Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фикобилипротеины и антенные пигмент-белковые комплексы фотосинтетического аппарата
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Фикобилипротеины и антенные пигмент-белковые комплексы фотосинтетического аппарата"
российская академия наук
Институт биохимии им. А.Н.Баха
р г ОД-:
На правах рукописи
- 1 ДПР 1335
УДК: 577.152; 577.355; 581.132; 581.174
СТАДНИЧУК Игорь Николаевич
фикобилипротеины и антенные пигмент-белковые комплексы фотосинтетического аппарата
03.00.04 - Биохимия
Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада
Москва -1996 г.
Работа выполнена на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М.ВЛомоносова и в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН
Официальные оппоненты:
доктор физико-математических наук, профессор А.Ю.Борисов доктор биологических наук, профессор В.Я.Быховский доктор биологических наук, профессор В.В.Климов
Ведущая организация:
Институт физиологии растений имени КА Тимирязева РАН
Защита состоится " "_1996 г. в_час
на заседании специализированного ученого Совета Д 002.96.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (117071 Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОБН РАН (Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1)
Диссертация разослана "_"_1996 г.
Ученый секретарь специализированного Совета доктор биологических наук
Т.А.Валуева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование фотосинтеза имеет важнейшее значение для фундаментальной биологической науки, для формирования представлений о принципах биотрансформации солнечной энергии. Раскрытие механизма фотосинтеза важно и для практических целей: селекциии растений, создания биотехнических устройств и искусственных фотопреобразователей излучения.
Фотосинтетический процесс начинается с поглощения и первичной стабилизации энергии световых квантов в виде разделенных зарядов в пигментном аппарате фотосинтеза. Известно, что доля пигментов, находящихся в реакционных центрах и участвующих в фотохимическом разделении заряда, очень мала. Основное количество хлорофилла а и его аналогов образует так называемую антенну, улавливающую солнечную энергию и передающую ее реакционным центрам. Исследование антенных, или светосо-бирающих, пигментов (хлорофиллы, бактериохлорофиллы и фикобилины) показало, что они входят в состав специализированных макромолекуляр-ных структур - пигмент-белковых комплексов. Полипептиды комплексов составляют основную массу протеинов фотосинтетического аппарата, а молекулы пигментов, или хромофоры, выполняют роль простетических групп данных белков.
Значительные успехи в исследовании строения и функционирования пигментного аппарата фотосинтеза достигнуты благодаря работам школы академика ААКрасновского и других отечественных ученых (А.Ю.Борисов, Т.Н.Годнев, Ю.Е.Ерохин, Н.В.Карапетян, В.В.Климов, Ф.Ф.Литвин, А. Б.Рубин, ВАШувалов) и многих зарубежных лабораторий (Е.Гант, АХлазер, В.Вермайер, К.3ауэр, Х.Михель, Х.Цубер, Г.Шеер и др.).
Особенностью пигмент-бапковых комплексов является связь апопро-теинов с многими хромофорными группами. В состав каждого комплекса входит, как правило, по нескольку полипептидов. Сложность молекулярной организации фотосинтетических антенн нашла непосредственное отражение в названии: пигмент-белковые комплексы. Обилие систематических групп фотосинтезирующих организмов, связанное с осуществлением фотосинтеза в широком спектральном интервале и при значительных перепадах в интенсивности света, привело к многообразию антенных комплексов.
Ко времени начала наших исследований содержание хромофорных групп и полипептидный состав у большинства антенных комплексов оставались неизвестными. Эти характеристики являются важнешими для пигмент-белковых комплексов, так как определяют эффективность их функционирования в качестве фотосинтетических сборщиков света. Представлялось необходимым изучение хромофорного состава у возможно большего числа комплексов, принадлежащих различным фотосинтетикам, с привлечением к проблеме формирования антенн эволюционного подхода. Решение многих вопросов связано с исследованием фикобилипротеинов - све-тособирающих комплексов цианобактерий, красных и криптофитовых водорослей. Этот тип комплексов в сопоставлении с антеннами высших растений и других фотосинтезирующих организмов стал предметом наших исследований.
Цели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было изучение хромофорного состава светособирающих комплексов: фикобилипротеинов, пигмент-белковых комплексов хлорофилла а и его аналогов, а также выяснение закономерностей, связывающих содержание хромофоров и полипептидное строение с характеристиками спектров поглощения комплексов.
В работе решались следующие задачи:
1) Выяснить хромофорный состав фикобилипротеинов и других светособирающих комплексов, предприняв при этом поиск новых пигментов фикобилипротеиновой ветви кислородвыделяющих фотосинтетиков.
2) Провести сравнительный анализ хромофорного и полипептидного состава и свойств спектров поглощения светособирающих комплексов для выявления общих принципов молекулярной организации антенной части фотосинтетического аппарата.
3) На основе полученных сравнительных данных рассмотреть основные направления эволюции светособирающих комплексов у фотосинтезирующих организмов.
Научная новизна. Получены новые данные и сформулированы новые представления о молекулярной организации и эволюционном формировании фикобилипротеинов и других светособирающих комплексов.
Найден новый фикобилипротеин, С11-фикоэритрин, принадлежащий цианобакгерии ОзсШаЬпа аппае. Другой выделенный си-фикоэритрин из нового вида термофильных цианобактерий, ОьсНШопа зр. Я5-21, стал вто-
рым (после цианобактерии Gloeobacter viofaceus - Rippka, 1974) случаем выявления этого пигмента у цианобактерий.
Установлен хромофорный состав а-, р- и у-полипептадных субъединиц R-фикоэритринов красных водорослей Antithamnion sparsum и Callrthamnion corymbosum. Обнаружение в составе R-фикоэритринов трех у-субъединиц свидетельствует о том, что эти пигменты обладают сложной надмолекулярной структурой, связанной с их функционированием в составе фикобилисом.
Обнаружена фосфоресценция фикобилипротеинов. Установлена корреляция между возгоранием фосфоресценции и переходом линейной геометрической формы билиновых тетрапирролов в псевдоциклическую, происходящем при денатурации фикобилипротеинов. Выявленная особенн-ность фосфоресценции объясняет необходимость ковалентного, в отличив от хлорофиллов, связывания фикобилинов с апопротеином поддержанием в натавных белках с помощью коваленттгой связи фотохимически неактивной вытянутой конфигурации хромофорных молекул.
Обнаружены два новых для криптофитовых водорослей пигмента: хлорофилл с, и хлорофилл с5 (а5 монометиловый эфир Мд-дивинилфео-порфирина). Последний из них может служить таксономическим маркером для сближения криптофит с другой группой жгутиковых, празинофитовыми водорослями, и установлением филогенетических связей с прохлорофит-ными фотобактериями, также содержащими хлорофилл cs. Доказан перенос энергии от хлорофилл а/с-протеина к фотосистеме I в криптофитовых водорослях, в то время как от другого светосборщика, фикобилипротеинов, энергия поступает к фотосистеме II.
На основе разработанного метода математического совместного моделирования низкотемпературных спектров поглощения и флуоресценции пигмент-белковых комплексов установлено, что спектры Бхл а-протеи-на зеленых бактерий описываются семью компонентами. Сделан вывод о том, что белок комплекса содержит гептамеры пигмента; полученные данные подтверждены последующим рентгеноструктурным анализом (Fenna, Mathews, 1975). Аналогичным образом показано, что в комплексе В850 пурпурных бактерий существуют два типа пигментных агрегатов, причем в агрегации участвуют хромофорные группы бакгериохлорофилла а, расположенные на нескольких полипептидах комплекса. В случае Хл а/Ь-лротеина высших растений также на основании исследования структуры спектров
поглощения и флуоресценции показано, что размеры пигментных агрегатов являются меньшими, чем число молекул хлорофиллов, связанных с одним полипептидом комплекса.
Предложен показатель плотности упаковки хромофоров, связывающий размеры полипептидов с числом хромофорных групп, находящихся в светособирающих комплексах. Показано, что разнообразию фотосинтетических антенн соотвествует многообразие кластерной организации хромофоров.
Предложена схема возможной эволюции антенных комплексов окси-генного фотосинтеза, постулирующая существование предкового прокариота, не имевшего иных пигментов, кроме хлорофилла а, и предполагающая формирование фикобилипротеиновой ветви фотосинтеза, независимое от организмов, содержащих Хл а/Ь- и Хл а/с-протеины.
Научно-практическая значимость работы. Полученные в работе данные о хромофорном и полипептидном составе пигмент-белковых комплексов служат для выяснения молекулярного механизма наиболее ранних этапов фотосинтетического процеса, протекающих в антенне, которая составляет более половины всех тилакоидных белков и подавляющую часть пигментов тилакоидов. Результаты исследований положены в основу предложенной схемы эволюции антенной части фотосинтетического аппарата.
Обнаружение новых фотосинтетических пигментов расширяет представления об адаптационных возможностях фотосинтеза по отношению к спектральному составу света. Данные о спектральных свойствах антенных комплексов и их хромофорном составе могут быть применены для оценки физиологической активности фотосинтеза в зависимости от световых и других условий обитания растений.
Разработанные методы выделения отдельных пигмент-связанных полипептидов светособирающих комплексов могут иметь практическое значение при создании биотехнических систем и молекулярных преобразователей энергии света. Данные исследований фикобилипротеинов как натуральных красителей могут быть использованы в современных методах им-мунофлуоресцентной диагностики, а также в парфюмерной и пищевой промышленности.
Результаты экспериментальных исследований, касающиеся фикоби-липротеиновых пигментов, включены в монографии "Фикобилипротеины" (1990) и "Фикобилисомы" (1991). Научные представления, обоснованные в
работе, использованы в курсе лекций, читавшихся для студентов кафедры физиологии растений и других кафедр Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XIII Международном конгрессе по ботанике (Ленинград, 1975); на XIX научном совещании стран - членов СЭВ "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата" (Пущино, 1981); на Международном коллоквиуме по физиологии растений (Берлин, 1982); на Всесоюзной конференции "Современные проблемы эволюционной биохимии и происхождения жизни" (Петрозаводск, 1984); на IV Всесоюзной конференции по химии и применению порфиринов (Ереван, 1984); на VII Всесоюзном микробиологическом съезде (Алма-Ата, 1984); на XVI Международной конференции ФЕБО (Москва, 1985); на V Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986); на IX Международной конференции по происхождению жизни (Прага, 1989); на XX Международной конференции ФЕБО (Будапешт, 1990); на XI Международном фотобиологическом конгрессе (Киото, 1992); на III Всероссийском съезде физиологов растений (Санкт-Петербург, 1993); на V Европейском биофизическом конгрессе (Будапешт, 1993); на XVI Международном ботаническом конгрессе (Токио, 1993); на IX Всеевропейской конференции фотобиологов (Марбург, 1993); на Международной конференции памяти А.И.Опарина "Биохимия XXI века" (Москва, 1994) и на Гордоновской конференции по биофизическим проблемам фотосинтеза (Бостон, 1994).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано более 60 работ в отечественных и международных изданиях; полученные результаты вошли в три обзора и две монографии.
Методические аспекты работы. Объектами исследования служили фикобилинсодержащие организмы: цианобактерии, красные и крипто-фитовые водоросли, а также зеленые, пурпурные бактерии и высшие растения. Изучению были подвергнуты фикобилипротеины и светособираю-щие комплексы, выделенные из перечисленных выше фотосинтетиков, а также отдельные пигментсвязывающие полипептидные субъединицы комплексов.
В работе использованы методы дифференциального ультрацентрифугирования и колоночной белковой хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии повышенной разрешающей способности (распределительная, обращеннофазовая и ионобменная хроматография в сис-
теме ЯРЮ) с двойной регистрацией и обсчетом хроматографических пиков "по белку" и "по хромофору". При этом цель и характер исследований потребовали разработки ряда хроматографических методов разделения составляющих антенные комплексы полипептидов с сохранением их связи с хромофорами. В исследовании применялись методы аналитического и препаративного изофокусирования и препаративного электрофореза. Кроме того использованы различные вспомогательные методы белковой химии. Для изучения отделяемых от апопротеина пигментов применены методы препаративной тонкослойной хроматографии и хроматографии высокого давления в системе НРЮ.
В работе применен широкий набор спектральных методов: низкотемпературная абсорбционная, флуоресцентная и фосфоресцентная спектроскопия. Для изучения структуры многокомпонентных спектров антенных комплексов разработаны метод производной флуоресцентной спектроскопии и метод совместного математического моделирования спектров поглощения и флуоресценции с использованием универсального соотношения (соотношения Степанова).
В исследовании нашли применение методы световой и электронной микроскопии.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
I. Исследование хромофорного состава и спектральных свойств фикобилипротеинов
Фикобилипротеины - группа антенных пигментов цианобаюгерий, фасных и криптофитовых водорослей, существование которых в виде пигмент-белковых комплексов никогда не вызывало сомнений благодаря ковалент-ному связыванию апопротеина и хромофоров. Цветность фикобилипротеинов зависит от незамкнутых линейных тетрапиррольных хромофоров - фи-кобилинов, соединенных с цистеиновыми остатками белка. Фикобилипротеины багрянок и цианобактерий содержат четыре вида фикобилинов: фи-коциано-, фикоэритро-, фикоуробилин и криптовиолин. Они являются изомерами, различающимися числом конъюгированных двойных связей (Рис. 1а). Белки состоят из а- и р-полипептидных субъединиц с молекулярной массой 17-22 кДа и молярным соотношением 1:1. С (а(З)-мономера-
ми апопротеинов в зависимости от типа фикобилипротеина может быть связано от двух до шести хромофорных групп (см. [1, 2]).
1. Хромофорный состав цианобактериальных фикоэритринов
Важнейшей группой фикобилипротеинов являются имеющие интенсивную красную окраску фикоэритрины. Багрянки содержат В- или Я-фико-эритрин, а цианобактерии - С-фикоэритрин (префиксы "В", "Я" и "С" происходят от латинских названий ВапдюрИуМае, НИоборЬ^а и СуапорИу1а соответственно). Пигменты различаются числом и соотношением связанных с апопротеинами фикоэритробилиновых и фикоуробилиновых хромофорных групп, что находит отражение в спектрах поглощения: максимум 498 нм обусловлен фикоуробилином, а полосы в области 540-570 нм принадлежат фикоэритробилину. Поскольку С-фикоэритрин не содержит фи-коуробилина, считалось, что данный хромофор отсутствует в фикобили-протеинах циаобактерий. В 1974 г. фикоэритрин с дополнительной полосой поглощения 498 нм был найден у своеобразной, не имеющей тилакоидов, одноклеточной цианобактерии С. у/о/асеыз (Я1ррка, 1974). Соотношение максимумов 498 и 540-570 нм у нового пигмента оказалось отличным от наблюдаемого в спектрах В- и Я-фикоэритринов, что говорило об обнаружении нового типа фикоэритринов, названных позже (Массо!, Сиаг^Рпаг, 1987) си-фикоэритринами.
1.1. С1)-фикоэритрин цианобактерии ОэсПШопа эр. ЯЭ-21
Длительное время Э. уЫасеия оставался единственным видом циа-нобактерий, у которых был найден Си-фикоэритрин. Нами был предпринят поиск си-фикоэритринов у ранее не известных или малоизученных видов. Подобный пигмент был выделен из филаментозной цианобактерии, обнаруженной в термальных источниках полуострова Камчатка. По своей морфологии и клеточной ультраструктуре найденный штамм, обозначенный как ОасНШопа эр. ЯЭ-21, можно считать новым видом, принадлежащим роду осциллаториевых [33].
При денатурации фикобилипротеинов утрачиваются хромофор-хромофорное и нековалентное хромофор-белковое взаимодействия, присущие нативным белкам, в результате чего спектры поглощения становятся по-
добными спектрам свободных хромофоров в растворе (Рис. 16). По известным в этом случае коэффициентам экстинкции можно определить содержание хромофорных групп у фикобилипротеина и, после разделения, у составляющих его полипептидных субъединиц. Выделенный нами CU-фикоэ-ритрин состоял из а- и р-полипептидов с мол. массой 19 и 20 кДа соответственно. Количество хромофорных простетических групп было найдено следующим: а-полипептид, подобно а-субъединицам В-, С- и R-фикоэритри-нов, содержал два фикоэритробилиновых хромофора; р-субъединица обладала тремя хромофорными группами, двумя фикоэритробилинами и одним фикоуробилином. Хромофорный состав найденного CU-фикоэритрина совпал с известным для CU-фикоэритрина G. violaceus (Bryant et all., 1981), a Oscillatoria sp. RS-21 стала первым известным видом нитчатых цианобак-терий, обладающих CU-фикоэритрином [33].
