошшый ранее пик термоиндуцированной ЗФ 401

мембран термофильных цианобактерий

препаратов, обогащенных фотосистемой 1 /401/

/ТЗФ ФС1/ и' исследованы со свойства. Выявлено по крацнеП меро две' отличающиеся по термочувствительное™ компоненты ЗФ 'ICI, icotopho дают вклад в формирование пика ТЗФ ФС1 в восстановительных условиях. На основании розультатов исследования своПстз ЗФ в аэробных и аиаэообных условиях выясняюсь, что молекулярнuir кислород играот па-шую роль п процессах, обуславливающих термонидуцирован-гшо измепония интенсивности ЗФ ФС1. Обнаружен эффект тушения ЗФ <Х1 анионами гаюгенов и нитрата.

• Показало, что параметры ТЗФ <1€2 значитолышм образом изменяются в зависимости от свойств среди инкубации. Сдвиг рН среды инкубации приводит к уволичоний неоднородности температурных зависимостей 3«/ Ф02 мембран S . ùl-Ontjjia>;.. Предполагается, что изменение интенсивности мкчлисокуццно!! компоненты ЗФ <*С2 типа утечки с ростом температуры d значительно!'! степени обуславливается тер-моиндущгровашшмн изменениями текучести липидного матрикса <¿02.

Практическая значимость. Полученные в работе новые данные о свойствах ЗФ <101 л ФС2 ва:<нн в научном и практическом плане, поскольку метод ЗФ широко использунтся для исследования свойств фотосннтотического аппарата различных организмов и оценки их физиологического состояния. Использование субклеточных препаратов термофильных цианобактериП для исследования температурных зависимостей ЗФ значительно расширяет возможности интерпретации розультатов, полученных данным методом. Температурные зависимости ЗФ изолированных мембран тормофильных цпанобактсрий прояшшют высокую чувствительность к структерно-функциопалышм сдвигам, происходящим в фотосинтетическом аппарате вследствие изменения физико-химических свойств среды инкубации. Кривые ТЗФ в дальнейшем могут слукить чувствительным и 1шформатлвным инструментом контроля состояний фототосистем црн разноплановых исследованиях принципов их

функционирования.

Ащюбация работы. Основнмо розультити работы били доломопы на 12 Всесоюзном сопощании но ионному гомоостазу и влиянию факторов внешне!! среди на ;:<изнодоялолыюсть клотки '/Иркутск, 1987/, 19 конференции молодых учонмх Биологического ([«культота МГУ /Москва, 1988/, 3 конгрессе ЁнропоЛского ^огобиологичоского общества /Будапешт, 1989/, па заседаниях семинара по фотосинтезу кафедры биофизики Биологического факультета МГУ.

Публикации. Но томе диссертации опубликовано 5 печаттах работ.

Структура диссертации. Диссортационная работа построена но традиционному плану и включает введение, обзор литоратури, экспериментальную часть /объекты и методы исслодснатш, результаты и обсуждение/, выводы и список литератур.

СОД'Г^ШЕ^АБОШ

Глава 1. Об^ор литературы. -ОЙйбр1Литературы состоит из тро разделов, в которих изло™онн -сой^'омйНйис .представления о Функционировании элоктпонтранснортнО!Г:^ВДиГ/Э'Щ/ фотосинтеза, стругу-ре 4С1 и 402 зеленых растений й' цЙ&ййбактерш''., Рассмотрен механизм генерации в реакционны^' йонтрах ({отосинтсза и взаимосвяз компонент ЗФ с процессами прямого и обратного транспорта олоктро нов. Представлены даннио о тормоиндуцировшшых структурных перестройках липидного матрикса фотосинтотичоских мембран и их влияние на функционирование фотосинтотического аппарата.

Глава 2. Объекты и методы -исследования. Основным объектом исследования служили изолированные мембраны термофильных циано-б акт ери;] $>уцСскососсиЛ. еЛсн^о^и^ . в работе также пепользова

лись целые клетки -S . cßoiu^aiit^. , частицы С>С2 с активно;'? кисло" родвидсллгащои системой мембранные фрагменты, обогащонныо CGI. Выделение частиц <К2 и мембранных фрагментов, обогащенных CGI проводили путем селективного фракционирования мембран детергентом лаур1ьгдпмет::ла:.:пиоокс:1дом по методу, описанному ранее /Кауров п др., 1Ш6/.

