Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах

Максимов, Евгений Георгиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах
ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах"

На правах рукописи

Максимов Евгений Георгиевич

МИГРАЦИЯ ЭНЕРГИИ ВОЗБУЖДЕНИЯ В НАТИВНЫХ И ГИБРИДНЫХ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИХ АНТЕННЫХ КОМПЛЕКСАХ

Специальность: 03.01.02. - "Биофизика"

1 О НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2011

4859590

Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор физико-математических наук, профессор Пащенко Владимир Захарович

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН Рубин Андрей Борисович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук

Разживин Андрей Павлович

кандидат биологических наук Шубин Владимир Вениаминович

Ведущая организация:

Институт фундаментальных проблем биологии РАН

Защита состоится 15 декабря 2011 года в _ часов _ минут на заседании

Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском Государственном Университете им. М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ, биологический факультет, кафедра биофизики, аудитория "Новая",

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан_октября 2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

М. Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фотосинтез - совокупность процессов поглощения, превращения использования энергии квантов света в различных эндергонических реакциях, в том исле преобразование углекислого газа в органические вещества (Рубин, 2000). Первичные роцессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются а тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные комплексы фотосистемы (ФС2), цитохрома 6</и фотосистемы 1. Известно, что эффективность разделения зарядов реакционных центрах (РЦ) фотосинтеза близка к 100 %. Высокий квантовый выход бразования первичной ион-радикальной пары в РЦ позволяет рассматривать их в качестве ерспективных фотопреобразователей световой энергии в электрическую. Расчеты оказывают, что при использовании этих природных «генераторов» коэффициент олезного действия фотопреобразователя может быть существенно выше, чем у лучших овременных солнечных батарей (Ооуогоу, 2007). За последние годы было осуществлено есколько попыток получения электрического тока с помощью наноразмерных устройств, ключающих фотосинтетические РЦ, у которых хиноны замещены синтетическими кцепторами электронов, соединенными с электродом посредством «молекулярных роводов» (ТегаваИ, 2006). Общим недостатком подобных устройств является ничтожно алая поглощающая способность тонких слоев изолированных РЦ, что существенно нижает эффективность и целесообразность применения таких систем для получения ектрического тока. Очевидна необходимость создания искусственных ногокомпонентных энергопреобразующих устройств, способных эффективно поглощать олнечную энергию и преобразовывать её в электрохимический потенциал.

Современные исследования показывают, что для увеличения поглощающей пособности изолированных РЦ могут быть использованы полупроводниковые анокристаллы, или квантовые точки (КТ). КТ в роли искусственных антенных омплексов могут быть перспективны, только если они способны обеспечить ффективность переноса энергии к акцепторам, сравнимую с таковой в природных ветосборщиках, например, в таких как фикобилисомы цианобактерий.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось сравнение процессов миграции нергии в нативных и гибридных антенных комплексах. Для осуществления цели были оставлены следующие задачи:

1. Исследовать эффективность переноса энергии от фикобипротеинов к хлорофилл реакционных центров ФС2 у Synechocystis sp. РСС6803 и её мутантов отличающихс размером фикобилисом.

2. Изучить процессы миграции энергии в гибридных комплексах типа КТ - природнь ПБК и сравнить полученные данные с результатами исследования нативны светосборщиков.

3. Изучить влияние температуры на процессы миграции энергии в природны светосборщиках и в гибридных комплексах.

Научная новизна работы. В условиях in vitro были получены гибридные структуры полупроводниковых (CdSe/ZnS) квантовых точек и природных пигмент-белковы комплексов. Впервые показано, что в полученных структурах происход высокоэффективный перенос энергии от доноров (КТ) к акцепторам (фикоэритри комплексы ядра ФС2) по индуктивно-резонансному механизму. Установлено, ч увеличение эффективного сечения возбуждения флуоресценции комплексов ФС2 за сч взаимодействия с КТ приводит к увеличению скорости восстановления первичны акцепторов электрона. Сравнение КТ и природных ПБК - фикобилипротеинов показал что КТ не уступают нативным ПБК по эффективности светосбора. Установлено, ч длительность (тфЛ) флуоресценции аллофикоцианина (АФЦ) зависит от скорост замораживания. Предложен механизм взаимодействия хромофоров и водно-белково матрицы, объясняющий влияние температуры и скорости замораживания на тфл АФЦ.

Научно-практическая ценность работы. Полученные результаты расширя современные представления о механизмах взаимодействия хромофоров и апопротеино фикобилипротеинов и важны для понимания процессов преобразования энергии фикобилисомах цианобактерий. Результаты исследования гибридных комплексов полупроводниковых нанокристаллов и природных ПБК могут быть использованы биотехнологии для создания гибридных фотопреобразователей энергии ил высокочувствительных биофотосенсоров. Обнаруженная температурная зависимост времени жизни флуоресценции АФЦ может служить параметром в тест-системах дл оценки скорости замораживания.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на XIX Пущинских чтения по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных природных системах» (г. Пущино, 2009); 15-ом международном конгрессе по фотосинтез

. Пекин, Китай, 2010); конференции молодых ученых в рамках Rusnanoforum 2010 (г. осква, 2010); международной конференции «Photosynthesis for sustainability» (г. Баку, зербайджан, 2011), а также докладывались на семинарах кафедры биофизики иологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 6 в реферируемых урналах.

Сокращения, принятые в работе. ПБК - пигмент-белковый комплекс; ФС1 -отосистема 1; ФС2 - фотосистема 2; ФБС - фикобилисома; ФЭ - фикоэритрин; ФЦ -икоцианин; АФЦ - аллофикоцианин; ОСР - оранжевый каротин-протеин; WT - дикий ш Synechocystis sp. РСС 6803; СК, PAL - мутанты Synechocystis sp. РСС 6803 лишенные икоцианина и фикобилисом, соответственно; APSI/APSII - мутанты Synechocystis sp. РСС 03, лишенные ФС1 и ФС2; КТ 530 (или 630) - квантовые точки с максимумом эмиссии и 530 (или 630) нм.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах ашинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, зультаты и их обсуждение, заключение, выводы и список литературы. Работа содержит рисунка и 5 таблиц. Список литературы включает 130 источников.

Во введении обоснована актуальность темы диссертации, сформулированы цель и новные задачи, показана научная новизна и практическая значимость работы. В главе 1 редставлен обзор литературы, в котором отражены основные современные подходы к сследованию миграции энергии в гибридных структурах. В главе 2 изложены ^перементальные методики, используемые в работе. В главе 3 изложены основные зультаты и их обсуждение.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования служили клетки дикого типа Synechocystis sp. РСС 6803, оторые выращивали в модифицированной среде BG-11 (Ripka, 1979) при 30 °С и остоянном освещении люминесцентными лампами 40 мкЭ м-2 с'. Мутант СК, лишенный Ц, и мутант PAL, полностью лишенный фикобилисом выращивали в среде BG-11, одержащей удвоенную концентрацию NaN03. Мутант СК выращивали в присутствии анамицина, мутант PAL - в присутствии спектиномицина и хлорамфеникола. Мутанты

ЛР81/ЛР8П, лишенные ФС1 и ФС2 выращивали в среде ЕЮ-И, содержащей глюкоз спектиномицин, эритромицин и хлорамфеникол при освещенности 5 мкЭ м~2 с-1.

Культуру Acaryochloris marina выращивали в искусственной морской воде п|

температуре 28 °С и постоянном освещении 5 мкЭ м~2 с4 и аэрации (Larkum, 2002).

Одноклеточные цианобактерии Gloeobacter violaceus выращивали в стационарн^ условиях также в среде BG-11. Фикоэритрин из G. violaceus выделяли методе анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (Guglielmi, 1981).

Аллофикоцианин (АФЦ) получали из супернатанта разрушенных во Френч-прес клеток нитчатой цианобактерии Arthrospira platensis с использованием тр последовательных хроматографических процедур (Gottschalk, 1993).

Gloeobacter violaceus Í5T

®0 о

[о, <! Г J

Фотосистема 2

Гибридные системы

КТ 630

КТ 530

P6S0

КТ530

JÍ3

Synechocystis sp. РСС 6803

о оьО о

( Рбао ( РбЗО S

1°' J «J U J

Дикий тип

СК

ÜPSI/ÜPSII

PAL

Рис. 1. Схематическое представление объектов исследования. Показано строение: антенш комплексов цианобактерии Gloeobacter violaceus; Synechocystis sp. РСС 6803 и её мутантов С PAL и APSI/APSH; гибридных структур: 1 - КТ 630 + ФС2, 2 - КТ 530 + фикобилисома A. marir^ 3 - КТ 530 + фикоэритрин.