1.2. Новый CU-фикоэритрин цианобаюгерии Oscillatoria annae.
С-фикоэритрин встречается примерно у 30% видов цианобактерий, в то время как CU-фикоэритрины, как отмечено выше, найдены у единичных видов. Было общепринято, что каждый вид цианобактерий, подобно красным водорослям, может содержать лишь один из типов фикоэритри-на. Однако у экзотических цианобактерий, являющихся симбионтами губок и асцидий (Рагту, 1935), а затем у двух пикопланктонных морских видов (Ong et al., 1991) были обнаружены одновременно С- и CU-фикоэритрины. Нами был продолжен поиск CU-фикоэритринов и у пресноводной циано-бактерии О. annae найден новый CU-фикоэритрин, присутствующий в клетках вместе с С-фикоэритрином (Рис. 1в).
Разделение двух красных фикобилипротеинов представляет собой определенные трудности. Был предложен обладающий повышенной разрешающей способностью метод получения двух пигментов в системе FPLC с помощью анионобменной хроматографии в нарастающем градиенте концентрации Ыа-ацетатного буфера. В примененной системе С- и CU-фикоэритрины разделяются, образуя два четко разрешающихся хроматографи-ческих пика. Найденный CU-фикоэритрин образован а- и р-лолипептида-ми, имеющими мол. массу 21 и 22 кДа соответственно. Соотношение фико-уробилиновых и фикоэритробилиновых хромофоров на (сф)-мономере пигмента оказалось равным 1:1. По расчетной оценке, CU-фикоэритрин несет
450
5оо
550 (09 m
«О 500
}j0 мо d*
Рис. 1. «) Спи» ххжпкхОГВ строек*« кап» них, хомлгатяо е»*-»нхкк с жлояротмион. «опбялмюи 1) фгеоэритробклхн; 2) <ихо-уробялкм (Qlazor. 1989)5
в) сямстры поглотан»* си-4ихоэрктрик* цкахобмтсрга Oscllia torta ар. R3-21 » 0,005 К Ка-вкфатмж бу^рнеж рмт»ор« рН 7.0 (1) х поел» дматурацм a рветвср» 8 М мочевкхи рН 3.0 (21:
в) еа«ггри поглоцчкхя Си-фнкоэ^триив. UI к С-<тсоэритр»н» 12) пиыю<а*т«р«к О.аппа« в 0,005 К Нв-фоеф»тмо* буферном раствор» рЯ 7.0 (сокршцмшжг РЕВ - «ккоэрмтрови™*, piJB - фкквуробхдяя).
а)
с-ч 1« СП
с-ч МП
MU ж m
ОМ) ОМ1 ем» см)
е-»
е-«
ütt-щ im-ю с-<а
«М чл <n ж
« s « i
6) и» м> MI м
е-я wa ма m
ж т «а м т
i X i < 9
9ме. г. Схми пнпамтюк тч-го» флсовилксож (coi«t«hhD 4н-хобилкпротмноа) у цииобит«-рий (а) к краем» »едоросмй <в). СО*рвЩ0!Ш*1 мц - *лло«м-КОфШХИМ: *ЭЦ - (НХОЭрПрООК-«*н; С-4Ц - C-tKX0t9(*ii*iif П-«Ц - R-fmnqxaiM*: H-IX «Ц - R-Ц (юсоцяатт; Я-III *Ц - R-III «к. водааниш В-43 - B-t*xo3p«Tp«ni: С-«Э - С-еотгазрктрин I CU-43 - CU-««KospNTjaiitdi): Й-*Э - Я-фпоэ-рктрмк.
Рис. 3. а) Разделение полхпвптидюос• . субъедикхц. Е-фсхоэрмтрина водоросли С.- corymbosua кетодои обращекнофазовоА- хрохатогра{«и ' а систем»: FPLC . с двойной. -регистрацией хроютографиесхих ' вихов "по белку" при 280 их и "по хрохофору" при 555 юс; •
б) слектри. поглоцекнл. f-субъедишщ К-фпсоэритрина в. 8 . М кислой мочевине1 1 - у-субъоданица'- пигкеята водоросли С. corymbosum; 2 -7~субъ«давица. вигхектк. водоросли. Д - spars tum
в) идентя4акадкг. трех- • 7-полхпептидоа R-фикоэритрина водоросли С. corymbosum с похоцыо SDS-электрофореза в полиахрилахиднои геле.
кУ
Рис. Уменьшение размеров фикобилисои под действие» света и свя-
занное с эти» изкенеяи» молярного соотношения 7_полипв'гп<дов Н-4и-хоэритркка. Использована кодель полудисховидной фикобилисоим
(*7еЪппеуег. 1977). Центральна* часть фехобилисоим, ядро, состоит из трех цилиндров аллофосовд&нина, к ним в перпендикулярной направлении прчшхают весть бохових цилиндров, образована состикованныхи даскаки-гехсахарахи фикоциаиина (штрихованные прххоугольккхи) и Й--фехоэритрина (светлив прямоугольники). Диски стыкуются благодаря Т-субъедиииц&х, выполняххции роль связующих белхов (обозначен» палией хвадратахи и пронумерованы).
три группы фикоуробилина и три - фикоэритробилина. У известных CU-фи-коэритринов других цианобактерий, включая G. violaceus, соотношение двух хромофоров составляет 1:5, 1:2, 2:3, 2:1 или 4:1 (Ong etal., 1991). Ни одно из них, как и соответствующие спектры поглощения, не совпадают с полученным для пигмента О. аллае. Установленный состав хромофоров свидетельствовал об обнаружении нового пигмента из группы CU-фикоэритри-нов [44, 46].
Семейство CU-фикоэритринов было пополнено новым белком-пигментом, а цианобактерии, сочетающие наличие С- и CU-фикоэритринов, дополнены первым пресноводным представителем. Редкость подобного сочетания у цианобактерий делает важным каждый новый случай и требует дальнейшего пигментного скрининга, прежде всего среди представителей рода Osclllatoria.
Обнаружение новых пигментов фотосинтеза представляет, на наш взгляд, несомненный самостоятельный интерес. Вместе с тем находка нового фикобилипротеина расширяет представления о световой приспособляемости цианобактерий. Присутствие двух красных пигментов увеличивает спектральную область поглощения клеток, что существенно для функционирования пигментного аппарата фотосинтеза.
С использованием перечисленных для CU-фикоэритринов соотношений хромофоров можно сформулировать принцип образования фикобили-протеинов: разнообразив белков-пигментов создается как результат сочетаний нескольких фикобилинов. Фикобилипротеины можно рассматривать как "мозаику", созданную природой из билиновых хромофорных групп, находящихся на гомологичных (сф)-апопротеинах. Особенно очевидно проявление этого принципа у фикобилипротеинов, для которых известно положение хромофоров в первичной структуре полипептидов (см. далее, Табл.1). У цианобактерий и красных водорослей сочетания четырех различных фи-кобипиновых хромофоров создают около 15-ти различных фикобилипротеинов (см. [1, 2]).
В клетках цианобактерий и красных водорослей фикобилпротеины объединены в фикобилисомы - надмолекулярные структуры с мол. массой 6-15 миллионов дальтон. Их обязательным компонентом является алло-фикоцианин; кроме него, как считалось, могут присутствовать лишь один или два других фикобилипротеина, в том числе - фикоэритрин. С учетом наших [33, 35, 44, 46] и других работ (Рапу, 1988; Ong & Glazer, 1991), пока-
завших воможность присутствия в клетках цианобактерий двух разных фи-коэритринов, можно предложить три пигментных типа фикобилисом: с двумя, тремя или четырьмя различными фикобилипротеинами [1]. Поскольку каждая из таких групп может представлять собой комбинацию разных фи-кобилипротеинов, то соответствующих пигментных подтипов реализуется значительно больше (Рис. 2). Обилие различных фикобилисом является проявлением широких возможностей филогенетической световой адаптации у цианобактерий и красных водорослей.
2. Полипептидный и хромофорный состав R-фикоэритринов
R-фикоэритрин - важнейший пигмент красных водорослей, обуславливающий их название и окраску. Было известно, что данный тип фикоэ-ритринов наряду с а- и (5-полипептидами содержит у-субъединицы с мол. массой 30 кДа и молярным отношением 1:6 к сумме а- и ß-субъединиц. Хромофорами R-фикозритрина, судя по спектрам поглощения, являются фикоуробилин и фикоэритробилин. Существовали косвенные данные о том, что R-фикоэритрин, возможно, имеет более одного у-полипептида. Требовалось определение полипептидного и хромофорного состава этого пигмента, причем ко времени наших исследований отсутствовали методы хро-матографического разделения у-полипептидов.
Для разделения a-, ß- и у-полипептидов R-фикоэритрина нами использовано четыре хроматографических метода: 1) хроматография на катио-нобменном носителе Bio-Rex 70 в растворе 8 М мочевины, pH 3,0; 2) распределительная хроматография в системе FPLC на колонке Superóse 12 HR 10/30 в том же растворе; 3) катионобменная хроматография в системе FPLC на колонке Mono S HR-5/5 в нарастающем градиенте концентрации кислой мочевины; 4) обращеннофазовая FPLC-хроматография на колонке Ultrapore RPSC в системе растворителей изопропанол/ацетонитрил. Исследованы R-фикоэритрины черноморской красной водоросли С. coiymbosum и водоросли из Японского моря A. sparsum. Большое число методов связано с тем, что а- и ß-полипептиды можно получить любым из них, в то время как у-субъединицы удалось разделить лишь с помощью двух последних. Двойная регистрация хроматографических пиков, "по белку" при 280 нм и "по хромофору" при 555 нм, позволила получить соотношение белка и хромофоров для каждого полипептида (Рис. За).
Число хромофорных групп, связанных с субъединицами, было рассчитано, как и в рассмотренных выше случаях CU-фикоэритринов, исходя из измерения спектров поглощения хроматографически разделенных полипептидов в 8 М кислой мочевине и известных в этих условиях коэффициентов экстинкции фикоуробилина и фикоэритробилина. Установлено, что а-полипептиды R-фикоэритрина водорослей С. corymbosum и A. sparsum несут по два фикиэритробилиновых хромофора, что совпадает с хромофорным составом а-полипептидов у В- и С-фикоэритринов. Состав ß-субъединиц оказался иным: они содержат три хромофорные группы, два фикоэритробилина плюс один фикоуробилин [27]. Аналогичные данные о хромофорном составе а- и ß-субъединиц были получены для R-фикоэритрина багрянок Gastrctonium coutteri (Klotz and Glazer, 1985) и Nemalion helmin-toides (Cheng and Chang, 1990), однако содержание хромофоров и число у-субъединиц R-фикоэритринов по-прежнему оставалось неизвестным. В ходе дальнейших экспериментов у R-фикоэритрина C.corymbosum нам удалось выделить три у-полипептида с мол. массой 32, 31 и 29,5 кДа соответственно (Рис. За и Зв). Они входят в состав белка в соотношении 1:5:2 и в суммарном молярном отношении 1:6 ка- и ß-полипептидам. У R-фикоэритрина A. sparsum также были обнаружены три у-субъединицы. Установлено, что у-полипептиды содержат по пять хромофорных групп, причем состав хромофоров трех у-субъединиц пигмента С. corymbosum одинаков: три фикоуробилина и два фикоэритробилина. у,-Полипептид R-фикоэритрина A. sparsum идентичен по набору хромофоров пигменту С. corymbosum, в то время как у,-субъединица несет четыре фикоуробилина и один фикоэритробилин (Рис. 36). (Состав у}-лолипептида остался невыясненным) [43, 50].
Известно, что у-субъединицы наряду со светосбором выполняют роль линкерных полипептидов, обеспечивающих порядок объединения имеющих дисковидную форму (ар)-гексамеров R-фикозритрина в цилиндрические элементы фикобилисом. Поэтому данные о том, что сумма трех различных у-полипептидов R-фикоэритрина соотносится с суммой а- и ß-субъединиц как 1:6, полностью соответствует молекулярному строению фикобилисом-ных цилиндров. Из соотношения у,: у 2: у3, равного 1:5:2, следует что гекса-меры R-фикоэритрина, имеющие структуру вида (aß)ey,, (aß)6Yz и («ß)6y3, находятся в фикобилисомах в разных количествах. Число (сф)6у-гексаме-ров в фикобилисомах регулируется интенсивностью света. Из наших данных следует новый вероятный механизм пигментной световой адаптации
фасных водорослей. Как известно, ¡n vivo с увеличением освещенности исчезают наружные гексамеры фикобилисомных цилиндров. Так как расположение гексамеров в цилиндрах регулируется у-субъединицами, то ясно,что у R-фикоэритрина с утратой, например (оср)6у,-гексамера возрастает доля (оф)6У 2- и (сф)6у3-злементов (рис.4). Следовательно, хромофорный состав R-фикоэритрина в клетке из-за разного содержания фикоуро- и фикоэрит-робилина на у-субъединицах будет меняться в зависимости от освещенности. Подтверждением этому служит не получавшее ранее объяснения наблюдение, что доля фикоуробилина в пигменте Callithamnion roseum незначительно (на несколько процентов), но достоверно изменяется, если водоросли выращиваются на свету разной яркости (Yu et al., 1981).
3. Фосфоресценция фикобилипротеинов
Фикобилипротеины, как и другие антенные пигменты, интенсивно поглощая свет, должны обладать устойчивостью к фотодеструкции. Последняя связана с фотохимической активностью и образованием триплетных состояний пигментов. Формирование триплетов хорошо известно у циклических тетрапирролов (см. Соловьев и др., 1985) и хлорофиллов (см. Kras-novski Jr., 1993). При этом протектором фотопревращений хлорофиллов в клетке служат каротиноиды, а фикобилипротеины как водорастворимые белки лишены подобной защиты. Триплетные состояния фикобилинов и других линейных тетрапирролов оставались неизвестными. Мы исследовали фосфоресценцию фикобилипротеинов как вид излучения, связанный с дезактивацией триплетов. Измерение спектров фосфоресценции позволяет получать непосредственную информацию об энергии триплетных уровней молекул и предоставляет дополнительные возможности для исследования спектральных свойств и функционирования пигментов в растении.
На спектральных установках, снабженных фосфороскопами, были зарегистрированы и исследованы спектры замедленной люминесценции R-фикоэритрина (С. corymbosum). При 77 К спектр содержал по крайней мере две полосы излучения (720 и 820 нм) и был сдвинут в длинноволновую сторону относительно спектра флуоресценции (максимум при 581 нм ) (Рис.5). Время жизни возбужденного состояния для двух названных полос составило 2,5 и 6,0 мсек соответственно.
Обнаруженная замедленная люминесценция является фосфоресцен-
цией связанных с белком фикобилиновых хромофоров. В пользу данной интерпретации свидетельствуют значительное длинноволновое смещение максимумов излучения по сравнению с флуоресценцией R-фикоэритрина, линейная зависимость его интенсивности от интенсивности возбуждающего света и милписекундное время затухания послесвечения [41,42,45].
Квантовый выход фосфоресценции составил 1,6 Ю-6 и был в 50.000 раз меньше квантового выхода флуоресценции. Спектр возбуждения фосфоресценции имел три пика: 498, 541 и 566 нм, характерных и для спектра поглощения. Однако относительная интенсивность полос отличалась от наблюдаемой в спектре поглощения или в спектре возбуждения флуоресценции и зависела от длины волны регистрации (Рис. 5). Это указывало на принадлежность свечения по крайней мере нескольким различным хромо-форамным группам. /На (ар)6у-гексамере R-фикоэритрина находится 35 хромофорных групп/.
В результате денатурации R-фикоэритрина квантовый выход флуоресценции падал в 15 раз, в то время как фосфоресценция возрастала на два порядка при практически неизменном квантовом выходе. В этих условиях возгорание послесвечения должно означать рост доли триплетных состояний у возбужденных молекул. Повышенный выход триплетов коррелирует с хорошо известным увеличением фотохимической активности фи-кобилипротеинов, происходящем при денатурации.