Регистрацию температурных зависимостей стационарного уровня 31' препаратов проводили па установке, сконстоу^грованноп па базе фосфороскопа при постоянном позбузденик в красной области спектра и непрерывном прогреве со скоростью 4°С/мин. Бремя возбуждения состагмяло 1,0 мс, время мозду возбуждением л оогистрацлей -1,5 мс, время регистрации - 1,3 мс. для записи кинетики спада ЗФ на осциллограф использовали фосфороскоп, соответствующие параметры которого сссгаалялк G.-1; 3 и 1.1 мс. Для регистрации ЗФ в анаэробных условиях использовали трубку Тумберга.

Качор;и.;е грпчоекпе исследования были выполнены на дифференциальном сканирующем микрокаюржетре ДЛСМ-L.I /СССР/.

Скорость изменения концентрации кислорода в среде измеряли ашеромотричесгсн на полярографе LP-7 /ЧССР/ с помощью электрода Кларка.

Глава 3. Экспериментальные результаты и обсуддение.

1. Исследование термоиндуцированной замененной флуоресценции хлорофилла изол1фованных мембран S . ilcngctiu4-.

В соответствии с поставленной задачей проводилось исследование термоиндуцированной замедленной флуоресценции на субклеточных препаратах цианоб актер::;"; S. eiongadui.. Ha'pnc.l(l) приведена температурная зависимость стационарного уровня ЗФ изолированных фотосш1тетических мембран S . dOßngcUuA' . Эта зависимость^ имеет два отчетливо выраженных максимума /пика/ при температурах

30 40 50

■ Рис.1. Температурные' зависимости Зф изолированных мембран (1), целых клеток 5 . ШпуаЖиь. (2), частиц ФС2 (з), фрагментов мембран, обогащенных ФС1 (4). 1а, 2а, 4а - соответствующие препараты в присутствии 40 мкМ ДХ$№ и 1 мМ аскорбата /а. Среда инкубации: 10 (,¿,1 Нерез -л/аОН, 5 ыМ К-/а фосфатный буфер, рН 7,6, 10 м1Л

Концентрация хл. а в препаратах мембран - 18 от Дм; клеток - 1,5 мг/мл; частиц ФС2 - 3 ыг/мл; в препаратах ФС1 - 18 мгДи

54 и 78°С. Положение низкотемпературного пика примерно соответствует положению основного максимума ЗФ хлорофилла целых клеток /рио.1(2)/ и частиц <Ю2 /рис. 1(з)/. Аналогичные пики регистрируются на клетках и тканях зеленых растений и цианобактерий. Их формирование происходит за оче.т изменений интенсивности секундного компонента ЗФ £С2 / рекомбинаци восстановленного первичного хинона о выоокоокисленными состояниями кислородвыделяацего коы плекса(квк)/. Рост интенсивности Зф объясняют термоактивацией прямого и обратного транспорта электронов, спад - инактивацией наиболее термолабнлыюго участка ЭТЦ0С2 - КВК /Воселовский, Ве-оелова, 1990/.

Аналогий высокотемпературному пику в литературе не встречается. Наиболее четко он выражен у препаратов изолированных мемб-

pair. У клеток аналогичная полоса выявлена в виде минорной компо-— центы, интенсивность которой в 50 раз ниже по сравнению с низкотемпературным пиком. Контролышо эксперименты показали, что высокотемпературная ЗФ но является хемилшинесценцией хлорофилла, в то яо Бремя сопоставление ТЗФ изолированных мембран и препаратов, обогащенных <101 и £02 /см. рис.1 (3,4)/ свидетельствует в пользу предположения, что 30 в области высокотемпературного пика, в отлично от низкотемпературного, генерируется в реакционных центрах /P'V ¿01.'

Это предположение подтверждается тшс;;о результата!ли донорно-акцепторпого и ипгибиторного анализа. В присутствии пары дихлор-фвиолиндофонол/аскорбат, донирующой электроны на <Ю1, происходит увеличение интенсивности ЗФ в области высокотемпературного пика у ¡'лоток, мембран и фрагментов мембран, обогащенных 401 /рис.1 (la,2a,-iaj/. Акцептор мотштиологен, принимающий электроны от £01, полностью тушит высокотемпературную ЗФ, не влияя на низкотемпературный пик. Добаалоние к мембранам феррицианида, который восстанавливается как CGI, так и.ФС2, вызывает исчезновение обоих пиков ЗФ. Напротив, высокотемпературный пик нечувствителен к воздействиям, затрагивающим электронный транспорт на донорной или акцепторной стороне ФС2. Он не изменяется в присутствии диу-роиа или при ингибировании КВК высокими концентрациями буфера Трис-КС£. Таким образом, полученные данные позволяют достаточно убедительно идентифицировать ЗФ 401, имеющую рекомбинацнонную природу. Бодео подробно оа свойства будут рассмотрены в 3 разделе.