В работе использовали водорастворимые квантовые точки с ядром из CdSe/Zn^ покрытые гидрофильной оболочкой с карбоксильными группами двух типов, обладающ^

аксимальной интенсивностью флуоресценции при 530 и 630 нм (Sukhanova, 2001) (см. ис. 1).

Спектры поглощения регистрировали с помощью спектрофотометров Hitachi - 557 Япония) и Ocean Optics (США). Спектры флуоресценции измеряли на пектрофлуориметре Horiba Jobin Yvon FluoroMax-4 (Франция).

Кривые индукции флуоресценции регистрировали с помощью приборов Handy-PEA

Hansatech, Великобритания), FIRe (США) и флуориметра высокого временного

азрешения, разработанного на кафедре биофизики биологического факультета МГУ им.

омоносова (РФ). При анализе индукционных кривых флуоресценции использовали

одход, основанный на предположении, что первая (быстрая) стадия индукционной кривой

арактеризует восстановление QA (т.е. переход РЦ в «закрытое» состояние), последующие

едленные стадии характеризуют восстановление QB и другие процессы (Falkowski, 1993).

ачальный участок кривой индукции флуоресценции аппроксимировали суммой __t_ __t_

кспонент: X(t) = 1 — [Bie~Ti + Вге тг], где S; - предэкспоненциальные факторы омпонент, Г( - соответствующие им времена (см. рис. 4). Поскольку, т2 более чем на |0ряд0К превосходит т1( экспоненциальные составляющие функции X(t) не 1ерекрываются во времени. Константа скорости фотохимической реакции ропорциональна плотности потока фотонов возбуждающего импульса /0 и эффективному ечению возбуждения флуоресценции РЦ ФС2 аФС2 (Falkowski, 1998), которое равно роизведению эффективного сечения поглощения и квантового выхода флуоресценции, оля РЦ ФС2 в закрытом состоянии X(t) может быть определена следующим образом:

X(t) = т=*± = 1 _ e-Wo»,

де оФС2 - эффективное сечение возбуждения флуоресценции, которое рассчитывали по ормуле аФСг = —, где - характерное время быстрой стадии индукции флуоресценции орофилла ФС2.

Мгновенные спектры флуоресценции с пикосекундным временным разрешением егистрировали с помощью измерительного комплекса на основе системы однофотонного чета Simple Tau 140 (Becker & Hickl, Германия). Для анализа кинетик затухания . луоресценции использовали двух- и трехэкспоненциальные модели и алгоритм

Левенберга-Марквардта для снижения х2 после деконволюции. Также для обработк мгновенных спектров флуоресценции использовали метод «глобального анализа» (Glob Lifetime Analysis), позволяющий рассчитать набор связанных (времен жизни компонен кинетики затухания флуоресценции т¡) и свободных параметров (амплитуд при различны длинах волн Зависимость Л ¡(Я) - графическое представление результато

глобального анализа, называют спектральным распределением компонент кинетик затухания флуоресценции (Decay Associated Spectra - DAS) (см. рис. 12). В системе переносом энергии DAS характеризуются положительными амплитудами компонент области эмиссии донора и отрицательными в области соответствующей флуоресценци акцептора.

Анализ полученных данных проводили при помощи пакетов программ Origin 8. (OriginLab Corporation, США) и SPCImage (Becker & Hickl, Германия) Globals Unlimite (Университет штата Иллинойс, Urbana, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Перенос энергии в фикобилисомах мутантов Synechocystis sp. РСС6803 с различным набором фикобилипротеинов

Известно, что в фотосинтетических мембранах цианобактерий перенос энергии о фикобилинов фикобилисом (донор - D) к хлорофиллу (акцептор - А) реакционных центро осуществляется по механизму Фёрстера (FRET) (см. рис. 2). Для описания донорн акцепторных взаимодействий обычно оценивают изменение интенсивност флуоресценции или времени жизни донора в присутствии акцептора и коэффициен усиления флуоресценции донора. В случае, когда спектры флуоресценции донора акцептора энергии перекрываются, а возбуждение флуоресценции акцептора происходит широком диапазоне длин волн, интенсивность регистрируемой флуоресценции можн описать уравнением:

//, = iff + Alfi = KVdaIoa - 10-£^!) + АК<ра1 о(1 - Ю-^1),

где iff - интенсивность флуоресценции донора в присутствии акцептора; /°¡ интенсивность флуоресценции акцептора; А - коэффициент усиления флуоресценци! акцептора; К - инструментальная константа; /0 - интенсивность возбуждающего света; q>d - квантовый выход флуоресценции донора в присутствии акцептора; еа, - коэффициен

экстинкции донора; cd, - молярная концентрация донора; I - длина оптического пути, кеизвестными параметрами уравнений являются ipia и А, поэтому аналитическое решение уравнения невозможно. Следовательно, в случае перекрывания спектров флуоресценции донора и акцептора, оценка миграции энергии в рамках теории Фёрстера с помощью

методов флуориметрии и тауметрии становится затруднительной. Именно к таким

Системам относятся фотосинтетические мембраны цианобактерий Synechocystis sp. РСС 5803, и её мутантов СК и PAL (см. рис. 1).

Донор

Акцептор

Chl'jRC Pheo Qft) k"23 = 600 ПС

k'oo = 1-7 HC ^

k\1, = 1.7 HC

k"32 =1 не" k"22 = 4 не

LChl(RC' Pheo QJ k34 = 170 ПС

Chi (RO Pheo )

рис, 2. Схема процессов преобразования энергии в антенных комплексах цианобактерии Acaryochloris marina (по F.-J. Schmitt et. al.).

i Альтернативным подходом для оценки эффективности миграции энергии является

анализ индукционных кривых флуоресценции. Известно, что рост интенсивности флуоресценции хлорофилла от минимального уровня F0 до максимального Fm Характеризует динамику накопления продуктов фотохимической реакции (Kautsky, 1931). -Ьценка миграции энергии возможна в приближении, когда константа флуоресценции

акцептора и скорости фотохимической реакции не зависят от константы скорости

миграции энергии, а захват энергии возбуждения осуществляется реакционными центрами

ТРЦ) ФС2 с эффективностью 100%. Тогда процесс миграции энергии от фикобилисом

;донор - Ю>) к хлорофиллу (акцептор - А) и затем к РЦ [PQ] можно представить в виде Ьхемы:

. IPQa] + hv

ki .

'[PQa

[PQa]<

kpn

,[P'QA]^i®A[P+QÄ

Скорость накопления состояния Р+(2д зависит от концентрации акцептора в возбужденном состоянии. Миграция энергии от донора к акцептору приводит к увеличению количества молекул акцептора в возбужденном состоянии, и, таким образом, к увеличению скорости образования фотопродуктов. Поскольку эффективное сечение

возбуждения флуоресценции сг непосредственно влияет на скорость восстановления

при освещении (Ра1коу/$1а, 1993), то в рамках данной модели коэффициент усиленш) флуоресценции А определяется отношением:

А = а,1'с2+ф1,с —1> Где аФС2+фБс и аФсг - эффективные сечения возбуждений

аФС2

флуоресценции ФС2 в присутствии ФБС и в отсутствии, соответственно.

Спектры поглощения цианобактерии ЗупесИосуяШ 6803 и её мутантов с дефектам^ фикобилисом представлены на рис. 3. Для сравнения приведен спектр поглощена^ водоросли ЫоеоЬасгег \iolaceus эр., обладающей полным набором фикобилипротеинов.

Установлено, что спектры флуоресценции РАЬ-мутанта в области 640-720 нм (пр^ возбуждении 400-600 нм) практически соответствуют спектрам флуоресценци* хлорофилла а; у СК-мутанта наблюдается значительная флуоресценция АФЦ, а у дикого типа - ФЦ и АФЦ, однако, интенсивность флуоресценции фикобилисом дикого тип^ значительно ниже, чем таковая у мутанта ДР81/АР8П, лишенного ФС1 и ФС2. Бед рассматривать ЗупесккувШ 6803 и её мутантов в рамках теории Фёрстера, тс флуоресценция РАЬ-мутанта соответствует флуоресценции акцептора (А) в отсутствий донора, мутант ДР81/ДР8Н можно рассматривать как донор (Ю) в отсутствии акцептора, дикий тип и мутант СК - как системы с разным соотношением А и О, в которые происходит перенос энергии.