Стократное усиление послесвечения естественно связать с изменением геометрической формы хромофорных групп. Известно, что билины, в отличие от порфиринов и других замкнутых тетрапирролов, являются молекулами с легко меняющейся геометрией. В нативных белках поддерживается вытянутая форма хромофоров, а в денатурированных билины приобретают энергетически более устойчивую псевдоциклическую форму (Рис. 5в). Обнаруженный эффект послесвечения мы предлагаем для вероятного объяснения причин поддержания вытянутой, линейной конфигурации хромофоров у фикобилипротеинов /л vivo: обеспечивается более высокая фотостабильность этих антенных пигментов. Эффект объясняет также наличие ковалентной связи хромофоров и апопротеина. При нековалент-ном связывании невозможно обеспечить поддержание менее энергетически выгодной, но более фотостабильной линейной конфигурации.
Поиски послесвечения у других фикобилипротеинов показали, что В- и С-фикоэритрины имеют сходные параметры фосфоресценции. Замед-
ленное излучение не обнаружено у аллофикоцианина и С-фикоцианина. Возможно, квантовый выход фосфоресценции у этих синих пигментов значительно ниже, чем у фикоэритринов, или спектр излучения существенно смещен в длинноволновую область, где чувствительность спектральной установки не позволяла надежно регистрировать послесвечение. Полученные данные - первый случай обнаружения фосфоресценции у линейных тетралирролов.
4. Спектры поглощения фикобилипротвинов.
По сравнению с отделенными от белка пигментами в разбавленном растворе два главных фактора определяют форму спектров поглощения пигмент-белковых комплексов: хромофор-белковое и хромофор-хромофорное взаимодействия. У фикобилипротвинов последнее не играет заметной роли из-за достаточно больших (20 и более А, по данным рентгеноструктур-ного анализа) расстояний между хромофорами (Sauer & Schser, 1988).
Как известно, (ар)-мономер С-фикоцианина несет три хромофорные фикоцианобилиновые группы, ковалентно связанные с а-82, р-84 и ß-1 S5 цистеиновыми остатками. Благодаря индивидуальным хромофор-белковым взаимодействиям каждая из трех групп имеет собственную полосу поглощения с максимумами при 617, 598 и 622 нм соответственно, а суммарный спектр трех названных полос совпадает со спектром поглощения нативного С-фикоцианина (Sauer, 1987). Таким образом, спектр поглощения одного и того же хромофора (фикоцианобилин) в составе нативного фикобилипро-теина определяется тем, с каким остатком цистеина в конкретном участке полипептидной цепи ковалентно связана хромофорная группа.
Для фикобилипротвинов, содержащих на (ар)-мономере по три хромофорные группы, их состав и локализация в первичной структуре известны (Табл. 1). Мы исследовали структуру спектров поглощения "трвххромо-форных" фикобилипротвинов, основываясь на изложенных выше данных для С-фикоцианина и особенностях расположения фикобилинов на апо-протеиновой матрице. Главной из них является фиксированное в аминокислотных последовательностях положение цистеиновых остатков, с которыми соединены хромофоры. Были рассмотрены спектр С-фикоцианина, полученного нами из водоросли Synechococcus 6301, а также спектры R-фикоцианина, фикоэритроцианина и R-фикоцианинов II и III, приведен-
Таблица 1. Хромофорный состав фикобилипротеинов, содержащих на (ар)-мономере аполротеина по три хромофорные группы (см.[1,2])
Хромофоры, связанные
. с цистеиновыми остаткоми
Фикобилипротеин
а- и ß-субъединиц
сс-82 ß-«4 ß-155
С-фикоцианин PCB PCB . PCB
R-фикоцианин PCB PCB РЕВ
фикоэритроцианн CPV PCB PCB
R-фикоцианин II РЕВ PCB ■ РЕВ
R-фикоцианин III PUB PCB PCB
Использованные сотфащвнияс
PCB - Фикоцианобилин РЕВ - фюсоэритробилин PUB • фмсоуробклин CPV-крилтовиолин
ные в работах (Glazer & Hixson, 1975; Kufer & Bjom, 1989; Ong & Glazer, 1987; 1991).
Моделирование (разложение спектров на три составляющие компоненты) проведено с помощью микрокалькулятора, так как значительная асимметрия и индивидуальность каждой компоненты не позволяли, как показали предварительные оценки [17], использовать ЭВМ-программы моделирования, предназначенные для симметричных полос. При моделировании сделано априорное предположение, что полоса поглощения любой хромофорной фуппы остается неизменной в составе спектров разных фико-билпротеинов, если хромофор занимает одно и то же положение в первичной структуре. Например, ß-84-фикоцианобилин (Табл. 1: PCB, 2-я колонка) обладает одними и теми же спектральными характеристиками у любого из названных выше фикобилипротеинов. Полоса, принадлежащая ß-155-фикозритробилину (Табл. 1: РЕВ, 3-я колонка) у R-фикоцианина и R-фикЬ-цианина II должна быть одинакова и т.д. Для подобного предположения служили следующие обоснования: 1) высокая, достигающая 80%, степень гомологии первичной структуры фикобилипротеинов; 2) консервативные третичная и четвертичная структуры фикобилипротеинов (см. [1,2]). Иными словами, предполагалось, что благодаря глубоко выраженному сходству молекулярного строения этих белков хромофор-белковые взаимодействия также являются стабильными настолько, что приводят к сохранению формы спектра каждой хромофорной группы в разных фикобилипротеинах.
Было показано, что спектр Я-фикоцианина может быть описан как сумма полос а-82 и р-84-фикоцианобилиновых групп плюс спектр р-155 фикоэритробилина (Рис. 6). При этом спектральные характеристики двух первых хромофоров.совпали в пределах ошибки моделирования с характеристиками, известными для них в составе С-фикоцианина. Аналогично спектральный контур фикоэритроцианина может быть составлен из спектров поглощения р-84 и р-155 фикоцианобилиновых хромофоров и спектра крип-товиолина, связанного с а-82-цистеиновым остатком. Подобное моделирование оказалось возможным и для спектров двух остальных фикобилипро-теинов (Табл. 1), [53].
Данные Табл. 1 наряду с рассмотренными выше данными для си-фикоэритринов свидетельствуют, что каждый фикобилипротеин представляет собой апопротеиновый каркас, предназначенный для складывания "мозаики'.из различных хромофоров (Рис. 6). Хромофорной "мозаике", как рассмотрено в данном разделе, полностью соответствует "мозаика" спектров. Следовательно, для фикобипипротеинов необходимы сведения не только о хромофорном составе и числе хромофорных групп, но и о положении каждой группы в первичной структуре, а спектр поглощения каждого фико-бипипротеина можно рассматривать как сумму спектров его хромофорных групп.
5. Фикобилипротеины и Хл а/с-протеин - антенные комплексы криптофитовых водорослей
Криптофитовые водоросли (криптофиты) - уникальные жгутиковые организмы, хлоропласты которых содержат два антенных комплекса: Хл а/с-протеин и фикобилипротеины. В отличие от цианобактерий и красных водорослей фикобилипротеины криптофит не образуют фикобилисом и в мелкодисперсном состоянии примыкают не к наружной, как фикобили-сомы, а к внутренней стороне тилакоидной мембраны.
5.1. Взаимодействие фикобилипротеинов и Хл а/с-протеина в хлоропластах криптофитовых водорослей
Антенные комплексы оксигенных фотосинтетиков являются преимущественной принадлежностью фотосистемы II. У криптофит при наличии
Рис. S. а) Спектр возбуждения флуоресценции (совпадает со спектром поглощения) (1) и спектры возбуждения фосфоресценции Н-4*гхоэритрина водоросли С. согутЬозит при 77 К: область регистрации фосфоресцец-ции - 730 их (2) и 840 як (3);
б) спектр флуоресценции (и» зависит от длины волю) возбуждения ) (1) и спектры фосфоресценции R-фикозритрииа (7T) при возбуждении излучения в области 500 ни (2) и 570 нх (3)!
в) изменение геометрической Форш) молекул у Фихобилинових хромофоров при денатурации {«-кобилипротекков (Kufer & Scbeer, 1979).
О »)
Рис. б. а) Спектри поглощения С-ф«хоцианина и Я-фпоцца-нкна, моделируемые индивидуальны!« полосами поглощения содержащихся в них хромофоров;
5) расположение хромофорных групп (выделен« крутками) в полых дисках, образуемых (Сф )-тримерами названию« белков. Схемы тримеров представлены в соответствии с рентгенострук-туртши данными (ЗсМгтег «Ь а1., 1987). согласно которых {С(р)-мономеры имеют форму неправильных. примыхаяцих друг х другу полудуг. Замена 0155-4«-хоцианобилина (ЯСВ) в С-4*хо-циаиине на Р155-<«коэрутро<5и-лин (затененный кружок) в Я-фи-фикоцианике происходит с сохранением геометрического положения хромофоров.
* С-фпдашш х >4|цш1ш Л
Г /I
- № 1 ^>1 К1 1
S00 800 700 ы Soo 6С0 700 »
Рис. 7. Cncjnpu возбуждения Флуоресценции тилахоидюое иеа-брлн Chrooaonas ер. ори р&эюк дотах воля регистрации излучения: 665 ям - (1 ), 69S юс -(2) и 720 ни - (3). 77 К; я» встдвхе: изкекехив соотношения пасхииумов, прии&длвяирос в спектрах воабуздения хлорофиллу с (¿£0 юО к хлорофсллу 4 (42S к») в зависимости от дли-1Ш волн« регистрации излучения.
а)
'1__
400 МО СОО 7ТОМН
<5)
• и I» » в га м
время элшяя (мин)
<н m м mm
ftre. 3. Споктри оогоекетм морофиио»
с > дхэтидокж эф<Р* (—
-) к их емми-юившс прокзмдевос. ♦•о«ор<Чгдо», в 90* иргам (- -
- ] ; ») море««« in хршпо«мтомА »одо росл* Chrocoona* «р. 4) хлорофии ct кз хршгтофгтомй »о до росл* Cryptoaonaa macuiata. R» »с Гансах вр«дст*амш я умяпопе» UC>m4o жросш обдаст» во-гломо» пигимгго». «сводиуомя щж »дпггаипм««.
») Хромтогрккя > CMCTW9 HPLC и псшлипок« «оектмо o<io-rutoima хлор<ха<иш с цтпш wttpucro» к* жрюпо<*101их м-доромА « дтоп* орк 450 т >) Отсоопля ■ ар.) г) Cryptooonaa macuiata'- 1 • хлорозам 2 » хлорацсд* с,. 3 » «хорошим с^ .
- продукта догроддом хлероемлоа е.
д) Ххк*1»схо# стромлг« хлорофшп е. В от««*» от другхх тявоа хлорофмло» но содержит («той. копир D >• меетиоммо.
Двух светособирающих комплексов возникает естественный вопрос о связи каждого из них с фотосистемой I или II. Предполагалось, что хлорофилл с, который поглощает свет в клетке в области 640 нм, являющейся промежуточной между поглощением хлорофилла а и фикобипипротеинов, выступает посредником в передаче энергии от последних ко второй фотосистеме. Прежние спектральные данные не исключали посреднической роли Хл а/с-протеина (Lichtle, 1977).
Были исследованы два вида криптофитовых водорослей: Ctyptoma-nas macúlate и Chroomonas sp. Известно, что при низких температурах фотосистема I обладает более длинноволновой флуоресценцией, чем фотосистема II. Регистрируя спектры возбуждения при разных длинах волн флуоресценции, можно выявить связь антенны с каждой из фотосистем. Полученная для целых клеток зависимость спектров возбуждения от длины волны флуоресценции ясно свидетельствовала, что у обоих видов водорослей фикобилипротеины передают поглощенную энергию фотосистеме II. Эти результаты полностью соответствуют роли фикобипипротеинов у.циано-бакгерий и багрянок. Для выяснения направления миграции энергии от Хл а/с-содержащего комплекса клетки водорослей с помощью осмотического шока были освобождены от фикобипипротеинов, частично экранирующих полосу Соре хлорофилла с (462 нм). Как показала зависимость спектров возбуждения от длины волны регистрируемой флуоресценции, Хл а/с-протеин у С. maculata также передает энергию преимущественно фотосистеме II, в то время как у Chroomonas sp. Хл а/с-содержащий комплекс связан с фотосистемой I (Рис.7), [47].
Соотношение хлорофилл с : фикобилиновые хромофоры : хлорофилл а у С. maculata составило 0,3:1,0:1,0; у Chroomonas sp. оно равнялось 0,1:1,0:1,0. В последнем случае, соответствующем связи хлорофилла с.с фотосистемой I, его содержание относительно хлорофилла а оказалось втрое уменьшенным. Однако два вида водорослей содержат разные фикобилипротеины: фикоцианин-645 (Chroomonas sp.) и фикоэритрин-566 (С. maculata). Сопоставление спектров поглощения двух фикобипипротеинов показало, что сниженное содержание хлорофилла с у Chroomonas sp. в клетках полностью компенсируется увеличенным по сравнению с фикоэ-ритрином-566 поглощением фикоцианина-645. Таким образом, взаимодействие двух антенных комплексов заключается в поддержании баланса све-топоглощения фотосистемами. При этом Хл а/с-протеин и фикобилипро-
теины поглощают свет в разных спектральных участках, что расширяет возможности световой адаптации водорослей.
Миграция энергии от хлорофилла с к фотосистемеме I у Chroamonas sp. означает, что Хл а/с-протеин не может служить посредником между фикобилипротеинами и фотосистемой II. Энергия от фикобилипротеинов передается к фотосистеме II напрямую. Кроме того, очевидно, что мелкодисперсный слой фикобилпротеинов в хлоропластах криптофит обладает внутренней структурированностью, заключающейся в примыкании этих пигментов к тилакоидной мембране в областях локализации фотосистемы II [47].
5.2. Разнообразие хлорофиллов с у криптофитовых водорослей
Хл а/с-протеины хромофитных водорослей характеризуются разнообразием хлорофиллов с. Наиболее известны хлорофиллы с, и сг. Большинство исследованных видов водорослей содержат наряду с хлорофиллом а либо хлорофилл с3, либо оба пигмента. У всех изученных ранее видов криптофит был найден только хлорофилл с2. В последние годы у представителей примнезиофитовых, хризофитовых и празинофитовых водорослей обнаружены новые хлорофиллы с: хлорофилл с3, хлорофилл с4 и хлорофилл Cj (нередко именуется в соответствии с химической формулой как MgDVPP - Мд-2,4-дивинилфеопорфирин aä мо-нометилэфир) (Jeffrey, 1987; 1989; Fawley, 1989). Это так называемые минорные пигменты, присутствующие в клетках в отличие от хлорофиллов с, или с2 в очень малых количествах. Очевидно, что группа хлорофиллов с является гораздо более сложной, чем представлялось ранее, а Хл а/с-протеины представляют собой семейство антенн с недостаточно изученным составом пигментов. В связи с этим мы исследовали состав хлорофиллов с у криптофитовых водорослей С. macúlala, Cryptomonas S2 и Chroamonas sp.
Химические различия хлорофиллов с столь невелики, что эти пигменты остаются неразделенными в большинстве известных систем хроматографии. Пигменты не содержат фитола (за исключением хлорофилла с4), являясь значительно более полярными соединениями, чем другие хлорофиллы. До сих пор практически единственным методом их разделения служила тонкослойная хроматография на полиэтиленовом носителе (Jef-
frey, 1969). Мы использовали метод разделения хлорофиллов с на пластинках силикагеля в системе ацетон:петролейный эфир:диэтиловый эфир: метанол в соотношении 4:4:1:1, а также систему HPLC с теми же растворителями. Пигменты идентифицировали по спектрам поглощения в ацетоне и диэтиловом эфире и в дополнение по спектрам их безмагниевых производных (феопорфиринов) в ацетоне.