Приведенные выше результаты показывают, что изолированные' мембраны, а тэдеже частицы 402 и фрагменты мембран, обогащенные 401, обладают высокой термостабильностью, что позволяет регистрировать температурные .зависимости ЗФ.в шпротом интервале темпера-

тур - до 90°С. Таким образом субклеточные шопараты торма$ильных— цианобактерий могут использоваться наряду с целыми клетками для изучения особенностей ТЗФ. Изолированные мембраны являются наиболее удобным объектом для такого рода исследований, так как они сохраняют температурную зависимость ЗФ» характерную для целых клеток, и при этом представляют собой более простую систому, чем клетки. Так, у них прорван электронный транспорт мезду двумя фотосистемам:!, что связано с удалением. в процессе выделения растворимого цитохрома с-553, донирующего электроны на Р700+ /Щгипо (Л. а£1981/. Мембраны ^ . ¿¿оп^и^и-Ь в процессе выделения, включающего стадии аесткой механической обработки, теряют барьерные свойства. Проведенные в нашей лаборатории контрольные эксперимента показали, что они но создают свотозавиоимий протонный градиент. Отсутствие трансмомбранного электрохимического потенциала, . который у физиологически активных клеток моняотся сложным образом и иепостредственно влияет на интенсивность зф /пгиСк1*и 1977/, значительно упощает интерпретацию результатов, получониых при изучении ТЗФ изолированных момбран, "Кромо того, использование субклеточных препаратов вместо целых клеток даот возможность изучать влияние физико-химического состава среды на фотосинтотичео-кае мембраны.

Представляет интерес использование кривых ТЗФ для оценки влияния физико-химического состава среды на стабильность субклеточных препаратов. Устойчивость изолированных комплексов может бить повышена с помощью ряда соедшениИ, обладающих наспецифичео-кш стабилизирующим действием на макромолекулы и мембранные системы. Для этих долей в случае мембран цианобактерий используют высокие концентрации полиэтшшнгликоля /ПЭГ/ и цитрата а / /СД- -

, GaM.lt , 1979; гВш1лИ , 1983; Кауров и

да., 1988/. Изолированные мембранные системы из 5 . (¡^Сн^&'киЛ.

^кйггдчно теряют исходную термоустойчивость реакций электронного— ггрянодарта к искусственным акцепторам 'IC2 /Кауров и др., 1988/. ООшшзпио термостабильности электронного транспорта определяет и "иизкотемператушый сдвиг пика ТЗФ ФС2 в ряду клотки - изолированные мембраны - частицы <102 /рис.1/. В присутствии 20% ПЭ1МООО или 0,75 M цитрата/Va наблюдается сдвиг обоих пиков ТЗФ в высокотемпературную область, наиболее значительный сдвиг характерен для пика ТЗФ СС2 - на 6-7°С.

1Сатионы , в отличие от ПЭГ и цитрата /Са,оказывают выраженное специфическое влияние на ЭТЦ 4С2 изолированных мембран. При нсПтралышх рН они необходимы для поддержания электронного транспорта от воли к искусственным акцепторам. Это влияние обус-лоолоио, главным образом, участием в поддержании нативной кон-формации кешшеитлдов КВК мембран цианобактерий ¡Slc-Kwii. <L<x№-, 193Э, 1331/. Как видно из рис.4 б , отсутствие М^С^ в средо приводит к исчезновению характерного пика ТЗф ФС2. Введение в среду инкубации ионов j/aCl, которые значительно слабее влияют на скорость транспорта электронов в мембранах цианобактерий /Sic -wan-t , Rendait , 1980/, не приводит к восстановлению формы кривой ТЗФ 4С2, характерной для функционально-активных мембран.

Ионы U^Ctg существенно влияют также на температурную зависимость Зф CCI. Повышение их концентрации в среде вызывает тушение ЗФ, но не изменяет положения ее максимума. Как будет показано ниже /раздел 3/, этот эффект связан не о влиянием катионов, а определяется действием ионов СI",

Таким образом температурные зависимости стационарной ЗФ изолированных мембран термофильных цианобактерий проявляют высокую чувствительность к структурно-функциональным сдвигам, вызванным изменением свойств среды инкубации. Это обстоятельство, с учетом

достоинств систем 'иг позволяет иевояьзоаать- изолированные —' мембраны термофилов для детальных исследований механизмов термо-индуцированных изменений интенсивности ЗФ и' <Ш2..