Длина волны, нм

Рис. 3. Спектры поглощения клеток дикого типа Synechocystis sp. РСС 6803, мутанта СК, мутанту PAL и Gloeobacter violaceus sp. Спектры нормированы на поглощение при длине волны 680 нм (максимум поглощения хлорофилла а).

0,8-

0,4 -

0,2

10J

10"г 10"' Время, с

10"

10'

(Рис. 4. Кривые индукции флуоресценции цианобактерии Synechocystis sp РСС6803 и мутантов СК я PAL, полученные с помощью прибора Handy-PEA (возбуждение 655 нм). Минимальное значение флуоресценции (Fo) принято равным нулю, максимальное (соответствующее Fm) равным Единице. На вставке приведены результаты аппроксимации индукционной кривой суммой двух экспонент. Относительные погрешности определения Tj и т2 не превышают 2.4 и 5.9 %, ¡■оответственно. I

Процедуру регистрации спектров поглощения, флуоресценции и индукций ¡флуоресценции проводили на пяти культурах цианобактерий. Известно, что соотношение игорофилл/фикобилины у Synechocystis 6803 может изменяться в широких пределах даже три строгом соблюдении условий культивирования (Ripka, 1979), поэтому усреднение результатов, полученных на разных культурах, невозможно. Однако, во всех экспериментах наблюдались одинаковые тенденции. По этой причине, далее мы рллюстрируем характерные результаты на примере экспериментов из одной серии.

Экспериментальные кривые аппроксимировали суммой двух экспонент (рис. 4).

Результаты анализа индукционных кривых флуоресценции представлены в таблице 1.

[Таблица 1: Эффективные сечения возбуждения флуоресценции (а) ФС2 в исследуемых образцах.

Величины сечений возбуждения флуоресценции на длинах волн 455, 470, 589 и 655 нм рассчитаны 'по кривым индукции флуоресценции. Относительная погрешность не превышает 5 %.

Длина волны возбуждающего света, нм 455 470 589 655

<Тфсг™ТтЛ2 210 65 263 896

°ФС1СК{Х)Лг 175 65 67 220

<<тФаРА1ЮЛ2 170 60 57 83

Коэффициенты усиления флуоресценции А = "ФС2+ФБС — представлены в таблице №2.

<* ФС2

Таблица 2. Коэффициенты усиления флуоресценции ФС2 за счет миграции энергии о светособирающих комплексов (АФЦ + ФЦ дая WT, АФЦ для СК) по сравнению с мутантом PAL лишенным фикобилипротеинов, при различных длинах волн возбуждающего света Относительная погрешность не превышает 10 %.

Длина волны возбуждающего света, нм 455 470 589 65

АРС+ЛРС(Л) 0.24 0.08 3.61 9.7

АРС(Х) 0.03 0.08 0.18 1.6

Увеличение эффективного сечения возбуждения флуоресценции ФС2 наблюдаете только в областях спектра, соответствующих поглощению фикобилипротеинов (550 - 67 нм), присутствующих в ФБС цианобактерии, поэтому при возбуждении 470 нм аФС практически не отличаются. Проведенный анализ свидетельствует, что присутствие АФ повышает эффективность светосбора реакционными центрами ФС2 в 2.6 раз, а комбинаци АФЦ и ФЦ в фикобилисомах увеличивает эффективное сечение возбуждения ФС2 коэффициент усиления флуоресценции хлорофилла практически на порядок.

Расчет коэффициента усиления флуоресценции ФС2 позволяет, выполнив анали спектров флуоресценции, получить оценку квантового выхода флуоресценции донор энергии (ФБС) в присутствии акцептора (ФС2) (pda и, соответственно, определит эффективность миграции энергии от донора к акцептору как функцию тушени флуоресценции донора: Et = 1 — где <pd - интенсивность флуоресценции донора, <pda

интенсивность флуоресценции донора в присутствии акцептора. Для определения tp исследовали оптические свойства мутантов APSI/APSII, лишенных ФС1 и ФС2, т.е. н содержащих акцепторов энергии, и, в тоже время, имеющих набор фикобилипротеинов необходимых для сборки ФБС. Анализ спектров флуоресценции дикого типа, мутанта APSI/APSII и PAL позволил оценить тушение флуоресценции ФБС в присутствие ФС2 Значение Et в данном случае соответствует эффективности миграции энергии и составляе примерно 95 %. Анализ кинетики затухания флуоресценции ФБС мутанта APSI/ÁPS1 позволил определить время жизни флуоресценции tm, которое составило 1.83 ±0.1 не Эти оценки позволяют вычислить константу скорости миграции энергии кт = ———

tmCl-ВД

значение которой составило 1.04-1010 с"1.

Таким образом, эффективное сечение возбуждения флуоресценции хлорофилла ФС2 увеличивается с 83 ± 4 до 896 ± 27 А2 за счет миграции энергии возбуждения от природных

антенных комплексов - фикобилисом к ФС2, что приводит к десятикратному усилению интенсивности флуоресценции хлорофилла.

2. Исследование миграции энергии в гибридных системах из КТ и природных пигмент-белковых комплексов

Водорастворимый белок фикоэритрин (ФЭ) выполняет функцию светосборщика в природных антенных комплексах фотосинтеза - фикобилисомах, поглощая свет в области 50 - 570 нм и эффективно передавая энергию электронного возбуждения на другие фикобилипротеины. В водной среде свободный ФЭ агрегирует, образуя гексамеры в форме иска диаметром 11.5 нм и толщиной 6 нм; в центре диска имеется отверстие диаметром коло 3.5 нм (Bryant, 2010). В состав ядра ФС2 входят белки Dl, D2, ср43, ср47 и кислородвыделяющий комплекс. Каждый комплекс ФС2 содержит ~ 50 молекул хлорофилла и сохраняет способность к фотоиндуцируемому выделению кислорода Ramesh, 1997). Описанные комплексы являются наименьшими по размеру антенны частицами фотосинтетической единицы, обладающими характерной индукцией флуоресценции хлорофилла.

По сути, фикоэритрин и ядерные комплексы ФС2 представляют собой природные езоскопические наноструктуры. Именно поэтому они подходят для модельных кспериментов в качестве акцептора энергии возбуждения КТ. Функциональные группы рганической оболочки КТ (СОО~), доступные для электростатических взаимодействий с положительно заряженными аминокислотными остатками, обеспечивают самоорганизацию гибридных структур (Mattoussi, 2009).

Из спектров флуоресценции КТ и спектров поглощения природных ПБК (рис. 5) нами были рассчитаны соответствующие интегралы перекрывания: I = /J"Fd(Х)га(А)А4 dX, где Fd(X) - нормированный спектр флуоресценции донора, £0(Л) - молярный коэффициент экстинкции акцептора, Я - длина волны. Фёрстеровский радиус переноса энергии от КТ к ПБК был вычислен из соотношения R0 = ^8,8 X 10~2S(k2n~*(pdI'), где <pd - квантовый выход донора в отсутствие акцептора, п — показатель преломления среды, к2 -ориентационный фактор, который считали равным 2/3. Полученное значение R0 для системы КТ 530 - фикоэритрин составило 78.5 А, для системы КТ 630 - ядерный комплекс ФС2 Rg равен 52.3 А. Очевидно, что для обеспечения переноса энергии с КТ на ПБК

необходимо либо сближение в растворе молекул донора и акцептора на расстояния порядка й0, либо образование устойчивых гибридных комплексов белок - КТ.

■ 1 Поглощение КТ 530

■ 2 Флуоресценция КТ 530

3 Поглощение фикоэритрина

■ 4 Флуоресценция фикоэритрина

■ 1 Поглощение КТ 630

■ 2 Флуоресценция КТ 630 3 Поглощение ФС2

■ 4 Флуоресценция ФС2

500 550 Длина волны, нм

700 500 550 600 650 700 750

Длина волны, нм

Рис. 5. Слева: спектры поглощения и флуоресценции фикоэритрина и КТ 530, справа: поглощения и флуоресценция ядерных комплексов ФС2 и КТ 630. Спектры нормированы на соответствующий значения интенсивностей максимумов поглощения/флуоресценции. Максимальное знамени: относительной погрешности не превышает 3 %.