Было найдено, что С. maculata и Cryptomonas S2 в соответствии с ранее известным для криптофитовых водорослей содержат хлорофилл сг Третий вид, Chroomonas sp., вместо хлорофилла с2 нес хлорофилл с,, что стало первым случаем нахождения этого пигмента у криптофитовых водорослей. Кроме того, у всех трех видов был найден хлорофилл cg (Рис. 8), ранее известный только у празинофитовых, другой группы жгутиковых водорослей, и прохлорофитных фотобактерий. Доля найденного хлорофилла с{ оказалась очень мала и составила 1-1,5% от содержания хлорофилла а [51]. Это типичный минорный хлорофилл с.
Очевидно, что присутствие различных хлорофиллов с имеет важное значение для систематики хлоропластов у хромофитных водорослей. К настоящему времени более 100 видов водорослей исследовано на наличие хлорофиллов с (см. [51]). С учетом наших данных известны следующие сочетания, включающие минорные пигменты этой группы: Хл с, + Хл с2 + Хл с3 (Prymneslum parvum), Хл с, + Хл с2 + Хл с4 (Pavlova girans), Хл сг + Хл с3 + Хл с, (Emiliania huxleyi), Хл ct + Хл cs {Chroomonas sp.), Хл c2 + Хл c6 (С. maculata и Cryptomonas S2), а также Хл 6 + Хл cf (Mantonlella squamata).
Различия в положениях как синего, так и красного максимумов поглощения у хлорофиллов с не превышают нескольких нм, что требует особенно тщательной спектральной идентификации этих пигментов. Распространение у водорослей минорных хлорофиллов с вследствие их небольших спектральных различий и крайне малых относительных количеств остается почти не изученным. По крайней мере в случае М. squamata показано, что хлорофилл cs не является промежуточным продуктом метаболизма, а входит в состав Хл а/Ь/с-содержащего пигментного комплекса (Wilhelm, 1989). Проблема появления множественных форм хлорофиллов с анализируется нами далее (Раздел IV).
II. Пигмент-белковые комплексы, содержащие циклические тетрапирролы - хлорофилл а и его аналоги
В отличие от фикобипипротеинов, связь циклических тетрапирролов, хлорофилла а и его аналогов, с апопротеинами ¡n vivo является некова-лентной. Биохимическое исследование подобных комплексов требует значительно более мягких по сравнению с фикобилипротеинами процедур выделения и практически никогда не дает полных гарантий 100%-сохране-ния всех хромофорных групп в состоянии связи с апопротеином. Поэтому особое значение приобретают спектральные методы исследования, позволяющие судить о содержании и молекулярной организации хромофоров в комплексах. Так как спектры поглощения и флуоресценции пигмент-белковых комплексов являются многополосными, то для выявления отдельных полос и определения их параметров понадобилась разработка ряда специальных спектральных методов.
Был впервые реализован метод производной низкотемпературной флуоресцентной спектроскопии, с помощью которого установлена сложная структура спектров флуоресценции хлорофилла а и его аналогов в клетке [6-9, 11], подобная вывленной ранее в спектрах поглощения (Литвин, Гуляев, 1969).
Для решения вопроса о соответствии парных полос в многокомпонентных спектрах поглощения и флуоресценции комплексов было использовано универсальное соотношение (соотношение Степанова), устанавливающее связь между отдельными излучающими и поглощающими центрами. .Формула соотношения имеет вид (Степанов, 1957):
W/tf = D(T)v3e~hv/kT.
Здесь W - мощность испускания, ü - коэффициент поглощения, v -частота, Т - абсолютная температура, h - постоянная Планка, к - постоянная Больцмана, D(T) - коэффициент, зависящий от температуры. В подобном неявном виде формула не пригодна для исследования многокомпонентных спектров. Поэтому мы использовали универсальное соотношение в виде, к которому оно преобразуется для полос гауссовской формы (Каза-ченко, 1965):
2
стоксовский сдвиг 6 = vmri - v^ = b hc/8kTIn2.
Здесь v[wn - максимум поглощения, v - максимум флуоресценции, b - полуширина полос и с - скорость света.
24
При применении последней формулы нет нужды в вычленении из спектра полного контура каждой из исследуемых полос, а достаточно знания их полуширины и положения максимумов поглощения и флуоресценции. Данные параметры были получены при регистрации производных спектров. В результате было установлено, что стоксовский сдвиг для большинства полос, принадлежащих In vivo хлорофиллу а, при 77 К не превышает 5-8 нм [16]. Из наших данных следовало, что при прежней, качественной оценке величины стоксовского сдвига она существенно завышалась (Brown & French, 1961; Cho & Govindgi, 1970). Дальнейшее изучение показало, что универсальное соотношение соблюдается, а стоксовский сдвиг характеризуется малой величиной и в спектрах аналогов хлорофилла а в клетке: бак-териохлорофилпа а, протохлорофилла и др. [20, 28].
Как известно, соблюдение соотношения Степанова означает, что испускание флуоресценции происходит из состояния установившегося ори-ентационного равновесия между возбужденной молекулой и средой. Молекулы среды успевают принять конфигурацию, равновесную в ориентацион-ном смысле по отношению к молекуле хромофора за время жизни ее возбужденного состояния. В случае пигмент-белковых комплексов средой служат аминокислотные остатки апопротеина и молекулы воды, входящие в микроокружение хромофорных простетических групп. Вероятно, достижение ориентационного равновесия является необходимым условием переноса энергии между пигментами комплексов.
Было осуществлено ЭВМ-моделирование многокомпонентных спектров комплексов. Для минимизации известной (Грибов, 1965) неоднозначности решения обратной спектральной задачи была предложена идея совместного моделирования спектров поглощения и флуоресценции комплексов. Сущность предложенного метода состояла в выборе из множества получаемых математических решений одного, отвечающего накладываемым условиям-ограничениям, которые заключались в следующем: 1) универсальное соотношение соблюдается для каждой пары полос в двух типах спектров; 2) попарно связанные полосы поглощения и флуоресценции имеют одну и ту же полуширину; 3) имеющиеся в спектрах хлорофилла а и его аналогов сателлитные колебательные полосы отстоят от соответствующих основных полос на одно и то же фиксированное расстояние и связаны с ними фиксированным соотношением полуширин и амплитуд; 4) в качестве нулевого приближения, т.е. в качестве исходных данных для моделирова-
ния избирается число полос, предварительно выявляемых в исходных и производных низкотемпературных спектрах поглощения и флуоресценции. Наиболее жестким в предложенном методе, резко ограничивающим неоднозначность моделирования, является соблюдение универсального соотношения. С использованием созданного метода были разложены на компоненты и проанализированы спектры поглощения и флуоресценции различных пигмент-белковых комплексов [13, 15, 19, 28].
1. Комплекс бактериохлорофилл а-протеина зеленых бактерий
Бхл а-протеин зеленых бактерий служит посредником в передаче энергии отхлоросом к реакционным центрам Р840. Комплекс содержит единственный тип пигмента - бактериохлорофилл а, и состоит из одного вида полипептидов (358 аминокислотных остатков). Водорастворимость Бхл а-протеина связана с его нахождением в примыкающей к мембране кристал-лоподобной базальной пластинке. К началу наших исследований спектры поглощения и кругового дихроизма Бхл а-протеина были интерпретированы в терминах экситонного взаимодействия молекул бактериохлорофилла а, образующих пигментные агрегаты на полипептидах комплекса (Philipson &. Sauer, 1972). На это указывали значительное сужение полос пигмента в спектре поглощения комплекса по сравнению с полушириной полосы в растворе и наличие консервативных полос большой вращательной силы в спектрах кругового дихроизма. Моделирование спектров поглощения и кругового дихроизма гауссовскими полосами при 77 К позволило названным авторам выявить в них по пять компонент и сделать вывод, что каждая белковая молекула комплекса связана с пятью молекулами бактериохлорофилла а, объединенными в агрегат-пентамер.
В наших исследованиях был использован препарат Бхл а-протеина из Prostecochloris aestuarii. Некоторая контаминация хлоросомами не помешала спектральному изучению комплекса благодаря большим различиям в областях поглощения и флуоресценции бактериохлорофиллов а и с. Судя по исходным и производным спектрам поглощения препарата, в них при 77 К действительно удается зарегистрировать только пять полос. В производном спектре флуоресценции были выявлены четыре полосы. Совместное моделирование двух типов спектров было связано с перебором до сотни различных вариантов. Их анализ показал, что спектры поглощения и флу-
740 7<И 780 600 820. 849 860 ю
700 еоо ого мо обо ям ш
Ркс, 9. Смисло« идмхрсмт* 1Ш1Щ аотжащо« ш *я]ю»к-
ц«топ щ»п»р»т» тгшздешх >ы«ш блхтф* рш 4*>еи«-
ГЦ, овог*щ*пкег<з Вкл «-прететго«, пдесояеюпос с со&а»-
дмим утмрсмыюг» «няни (X - гаЦти гоищи, ■ а
■оцюсп »сгусюа«, V •• чмтотО, ТГ К| • ) сп«ггр игкпш, «)
са*хтр Фяуор*сй«1ЩП11
») пштпй гтич, 8« «-тост«п», во щи (тгпкщк-»п»юго *мла» (Г*пп» Ь К»и»«ч», 1979) .
оресценции комплекса невозможно описать только пятью полосами: либо не соблюдается соотношение Степанова, либо полуширина парных полос в двух спектрах различна, либо крайне низка точность моделирования. Рассмотрение варианта из шести пар полос также не дало положительных результатов. Минимальное число полос, описывающее оба типа спектров, оказалось равным семи (Рис. 9 а,б). Поэтому основным выводом проведенного исследования явилось утверждение, что Бхл а-протеин организован как совокупность агрегатов-гептамеров пигмента [9]. Энергия экситонного взаимодействия между молекулами гептамера, определенная из спектров как разность уровней 0-0 переходов, составила 80 см"1. В полном соответствии с теорией вырожденного основного состояния молекулярных агрегатов полуширина уединенной полосы оказалась в V 7 раз меньше, чем полуширина полосы мономерного бактериохлорофилла а в растворе. Соблюдение соотношения Степанова означало, что энергия электронного возбуждения быстро делокализуется между молекулами бактериохлорофилла а, образующими гептамер.
Бхл а-протеин стал первым закристаллизованным белком пигментного аппарата фотосинтеза, для которого число хромофорных молекул было
определено с помощью рентгеноструктурного анализа (Fenna & Mathews, 1975-1979; Tronrud etal., 1986). Из кристаллографических данных следовало, что Бхл а-протеин содержит, как было предсказано нами, семь, а не пять молекул пигмента (Рис. 9в). С появлением этих данных раннее спектральное исследование Бхл э-протеина (Philipson & Sauer, 1972) подверглось ревизии, для улучшения разрешения спектральных полос была использована температура жидкого гелия и показано, что спектры поглощения и циркулярного дихроизма этого комплекса действительно описываются семью компонентами (Olson, 1978; Whitten et al„ 1978; 1980). Тем самым полностью подтверждены наши результаты исследований Бхл а-протеина. Квантовомеханическое описание спектра поглощения Бхл а-протеина семью компонентами осуществлено на базе теории межмолекулярных эк-ситонных взаимодействий (Pearlstain, 1976; 1991; 1993), хотя для полного совпадения расчетов с реальными спектрами требуется скрупулезный учет влияния на каждую из семи хромофорных молекул ее индивидуального аминокислотного микрокружения. В последние годы термин "Бхл а-проте-ин" заменен "FMO комплексом", названном по инициалам авторов, проведших рентгеноструктурный анализ (Fenna & Mathews, 1975) и англоязычного автора, описавшего семью компонентами спектры комплекса (Olson, 1978).
2. Антенный комплекс В850 пурпурных бактерий
Белки комплекса В850 составляют до 50% мембранного протеина тилакоидов у пурпурных бактерий. Комплекс состоит из двух, обозначаемых как аир, полипептидов, содержащих по 45-60 аминокислот. Размеры полипептидов достаточны для однократного пронизывания фотосинтетической мембраны. По биохимическим данным, а-полипептид связан с одной молекулой и ß-полипептид - с двумя молекулами бактериохлорофилпа а (Sauer & Austin, 1978). Априорно комплекс В850 может представляться весьма простым: он имеет один тип пигмента, минимум хромофорных групп и низкую молекулярную массу полипептидов. Спектр поглощения комплекса состоит из двух полос, меньшей при 800-805 и большей - при 850 нм. Мягкой обработкой детергентами коротковолновая полоса может быть элиминирована при сохранении максимума 850 нм. В свою очередь длинноволновая полоса под различными воздействиями, например при изменении температуры, может менять свое положение в спектре, смещаясь на
10-15 нм, при неизменности полосы 800 нм. С учетом этих данных и хромофорного состава комплекса считалось, что комплекс В850 содержит пигментный мономер (полоса 805 нм) и димер (полоса 850 нм), находящиеся на (ар)-мономере апопротеина (Sauer & Austin, 1978; Cogdell & Thornber, 1979; Talsky et al„ 1980).
Комплекс B850 был получен с помощью препаративного электрофореза в полиакриламидном геле из мембран пурпурных бактерий Rhodobacter palustris. Спектральное исследование комплекса, заключавшееся в измерении исходных и производных спектров поглощения и флуоресценции при 293 и 77 К и моделировании спектров гауссовскими полосами, позволило выявить следующие закономерности. В соответствии с литературными данными (Москаленко, Ерохин, 1974), при понижении температуры до 77 К полоса поглощения 805 нм значительно сужалась, а длинноволновая полоса вследствие изменений во взаимодействии апопротеина и хромофоров претерпевала фасный сдвиг от 860 до 871 нм. Аналогично максимум флуоресценции смещался от 874 до 903 нм. Смещение максимумов в одном случае на 11, а во втором - на 29 нм мы интерпретировали как результат сложного, многокомпонентного харатера длинноволновой полосы. Согласно соотношению Степанова флуоресценция не могла быть связана с коротковолновой полосой поглощения 805 нм и полностью определялась длинноволновыми спектральными формами бактериохлорофилла а.
Коротковолновая полоса поглощения была разрешена в производном спектре на две: высокоинтенсивную при 806 нм и дополнительную при 790 нм. Еще две полосы, выявляемые в производном спектре, 756 и 771 нм, следовало рассматривать как колебательные сателлиты вышеназванных. Длинноволновая полоса оказалась разрешенной по крайней мере на три, 861, 872 и 891 нм; в дополнение к ним более коротковолновые полосы располагались в области поглощения колебательных сателлитов (Рис. 10а). Моделирование спектра поглощения и совместно с ним спектра флуоресценции подтвердило данные о наличии по крайней мере трех компонент в области широкой исходной длинноволновой полосы (Рис. 106, в) [28]. Аналогичные данные о присутствии трех-четырех слагаемых длинноволнового максимума 850 нм были получены позднее для спектра поглощения другой пурпурной бактерии, R. sphaeroides, измеренного при 4 К (van Dorssen et al., 1988).
Выявленный сложный характер полосы поглощения 805 нм показал, что она не может принадлежать мономеру пигмента. Соблюдение соотношения Степанова для компонент, составляющих полосу 860 нм, указывало на экситонную природу спектра и тем самым на его "агрегатное" происхождение. При этом наличие трех-четырех длинноволновых компонент в спектрах поглощения и флуоресценции комплекса В850 означало, что второй пигментный агрегат не является димером, а должен иметь более сложное строение. Очевидно, что в формировании спектральных свойств комплекса участвуют молекулы бактериохлорофилла а, находящиеся по крайней мере на двух или более (сф)-апопротеинах, что является важным отличием от формирования пигментных кластеров у фикобилипротеинов и бактерио-хлорофилл з-протеина.
Были предложены различные модели агрегатного строения комплекса В850, основанные на данных по измерению спектров поглощения, поляризации флуоресценции, линейного и кругового дихроизма (Breton et al., 1981; Kramer et al., 1984; Scherz & Parson, 1986). Вместе с тем исследование В850 представляет собой тот случай, когда несмотря на обилие всевозможных спектральных и биохимических данных, они недостаточны для построения молекулярной модели комплекса. Необходима кристаллография высокого разрешения, достаточного для локализации пигментных групп бактериохлорофилла а в апопротеине. После ряда предварительных данных (Pairitz et al., 1989), такие результаты были получены. Оказалось, что (сф)-белковые мономеры формируют надмолекулярную цилиндрическую структуру, в которой реализуются два пигментных кластера: кольцевой 9-мер бактериохлорофилла а, продуцирующий максимум 805 нм, и кольцо, состоящее из 18-ти молекул пигмента, которое обуславливает полосу поглощения 850 нм (McDermott et al.,1995). Расположение пигментов в двух кластерах существенно различается: в первом случае расстояние между пигментными молекулами достаточно велико, чтобы считаь зкситонное взаимодействие слабовыраженным, во втором - они тесно примыкают друг к другу (Рис. 10 г, д).