2. Исследование термоиндуцированной ЗФ изол!фованных мембран 5 «в!!опр&Ы<Ь> .

Параметры ТЗФ <К32 / положение максимумам суммарна» датенсив-ность, компонентный бовУйВ и др./ решающим- образом эаииенгг от свойств среды инкубации изолированных мембран ш частиц ФС2. Форма пика ойувломаиа тершиндуиированными изменениями интеисивно-оти овну¡¡Д1ЮГ0 шишома ЗФ, который генерируется ъ состоянии ¡5^) Ш Р680 Фао Од", Соответственно наблюдается его исчез-МОйвНЯе В Присутствии фэррицианида, который предотвращает рекомбинацию, окисляя Од, а тшае после обработки мембран Трио-Ш£ -

30 ко 50 60 70 80

IX.

30 <¡0 50 60 70 8сГ

ьл

Рис,2, Температурные зависимости ЗФ изолированных мембран в присутствии 2 Ш форрицианида (1) ; Ю"6!,! РССР (2); 50 м.1 Ун4Сб (з) 5 изолированных мембран, обработанных 0,8 М.Трис-НС£, рН 8(4). Среда инкубации описана на рис.1. Концентрация хл. а в пробах -18 мкг/мл.

Рис.3. Температурные зависимости ЗФ частиц ФС2 в аэробных (1) и анаэробных (2) условиях. Концентрация хл. а в препаратах 18 мкг/мл

сйуфдром, инактивирующим кослородвыделлющий комплекс. Значительное— уменьшение интенсивности пика происходит в присугствии ГССР, который кошсур:грует с Од" в реакции восстановления и "^-состояний К1Ж / Шт^сК-1972/. Введение в среду инкубации который вызывает накопление модифицированного 5 2 - состояния /ВапЛсп. , 1987/, наблюдается изменение формы пика ТЗФ 4С2, увеличение его амплитуды и сдвиг в сторону болое низких температур / см. рис.2/.

"Сложнее объяснить эффект значительного тушения ЗФ ФС2 в анаэробных условиях /рис. 3/, тогда как увеличение температуры максимума в этих условиях объясняется предотвращением в отсутствие О^ сктлигелиюИ деградации ФС2. Обращает на себя внимание потен-1ЯШЫШ ПФ&/фг8ЮС?Ь О о акцептировать электроны от возбужденного

А»

хлороФнляа шт расстановленного фоофитина, обладающих достаточно Н'ЛЯХИМЯ редокс-нотеш'.и плачи для восстановления кислорода. Такой вуть утечка электронен из закрытых РЦ ФС2 должен ускорять процесс формкровашм положительных вакансий на донорной стороне ФС2 и увеличивать интенсивность секундного компонента ЗФ 0С2.

Существенное влияние на температурные зависимости ЗФ ФС2 оказывает рН среды инкубации мембран. На рис.4а показаны температурные кривые ЗФ мембран в цитрат-фосфатном буфере с различными значениями рН. Снижение рН среды вызывает значительные изменения амплитуды и формы температурных кривых ЗФ ФС2. Во-первых, происходит резкоо увеличение амплитуды основного пика в интервале рН от 6,5 до 6,0 и последующее ее снижение при рН 5,5-3,6. Во-вторых, в этом же интервале рН на температурной кривой ЗФ четко проявляемся плечо при температуре 25-30°С.

Как у;ке отмечаюсь выше, при рН 7,5 в среде без М^С^ У мем-. оран отсутствует пик ТЗФ 4С2. Однако при рН ниже 6 наблюдается

Рио.4. Температурные зависимости ЗФ изолированнее мембран в ородо с различным значением рИ: а - в присутствии Ш мМ б - в отсутствио Пунктиром обозначена температурная зави-

симость ЗФ мембран в присутсивип 10~5,.1 диурона» Среда шшубащш -цитрат-фосфатный буфер /10 гл'Л Уа^ТО^ + 5 пМ лимонная к-хц/. Конц. хл. а в препаратах - 12 мкг/мл

V 5 6 7 еЗрН

Рис. 5. рН-зависшлости скорости выделения 0^ изолированными мембранами в присутствии 10 мь1 д^С^О-) и в отсутствие ¡АуСС2• Акцептор - феррицианвд 2 мМ. Среда инкубации и конц. хл.а-см.рио.