При добавлении белков к раствору КТ наблюдаются изменения, характерные для донорно-акцепторных взаимодействий - увеличение интенсивности флуоресценции ПБК снижение интенсивности собственной флуоресценции КТ. Каждый эксперимент повторял не менее пяти раз. Рассчитывали средние значения измеряемых величин, дисперсии I: соответствующие коэффициенты вариации, которые не превышали 7 - 9% (рис. 6, слева).

ш 15-

5 10-

-1 кривая зависимости свечения системы КТ+

—■— 1 флуореедзшия КГ

2 Тушгние фоусресцягции KTE=1-F£^Fcj

1,0

0.0 1,0x10" 2,0x10s 3,0x10s 4,0x10^

Кок^нтраиияФЭ, M

-0,4 g

0,0

0,0 1,0x10" 2,0x10"° 3,0x10s 4,0x10s

Рис. 6. Слева: изменение интенсивности свечения в полосе 570 нм (максимум в спектре1 флуоресценции ФЭ) от концентрации фикоэритрина. Возбуждение флуоресценции 266 нм. Справа: зависимость интенсивности флуоресценции КТ и тушения флуоресценции КТ от концентрации акцептора ФЭ. Кривая Е=1-Рйа/Р11 рассчитана из изменений интенсивности полосы 530 нм (максимум флуоресценции КТ). Максимальная относительная погрешность не превышала 5 %.

Тушение флуоресценции КТ при добавлении повышающихся концентраций ФЭ рассчитывали по формуле ££ = 1—— т], где ^ - относительный квантовый выход флуоресценции донора, РЛа - относительный квантовый выход донора в присутствии

акцептора энергии, г] - коэффициент коррекции: г] —

¡1 ч, где Аех, АеХ

- поглощение акцептора и донора на длине волны возбуждения, А^т, А^т - поглощение

' акцептора и донора на длине волны регистрации сигнала флуоресценции (ВопззеуксЬ, 1997). Значение параметра Ес достигает 88 % для пары КТ 530 - ФЭ (рис. 6, справа), 1 аналогичный параметр для пары КТ 630 - ФС2 достигает 65 % (данные не приведены).

4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,51,0 0,50,0

I \

0,0

1,0x10 2,0x10 3,0x10"" Концентрация ФЭ, М

4,0x10"

Рис. 7. Коэффициент усиления флуоресценции фикоэритрина при добавлении КТ У530, Рассчитан по данным рис.6 (левая часть). Максимальное значение относительной погрешности не превышает 12 %.

Как известно, в исследуемых системах могут наблюдаться два типа тушения флуоресценции КТ - статическое и динамическое. Доказательством миграции энергии

Р ^ — рп

служит увеличение интенсивности флуоресценции акцептора энергии: А = ——, где Иа -

Ра

относительный квантовый выход акцептора, РаЛ - относительный квантовый выход акцептора в присутствии донора. Было установлено, что при оптимальном соотношении концентраций КТ и ФЭ интенсивность флуоресценции акцептора усиливается почти на 400 % (А = 3.89 ± 0.3, рис. 7). Значение коэффициента усиления флуоресценции А ядерных комплексов при образовании гибридных комплексов с КТ 630 достигало 0.65 (по данным представленным на рис.8).

Как видно из рис. 7, коэффициент усиления достигает максимального значения, и, затем, уменьшается до нуля, когда концентрация акцепторных хромофорных групп ФЭ в 8-10 раз превышает концентрацию КТ. Возможно, после достижения оптимального соотношения КТ/ФЭ, дальнейшее увеличение концентрации белка приводит к экранированию КТ. В результате снижается доля энергии, поглощаемой непосредственно КТ и затем мигрирующей к ФЭ. Действительно, при высоких концентрациях белка в спектре возбуждения флуоресценции ФЭ вклад от КТ не выявлен (данные не представлены).

10-

1 КТ 2ФС2

3 ФС2 + КТ (суммарный спектр)

4 ФС2 + КТ (эксперимент)

400

450 500

Длина волны, нм

550

600

Рис. 8. Спектры возбуждения флуоресценции растворов КТ, ядерных комплексов ФС2, гибридных комплексов КТ ЯбЗО и ядерных комплексов ФС2. Для сравнения приведена сумма спектров возбуждения растворов квантовых точек и ядерных комплексов ФС2. Флуоресценцию регистрировали при 685 нм.

Сокращение тфл донора и увеличение Тфд акцептора являются характерными отличиями динамического тушения флуоресценции от статического (Вавилов, 1940). Поэтому измерение времени жизни флуоресценции необходимо для определения механизма тушения и вычисления эффективности миграции энергии. Были выполнены эксперименты по измерению длительности флуоресценции КТ, ФЭ и их гибридных комплексов (рис. 9). Кинетики аппроксимировали суммой двух экспонент. Среднее время жизни

длительность, а; -

флуоресценции рассчитывали по формуле: та„ = где Т;

а1+а2

амплитуда I компоненты кинетики затухания флуоресценции. Относительная погрешность определения та„ не превышает 5.4 %.

1.0

Флуоресценция КТ

Флуоресценция фикоэритрина

/ ' / / ' 7 ' 7 ' ✓

"7"

О 1000 2000 3000 4000 5000 6000

Время, пс

Рис. 9. Кинетики затухания флуоресценции квантовых точек, фикоэритрина, а также их гибридных комплексов. Двозб = 266 нм, А£имп = 50 пс. Область наблюдения 530 нм (максимум ' эмиссии КТ): ПГШ КТ 530, СШ КТ 530 + фикоэритрин. Область наблюдения 570 нм (максимум

эмиссии фикоэритрина): ВЯИ фикоэритрин, I-1 КТ 530 + фикоэритрин. Сигнал флуоресценции

, квантовых точек и фикоэритрина разделяли с помощью граничных светофильтров. Интенсивности флуоресценции нормированы на соответствующие максимальные значения.

I Установлено, что при образовании гибридных структур, состоящих из КТ и ФЭ, КТ сокращается от 6.9 ± 0.3 до 4.1 ± 0.2 не, при этом хт ФЭ увеличивается от 2.0 ± 0.1 до 2.7 ± 0.1 не. Эффективность миграции энергии, вычисленная по формуле Еа = 1——г],

- составляет 35 %. Поскольку полное тушение Е( флуоресценции КТ достигает 88 %, то

I £

вклад статического тушения равен 53 %. Константа скорости переноса кТ =--— при

| максимальном значении Еа достигает 8.39-107 с"1.

Исследование индукционных кривых флуоресценции ФС2 показывает, что добавление КТ приводит к увеличению скорости нарастания интенсивности флуоресценции ФС2 (рис. 10), т.е. скорости восстановления первичных акцепторов. Начальные участки индукционных кривых аппроксимировали суммой двух экспонент (рис. 10). Таким I образом, были получены значения времен т1г характеризующие скорость восстановления

I первичного акцептора электрона. Затем, по формуле аФС2 = —, рассчитывали

ч'о

1 эффективные сечения возбуждения флуоресценции ФС2 при длине волны возбуждения 455 нм.

Время, мкс

Рис. 10. Кривые индукции флуоресценции комплексов ядра ФС2 и гибридных систем из ФС2 и КТ 11630. Возбуждение 455 нм, 1500 мкЭ. На вставке результаты аппроксимации индукционной; кривой суммой двух экспонент. Относительные погрешности определения и т2 не превышают 3.2 и 7.1 %, соответственно.

Экспериментально установлено, что эффективное сечение возбуждения флуоресценции

комплексов ядра ФС2 составляет 160 ± 5 А2 при 455 нм, добавление КТ приводит к

увеличению <тФС2 до 247 ± 8 А2. Таким образом, значение коэффициента усиления

флуоресценции ФС2, рассчитанное с помощью формулы: А = — равно 0.64 ±

0.04, что хорошо соответствует значениям А, полученным при анализе спектров, флуоресценции и возбуждения флуоресценции.

Оценка коэффициентов усиления флуоресценции позволила сравнить эффективность |

светосбора фикобилипротеинов и гибридных светособирающих комплексов. Как

отмечалось выше, коэффициент усиления флуоресценции ФС2 за счет АФЦ варьирует от1

0.2 до 1.63 в зависимости от длины волны возбуждающего света, соответствующий

коэффициент для пары КТ - ФС2 равен 0.64 ± 0.04. Данные, представленные в таблице 2,1

позволяют оценить коэффициент усиления флуоресценции комплекса ФС2 - АФЦ за счет

ФЦ, величина которого составляет 5,9. Значение коэффициента усиления флуоресценции

ФЭ за счет КТ достигает 3,9. Итак, КТ практически не уступают природным

светосборщикам по коэффициентам усиления флуоресценции акцептора. Очевидно, это

объясняется большими, по сравнению с природными антенными комплексами,

расстояниями между донором и акцептором энергии и, возможно, слабыми 1

электростатическими взаимодействиями между КТ и ПБК.