Квантовомеханический расчет спектра поглощения проведен для 18-молекулярного агрегата (Novoderezhkin & Razjivin, 1995). В силу кольцевой структуры агрегата большинство из 18-ти возможных экситонных полос являются вырожденными и не проявляются в спектре. Сохраняются лишь две основные по интенсивности полосы плюс одна или две минорные. Эти
Ркс. 10. (тори щваэкдяи сялтра южщтж хохшмхг» KS0 пур-uyjmw «ахтараА Я. paluetrit (а) я елтщ. «омотпяхх (4) к Ф»уо-рвсценпхх (в) того х* обмкга, разлох«то>* iu асхххатргата rajre-
«кт хокпохмти с соблядмхи умаареалиого соотхоагам, TT_К.
Молвхул.трмоа стро«*хв хоииакса BOSO. »о дахтм рахтгахоструктур» кого ша» (McOareott »t »1.. 1993)i г) юол1в»»о*, состопосЯ xx 9-тх холакул агрегат бахт«у«охлоро4млла а. яаходпрАсх по харухяу» с то рои у а-долааппадца х полосу воглоацххх 800 хх»
д) холщаво« 19-««ряиА аграгат ■ «мирхоххорооииа «, располо»ах*|* хпду xapyxmai холщох х хаутраяххх кольцо« а-иошмщкдох я продуцируяожЛ полосу логлоцакха 8S0 ах.
Рис. It. Смгпи погломкх* х fayopacnaxm Хд «/Ъ-орот шм* шсжх растаю* (Л ittlvun), рамохатпша в совладеем уххмрса-льхого соотяомпн ха aenxxarprou» гауесокпа амотах», TT Ci а) свжтр юглохпх, в) епахтр ««уоркцтот.
а) схаха pacnuoaam* холахул пи г« «тот ха врояпипхкМ тхла-хоидаув xneptxy вопгааптхлюл цат X* е/Ь-вротехха а шх» ' j/ajx хлаетаро» (мятдогоааяхиа хрххоуголяох), храхетаиахо во Kühl— .brandt. 1992).
расчеты полностью соответствуют нашим сведениям о том, что максимум поглощения 850 нм у данного комплекса и соответстующий спектр флуоресценции моделируются тремя полосами, из которых две в спектре поглощения наиболее выражены (Рис. 106). Расчет коротковолновой полосы поглощения, обусловленной в комплексе В850 агрегатом-наномером, насколько известно, не проводился. Вследствие слабого характера экситонного взаимодействия молекул бактериохлорофилла а в данном случае остается неясным, возможно ли появление в спектре не одной, а двух полос (в нашем случае полосы 790 и 806 нм).
3. Светособирающий Хл а/Ь-содержащий протеин высших растений
Хлоропласты высших растений и ряда групп водорослей обладают Хл а/Ь-содержащим комплексом, обозначаемым также как СР 2, LHCP, LHC и LHC II (Используемая терминология рассмотрена Jansson, 1994). На долю комплекса приходится 50% белка тилакоидных мембран и 60% всего хлорофилла. Комплекс преимущественно связан с фотосистемой Ii. Полипептиды комплекса способны к обратимому фотофосфорилированию и латеральному перемещению в мембране, служащему для регуляции распределения энергии между двумя фотосистемами. Кроме того, Хл а/Ь-протеин участвует в катионзависимом стейкинге мембран тилакоидов.
Качественное отличие комплекса от рассмотренных выше Бхл а-про-теина зеленых - и комплекса В850 пурпурных бактерий заключается в наличии в нем двух пигментов, хлорофилла а и хлорофилла Ь. Количественные различия проявляются в увеличенном числе молекул хлорофилла, связанных с апопротеином: на один полипептид комплекса с мол. массой 25-29 «Да приходится 12-15 молекул хпорофиллов (Butler & Kühlbrandt, 1988).
3.1. Спектры поглощения и флуоресценции Хл а/Ь-протеина
Хл аФ-содержащий комплекс был получен из солюбилизированных тритоном Х-100 тилакоидных мембран хлоропластов гороха с помощью анионобменной хроматографии на DEAE-целлюлозе. Для исследования спектральных свойств Хл а/b-протеина использован метод совместного моделирования спектров поглощения и флуоресценции, успешно приме-
ненный ранее к изучению РМО-комплекса и комплекса В850. Усовершенствованием метода, как и в случае моделирования В850, стал учет асимметрии моделируемых полос, являющейся четвертым параметром, характеризующим спектральные полосы наряду с положением максимума, амплитудой и полушириной [19, 21]. В спектре поглощения Хл а/Ъ-протеина при 77 К были выявлены девять компонент: 640, 649, 662, 671, 676, 681, 688, 691 и 697 нм. Пяти последним из них согласно соотношению Степанова отвечали полосы, которые полностью моделировали спектр флуоресценции: 681, 685, 689, 695 и 701 нм (Рис. 11). Полуширина выявленных полос (7-11 нм) оказалась в полтора-два раза меньше, чем для мономерного хлорофилла в растворе. Это указывало на экситонную природу спектров, сближенность и взаимодействие молекул пигментов в комплексе. По энергии взаимодействия хромофоров, определяемой по разнице частот 0-0 переходов спектральных полос и равной 110 см"^, комплекс оказался близок к Бхл а-протеину.
Существенным представлялся вопрос о взаиморасположении и взаимодействии молекул хлорофилла а и хлорофилла Ь, соотношение которых в исследуемом комплексе составляло 1,0-1,2. Только две полосы поглощения, 640 и 649 нм, совпадающие с известными ранее для спектров целых хлоропластов, со всей очевидностью могли быть приписаны хлорофиллу Ь. Интенсивность этих полос оказалась значительно ниже, чем остальных длинноволновых. Если допустить, что поглощение хлорофилла Ь ограничивается областью 640-650 нм при практически равном содержании с хлорофиллом а, это обстоятельство остается непонятным (с учетом различия в коэффициентах экстинкции двух пигментов). Вместе с тем полосы поглощения 662 и 671 нм имели заметно большую полуширину, чем более длинноволновые компоненты. Можно заключить, что происходит частичное перекрывание спектров поглощения двух хлорофилпов, и число полос, принадлежащих хлорофиллу Ь, не ограничивается двумя, а может равняться трем или четырем.
В спектре флуоресценции Хл а/Ъ-протеина отсутствуют компоненты, которые можно было бы согласно соотношению Степанова приписать хлорофиллу Ь или коротковолновым спектральным формам хлорофилла а. Данный факт говорит о высокоэффективном распределении энергии в пользу длинноволновых компонент комплекса. Следовательно, можно полагать, что молекулы хлорофилла Ь не образуют на апопротеиновой матрице от-
дельного кластера, отстоящего от молекул хлорофилла а. В составе Хл аЯмгротеина должны реализовыватъся смешанные пигментные агрегаты, обеспечивающие межмолекулярную передачу энергии внутри пигмент-белкового комплекса.
Число молекул пигментов (12-15), приходящихся на полипептид, превышает число полос, выявленных нами в спектре поглощения Хл а/Ь-про-теина. Рентгеноструктурные исследования двумерных кристаллов комплекса вносят значительную долю ясности в причину даного факта (КйЫЬгапсК е1 а1., 1994). Как оказалось, молекулы хлорофиллов образуют два кластера в участках этого мембранного белка, граничащих с каждой из сторон типако-идной мембраны (Рис. 11 в). В кластерах находится по 6-8 пигментных молекул, среднее расстояние между которыми составляет 11.5 А, что обеспечивает экситоннов взаимодействие хромофоров. Последнее находит отражение в малой полуширине спектральных полос. Молекулы хлорофиллов а и Ь. как и следовало из рассмотренных выше спектральных данных, примерно равномерно распределены меаду двумя кластерами. Интерпретация спектров для столь сложной пигментной системы остается крайне затруднительной: на число полос и их характеристики влияют неполная идентичность двух кластеров и дополнительное взаимодействие граничных молекул хромофоров одного кластера с ближайшими к ним хромофорами соседнего. Кроме того, как будет рассмотрено ниже, исследованный нами и рентгеноструктурно препарат состоял из двух полипептидов с несколько разнящимся соотношением входящих в их состав молекул хлорофиллов а и Ь.
3.2. Полипептиды Хл а/Ь-протеина
К настоящему времени у высших растений идентифицированы 10 полипептидных продуктов, связанных с хлорофиллами а и 6; шесть из них являются компонентами фотосистемы II и четыре - фотоситемы I ^апэзоп & Сиз1а^$оп, 1992). Соотношение хлорофиллов а и Ь для полипептидов различно и составляет от 0,9 до 2,2. Полипептиды сходны по молекулярной массе, электрофоретической подвижности и аминокислотному составу. Их биохимическое разделение представляет собой большие трудности, а выяснение множественности данных белков заняло около пятнадцати лет. На изучение данного вопроса были направлены и наши усилия.
Многочисленными исследованиями выяснено, что в тилакоидных мем-
бранах существуют субкомплексы, состоящие из двух-трех Хл а/Ь-полипептидов. Важнейшим из них является связанный с фотоситемой II так называемый LHC llb-протеин. На его долю приходится более 80% всего хлорофилла, присутствующего в суммарном Хл аф-протеине. Подавляющее большинство исследований Хл а/Ь-протеина выполнены с этим субкомплексом. Первые сообщения о том, что LHC llb-протеин состоит из двух полипептидов, появились благодаря элетрофоретическим данным (Süss, 1981; 1982). Однако при разделении в полиакриламидном геле в требующихся при этом денатурирующих условиях полипептиды депигментировались, причем их молярное соотношение оставалось неизвестным из-за неравномерного прокрашивания белка в геле. Нам впервые удалось разделить полипептиды LHC llb-протеина, сохранив их связь с пигментами, с помощью изофокуси-рования на колонке с 50% градиентом плотности сахарозы в присутствии 8 М мочевины [31]. Соотношение двух полипептидов с мол. массой 25 и 28 «Да было определено равным 4:1 [26]. Оно было подтверждено последующими работами (Larson & Anderson, 1985; Spangford & Anderson, 1987), где было также показано, что минорный белок легко подвергается обратимому фотофосфорилированию. (Указываемое в ряде случаев в литературе соотношение 3:1, вероятнее всего, связано с формированием Хл а/Ъ-несущими полипептидами белковых агрегатов-тримеров (Jansson, 1994). Причины высокой гетерогенности Хл а/Ь-протеина далеки от полного выяснения.
III. Закономерности организации пигментов в антенных
комплексах
Современные знания о различных антенных комплексах далеко не равноценны. Так, сведения о Хл а/с-содержащих светособирающих комплексах и протекании фотосинтеза в многообразной группе хромофитных водорослей во многом не удовлетворительны: не хватает, например, элементарных данных о числе различных типов хлорофиллов с, их распространении и роли в хлоропластах. С другой стороны, для фикобилипротеи-нов, Бхл а-протеина и ряда других антенн имеются скрупулезные сведения об аминокислотных последовательностях полипептидов, рентгеноструктур-ные данные и данные многочисленных спектральных, биохимических и генетических исследований.
В нашей работе исследовано молекулярное строение различных антенн. Полученные экспериментальные результаты с учетом данных других авторов позволяют, не претендуя на полноту обобщений, сформулировать ряд закономерностей строения светособирающих комплексов.
1. Связь антенных полипептидов с одним, двумя или тремя видами хромофоров
Комплекс В850, Бхл а-протеин и другие антенны пурпурных и зеленых фотобактерий (аноксигенный фотосинтез) несут только по одному виду хромофоров. Для полипептидов антенных комплексов у оксигенных фотосинтетиков характерна связь не с одним, а двумя и более типами пигментов. Например, Си,- В- и Я-фикоэритрины несут фикоуробилин и фикоэрит-робилин. Полипептиды Хл а/Ь-протеина содержат хпорофиллы а и Ь, Хл а/с-протеина - хлорофиллы а и с; "рекорд" принадлежит фикобилипро-теинам криптофитовых водорослей, несущих до трех различных фикобили-нов, и Хл а/Ь/с-протеину празинофитовых водорослей и прохлорофитных фотобактерий, обладающему тремя пигментами. Разные хромофоры, входящие в состав пигмент-белкового комплекса, имеют перекрывающиеся спектры поглощения и флуоресценции, что оптимизирует условия передачи энергии от коротковолновых к длинноволновым спектральным формам пигментов.
Если полипептиды различных комплексов гомологичны, то они присоединяют одинаковые или родственные по химической природе хромофоры. Так, Хл а/6-протеины являются гомологичными продуктами десяти генов, содержащими, как отмечалось, молекулы двух пигментов в соотношении 0,9-2,2. Другим примером служат фикобилипротеины, содержащие линейные тетрапирролы-изомеры: а-полипептиды аллофикоцианина и С-фико-цианина связывают фикоцианобилиновые хромофоры, родственный им а-полипептид фикоэритроцианина несет другой хромофор - криптовиолин, а а-субъединицы С- и Я-фикоэритринов соединены с третьим видом фико-билинов - фикоэритробилином. .
2. Плотность хромофорной упаковки антенных полипептидов
Считается (Вазэ! е1 а|., 1990), что большое число хромофорных про-стетических групп является характерным свойством антеннных белков. Наше рассмотрение свидетельствует, что в действительности число хромофоров в пигмент-белковых комплексах существенно разнится (Табл. 2).
Таблица 2. Содержание хромофорных групп в антенных комплексах фотосинтетического аппарата
Число хромо- Мол. масса "Плотность
Пигмент-белковый комплекс форов на * полипептидов хромофорной
полипептиде кДа упаковки"
а Ь Ь/а
а-субъединицы аллофико- 1 17 17
цианина и фикоцианинов
а-субъединица В850 1 6 6
р-субъединицы фикоцианинов. 2 18 9
а-субъединицы фикоэритринов
Р-субъединица В850 2 6 3
р<у€ъединицы фикоэритринов * 3 18 6
у-субъединицы [^-фикоэритринов * 5 30 6
Бхл а-протеин * 7 37 5
Хл а/Ь-протеин 14 25-29 2
СР 47, СР 49 (антенна фотосистемы II) 18-25 47 2
СР 80, СР 82 (антенна фотосистемы I) 40 80 2
Примечание: * помечены данные, полученные автором.
Минимальное число хромофоров, равное одному на полипептид, реализуется для а-субъединиц аллофикоцианина и комплекса В850, наибольшее, равное 40, принадлежит собственной антенне фотосистемы I. Полипептиды с ббльшим числом хромофоров не существуют, по всей видимости, из-за высокой вероятности ошибок при самосборке пигментов и апопро-
теинов in vivo. Вместе с тем прослеживается тенденция увеличения числа хромофорных групп, приходящихся на единицу мол. массы полипептидов. Она связана с вводимым нами показателем "плотности хромофорной упаковки", определяемым как частное от деления молекулярной массы полипептида на число соединенных с ним хромофоров (Табл. 2) [52]. Худшими показателями, равными 6 - 17, и наиболее "рыхлой" упаковкой характеризуются фикобилипротеины. Минимальная величина, равная 2, достигается у трех пигмент-белковых комплексов высших растений. У данных комплексов оно не зависит ни от числа хромофорных групп, находящихся на полипептидах, ни от размеров самих полипептидов. Константное значение служит косвенным свидетельством того, что достигается связь максимального числа хромофоров с соответствующим апопротеином. "Плотность", равная
2, означает, что в среднем на каждые 1800 «Да белка приходится одна молекула хлорофиллов а или Ь с мол. массой около 900 кДа. (Хлоросомы зеленых бактерий, характеризующиеся существенно иной, чем в остальных известных случаях, молекулярной организацией пигментного аппарата, здесь не рассматриваются).