4»

его восстановление и появление на температурной зависимости ЗФ низкотемпературного плеча /рис.46/. В отличие от препаратов в буфере о максимальная интенсивность пика достигается при более кислом значении рН, равном 4,7. Восстановление при кислых рН

пика ТЗФ ФС2 в средо без .M^Ctg связало с восстановлением электронного транспорта через ФС2 /см. рис.5 (2)/. Однако рост его интенсивности нельзя объяснить увеличениям скорости электронного транспорта, поскольку аналогичное увеличение интенсивности ЗФ ФС2 наблюдается' и в присутствии l'^CC-g, 110 сопровоздаясь при этом увеличением скорости электронного транспорта от води к форрицпшш-ду /см. рис.4а, s(l)/. ¡.lu предположили, что увеличение интенсивности секундного компонента ЗФ может быть связано с усилением нри кислых рН оттока электронов от закрытых РЦ <i02 /от Р680* и Фоо~/ на кислород или эндогенные низкопотенциальные акцепторы.

В послодущой работе ш более детально исследовал!! природу низкотемпературного плеча ЗФ Ф02, которое отчетливо проявляется при снижении cil среды инкубации мембран /рис.4/. Плечо форлгиру-ется за счет миллисокундного компонента, иродставляющего собой 3>Ъ типа утечки, о чем сьидетельствует тот факт, что блокирование электронного транспорта на уровне вторичного хинона диуроном приводит к ого исчезновению /рис.46/. Увеличение при снижении рН вклада миллисокундного компонента /ЗФ типа уточки/ в стационарный уровень ЗФ связано, очевидно, с усилением оттока электронов от Од" на пул пластохинонов, так как при кислых рН происходит сдвиг равновесия вправо в реакции:

-PQ—; +2il+

QA-QB- = QA 0й" QA

Окисление пластогидрохинона в условиях, когда прерван транспорт электронов между двумя фотосистемами, может осуществляться в процессе циклического" транспорта вокруг 402.

Обращает на себя внимание тот факт, что плечо на температурной кривой ЗФ проявляется в области температур, где у мембран из клеток S . ùlcnoalub, выращенных при 55°С, наблюдается фа-

Рис.6. Температурные зависимости удельно!! теплоемкости изолированных мембран из меток 5 . исчи^аЫ,^„ выращенных ;фи /контроль/ (1); 1а -повторный прогрев препарата; ыомЗраи из клеток, выращенных при 42°С{2); коншяыпа м<е«браа в присутствии детергента ДДАО Усоотношоиив хя/юиг * .Среда инкуба» ции - 10 мМ Нере* - Л&ОН. 5 »1 ^^'фвсфзтиай -буфер, рН 7,5, 10 мГЛ МоС£2. 25'? глицерин. Конц. ял, чюг/ш-

•:Рйо'Л. '.Температурные зависимое» ти ЗФ .ФС2 контрольных Мембран (1) { мембран из клеток, выращенных яри 43°с (2) ; контрольных мембран, обработанных ЛДАО в соотн* хл/дет = 1/3 (3); частиц ФС2 (4).. Среда инкубадии-цитрат-фосфатный буфер /см, рис,4/ рН 4,,.7„ .Кони, -хл- а в препаратах мембран — 12 мкг/ш, частиц ФС2 -3 мкг/мл.

зовыМ переход мембранных липидов. Этот переход происходит в широ=~

ком диапазоне температур от 15 до 40°С, характеристическая температура /Тф>п / составляет примерно 30°0 /рис.5(l)/. Как известно, характер температурных зависимостей скоростей окислительно-восстановительных реакций пластохинона изменяется, когда в мембране происходят термоивдуцированныо структурные перестроШси липидного матрикса /Кукушкин, Тихонов, 1988/, что должно отражаться и на скорости оттока электронов от 0д~ в пул пластохинонов. Следовательно, изменение фазового состояния мембранных липидов мажет влйять на форму температурной зависимости миллисекундного компонента ЗФ.

Если излом температурних зависимостей ЗФ СС2 мембран 5 . е£о-fujaiui. при 25-30°С действительно связан о фазовым переходом, липидов, то следует ожидать, что у препаратов, характеристики фазового перехода липидного матрикса которых отличаются от коит- • рольных, произойдет изменение характера температурных зависимостей ЗФ. Снижение температуры роста клеток $ . eien^cvlurH. до 42°С сопровождается снижением Т* _ до 25°С /рис.5(2)/. Как видно из '

ф.Ц»

рис, б ('¿), температурная зависимость ЗФ Ф02 этих мембран значительно отличается от аналогичной зависшлости мембран из клеток, выращенных при 55°С. Она имеет более интенсивную низкотемпературную полосу с более четко шражошшм максимумом', который несколько смещен в сторону низких томпоратур. Эти особенности ИФ по-видимому обусловлены увеличением текучести липидов "42°-мембран" по сравнению о "55°-*лембранами". В присутствии детергента, который снимает фазовый переход мембранных липццов /см. рио.5(з)/, низкотемпературное плечо исчезает /рис. б(з)/. В -заботах нашей лаборатории показано, что фазовый переход липидов в частицах ФС2 из 3 . tflon^aiub. происходит при температуре около 46°С. Тем-

J

пературные зависимости ЗФ отих препаратов по содержат изломов в области 20-30°С, и в то жо время на них появляется плечо в области 45°0 /рис.б(4)/.