3. Влияние температуры на процессы миграции энергии в природных свегосборщиках и в гибридных комплексах

Для изучения зависимости эффективности миграции энергии от температуры в гибридных системах ФБС цианобактерии A.marina (максимум флуоресценции при 660 нм) инкубировали с КТ 530 (см. рис. 1). Кинетики затухания флуоресценции регистрировали в диапазоне 500 - 700 нм с помощью метода счета фотонов.

Увеличение скорости затухания флуоресценции КТ (рис. 11, слева) и рост интенсивности флуоресценции ФБС (см. раздел 3.3.2 диссертации) свидетельствуют о тушении флуоресценции КТ за счет высокоэффективного переноса энергии возбуждения к ФБС A. marina. Как известно, в результате переноса энергии от донора к акцептору, время жизни флуоресценции акцептора увеличивается. В данном эксперименте, напротив, наблюдается некоторое сокращение времени жизни флуоресценции ФБС в присутствии КТ за счет увеличения вклада быстрых компонент кинетики (см. рис. 11 справа и рис. 12 слева), что, вероятно, обусловлено изменением колебательных взаимодействий молекул хромофоров и белковой матрицы в гибридных комплексах ФБС-КТ, по сравнению с природными ФБС.

Среднее время жизни флуоресценции КТ в отсутствие ФБС та оказалось около 1.1 ±0.1 не. После добавления ФБС эта величина снизилась до rda = 230 ± 20 пс. Таким образом,

эффективность миграции энергии, рассчитанная по формуле Еа = 1 — —, составляет 0.78,

«а

соответствующее значение константы скорости миграции энергии кт достигает 3.22-109 с"'.

юооо

| 1000 в

I Рис. 11. Слева: кинетики затухания флуоресценции КТ на длине волны 530 нм после возбуждения лазерными импульсами (405 нм, 60 пс) при комнатной температуре в отсутствии (1) и в ' присутствии (2) ФБС A.marina. Справа: кинетики затухания флуоресценции ФБС на длине волны 660 нм при комнатной температуре в отсутствии (1) и в присутствии (2) КТ. Кинетики нормированы.

i Важная информация о миграции энергии в исследуемых комплексах была получена при регистрации кинетик затухания флуоресценции с помощью метода «глобального анализа».

Набор из 16 кинетик затухания флуоресценции в спектральном диапазоне 500 - 700 нм аппроксимировали суммой экспонент с фиксированными значениями времен ц, результаты аппроксимации использовали для построения зависимости предэкспоненциального фактора Л;(1) от длины волны (decay associated spectra - DAS -спектрального распределения компонент кинетики).

Рис. 12. Спектральное распределение компонент кинетики затухания флуоресценции (DAS) гибридной системы из квантовых точек и ФБС A.marina при возбуждении 405 нм при комнатной температуре (25 °С, слева) и -23 °С (справа).

На рисунке 12 представлены кинетики DAS гибридной системы КТ-ФБС при комнатной1 температуре (слева) и при -23 °С (справа). В обоих случаях для фитирования кинетик затухания флуоресценции использовали трехэкспоненциальную модель. При комнатной, температуре кинетика представлена компонентами с временами 140 пс (кривая 1), 640 nq (кривая 2) и 1.5 не (кривая 3). Спектр компоненты 140 пс характеризуется положительной полосой при 530 нм и отрицательной в области флуоресценции ФБС при 660 нм. Это свидетельствует о том, что миграция энергии от КТ к ФБС происходит в течение 140 пс. Амплитуды компонент с временами более 140 пс не превышали 10 % в области флуоресценции КТ, следовательно, более 90% всех КТ передает энергию на ФБС. Полученные времена затухания флуоресценции ФБС, равные 1.5 не, хорошо согласуются с литературными данными (Vermaas, 1991), а дополнительный компонент с временем 640 пс, вероятно, характеризует ФБС с измененной конформацией хромофора.

При -23 °С спектральное распределение компонент кинетики флуоресценции заметно1 изменяется (рис. 12, справа). Были обнаружены три компоненты: с временами 250 пс (кривая 1), 580 пс (кривая 2) и 2.5 не (кривая 3). Амплитуды отрицательных компонент в области флуоресценции ФБС (660 нм) значительно снижены по сравнению с таковыми при г 25 °С, что свидетельствует о нарушении переноса энергии от КТ к ФБС при температурах

260 пс

■6

500 550 600 650 700 Длина волны, нм

-5

500 550 600 650 700 Длина волны, нм

ниже точки замерзания воды. Большая, по сравнению с комнатной температурой, амплитуда компоненты с временем 580 пс (кривая 2) в области излучения ФБС (660 нм), вероятно, свидетельствует об увеличении количества ФБС с нарушенной конформацией.

< 20 пс

140 ПС

530 им 647 нм

Рис. 13. Схема переноса энергии в гибридных системах, состоящих из CdSe/ZnS квантовых точек и ФБС из A.marina. КТ, флуоресцирующие при 530 нм, передают энергию возбуждения на ФБС за время порядка 140 пс. Возбуждение распространяется по ФБС за времена порядка 20 пс. Максимумы в спектре флуоресценции ФБС - 647 и 660 нм соответствуют фикоцианину (ФЦ) и аллофикоцианину (АФЦ).

Таким образом, в гибридных комплексах перенос энергии от КТ к ФБС прекращается при температурах ниже температуры замерзания растворителя. Вероятно, это можно объяснить нарушением слабых электростатических взаимодействий КТ и ПБК.

Для изучения влияния температуры на эффективность миграции энергии исследовали кинетики затухания флуоресценции APS1/PS2 мутанта Synechocystis 6803 (см. рис. 1). Оказалось, что при замораживании миграция энергии в нативных антенных комплексах не только не прекращается, но и наблюдается увеличение её эффективности. 2200-,

" ■ « - . 3

£ 1200-о

ц 1000-ш ь

â а

« 1 - APS1/PS2 660 нм 2 - APS1/PS2 685 нм ■ 3 - АФЦ 660 нм

-200 -150 -100 -50 0 50

Температура, °С

Рис. 14. Изменение среднего времени жизни флуоресценции аллофикоцианина (кривая 1) и терминальных эмиттеров (кривая 2) APS1/PS2 мутанта Synechocystis 6803 при размораживании после быстрого замораживания. Для сравнения приведена аналогичная зависимость для АФЦ в растворе (кривая 3). Максимальное значение относительной погрешности не превышает 6.7 %.

Как следует из рисунка 14, быстрое замораживание приводит к сокращению среднего времени жизни флуоресценции аллофикоцианина APS1/PS2 мутанта Synechocystis 6803 в канале 660 нм (максимум флуоресценции АФЦ) в широком диапазоне температур, и, одновременно, к росту времени жизни флуоресценции в канале, соответствующем флуоресценции концевых эмиттеров (685 нм). Таким образом, наблюдаемое тушение флуоресценции АФЦ и увеличение тфл концевых эмиттеров при понижении температуры свидетельствует об увеличении эффективности миграции энергии от АФЦ к концевым эмиттерам. Полученные данные наглядно свидетельствуют о различии температурных зависимостей времени жизни флуоресценции АФЦ в фикобилисомах и в растворе (см. рис. 14, кривая 1 и 3, соответственно). Известно, что в фикобилисомах APS1/PS2 мутанта присутствует оранжевый каротин-протеин (ОСР) (Kirilovsky, 2008), который является тушителем флуоресценции ФБС. Вероятно, сокращение времен жизни флуоресценции АФЦ в составе фикобилисом, по сравнению с АФЦ в растворе, обусловлено взаимодействием ОСР и ФБС.

4. Температурная зависимость времени жизни флуоресценции аллофикоцианина

При комнатной температуре время жизни флуоресценции АФЦ та„ известно и составляет 1600 ± 200 пс (Barber, 1977). Нами показано, что при быстром замораживании раствора АФЦ с понижением температуры наблюдается увеличение времени жизни флуоресценции до 2100 ± 50 пс при - 180 °С (см. рис. 15, левая часть). Последующее размораживание образца приводит к уменьшению Tav с ростом температуры до исходной (1630 ± 24 пс) величины.