3. Формирование белками антенных комплексов четвертичной структуры и самосборка в надмолекулярные структуры как следствие низкой плотности упаковки хромофоров
Характерным для антенн является объединение, или агрегация, полипептидов и мономерных структурных единиц апопротеинов в надмолекулярные структуры. Так, Бхл a-протеин зеленых бактерий, Хл а/Ь- и Хп а/с-протеины водорослей и высших растений агрегируют, формируя тримеры из идентичных белков. С3-симметрия считается минимальным уровнем симметрии, обеспечивающим равномерный светосбор по всем направлениям распространения света. Еще более яркий пример - фикобилисомы, надмолекулярные комплексы, состоящие из многих десятков фикобилипротеино-вых молекул. Сначала (ар)-мономеры фикобилипротеинов образуют (оф)3-тримеры, которые в свою очередь объединяются в (ар)6-гексамеры пигментов. Наконец, имеющие дисковидную форму гексамеры соединяются в цилиндрические элементы фикобилисом, содержащие до семи гексамеров. Именно с агрегацией (сф)еу-гексамеров связано обнаруженное нами присутствие нескольких у-субъединиц у R-фикоэритринов (Раздел 1.2).
Основное значение надмолекулярных структур, образующихся в результате агрегации полипептидов, заключается в увеличении числа хромофоров, обслуживающих реакционные центры. В частности, фикобилисомы содержат до 300 и более хромофорных групп. Подобная антенна с молекулярной массой несколько миллионов Да не может разместиться в площади тилакоидной мембраны и располагается в притилакоидном пространстве. Мы прослеживаем следующую закономерность: чем меньше хромофоров связано с полипептидами, тем большей величины достигают соответствующие надмолекулярные структуры. Действительно, как уже отмечалось, Хл а/Ь-, Хл а/с- и Бхл а-протеины, имеющие высокое содержание хромофоров, образуют лишь белковые тримеры. Фикобилисомы характерны для фикобилипротеинов, комплекс В850, несущий на (ар)-мономере три молекулы Бхл а, образует наномеры белка, имеющие кольцевую форму.
4. Особенности спектров поглощения антенных комплексов, связанные с молекулярной организацией хромофоров
На сегодня полное квантовомеханическое описание спектров поглощения пигмент-белковых комплексов невозможно даже в случаях, когда имеются рентгеноструктурные данные высокого разрешения. Влияние аминокислотного микроокружения хромофоров на спектры из-за обилия хромофорных групп и окружающих их различных аминокислот не поддается полному количественному расчету (см. РеагЫе1п, 1993). На качественном уровне можно предложить описание спектров с учетом пигмент-пигментного, пигмент-белкового взаимодействий, данных о числе хромофоров в пигментных агрегатах (кластерах) и расстояниях между хромофорными группами. Совокупность спектров поглощения исследованных нами антенных комплексов может быть сведена к нескольким случаям.
4а. Спектры поглощения фикобилипротеинов. Расстояние между отдельными хромофорными группами, расположенными на апопротеине, достаточно велико, чтобы пигмент-пигментными взаимодействиями можно было пренебречь. Благодаря индивидуальным пигмент-белковым взаимодействиям каждая хромофорная группа характеризуется собственной полосой поглощения. Спектр поглощения каждого фикобилипротеина представляет собой сумму спектров его хромофорных групп. При подобном типе молекулярной организации хромофоров основным фактором, определяю-
щим форму спектров, является пигмент-белковое взаимодействие.
46. Спектр поглощения Бхл а-протеина. В результате пигмент-пигментного взаимодействия спектр поглощения расщепляется на семь полос, соответствующих формированию молекулами бактериохлорофилла а агрегатов-гептамеров. Электронное возбуждение делокализуется между семью хромофорами; полосы поглощения нельзя приписать индивидуальным хромофорным группам. Ведущим фактором спектральной характеристики комплекса становится экситонное взаимодействие хромофоров. Вклад пигмент-белкового взаимодействия остается существенным для суммарного длинноволнового' сдвига спектра.
4в. Спектр поглощения Хл а/Ь-протеина. Молекулы хлорофилллов а и Ь, находящиеся на одном полипептиде, разделены на два пигментных кластера, в пределах каждого из которых реализуется пигмент-пигментное взаимодействие. Вследствие этого число полос, наблюдаемых в спектре, меньше суммарного числа хромофоров. Количество хромофорных групп в составе Хл а/Ь-протеина не может быть выявлено, как в двух первых случаях, лишь с помощью исследования характеристик спектров поглощения.
4г. Спектр поглощения комплекса В850. Как и в случае Хл а/Ь-протеина, в составе комплекса В850 существуют два пигментных кластера, присутствие которых ясно прослеживается по характеру спектра поглощения. Различие в молекулярном строении заключается в том, что у Хл а/Ь-протеина хромофоры разделяются на два агрегата в пределах одного полипептида, в то время как у В850 для формирования каждого из двух кольцевых пигментных кластеров требуется участие хромофоров, находящихся на образующих цилиндр девяти (ар)-белковых мономерах.
Представление о нативной организации пигментов фотосинтеза в форме агрегатов или, в более общем виде, в форме кластеров, было сформулировано в результате работ многих исследователей. Наше сравнительное изучение показывает, что не существует единого типа кластеров. Каждый пигмент-белковый комплекс характеризуется собственным молекулярным строением кластеров, которое связано с величиной полипептидов комплекса, числом находящихся на них пигментных молекул и.особенностями хромофор-хромофорного и хромофор-белкового взаимодействий. Проведенное сопоставление служит свидетельством многообразия хромофорной организации фотосинтетических антенн.
XV. Эволюция антенных комплексов оксигенного фотосинтеза
Эволюция антенных комплексов является частью общей проблемы эволюционного развития фотосинтетического аппарата. Функционирование пигментов в составе комплексов имеет прямое отношение к эволюционному аспекту фотосинтеза, так как, рассматривая вопрос о первичности гете-ротрофии или автотрофии у предковых организмов, следует указать, что фотосинтез в известном ныне виде сформировался на сложившейся основе белкового синтеза (на основе пигмент-белковых комплексов). Предлагаемая схема биогенеза порфириновой ветви тетрапирролов ясно показывает, что хлорофиллы, бактериохлорофиплы и билиновые пигменты проявляют функциональную активность только в состоянии связи с соответствующими апопротеинами (Рис. 12). [4. 52].
Светособирающие комплексы, в отличие от реакционных центров, характеризуются большой вариабельностью как апопротеинов, так и пигментов. Вследствие этого эволюция фотосинтетического аппарата может быть во многом прослежена на антенном уровне, а антенны могут использоваться в качестве эволюционных маркеров в исследовании происхождения различных групп фотосинтетиков.
Изучение антенных комплексов, прежде всего фикобилипротеинов, и обобщение и анализ литературных данных {1, 2,38, 52] позволяют сформулировать ряд закономерностей эволюции светособирающих компартмен-тов фотосинтетического аппарата. Для выяснения родственных связей фотосинтетических антенн нами были использованы три подхода: 1) рассмотрение хромофорного состава комплексов; 2) анализ биогенетических путей синтеза хромофоров; 3) сопоставление степени гомологии полипегпи-дов, образующих ту или иную антенну.
1. Причины появления светособирающих комплексов в фотосинтетмческом аппарате
Реакционные центры за единицу времени способны стабилизировать значительно большее число световых квантов, чем им позволяет собственное поглощение. Поэтому давление отбора было направлено на увеличение светопоглощения и накопление пигментов в клетке, что и привело к формированию антенных комплексов фотосинтеза. Максимальное число
антенных хромофоров, приходящихся на один реакционный центр, определяется "пропускной способностью" его электронтранспортной цепи и световыми условиями обитания организмов. По многочисленным оценкам, оно составляет около 40 для пурпурных бактерий, 150-200 - для фотосистем I и II и доходит до 1000-2000 у антенны зеленых бактерий. Антенные полипептиды, содержащие столь большое число хромофоров, не синтезируются, как отмечалось, из-за высокой вероятности ошибок при самосборке пигментов и апопротеинов in vivo. Имеются очевидные пределы связывания хромофоров и апопротеина, которые характеризуются показателем "плотности упаковки хромофоров" (Табл. 2).
При формировании антенны реализуются две эволюционные стратегии: увеличение числа хромофоров, находящихся на алопротеинах (пример: собственная антенна фотосистемы I) и, при ограничении в числе хромофоров, как например у фикобилипротеинов, - образование надмолекулярных структур, ведущее к росту размера антенны.
2. Проблема преимущественной связи вспомогательных антенных комплексов с фотосистемой II
Выделение кислорода при фотосинтезе связано со взаимодействием двух фотосистем. Каждый из двух реакционных центров окружен собственной антенной, пигментом которой служит только хлорофилл а. Условия оптимальности миграции энергии к реакционным центрам и конкуренция между фотосинтетиками за светосбор в спектральных областях минимальной абсорбции хлорофилла а привели к появлению дополнительных пигментов, поглощающих свет в коротковолновом диапазоне. Алопротеины собственной антенны фотосистемы II содержат вдвое меньше хромофоров по сравнению с апопротеинами фотосистемы I (Табл. 2). В этих условиях возникла дополнительная антенна со вспомогательными пигментами, которая в результате давления отбора, направленного на сбалансированность све-топоглощения двумя фотосистемами, оказалась преимущественно связанной с фотосистемой II. Три пигментные ветви оксигенного фотосинтеза соответствуют наличию в клетках трех видов дополнительных антенн: фикобилипротеинов, Хл а/Ь- и Хл а/с-протеинов.
3. Эволюция фикобилипротвиновой антенны цианобактерий и красных водорослей
Анализ свойств фикобилипротеинов позволяет выявить следующие закономерности их формирования как антенны фотосинтеза.
За. Наличие изопротеинов. Нами найдены три изопротеина Я-фико-эритрина. Двумя или тремя изопротеинами обладают также другие фико-билипротеины. Свойство характерно для большинства антенных комплексов, так как позволяет, влияя на активность соответствующих генов, регулировать размеры фотосинтетической антенны в зависимости от интенсивности и спектрального состава света или других физиологических условий.
36. Связь бипиновых хромофоров с гомологичными полипептидами и разнообразие фикобилипротеинов. Четыре фикобилиновых хромофора цианобактерий и красных водорослей, фикоцианобилин, фикоэрит-робилин, фикоуробилин и криптовиолин, соединяясь в разных сочетаниях и количественных соотношениях с (аР)-мономерами апопротеинов, образуют до 15 различных фикобилипротеинов. Данное свойство мы выделяем как интереснейший пример адаптивной радиации, возникшей на молекулярном уровне. Дивергенция фотосинтетических пигментов в ходе эволюции вызвана приспособлением к поглощению света различного спектрального состава. Благодаря возникающему разнообразию фикобилипротеинов становится возможным перекрывание области поглощения от 450 нм (фи-коэритрины) до 660 нм (аллофикоцианин).
Чтобы сочетания четырех хромофоров дали начало пятнадцати белкам-пигментам, необходимо, чтобы каждый из хромофоров мог соединяться с разными апопротеинами. Например, фикоцианобилин входит в состав аллофикоцианина, фикозритроцианина, С- и И-фикоцианинов. Фикоуробилин является хромофором В-, С1)- и Я-фикоэритринов. Возможность присоединения одного и того же фикобипина к разным апобелкам не позволяет на основе состава хромофоров судить о последовательности эволюционного формирования фикобилипротеинов.
Зв. Общность происхождения и высокая степень гомологии полипептидов. Фикобилипротеины происходят от одного родоначального гена благодаря дупликации, давшей начало а- и р-субъединицам, из которых состоят эти белки-пигменты. Степень гомологии достигает 30-80% и свидетельствует о следующей последовательности появления этих белков в ходе
5-А»«олЕвалиновля КИСЛОТА
уропор«и»у«оген
Протопор*ИРНН
включая«« Кв
Вклачаяха Тв
хЛОРОФИЛЛЫ и
Бактериохлорсхиапы
Утрата Ив
и
БдктЕРио«со«итв1
р£АК1»ЮКШЕ
центры «отосжтеза
СвЕТОсоеиржяяЕ гогмент-БСлкоеыЕ комплексы фотосинтеза
/трата Ра к разяикамх* кольаавой структуры_
ЗУкобнлины] [»ЯОКРОМОБН/ИН
| Фикобнпипротсжы) |<Упохром|
Рке. 12. Протвворфсрановая а«т» биоскжтюа тпралмрролоа« т»т-ратрродсоА*рхаша <алхх аахлвчащ а ранш.
строение «юсошшсоы
О Аллофюсовдакия ЕВ Фккоцкамкн СЭ «икоэрнтрии
шксииуш поглощений.
«шобили-протеинов
650 ни
620 нм
5Б5 Ж
филогенез дпопроташш
Алло«коииАнж
биогенез хромофоров
Протогем
I \ I
•гИКОЦИА»« \ ^Фихозритр СБИЛИ
I X. I
Фикоэритрж
Фжочианоеилм
Ркс. 13. «ихобялхпротаяхы: еопостммтвлким схеяа располохскмя а фпсобишеохах. областей поглованмл. (нлоганатичасхкх свлзай ало-оротанно» и бяоганаз* хромофоров.
Фотобактерии, содержащие I собственные антенные ^комплексы фотосистем I и II
+ Фияобилипротеинн
Дополнительная антенна, содержащая только Хл а
I Фотобактерия« I обладающие Хл а-антенной!
»—«ммм^р I — ■ ч
Г Прохлорофитша | фотобактерии 11 Хл а/Ь-протекн
Прохлорофггные Фотобактерии
(Хл а/Ь/с протеин]
ПрохроиофптткГ] | фотобактерия | ¡(Хл а/о-протеин^
ЭУКАРИОТЫ
Рис. 11. Вероятная схема происхождения трех пигиеитнлх групп оксигеняого Фотосинтеза. Предполагаемые нееохранив-шиеся тахсояы обведен» прерывисты*« линияии-рамкаки.
3.
Хл а-протеин 1
Хл а/ь-протеин
Хл а-протеин
Хл а-протеин
I
Хл а/с-протеин
| Хл а/ъ-протеин Хл а/с-протеин . |
Хл а/Ъ/с-протеин / Хл а/Ь/с-протеин
I \/ |
Хл а/с-протеин Хл а/Ь/с-протеин Хл а/ь-протеин
I
г
Рис. 15. Воэхояше пути зволяо«* Хл а/Ь- ■ Хл а/с-вротеииов.
45
эволюции: алпофикоцианин -> фикоцианин(ы) фикоэритрин(ы) (Оисге^ 1994). Последовательность полностью согласуется с порядком расположения фикобилипротеинов в составе фикобилисом и со спектральными свойствами хромофоров, связанных с соответствующими апопротеинами и обеспечивающих направленный сток энергии к хлорофиллу. Например, длинноволновый хромофор, фикоцианобилин, находится в аллофикоцианине и фикоцианине, располагающихся в проксимальной части фикобилисом, а имеющие более коротковолновые максимумы поглощения фикоэритро- и фикоуробилины принадлежат фикоэритринам, образующим дистальные участки фикобилисомы.
Зг. Особенности биогенеза фикобилинов. Все известные билино-вые хромофоры красных водорослей обнаружены также у цианобактерий и, следовательно, появились, как и хлорофиллы, на прокариотной стадии формирования фотосинтетического аппарата.
Фикобилины образуются из протогема путем разрыва макроцикла молекулы. Реакция протекает с участием молекулярного кислорода и подразумевает достаточное атмосферное содержание этого газа, источником которого мог быть лишь фотосинтез. Это свидетельствует о вторичности происхождения по отношению к хлорофиллу а сопровождающих пигментов - фикобилинов.