Ь целом приведенные результаты свидетельствуют в пользу возможной взаимосвязи низкотемпературного плеча ЗФ ФС2 с фазовыми переходами липидов мембран S . c£au^a,ûn.

3. Изучение термоиндуцированной ЗФ ФС1 изолированных мембран S . cion^cUi-tb..

На заключительном этапе работы мы предпрлняли дальнейшее исследование обнаруженного явления - термоиндуцированной 3i> ФС1 -с целью более полно изучить ее свойства и выяснить возможную природу термокндуцированных изменений интенсивности ЗФ «101.

Как было отмочено ранее, удаление i.l^Oi^ из среды инкубации мембран вызывает увеличение интснс^ццрст^. пика ТЗф £01, поэтому в дальнейших исследованиях vu исдалдояфад в качестве среды инкубации только раствор органического, буфера (iopes - A^aOti.

Наиболее вероятно, что пик ТЗф <if>X в результате

увеличения интенсивности ЗФ, испускаемой щщ '.рекомбинации Р700+ с восстановленным терминальным акцептором-4G1--Р430"". Как известно, в среде без восстановителей при комнатной:температуре РЦ 401 зеленых растений испускает очень слабую -iWr-co' временем полуспада 10-20 ыс /Рубин и др., 1987/. Недавно-ПдяйиЛиСь данные, что РЦ ФС1 испускает две компоненты миллисекущшой ЗФ с é 15 и 70 мс /Vûù dal., 1988/. 1»1иллисекундная -ЗФ»^01 обусловлена рекомбинацией в паре Р700+Р430~. ,

Когда Р430 предварительно восстановлен, наблюдается ЗФ с t 1/2" °»5-1 т /SitM^cUiM к tÀ (*£., 1978/, ко-

торая обусловлена, по-видимому, • рекомбинацией Р700+ с более ранним акцептором РЦ <101 -

Время полуспода высокотемпературной ЗФ изолированных мемб-— paît, записанной и интервале 3-18 мс поело освещения, составляет около 7 мс, соответственно ее следует отнести к рекомбинации в паре Р700+Г43Э~. Акцепторы Р430 и Г^ являются наиболео тормо-лабильными компонента;,m ЭТЦ СО 1. Так, Оотосинтотичоскоо раздоло-ние зарядов в ФС1 термофильных цианобактерии Ъупсскоеоесил- sjb наблюдается вплоть до 100°С, в то ко время 50:';! Г- и Р430 инакти-вируются после 5 мин. прогрева при 81°С /Kolkt iL ciC.t 1S82/. Таким образом, необратимый спад ЗФ ¿01 после 78-80°С убедительно об'ьясняотся термоинактивацией акцептора Р430.

Термоиндуцированпыо изменения интенсивности ЗФ ФС1 обратш.ш по температуре, Как видно из рис.8(l), участки кривых роста интенсивности ЗФ при увеличении температуры до 73°С и ее снижении при последующем охлаждении мембран в интервале температур от 63 -до ?3°С полностью совпадают. При этом скорость охлаждения в 10 раз превышала скорость нагрева, Это согласуется с предположением,

'Рис.8. Температурные зависимости ЗФ изолированных мембран в отсутствие(l) и в присутствии 40 mio'vl ДХФИФ и 1 м.Л аскорбата -Va (2). Среда инкубации - llepes -Л/аОН 10 r.v.l. pH 7,5. Конц. хл. а - 12 мкг/мл.

30 ¥> SO 60 70 8 0 90

что рост интенсивности УФ определяется процессом активацш: излу-~ чатольной рокомбшюции зарядов в соответствии с законом Лррсни-уса. В области температур, где наблюдается рост интенсивности ЗФ Ф01, в мембране такко происходят необратимые процессы инактивации, затрагивающие РЦ <¿01. Этим объясняется значительное уменьшение пика ТЗф Ф01 при повторном прогреве охлажденного образца /рис. (l)/. Кроме того, скорость электронного транспорта от ДХФПФ Н2 к мотилвпологопу, изморенная при комнатной температуро, розко снижается у проиаратов мембран, подвергнутых предварительному прогреву до томпоратур шшо G0°C, Таким образом при повышении температуры обратимый процеао термфилактивации иэлучатолыюй рекомбинации зародов конкурирует Q процессом необратимой инактивации, затрагивающим CXJ1, что и оцредедяет о,бщуи форму температурной зависимости Зф COI.