Температурная зависимость длительности флуоресценции АФЦ может быть разделена на три участка, (рис. 15): от + 30 до + 4 °С - снижение температуры приводит к увеличению та„ от 1.6 до 1.8 не, как при быстром, так и при медленном замораживании; от + 4 до - 15 °С - снижение температуры приводит к сокращению rav - незначительному при быстром и до 0.6 не при медленном замораживании; от - 15 до - 192 °С - снижение температуры приводит к плавному увеличению tav, примерно на 0.2 не. Показано, что при быстром замораживании с ростом xav наблюдается плавное уменьшение полуширины спектра флуоресценции АФЦ АХфл (рис. 15, справа). При медленном замораживании направление изменений ДЯ,д, противоположно таковому для rav. Рассчитанные коэффициенты корреляции температурных зависимостей таР и ААфл при быстром и

медленном замораживании составили - 0.89 и - 0.91.

- 1800-X

s и

ф 1600-о

§- 1400-1200-j

ь О

5 1000

с;

g 800

3 2 1

е ' 1 • • .

• • •..

* • • * « ¿

■ ■ •

■ ■

■ медленное замораживание, Na-Pi а

» быстрое замораживание, Na-Pi

медленное замораживание, 90% Глицерин

1 ' « . ■

■ ■ ■ ■ > -1-1->-1-1-1-1—

з 2 i

• • . • *

• •

• * г

• •/

И г

-»- быстрое замораживание, Na-Pi • /

• медленное замораживание, Na-Pi ---,-,-,-,---г-!

-2С0 -150 -100 -50 0 50 -200 -150 -100 -50 0 50

Температура, С Темлерэтура. "С

Рис. 15. Влияние скорости замораживания и растворителя на среднее время жизни флуоресценции АФЦ при А=660 нм (слева) и полуширину спектра флуоресценции (справа). Черные квадраты -медленное замораживание, Na-Pi буфер рН 7,0. Темно серые круги - быстрое замораживание, Na-Pi буфер рН 7,0. Светло-серые треугольники - медленное замораживание в 90% глицерине.

Увеличение zav на участках 1 и 3 при понижении температуры, вероятно, связано со снижением заселенности верхних колебательных уровней АФЦ. Наибольший интерес имеет изменение rav на участке 2 температурной зависимости при медленном замораживании образца. Именно в этом диапазоне температур происходит фазовый переход «лед-вода». Замена растворителя на 90 % глицерин или высушивание образца приводили к тому, что скорость замораживания переставала влиять на форму графика температурной зависимости, а именно - исчезало характерное для участка 2 сокращение

t UV ■

Для выяснения механизмов наблюдаемой температурной зависимости длительности флуоресценции аллофикоцианина от скорости замораживания исследовали флуоресценцию АФЦ, денатурированного 8 M раствором мочевины при рН 2.0. Концентрированный раствор мочевины является растворителем, в котором боковым группам полимерной цепи энергетически выгоднее взаимодействовать с молекулами растворителя, чем друг с другом. Поэтому в таких условиях происходит переход «глобула - клубок» (Финкельштейн, 2005). Известно, что при денатурации апопротеина хромофор фикоцианобилин переходит из линейной формы в скрученную, что сопровождается многократным сокращением квантового выхода флуоресценции АФЦ (Scheer, 2007).

Время, не

Рис. 16. Кинетики затухания флуоресценции нативного (кривая 1) аллофикоцианина и денатурированного в 8 М растворе мочевины при рН 2,0 (2) при комнатной температуре. Для сравнения представлена кинетика затухания флуоресценции АФЦ при медленном замораживании при -20 °С (3). Кинетики нормированы.

На рис. 16. представлена характерная кинетика затухания флуоресценции тримеров АФЦ в Na-Pi буфере. Как отмечалось ранее, время жизни флуоресценции нативного АФЦ tav составляет 1630 ± 24 пс при комнатной температуре. Денатурация АФЦ приводит к снижению значения та„ до 290 ± 17 пс. Медленное замораживание (кривая 2), также как и денатурация (кривая 3), приводит к сокращению длительности флуоресценции АФЦ. В случае, представленном на рис. 12, Tav, АФЦ составляет 630 ±21 пс.

По-видимому, медленное замораживание вызывает обратимое изменение конформации апопротеина АФЦ, которое приводит к изменению конформации хромофора. Существует несколько процессов, которые могут приводить к изменению конформации белковой части АФЦ. Во-первых, гидрофобные взаимодействия значительно ослабевают при снижении температуры. Происходящее при этом разрыхление нативной структуры белка приводит к появлению новых колебательных степеней свободы. Этим, вероятно, можно объяснить наблюдаемое уширение спектра флуоресценции АФЦ. Во-вторых, при медленном замораживании образуются крупные кристаллы льда. Возникновение такого кристалла во внутренней полости тримера АФЦ приводит к изменению геометрии белка и, как следствие, к изменению конформации хромофоров. Тепловые эффекты, сопровождающие эти перестройки, весьма малы, что характерно для структур, в которых изменение даже небольшого числа связей-фиксаторов влечет перестройку системы в целом (Чернавский, 1999). С этой точки зрения, фазовый переход воды может сопровождаться разрывом

небольшого количества водородных связей, фиксирующих а-спирали в структуре АФЦ относительно друг друга. В результате происходит изменение конформации хромофора, сопровождающееся резким изменением квантового выхода и времени жизни флуоресценции молекулы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью диссертационной работы было сравнение процессов миграции энергии в нативных антенных комплексах цианобактерий и в гибридных системах, состоящих из полупроводниковых квантовых точек и природных ПБК.

Определение эффективных сечений возбуждения флуоресценции позволило описать перенос энергии от ФБС к ФС2 в рамках теории Ферстера. Установлено, что аллофикоцианин увеличивает эффективное сечение возбуждения флуоресценции ФС2 в 2.6 раз, а сочетание аллофикоцианина и фикоцианина позволяет увеличить этот параметр на порядок. Показано, что метод световой индукции флуоресценции хлорофилла подходит для оценки донорно-акцепторных взаимодействий в гибридных системах, таких как КТ-ФС2. Сравнительный анализ полученных характеристик природных и гибридных антенных комплексов представлен в таблице 3.

Таблица 3. Сравнение характеристик антенных комплексов из нативных ПБК и полупроводниковых квантовых точек.

Нативные антенные Гибридные

комплексы антенные

комплексы

Расстояние между донором и акцептором 1-3 нм 3-8 нм

Максимальное значение эффективности 95 % 78 %

миграции энергии

Максимальное значение коэффициента 5.9 3.9

усиления флуоресценции акцептора

Константа скорости миграции энергии, с' П 1.02-Ю10 3.22-10"

При температурах ниже температуры Эффективность миграции Нарушается связь

замерзания растворителя энергии увеличивается на 15% между КТ и ПБК

Итак, квантовые точки практически не уступают фикобилипротеинам по величине коэффициента усиления флуоресценции акцептора энергии. Это позволяет рассматривать

квантовые точки как перспективные флуоресцентные зонды, которые могут быть использованы для создания гибридных структур с целью изучения процессов миграции энергии или создания гибридных фотопреобразователей энергии. Очевидно, что для увеличения эффективности миграции энергии в гибридных комплексах необходимо получить структуры, в которых КТ и ПБК находятся на малых расстояниях друг от друга, например, связаны ковалентно.

Показано, что причиной нелинейной температурной зависимости времени жизни и полуширины спектра флуоресценции АФЦ является нарушение нативной конформации апопротеинов, приводящее к изменению конформации хромофоров АФЦ при фазовых переходах растворителя.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что полупроводниковые квантовые точки образуют гибридные структуры с природными пигмент-белковыми комплексами, в которых происходит высокоэффективный перенос энергии.

2. Анализ кинетики световой индукции флуоресценции ФС2 БупесИосузШ 6803 показал, что эффективное сечение возбуждения флуоресценции ФС2 составляет 83 А2 при 655 нм. Аллофикоцианин увеличивает этот параметр до 220 А2, а сочетание аллофикоцианина и фикоцианина в фикобилисомах увеличивает аФС2 до 896 А2.

3. Показано, что увеличение эффективного сечения возбуждения флуоресценции ФС2 при образовании гибридных структур с квантовыми точками приводит к увеличению скорости восстановления первичных акцепторов электрона.