В цепи биосинтеза фикобилинов коротковолновый хромофор фико-эритробилин предществует длинноволновому фикоцианобилину (Веа!е, 1993). Направленность реакций определяется степенью восстановленнос-ти молекул по отношению к протогему и не соответствует рассмотренной выше последовательности образования апопротеинов и их связыванию с названными хромофорами (Рис. 13). Данные противоречат сложившемуся представлению, по которому биогенез (последовательность биохимических реакций синтеза хромофоров) есть краткое повторение филогенеза. Эволюционные этапы образования фикобилинов определяются не спектральными свойствами, как бы они ни были важны для пигментов фотосинтеза, а возможностями биохимических путей анаболизма. Выявленная особенность филогенеза не может в свою очередь считаться абсолютной. Априорно следует допустить обе возможности: повторение биогенеза в филогенезе и появление новых филогенетических путей за счет придания функциональной роли промежуточным продуктам биосинтеза. В данном случае важна конкретная реализация второго из двух возможных вариантов для опреде-
ленной группы соединений, а именно тетрапирролов. Полученный результат можно использовать для рассмотрения онтогенетических и филогенетических связей хлорофиллов и бактериохлорофиллов. Из него, в частности вытекает, что оксигенный фотосинтез вовсе не должен предшествовать бактериальному на том основании, что бактериохлорофиллы, по-видимому, образуются на основе хлорофилла а.
Итак, анализ хромофорного состава, биогенетических путей синтеза хромофоров и гомологии полипептидов свидетельствует, что в рассмотрении происхождения как фикобилипротеинов, так и, очевидно, других пигмент-белковых комплексов основным указателем филогенеза должна служить степень гомологии белков. Первые два признака имеют вспомогательное значение. Креме того, проведенное рассмотрение позволяет сделать ряд эволюционных обобщений. К ним относятся: 1) появление сопровождающих пигментов фотосинтеза позднее хлорофилла а; 2) появление автото-рофов вслед за гетеротрофными организмами; 3) недостаточность данных о биогенетических связях тетрапирролов для заключений о последовательности появления различных групп фотосинтетиков, в частности кислород-выделящих и бескипородных.
4. Эволюция Хл а/Ь- и Хл а/с-содержащих комплексов
Хлорофилл Ь в цепи биосинтеза образуется на основе хлорофилла а и в этом случае последовательность образования двух пигментов согласуется с более поздним появлением Хл а/Ь-протеина как вспомогательной антенны, по сравнению с собственными антеннами фотосистем I и II.
В хлоропластах высших растений присутствуют десять гомологичных Хл а/Ь-содержащих полипептидов. В эволюционном отношении наиболее интересными представляются данные об изменении соотношения двух видов хлорофиллов у полипептидов этой группы. Оно составляет, как отмечалось, 0,9 - 2,2 при, вероятно, постоянном суммарном содержании хромофоров и является примером широкой дивергенции, реализуемой на молекулярном уровне.
Имеющиеся данные о первичной структуре Хл а/Ь-протеинов у высших растений являются недостаточными для построения филогенетического древа данного семейства белков для всех хлорофитных фотосинтетиков. Аналогичное утверждение тем более справедливо для семейства
Хл а/с-протеинов. Водоросли, содержащие Хл а/с-несущие полипептиды, являются наиболее многочисленными: число систематических групп превышает таковое для растений, имеющих фикобилины или хлорофилл 6, вместе взятых. Ни для одной группы хромофитных водорослей не известно, как это имеет место для высших растений, точное число полипептидов, относимых к Хл а/с-протеину. Наконец, пять обнаруженных видов хпоро-филлов с также осложняют проблему.
Вопрос о биогенезе и распространенности хлорофиллов с не выглядит столь относительно простым, как в случае хлорофилла Ь. Минорные хлорофиллы с присутствуют в хлоропластах в очень малых количествах. Спектральные различия хлорофиллов с крайне невелики, а последовательность конечных этапов их биосинтеза остается неизвестной. Мы полагаем,что минорные хлорофиллы с можно рассматривать как рудиментарные пигменты, сохранившиеся от ранних групп хромофитных водорослей. Другая возможная точка зрения: хлорофиллы с служат примером селективно нейтральных мутаций (в рамках теории нейтральной эволюции) на уровне низкомолекулярных соединений.
Перечисленные факты свидетельствуют, что выяснение филогенетических взаимоотношений внутри и между семействами Хл а/Ь- и Хл а/с-протеинов станет возможным с накоплением данных о распространенности различных хлорофиллов с и первичной структуре соответствующих полипептидов, хотя на ряд вопросов, связанных с последовательностью появления двух данных антенн можно попытаться ответить уже сегодня. (см. далее).
5. Вероятная эволюционная последовательность появления антенных комплексов оксигенного фотосинтеза
Эволюционные сценарии, приводящие к объединению в фотосинтетическом аппарате реакционных центров I и II, подробно проанализированы (Ьагкит, 1991; В1апкепзЫр, 1993). Для осуществления фотосинтеза достаточно пигментов, присутствующих в реакционных центрах: уровень све-тосбора резко снизится, но протекание процесса принципиально останется тем же. Причиной появления светособирающих комплексов, как рассмотрено нами, стало повышение эффективности светопоглощения. Сформировавшиеся реакционные центры "обзавелись" собственными антеннами,
что не потребовало новых пигментов. Хлорофилл а соединился в этих антеннах с белками, не гомологичными полипептидам реакционных центров. Направленный сток энергии был достигнут за счет спектральных сдвигов полос поглощения хлорофилла а, возникающих благодаря пигмент-пигментным и пигмент-белковым взаимодействиям. Таким образом, в реакционных центрах и собственных антеннах фотосистем присутствует лишь хлорофилл а. С учетом данного факта и исходя из монофилетического происхождения пигмента, мы постулируем предкового несохранившегося фотосинтетика, содержавшего только хлорофилл а и собственные антенны двух фотосистем. Дополнительные антенны оксигенного фотосинтеза должны были появиться позже (Рис. 14).
Первый из возникающих вопросов: почему существуют оксигенные фотосинтетики с тремя различными типами дополнительных антенн и принципиально одинаковыми пигмент-белковыми комплексами фотосистем I и II? Наиболее очевидный ответ заключается в том, что различные вспомогательные пигменты позволяют организмам наиболее полно использовать все разнообразие световых условий обитания. Однако исследование световых ниш мирового океана показало, что цианобакгерии и багрянки благодаря широкой спектральной области поглощения и обилию различных фикоби-липротеинов обладают преимуществом в светопоглощении на любых глубинах перед всеми другими пигментными группами водорослей (Dring, 1981). Вместе с тем существует значительное число располагающихся на одной глубине, в одинаковых условиях освещенности, водных растительных сообществ, состоящих из представителей фасных, хлорофитных и хромофит-ных водорослей. Очевидно, океаническая стратификация водорослей определяется наряду со спектральным составом и интенсивностью света многими другими физико-химическими факторами, сочетание которых влияет на формирование водорослевых экосистем. Из перечисленного следует, что появление трех пигментных линий водорослей стало, вероятно, возможным на ранних этапах становления автотрофии при отсутствии жесткой конкуренции за световые условия обитания между группами оксигенных фотосинтетиков. (Иная ситуация сложилась при возникновении наземных растений - см. далее).
Какова возможная последовательность появления трех типов антенных пигмент-белковых комплексов фотосинтеза? Независимое от двух других групп происхождение фикобилипротеиновой ветви (цианобактерии) вы-
текает из отличного от биосинтеза любого из хлорофилпов пути образования хромофоров-фикобилинов, и отсутствия гомологии соответствующих апопротеинов. Наоборот, сходство первичной структуры Хл а/Ь- и Хл а/с-протеинов (Caron et al., 1995) убеждает, что эти две фотосинтетические антенны родственны друг другу. Молекулярное строение второго комплекса можно рассматривать как строение первого, в котором хлорофилл Ь заменен на хлорофилл с. Свидетельством тому служит и обнаружение Хл а/Ь/с-протеина у празинофитовых водорослей (Wilchelm, 1986) и про-хлорофитных фотобактерий (Larkum, 1994). Белок гомологичен как Хл a/Ь-, так и Хл а/с-протеинам (Mörschel et al., 1993). Светособирающий Хл а-протеин мог служить исходным пигмент-белковым комплексом при формировании антенн данного типа. На это указывают ныне живущие эустиг-матофитные водоросли, дополнительная светособирающая антенна которых содержит только хлорофилл а, и рафидофитные водоросли, имеющие две вспомогательные антенны: Хл а/с-протеин и Хл а-протеин. От Хл а-содержащей антенны могли независимо возникнуть Хл а/Ь- и Хл а/с-протеины (Рис. 14). Поиск ответа на вопрос о последовательности возникновения двух данных светосборщиков, очевидно, заключается в определении первичной структуры у возможно большего числа Хл а/Ь- и Хл а/ с-протеинов у представителей различных групп хлорофитных и хромофит-ных водорослей. Поскольку на сегодня подобные данные не накоплены, мы не имеем соответствующего филогенетического древа. Поэтому наряду с рассмотренным (Рис. 14) представляются равновероятными варианты с параллельным или последовательным появлением Хл а/Ь- и Хл а/с-проте-инов (Рис. 15).
Ряд авторов (см., например, Пиневич, 1991), полагая цианобактерии наиболее древними фотосингетиками, выводят от них две другие пигментные линии редукцией фикобилипротеинов и замещением их Хл а/Ь- или Хл а/с-протеинзми. Основанном для этого служит хорошо известный факт построения осадочных ископаемых - строматолитов, имеющих возраст около 3 млрд. лет, из клеточных оболочек цианобактерий. Фактором отбора при возможной замене фикобилипротеинов иными пигментами должны выступать световые условия. Поэтому предположение о замещении фикобилипротеинов пигмент-белковыми комплексами, обладающими более узкой спектральной областью поглощения, следует рассматривать с определенной осторожностью. Существенным для прояснения вопроса представля-
ется целенаправленный поиск фототрофных бактерий, обладающих Хл а/Ь- и Хл а/с-антенными комплексами, а также объяснение отсутствия среди хромофитных водорослей представителей, обладающих, подобно высшим растениям, двойной хлоропластной мембраной. При отсутствии подобных данных ряд проблем эволюции пигментного аппарата фотосинтеза по необходимости остается предметом общебиологических представлений.
6. Причины отсутствия фикобилипротеинов у высших (вышедших на сушу) растений
Главной линией эволюции явились растения, содержащие наряду с хлорофиллом а хлорофилл Ь. Почему водоросли, имеющие фикобилипро-теины или хлорофилл с, не дали начала растениям, сумевшим выйти на сушу? Фикобилипротеины, обладая поглощением, перекрывающим большую часть видимого спектра, имеют, как отмечено выше, несомненное преимущество в светопоглощении перед организмами с хлорофиллами Ь или с на большинстве глубин, в том числе в приповерхностных водах, а значит, и на земной поверхности. Мы предлагаем объяснение, не связанное со спектральными свойствами рассматриваемых пигментов. По нашему мнению, проблема решилась не в пользу фикобилипротеинов из-за низкого содержания в этих белках фикобилиновых хромофоров. В среднем на апопроте-ин у них приходится в 5-6 раз раз меньше хромофорных молекул, чем в Хл а/Ь-протеине. У цианобакгерий на фикобилипротеиновую антенну затрачивается до 60% всего водорастворимого белка клетки. Очевидно, энерготраты на подобный биосинтез были бы для наземных растений, у которых доля автотрофных тканей резко уменьшена, слишком дорогой ценой за поглощение света в широком спектральном интервале. У высших растений этот недостаток должен компенсироваться простым повышением содержания Хл а/Ь-протеина в хпоропластах.
Преимуществом высших растений перед организмами, содержащими Хл а^с-протеин, мог стать стейкинг тилакоидов, наблюдаемый только в пластидах, несущих хлорофилл Ь. Число тилакоидных стопок (фан) в одном хлоропласте может доходить до 20-30 и более. В отличие от этого, для хромофитных хлоропластов характерна не более чем трехтилакоидная система внутренних мембран. Тем самым плотность тилакоидов в хпороплас-тах высших растений является наиболее высокой, что отвечает принципу
усложнения и совершенствования энергодающих систем клеток в ходе эволюции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Многообразию фотосинтезирующих организмов, функционирующих в различных световых условиях обитания, соответствует многообразие антенных пигмент-белковых комплексов. Оно проявляется в размерах и числе составляющих комплексы полипептидов, разнообразии пигментов и вариантов их сочетаний: молекулы пигментов (хромофоры), входящие в состав той или иной антенны, образуют разные по величине и сложности молекулярного строения агрегаты (кластеры).
Подвергнутые изучению пигмент-белковые комплексы являлись как мембранными, так и водорастворимыми; использованные биохимические методики выделения позволили сохранить нативное состояние комплексов. При необходимости дальнейшей дезинтеграции, как в случаях фикобили-протеинов и Хл а/Ь-протеина, были применены и разработаны методы, позволившие избежать отделения молекул хромомофоров от апопротеина, что было необходимым условием исследований.
В ходе спектральных измерений был впервые реализован метод производной флуоресцентной спектроскопии и предложен и осуществлен метод математического совместного моделирования низкотемпературных спектров поглощения и флуоресценции комплексов.
У цианобактерий был обнаружен новый пигмент - СИ-фикоэритрин, у криптофитовых водорослей описаны не известные для них ранее виды хло-рофиллов с. Найденные пигменты расширяют представления о возможностях филогенетической световой адаптации у различных групп фотосинтетиков. Проведенный подсчет хромофоров у Я-фикоэритрина и обнаружение в его составе минорных, различающихся по типу хромофоров полипептидных субъединиц позволяют говорить о новом виде световой адаптации у красных водорослей.
Обнаружение нового для линейных тетрапирролов вида излучения -фосфоресценции и исследование ее возгорания при денатурации фикоби-липротеинов использованы для объяснения причины ковалентного, в отличие от хлорофиплов, связывания тетрапиррольных хромофоров и апопротеина: ковалентная связь необходима для повышения фотохимической ус-
тойчивости фикобилипротеиновой антенны.
Благодаря исследованию тонкой структуры спектров поглощения и флуоресценции Бхл а-протеина предсказана молекулярная организация пигментов данного комплекса в виде агрегатов-гептамеров, что нашло подтверждение в последующем рентгеноструктурном анализе (Fenna & Mathews, 1975). Совокупность полученных биохимических и спектральных данных о содержании и составе хромофорных групп в различных антенных комплексах позволили утверждать, что разнообразию антенн отвечает разнообразие кластерной организации комплексов. Например, у фикобилипротеинов хромофорные группы располагаются на апопротеине таким образом, что на первый план в спектральных свойствах выступает пигмент-белковое взаимодействие; у Бхл а-протеина пигментный кластер состоит из молекул хромофоров, находящихся на одном полипептиде; у Хл а/Ь-протеина хромофоры, принадлежащие одному полипептиду, разбиваются на два кластера, в то время как у комплекса В850 пурпурных бактерий в формировании кластеров участвуют хромофорные группы, находящиеся на нескольких примыкающих друг к другу полипептидах.
Существенной характеристикой антенн является вводимый нами показатель плотности упаковки хромофоров, показывающий количество хромофорных молекул, приходящихся на единицу молекулярной массы апо-протеинов. Чем меньше число хромофорных групп, тем ярче проявляется у белковой антенны тенденция образования надмолекулярных структур. Она находит наиболее полное проявление в формировании фикобилисом у ци-анобактерий и красных водорослей - сложных белковых субчастиц, состоящих из нескольких десятков связанных с пигментами полипептидов.
Данные о хромофорном и полипептидном составе антенных комплексов позволили рассмотреть основные направления их эволюционного развития, выявив примеры дивергенции и адаптивной радиации на молекулярном уровне, дать объяснение преимущественной связи вспомогательной антенны у кислородвыделяющих фотосинтетиков с фотосистемой II и представить гипотезу, объясняющую отсутствие фикобилипротеинов и хлорофилла с у наземных растений.
выводы
1. Обнаружен новый фикобилипротеин (цианобактерия О. аппав) -С11-фикоэритрин, содержащий не известное ранее сочетание фикоуроби-линовых и фикоэритробилиновых хромофоров. Описан вид термофильных цианобактерий, принадлежащих к роду Озс/У/а/ола, у которого выявлен другой Си-фикоэритрин, известный ранее лишь у одной цианобактерии -б. уЫасеиэ. На основе данных о найденных и известных фикобилипротеи-нах предложена классификация пигментных типов фикобилисом у цианобактерий и красных водорослей.
2. Установлен хромофорный и полипептидный состав Я-фикоэритри-нов красных водорослей С. согутЬоаит и А. ¿ракит. В составе Я-фико-эритринов обнаружены три у-полипептида, причем у-субъединицы пигмента А. ярагзит обладают разными сочетаниями фикоуробилиновых и фикоэритробилиновых хромофоров. Различия у-полипептидов свидетельствуют о новом виде световой пигментой адаптации красных водорослей: в ответ на изменение интенсивности света в фикобилисомах меняется доля различных (сф)6у-гексамеров ^фикоэритрина и тем самым меняется его хромофорный состав.