Существенный вклад в процесс деструкции СС1 вносит окислитол пая деградация. в отсутствие кислорода, характер температурной зависимости резко меняется значительно возрастает интенсивность ЗФ и ее полоса сдвигаотся в область'болао высока температур . Кроме того, сохршшатод рвдокш Штойсувиость ЗФ при повторном прогрова образца /см, рис,9Д иайДюД&оми-е эффекты, вороятно, главным образом связаны с замедлс^Йл 'Ь^сжтелыюй деградации 401, в результате чего в анаэробпШс'^йЛовиях па всем инторвале исследуемых температур преобладает :1Ьй'цессы термоактивации ЗФ sLOl Определенную роль в процессе ryuiéiüh ЗФ (101 может таете играть способность 0£ акцепт!фовать электроны от 401 и тушить возбуадон-ные и триплетные состояния хлорофилла. .

Интеросной особенностью ТЗФ '■101, является гетерогенность пике проявляющаяся в присутствии'пЯ^даФИф/аскорбат. В этих условиях происходит значительное уширенйе пика за счет появления новой бо-

Рис.э. Температурные зависи-ЗФ изсштоваиных мембран в аороб-' них (1) и в анаэробных (2) условиях; 2а - повторный прогрев препарата. Среда инкубации - Неое* - Лои 10 мМ, пН 7,5. Конц. хл. а - 12ШР

мМ

иМ

Рисло. Зависимость интенсивности пика ТЗФ '101 в максимуме от концентрации солей. Среда инкубации - Нерез -УаОН 10 мМ, рН 7,5. Конц. хл. а в препаратах мембран - 12 мкг/мл.

лоо термочувствительной компоненты, формирующей шшчо в области— С5-73°С /рис.8(2)/. Таким образом в присутствии восстановителе!) в формирование пика ТЗФ ¿01 дают вклад по. крайней море дво компоненты. Неоднородность ЗФ й01 может отражать гетерогенность реакционных центров <101, а такие может быть связана с гетерогенностью терминального акцептора Р43Э, lii 'Состав которого входят два железо-серных центра Гд и F^.

Заключительны:! этап работы бил Йиязан с выяснением причин отмеченного ранее эффекта - туисний ЗФ '101 в присутствии "У^. При исследовании влияния ряда других соло» на интенсивность 8Ф йС1 выяснилось, что тушение ЗФ 'вызывают анионы солеО, причем эффективными тушителями яоглвтея aiiaotiú галогенов /d Ьг~, 3 "/. а также нитрат-анион /рис.10/ При ЬЗДм в ряду галогепои эффективность тушения возрастает с увеличением''атомарно!) массы."Выпадение" аниона иода из этого ряда вызвано, по-видимому, снижением ого эффективно'! концентрации в результате ойй&йшш.

При рассмотрении возможных причин тушения ЗФ"с'лЩУ®г отметить, что нам неизвестны данные о каком-либо специфическом влиянии анионов галогенов и нитрата на ípá/ícnópT электронов в 401, В наших экспериментальных условиях но£ЗзШо, что скорость электронного транспорта ДлФИФ — ШГ|р?е:,гйвй'еит от присутствия в среде ионов СС~ и Уо3 /другие туЖота' п'е'рассматривались/.

С другой стороны известно,"чт'о-эти анионы, а также молекулярный кислород, являются тушителями триплетных и синглетных • возбужденных состояний молекул; и в ряду анионов галогенного ряда эффективность тушения возрастает с увеличением массы иона /Теренин, 1968/. С наибольшей эффективностью перечисленные соединения тушат триплетные состояния -'молекул, поскольку их время жизни значительно превышает время жизни синглетно-возбужденных

состояний. Приведенные свойства использованых в нашей работе вв-=~" щоств предотавлпют интероо в связи с том, что в соответствии со сладывающимися в последние годы представлениями /УинлииХ. , 11)86; с1 ., 1У88/, бозизлучатольная рекомбинация в '101 происходит в оспо пом чероз тпинлотноо состояние первичного донора. Соответственно ускорение тушения ^Р700 сдвигаот равновесие в пользу пути безизлучатсльноП рекомбинации.