4. Установлено, что время жизни флуоресценции фикобилипротеинов обладает аномальной нелинейной температурной зависимостью времени жизни и полуширины спектра флуоресценции, чувствительной к скорости замораживания.

5. Сравнение характеристик природных и гибридных антенных комплексов показывает, что последние не уступают нативным ПБК по величинам коэффициентов усиления флуоресценции акцептора энергии.

6. Предложенный механизм изменения конформации апопротеинов и хромофоров аллофикоцианина при фазовом переходе вода - лед позволил объяснить зависимость времени жизни и полуширины спектра флуоресценции от температуры.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. E.G. Maksimov. F.I. Kuzminov, I.V. Konyuhov, I.V. Elanskaya, V.Z. Paschenko, Photosystem 2 effective fluorescence cross-section of cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 and its mutants, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. (2011), v. 104 (1-2), p. 285 - 291.

2. Е.Г. Максимов. T.C. Гостев, Ф.И. Кузьминов, H.H. Случанко, И.Н. Стадничук, В.З. Пащенко, А.Б. Рубин (2010) Гибридные системы из квантовых точек и фоточувствительного белка фикоэритрина, Российские Нанотехнологии, т. 5, № 7-8, с. 531-537.

3. E.G. Maksimov. V.Z. Paschenko, G. Renger, A.B. Rubin. Temperature dependent properties of allophycocyanin fluorescence. International Conference "Photosynthesis Research for Sustainability", Baku, Azerbaijan, July 24-30,2011, Book of Abstracts, p. 77.

4. E.G. Maksimov. V.Z. Pashchenko, A.B. Rubin. Quantum dots and phycoerythrin hybrid systems. The 15th International Congress Of Photosynthesis, August 22-27, 2010, Beijing, China, Book of Abstracts, p. 107.

5. Е.Г. Максимов. T.C. Гостев, Ф.И. Кузьминов, H.H. Случанко, Ф-Й Шмитт, Г. Ренгер, В.З. Пащенко, А.Б. Рубин. Исследование фотофизических свойств гибридных систем, состоящих из нанокристаллов, связанных с фотосинтетическими пигмент-белковыми комплексами // Сборник тезисов XIX Путинских чтений по фотосинтезу и Всероссийской конференции «Фотохимия хлорофилла в модельных и природных системах», Пущино, 2009.

6. И.Н. Стадничук, С.К. Жармухамедов, Е.Г. Максимов. В.З. Пащенко, М.Ф. Янюшин, Тушение флуоресценции фикобилисом оранжевым каротин-протеином, ДАН, 2011,439 (2) 270-273..

7. F.-J. Schmitt, E.G. Maksimov. Н. Suedmeyer, V. Jeyasangar, С. Theiss, V.Z. Paschenko, H.J. Eichler and G. Rengcr, Time resolved temperature switchable excitation energy transfer processes between CdSe/ZnS nanocrystals and phycobiliprotein antenna from Acaryochloris marina, Photon Nanostruct: Fundam Appl (2010), v. 9 (2), p. 190-195.

8. F.-J. Schmitt, J. Fuesers, H. Südmeyer, J. Börner, V. Jeyasangar, R. Olliges, E. G. Maksimov, M. Grehn, C. Theiss, V. Z. Paschenko, H. J, Eichler, and G. Renger, Simulations of Energy Transfer Processes along the Rod Shaped PBP and Chi d Antenna of A.marina, AIP Conf. Proc. November 10, 2010, V 1288, pp. 113-116.

9. Т. С. Гостев, Ф. И. Кузьминов, E. Г. Максимов. В. 3. Пащенко, В. В. Фадеев. Фитопланктон как флуоресцентный биоиндикатор качества природных вод. Сб.: Физические проблемы экологии (экологическая физика), 2008, Ks 15, с. 102-113, М.: Макс Пресс.

10. F.I. Kouzminov, E.G. Maximov. М.У. Gorbunov, V.V. Fadeev. Studying of photoprotection mechanisms in photosynthetic apparatus of cyanobacteria using non-linear laser fluorometry and variable fluorescence techniques. The XII International Conference on Laser Applications in Life Sciences (LALS-2010), June 9-11,2010, Oulu, Finland, Book of Abstracts, p. 267.

11. Миронов K.C., Максимов Е.Г.. Максимов Г.В., Бедбенов B.C., Лось Д.А. (2011) Обратная связь между текучестью мембран и транскрипцией гена desB, кодирующего соЗ-десатуразу жирных кислот у цианобакгерии Synechocystis. Молекулярная биология (в печати).

12.1. Stadnichuk, М. Yanyshin, Е. Maksimov, Е. Lukashev, S. Zharmukhamedov, I. Yelanskaya, V. Paschenko. Phycobilisomes in phenomena of short-term light adaptations. International Conference "Photosynthesis Research for Sustainability", Baku, Azerbaijan, July 24-30, 2011, Book of Abstracts, p. 101

Подписано в печать 24.10.2011 Печать лазерная цифровая Тираж 100 экз.

Типография Aegis-Print 115230, Москва, Варшавское шоссе, д. 42 Тел.: 8 (495) 785-00-38, 8 (926) 850-53-16 www.autoref.ae-print.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Максимов, Евгений Георгиевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Структурные и функциональные аспекты организации фотосинтетических мембран.

1.1.1 Представление о фотосинтетической единице.

1.1.2 Реакционный центр ФС2.

1.1.3 Фотосинтетический аппарат цианобактерий.

1.1.4 Фикобилипротеины.

1.2 Полупроводниковые нанокристаллы.

1.3. Методы исследования процесса переноса энергии.

1.3.1 Индукционный резонансный механизм переноса энергии.

1.3.2 Применение метода индукции флуоресценции для исследования переноса энергии.

1.4 Фазовые переходы в белковых молекулах.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Материалы.

2.2 Методы.

2.2.1 Абсорбционная спектроскопия.

2.2.2 Спектрофлуориметрия.

2.2.3 Измерения кинетики световой индукции переменной флуоресценции.

2.2.4 Мгновенные спектры флуоресценции.

2.2.5 Методика замораживания образцов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Эффективное сечение поглощения ФС2 Зупескосузйз зр. РСС 6803 и его мутантов.

3.2 Тушение флуоресценции фикобилисом оранжевым каротин-протеином

3.3 Гибридные системы из квантовых точек и пигмент-белковых комплексов.

3.3.1. Гибридные системы из КТ и фикоэритрина.

3.3.2 Гибридные системы из КТ и фрагментов фикобилисом.

3.3.3 Гибридные системы из КТ и ядерных комплексов ФС2.

3.4 Влияние скорости замораживания на время жизни флуоресценции аллофикоцианина.

3.5 Миграция энергии в фикобилисомах мутантов БупескосухИя яр. РСС 6803, лишенных фотосистем.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах"

Фотосинтез — совокупность процессов поглощения, превращения и использования энергии квантов света в различных эндергонических реакциях, в том числе преобразование углекислого газа в органические вещества [1]. Первичные процессы фотосинтеза в цианобактериях, водорослях и высших растениях осуществляются на тилакоидных мембранах, где локализованы трансмембранные комплексы фотосистемы 2 (ФС2), цитохрома и фотосистемы 1 [2]. Известно^ что эффективность разделения зарядовш.реакционных центрах фотосинтеза (РЦ) близка к 100 % [3]. Высокий квантовый? выход образования первичной ион-радикальной пары в РЦ позволяет рассматривать, их . в качестве перспективных фотопреобразователей световой энергии в электрическую. Расчеты показывают, что при использовании этих природных «генераторов»: .тока коэффициент полезного действия фотопреобразователя может, быть, существенно выше, чем у лучших современных солнечных батарей [,4];. Актуальность данного направления исследований , определена в< документе, называемом «Национальная; н ан отех н о л огическая инициатива; Путь к следующей промышленной революции» (США), и является общепризнанной. Аналогичная программа принята правительством России: За последние годы было осуществлено несколько попыток получения^ электрического тока с помощью наноразмерных устройств, включающих фотосинтетические РЦ, у которых хиноны замещены синтетическими акцепторами электронов, соединенными с электродом посредством «молекулярных проводов» [5]. Основным недостатком подобных устройств* является ничтожно малая поглощающая способность тонких слоев изолированных РЦ, что существенно снижает эффективность и целесообразность применения таких систем для получения электрического тока. Очевидна необходимость создания» искусственных многокомпонентных энергопреобразующих устройств, способных эффективно поглощать солнечную энергию и преобразовывать её в электрохимический потенциал.