3. Впервые зарегистрирована фосфоресценция у линейных тетрапир-ролов - хромофоров фикобилипротеинов. Стократное возгорание послесвечения отмечено при денатурации Я-фикоэритрина, сопровождающейся переходом линейной геометрической формы хромофоров в псевдоциклическую. Эффект позволяет объяснить фотохимическую инертность фикобилипротеинов поддержанием в нативных белках благодаря ковалентной связи све-тоустойчивой линейной формы хромофоров.
4. Установлен перенос энергии от антенного комплекса, Хл а/с-про-теина криптофитовых водорослей (СИгоотопаз ер.), к фотосистеме I, в то время как вторая, фикобилипротеиновая, антенна передает поглощенную энергию фотосистеме II. Полученные данные исключают гипотезу посреднической роли хлорофилла с у криптофит в миграции энергии от фикобилипротеинов к фотосистеме II.
5. Обнаружены два новых для криптофитовых водорослей типа хло-рофилпов с: хлорофилл с,, а также хлорофилл с4, известный ранее только у празинофитовых водорослей и прохлорофитных фотобактерий. Выявленные пигменты могут служить важным таксономическим признаком в иссле-
довании происхождения хлоропластов у хромофитных фотосинтетиков.
6. Выявлено, что спектры поглощения и флуоресценции Бхл а-про-теина зеленых баетерий содержат по семь компонент. На основе полученных данных и представлений об экситонной природе спектров предсказано присутствие в антенном комплексе гелтамеров пигмента.
7. Показано, что в агрегации молекул бактериохпорофилла а, принадлежащих комплексу В850 пурпурных бактерий, участвуют хромофорные группы, находящиеся на нескольких полипептидах комплекса, в то время как пигментные агрегаты Хл а^Ь-протеина по своей величине не превосходят число хромофорных групп, находящихся на одном полипептиде.
8. Предложен показатель плотности упаковки хромофоров в свето-собирающих комплексах. С показателем связаны содержание хромофорных групп и образование надмолекулярных белковых структур у фотосинтетических антенн. Показано, что многообразию антенных комплексов соответствует многообразие кластерного строения хромофоров.
9. Предложена схема эволюционного формирования светособираю-щих комплексов оксигенного фотосинтеза (фикобилипротеины, Хл а/Ь- и Хл а/с-протеины), в которой: 1) обосновывается независимое от двух других пигментных линий происхождение фикобилипротеиновой ветви кисло-родвыделяющих фотосинтетиков; 2) предлагается объяснение преимущественной связи антенных комплексов с фотосистемой II; 3) объясняется отсутствие фикобилипротеинов и Хл а/с-протеина у растений, вышедших на сушу.
СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ
Монографии
1. Стадничук И.Н. "Фикобилипротеины" (Ред. В.Я.Быховский). Итоги науки и техники, Сер. Биологическая химия, т. 40, М. Изд. ВИНИТИ, 1990, 194 стр.
2. Стадничук И.Н. "Фикобиписомы", (Ред. В.Я.Быховский) Итоги науки и тех-
ники, Сер. Биологическая химия, т. 46, М. Изд. ВИНИТИ, 1991, 176 стр.
Обзоры
3. Стадничук И.Н., Гусев М.В. Фикобилипротеины сине-зеленых, красных и криптофитовых водорослей. Биохимия, 1979, т. 44, № 4, с. 579-593.
4. Стадничук И.Н. Биогенез линейных тетрапирролов-фикобилинов. Научн. докл. высшей школы. Биол. науки, 1988, № 2, с. 213-227.
5. Stadnichuk I.N. Phycobiliproteins: detenu ¡nation of chromophore composition and content Phytochem. Analysis, 1995, v. 6, № 6, p. 281-288.
Экспериментальные работы
6. Литвин Ф.Ф., Стадничук И.Н. Измерение второй производной спектров люминесценции хлорофилла а в клетках фотосинтезирующих организмов. Докл. МОИП, Общая биология, М. Изд. МГУ, 1972, с. 22-23.
7. Стадничук И.Н., Шубин В.В., Синещеков В.А., Литвин Ф.Ф. Изучение струк-
туры спектров люминесценции фотосинтезирующих организмов в модельных системах методом производной спектроскопии. Докл. МОИП, Общая биология, М. Изд. МГУ, 1974, с. 37-38.
8. Литвин Ф.Ф., Беляева О.Б., Гуляев Б.А., Карнеева Н.В., Синещеков В.А.,
Стадничук И.Н., Шубин В.В. Система нативных форм хлорофилла, ее роль в первичных процессах фотосинтеза и развитие в процессе зеленения листьев растений. Сб. "Хлорофилл", Минск. Изд. "Наука и техника", с. 215-231.
9. Стадничук И.Н. Структура спектров флуоресценции фотосинтезирующих организмов. Автореф. диссертации на соискание ученой степени канд. биол. наук. М. 1974, 26 с.
10. Беляева О.Б., Карнеева Н.В., Стадничук И.Н. Динамика накопления нативных форм хлорофилла от начальных стадий до завершения процесса зеленения этиолированных листьев. Биохимия, 1975, т. 40, N 5, с. 951-961.
11. Литвин Ф.Ф, Стадничук И.Н., Шубин В.В. Вторая производная спектров флуоресценции хлорофилла а и сопровождающих пигментов в высших растениях и водорослях. Научн. докл. высшей школы. Биол. науки, 1976, N 9, с. 36-46.
12. Рубин Б.А., Перова И.А., Воронков Л.А., Гуляев Б.А., Стадничук И.Н. Спектральные характеристики фотосистем, выделенных из хлороппас-тов здоровых и пораженных вертициллезным вилтом листьев хлопчатника. Научн. докл. высшей школы. Биол. науки, 1976, N 11, с. 35-41.
13. Стадничук И.Н., Литвин Ф.Ф. Разложение на компоненты спектров поглощения и флуоресценции зеленых бактерий. Биофизика, 1977, т.22, N 1, с. 170-174.
14. Стадничук H.H., Литвин Ф.Ф., Спектры поглощения, флуоресценции и возбуждения флуоресценции хлорофилла с в клетке. Биофизика, 1977, т. 22, N 3, с. 541-542.
15. Литвин Ф.Ф., Стадничук И.Н., Круглое В.П. Разложение на компоненты спектров поглощения и флуоресценции хлорофилла а в клетке. Биофизика, 1978, т. 23, N 3, с. 450-455.
16. Литвин Ф.Ф., Стадничук И.Н. О соблюдении соотношения Степанова для параметров спектров поглощения и флуоресценции хлорофилла а в растворе и клетке. Биофизика, 1978, т. 23, N 4, с. 651-656.
17. Стадничук И.Н., Минеева Л.А., Гусев М.В. Хромофорный состав и природа спектров поглощения фикобилипротеидов. Биохимия, 1980, т. 45, N 9, с. 1560-1567.
18. Стадничук И.Н., Минеева Л.А. Спектры флуоресценции фикобилипротеидов. Биофизика, 1980, т. 25, N 4, с. 727-728.
19. Стадничук И.Н., Шутилова Н.И. Структура спектров поглощения и флуоресценции и пигментная организация комплекса хлорофилла-антенны высших растений. Биофизика, 1980, т. 25, N 5, с. 781-786.
20. Литвин Ф.Ф., Стадничук И.Н. Длинноволновые формы предшественника хлорофилла в этиолированных листьях и система натовных форм протохлорофиллида. Физиология растений, 1980, т. 27, N 5, с. 1024-1031.
21. Stadnichuk I.N., Gusev M.V. Absorption spectra and molecular organization of photosynthetic pigments in light-harvesting complexes. Photosynthetica, 1981, v. 15, N2, p. 221-230.
22. Stadnichuk I.N. Pigment-protein Komplexe in Pro- und Eukarioten. Colloqia Pflanzenphysiologie, Berlin, Humboldt Universität Verlag, Berlin, 1982, S. 144-147.
23. Hoxterman E., Wemcke W., Stadnichuk I.N., Lau A., Hoffmann P. Reso-nanse coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) of chlorophyll. I. A Raman spectroscopic method for characterization of chlorophyll in vivo using excitation in the red band. Studia Biophysica, 1982, v. 92, N 3, p. 147-158.
24. Hoxterman E., Lau A., Stadnichuk I.N., Hoffmann P. Resonance coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) of chlorophyll. II.CARS-spectra of chlorophyll-protein complexes after ruby lazer excitation in the red band. Studia Biophysica, 1982, v. 92, N 3, p. 159-168.
25. Hoxterman E., Lau A., Stadnichuk I.N., Hoffmann P. Resonance coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) of chlorophyll. III. Influence of dena-turation on the resonance CARS-spectra of chlorophyll-protein complexes. Studia Biophysica, 1982, v. 92 N 3, p. 169-275.
26. Стадничук И.Н., Захарова Н.И. Полипептидный состав пигмент-белкового комплекса фотосистемы I и вспомогательного хлорофилл а/Ь-содержащего комплекса высших растений. Биохимия, 1983, т. 48, N 6, с. 1052-1054.
27. Стадничук И.Н., Одинцова Т.А., Стронгин А.Я. Молекулярная организация и хромофорный состав R-фикоэритрина красной водоросли Cal-lithamnion corymbosum. Мол. биология, 1984, т. 18, N 2, с. 343-349.
28. Стадничук И.Н., Абдурахманов И.А., Кузнецова Н.Ю., Ерохин Ю.Е. Молекулярная организация и спектры поглощения и флуоресценции комплекса В850 пурпурных бактерий. Мол. биология, 1984, т. 18, N 3, с. 685-690.
29. Stadnichuk I.N., Zakharova N.I. Universality of polypeptide composition of pigment-protein complex of photosysteme I and light-harvesting chlorophyll а/Ь-protein complex in chloroplasts of pea. Photosynthetica, 1984, v. 18, N 1, p. 150-152.
30. Стадничук И.Н., Вальтер Г. Выделение и полипептидный состав протох-лорофилпид-голохрома этиолированных листьев пшеницы. Физиология растений, 1984, т. 31, N 5, с. 856-863.
31. Стадничук И.Н., Захарова Н.И. Полипептидный состав и распределение хлорофиллов а и b в светособирающем пигмент-белковом комплексе хлороппастов. Биохимия, 1984, т. 49, N 8, с. 1383-1385.
32. Hoxterman E., Wemcke W., Stadnichuk I.N., Lau A., Hoffmann P. Raman-spectroskopische Charakterisierung nativen Chlorophyll. Wissenschaft. Z. Humboldt-Univ. Berlin. Math.-Nat, 1984, B. 33, H. 4, S. 289-291.
33. Stadnichuk I.N., Romanova N.I., Selyakh I.O. A phycourobilin-containing phycoerythrin from the cyanobacterium Oscillatoria sp. Arch. Microbiol., 1985, v. 143, N 1, p. 20-25.
34. Стадничук И.Н. Эволюция фотосинтетического аппарата и пигмент-белковые комплексы. Материалы 1-й Всесоюзн. конференции по проблемам эволюции, Изд. МГУ, М. 1985, с. 203-204.
35. Стадничук И.Н., Романова Н.И., Селях И.О. Обнаружение фикоуроби-линсодержащего фикоэритрина у цианобактерии рода Oscillatoria. Микробиология, 1985, т. 54, N 6, с. 953-961.
36 Каракашев Г.В., Стадничук И.Н., Юрина Н.П., Одинцова М.С. Полипептиды тилакоидных мембран одноклеточной красной водоросли Cyanidi-ит caldarium. Биохимия, 1987, т. 52, N 9, с. 1485-1493.
37. Стадничук И.Н., Литвин Ф.Ф. Обнаружение миграции энергии от кароти-ноидов к протохлорофиллиду в этиолированных листьях. Биофизика, 1989, т. 35, N 6, с. 1066-1068.
38. Стадничук И.Н. Эволюция хлоропластов как эндосимбионтных органелл эукариотов. Научн. докл. высш. школы. Биол. науки, 1989, N 6, с. 1066-1068.
39. Stadnichuk I.N. Chloroplast origin from photobacteria. Abstracts of the IX International Conference on the Origin of Life, Prague, 1989, p. 127.
40. Stadnichuk I.N. A new CU-phycoerythrin from the cyanobacteria Oscillatoria annae. Abstracts of the XX FEBS Meeting, Budapest, 1990, p. 64.
41. Стадничук И.Н., Ковалев Ю.В., Красновский A.A. мл. Обнаружение фосфоресценции R-фикоэритрина. Докл. АН СССР, 1992, т. 332, N 1, с. 174 -177.
42. Stadnichuk I.N., Kovalev Yu. V. Krasnovsky A.A. Jr. Phosphorescence spectra of R-phycoerythrin. Abstracrs of the XI International Congress on Photobi-ology, Kyoto, 1992, p. 134.
43. Стадничук И.Н., Хохпачев A.B., Тихонова E.B. Хромофорный состав у-полипептидов R-фикоэритрина. Мол. биология, 1993, т. 27, N 3, с. 552-560.
44. Стадничук И.Н. CU-фикоэритрин пресноводной синезеленой водоросли рода Oscillatoria. Докл. АН России, 1993, т. 338, N 2, с. 259-262.
45. Stadnichuk I.N., Kovalev Yu.V., Krasnovsky A.A. Jr. Phosphorescence of R-phycoerthrin. J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 1993, v. 19, p. 15-18.
46. Stadnichuk I.N. CU- and C-phycoerythrins of freshwater cyanobacterium Oscillatoria annae. Photosynthetica, 1993, v. 29, N 1, p. 55-61.
47. Schimek C., Stadnichuk I.N., Reuter W., Wehrmeyer W. Pigment-protein complexe of photosynthesis in cryptohycean algae. Abstracts of the V Congress of the European Society for Photobiology, Marburg, 1993 p. 73.
48. Stadnichuk I.N. Blue-green, red and cryptophyte algae: evolution of phycobil-iproteins. Abstracts of the XV International Botanical Congress, Tokyo, 1993, p. 87.
49. Stadnichuk I.N. Evolution of chloroplasts. Why higher plants do not contain phycobiliproteins and chlorophyll c. Abstracts of the XV International Botanical Congress, Tokyo, 1993, p. 88.
50. Stadnichuk I.N., Khokhlachev A.V., Tikhonova E.V. Chromophore content of R-phycoerythrin polypeptides. J. Photochem. Photobiol. B:Biol., 1993, v. 18, p. 169-175.
51. Schimek C., Stadnichuk I.N., Knaust R., Wehrmeyer W. Detection of chlorophylle and magnesium-2,4-divinylpheoporphyrin as monomethylesterin cryp-tophytes. J. Phycol. 1994, v. 30, N 4, p. 621-627.
52. Stadnichuk I.N., Karapetyan N.V. Evolution of antenna pigment-protein complexes of oxygenic photosynthesis. In: Evolutionary Biochemistry and Related Areas of Physicochemical Biology, (Ed. B.Poglazov et al.), Bach Inst of Biochemistry and ANKO, M. 1995, p. 219-228.
53. Stadnichuk I.N. Absorption spectra of phycobiliproteins with three chromophore groups per (ap)-monomer. Photosynthetica, 1996, In press.
В названиях пигмент-белковых комплексов использованы сокращения:
Бхл а-лротеин - бакгериохлорофилл а-лротеин;
Хл a/b-протеин - хлорофилл а/Ь-лротеин;
Хл а/с-протеин - хлорофилл а/с-протеин.
Хл а/Ь/с-протеин - хлорофилл а/Ь/с-протеин
-
Стадничук, Игорь Николаевич
-
доктора биологических наук
-
Москва, 1996
-
ВАК 03.00.04
- Фотодеструкция пигментов в клетках цианобактерий Awabaena variabilis и Synechococcus elongatus
- Изучение фикоэритрин-содержащих "пурпурных" цианобактерий
- Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах
- Механизм двухфотонного возбуждения светособирающих комплексов фотосинтезирующих пурпурных бактерий
- Исследование цианобактерий рода Prochlorothrix