Исходя из этих предотаплоний, гм[фокт резкого уменьшения ЗФ 401 ,в присутствии анионов Вг-, Л" и можно, по-види-

мому, рассматривать как результат тушения этими веществами три-плетннх состоянии,что приводит к ускорению бозизлучательной рекомбинации зарядов. Однако поскольку известно, что при физиологической тсмиературо триплетнно состояния эффективно тушатся ка-ротиноидами, то при объяснении значительного эффекта указанных анионов в рамках данной гипотезы необходимо также предположить, что при высоких температурах эффективность тушения ^Р700 кароти-ноидами значительно снижается и увеличивается роль "экзогенных" тушителей, в том числе указанных анионов и кислорода.

ШЬОДО

1. При исследовании температурных зависимостей стационарной ЗФ хлорофилла изолированных мембран термофильных цианобактерий $>у\сс1иэсссслс\ ьСспдаЛи,^ показано, что в отличие от изолированных фотосинтетических мембранных систем зеленых растений мем-бпяны термофильных цианобактерий 5 . сохраняют общую фоту температурной зависимости ЗФ, характерную для цолых клеток.

2. Впервые обнаружено, что термоиндуцированные кривые ЗФ изолированных мембран цианобактерий кроме низкотемпературной полосы ЗФ ФС2 содержат высокотемпературную полосу, принадлежащую 401.

3. Показано, что кривые термоиндуцированного роста ЗФ Ф01 имеют — многокомпонентный хапактер, который отчетливо проявляется в присутствии экзогенных доноров электронов к 401. В осново тормости-муляции ЗФ 401 по-видимому лежит провеса температурной активации иэлучательной рекомбинации зарядов в. реакционном центре 401.

4. На основании результатов исследования свойств 34> <101 в различных условиях пред-южен механизм влияния анионов гшюгонного ряда, нитрат-аниона и молекулярного ююлорода иа термоиндуцйрованный пик ЗФ 401. Перечисленные соединения снижают интенсивность ЗФ «iCl за счет увеличения скорости йоздол#чателы1о!1 рекомбинации зарядов. Кромо того, молекулярный кислород реэко''усиливает деградацию 401 при высоких температурах.

5. Показано, что снижение pH среды ии&уоНаЬси приводит к увеличению неоднородности температурных зависимостей Зч> 402 мембран S . elerujcUut. за счот увеличения пклада'в'стационарный уровопь ЗФ термочувствительного компонента Ьф"Ш'За"'утечки. Предположено,

• ■ .Ь* ■ >

что изменение интенсивности шилйЬШф'ищогсь компонента ЗФ обусловлено термоиндуш.'рованными измйп.енидаи текучести линидного матрикса 402.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Кауров Ю.П., Белянская Г.К., Аксенова Г.Е. Нпгибироиачие и реактивация цитратом натрия электронного транспорта в изолирован ных мембранах термофильных цианобактерпй.// 12 Всесоюзное совещание по транспортным АТФазам: "Ионный гомеостаз и вл;шние (j-акторов внешней среды на жизнедеятельность'клетки", тез. докл., Иркутск, 19ь7, с. 39.

2. Кауров W.H., Аксенова Г.Е., Ловягина Е.Р., Иванов И.И., Рубин A.B. Термоиндуцированная замедленная флуоресценция хлорофилла фотосистем 1 и 2 мембран термофильных цианобактерий Swtvc -

скоссссиь- Биол. мембраны, 1988, т.5, Ш, с. 1289-

1295.

3. Ловягина Е.Р., Аксенова Г.Е. Калоримоуричоское исследование структурных переходов в мембранах и частицах 'Ю1 и из термофильных цианобактерий.// Труды 19 конф. мол. ученых Биологического ф-та МГУ /рукопись деп. в ШШТИ 24.08.1988, 6711-В88/, г.1., 1988, 170-174.

4. Аксонова Г.Е. Тормоиндуцированная замедленная флуоресценция хлорофилла фотосистем 1 и 2 мембран термофильных цианобактерий.// Труды 19 конф. мол. ученых Биологического ф-та МГУ /рукопись доп. в ШШТИ 24.08.19UH, 6711-В88/, М., 1988, 134-139.

5. Kaurov Yu., Akeyonova 0., Lovyagina В. Thermally-induced delay fluorescence of chlorophyll of Photosystems 1 and 2 of thermophy-lllo cyimobacterla.// 3 Congress of the European Society for photoblology. Pook of abet., 1989, Budapest,- Hyngary, p. 267.

J4