Современные исследования показывают, что для увеличения поглощающей способности изолированных РЦ могут быть использованы полупроводниковые нанокристалльт, или так называемые квантовые точки (КТ) [4, 6]. Очевидно, что КТ в роли искусственных антенных комплексов могут быть перспективны, только если они могут обеспечить перенос энергии к акцепторам, сравнимый по эффективности и скорости с переносом, осуществляемым в природных светосборщиках, например, в таких как фикобилисомы цианобактерий.

Цель и задачи исследования

Целью работы являлось сравнение процессов миграции энергии в нативных и гибридных антенных комплексах.

Для осуществления цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать эффективность переноса энергии от фикобипротеинов к хлорофиллу реакционных центров ФС2 у Synechocystis sp. РСС6803 и её мутантов отличающихся размером фикобилисом.

2. Изучить процессы миграции энергии в гибридных комплексах типа КТ — природные ПБК и сравнить полученные данные с результатами исследования нативных светосборщиков.

3. Изучить влияние температуры на процессы миграции энергии в природных светосборщиках и в гибридных комплексах.

Научная новизна работы

В условиях in vitro были получены гибридные структуры из полупроводниковых (CdSe/ZnS) квантовых точек и природных пигмент-белковых комплексов. Впервые показано, что в полученных структурах происходит высокоэффективный перенос энергии от доноров (КТ) к акцепторам (фикоэритрин, комплексы ядра ФС2) по индуктивно-резонансному механизму. Установлено, что увеличение эффективного сечения возбуждения флуоресценции комплексов ФС2 за счет взаимодействия с КТ приводит к увеличению скорости восстановления первичных акцепторов электрона. Сравнение КТ и природных ПБК — фикобилипротеинов показало, что КТ не уступают нативным ПБК по эффективности светосбора. Установлено, что длительность (Тфл) флуоресценции аллофикоцианина (АФЦ) зависит от скорости замораживания. Предложен механизм взаимодействия хромофоров и водно-белковой матрицы, объясняющий влияние температуры и скорости замораживания на тфл АФЦ.

Научно-практическая ценность работы

Полученные результаты расширяют современные представления о механизмах взаимодействия хромофоров и апопротеинов фикобилипротеинов и важны для понимания процессов преобразования энергии в фикобилисомах цианобактерий. Результаты исследования гибридных комплексов из полупроводниковых нанокристаллов и природных ПБК .могут быть использованы в биотехнологии для создания гибридных фотопреобразователей энергии или высокочувствительных биофотосенсоров. Обнаруженная температурная зависимость времени жизни флуоресценции АФЦ может служить параметром в тест-системах для оценки скорости замораживания.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения и списка литературы.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Максимов, Евгений Георгиевич

выводы

2. Анализ кинетики световой индукции флуоресценции ФС2 БупесИосуБИз 6803 показал, что эффективное сечение возбуждения флуоресценции ФС2 составляет 83 А2 при 655 нм. Аллофикоцианин увеличивает этот параметр до 220 А2, а сочетание аллофикоцианина и фикоцианина в фикобилисомах увеличивает (ТФС2 до 896 А2.

6. Предложенный механизм изменения, конформации апопротеинов и хромофоров аллофикоцианина при фазовом переходе вода - лед позволил объяснить зависимость времени жизни и полуширины спектра флуоресценции от температуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основной целью проведенного комплексного исследования являлось сравнение процессов преобразования энергии и эффективности светосбора в нативных антенных комплексах цианобактерий и в гибридных системах, состоящих из полупроводниковых квантовых точек и природных пигмент-белковых комплексов.

С помощью1 метода индукции флуоресценции хлорофилла проведена оценка^ эффективного сечения флуоресценции реакционных центров ФС2 с различными размерами светособирающей антенны. Определение эффективных сечений1 флуоресценции позволило рассмотреть перенос энергии от ФБС к ФС2 в рамках теории Ферстера [129]: Установлено, что аллофикоцианин увеличивает эффективное сечение флуоресценции ФС2 в 3 раза, а сочетание аллофикоцианина1 и фикоцианина позволяет увеличить этот параметр на- порядок. Показано, что данный метод подходит для оценки донорно-акцепторных взаимодействий в гибридных системах, таких как КТ-ФС2. Метод индукции флуоресценции позволяет оценить эффективность, миграции! энергии, коэффициент усиления флуоресценции акцептора и> соответствующие константы скорости миграции энергии даже в случае полного перекрывания спектров флуоресценции КТ и поглощения ФС2.

Исследование взаимодействия фикобилисом и оранжевого каротин-протенина в рамках теории Штерна-Фольмера показало, что для снижения интенсивности флуоресценции на 35%, сопоставимого с тушением in vivo в? клетках цианобактерий, в растворах требуются концентрации ОСР, многократно (в 20 раз) превышающие физиологические.

Таким образом, было проведено исследование как фотохимического тушения флуоресценции фикобилисом, т.е. за счет захвата энергии возбуждения реакционными центрами ФС2, так и нефотохимического, т.е. за счет взаимодействия ФБС и ОСР. Полученные данные позволяют глубже создания гибридных фотопреобразователей энергии. Используемые в данной работе КТ образуют гибридные комплексы с ПБК за счет электростатических взаимодействий, поэтому связь между КТ и ПБК может быть нарушена даже при таком слабом воздействии как понижение температуры ниже точки замерзания раствора. Показано, что замораживание приводит к увеличению эффективности миграции энергии в нативных ФБС примерно на 15%, при аналогичном воздействии в гибридных структурах из КТ и фикобилипротеинов перенос энергии полностью прекращается [130].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Максимов, Евгений Георгиевич, Москва

1. Рубин А.Б. (1999) Биофизика, т. 2.: Теоретическая биофизика: Учебник для вузов. -2-е изд., М.: «Книжный дом «Университет»,. 468 с.

2. Говинджи (1987) Фотосинтез: в 2-х томах, Т. 1. Пер. с англ. Под ред. Говинджи. М.: Мир, 728 с.

3. Рубин А.Б, Кренделева Т.Е. (2004) Регуляция первичных процессов фотосинтеза. Биофизика., М.: «Книжный дом «Университет», 239 с.

4. Пащенко В.З. (2000) Связь структурно-функциональной организации РЦ пурпурных бактерий Rh. sphaeroedes с пикосекундными стадиями фотосинтеза. Биофизика, 45, 461-468.

5. Emerson R., Lewis, C.M. (1943) The dependence of quantum yield of Chlorella photosynthesis on wavelength of light. Am JBot 30: 165-178

6. Ермаков И.П. (2005) Физиология растений. M.: Издательский центр «Академия», 456 с.

7. Schatz, G. Н., Н. Brock, and A. R. Holzwarth. (1988). Kinetic and energetic model for the primary process in photosystem II. Biophys. Journal. 54, 397-495.

8. Schatz, G. H., H. Brock, and A. R. Holzwarth. (1987). Picosecond kinetics of fluorescence and absorbance changes in photosystem II particles excited at low photon dencity. Proc. Natl. Acad. Sci. 84, 8414-8418.

9. Ferster, T. (1948) Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Annalen der Physik, WILEY-VCH Verlag, 437, 55-75.

10. Horton P., Ruban A.V. (2005) Molecular design of the photosystem II light-harvesting antenna: photosynthesis and photoprotection. J. Experimental Botany, 56, № 411, 365-373.

11. Vernon L. (2003) Photosynthesis and the Charles F. Kettering Research Laboratory. Photosynthesis Research, Springer Netherlands,, 76, 379-388.

12. Wolff Ch., Buchwald H.E., Ruppel H., Witt K., Witt H.T. (1969) Rise time of of the light-induced electrical field across the membrane of photosynthesis. Z. Naturforsch 24b, 1038-1041.

13. Климов В В. и Красновский А.А. (1982) Участие феофитина в первичных процессах переноса электрона в реакционных центрах фотосистемы 2. Биофизика, 27, 179-189.

14. Аллахвердиев С.И., Климов В.В., Ладыгин В.Г. (1986) Фотовосстановление феофитина в реакционных центрах фотосистемы 2 целых клеток зеленых водорослей и цианобактерий в анаэробных условиях. Биофизика, 33, 442-447.

15. Пащенко, В.З., Горохов, В.В., Корватовский, Б.Н., Гришанова, Н.П., Саркисов, О.М., Ренгер, Г., Рубин А.Б. (2004) Фемтосекундная динамика переходных процессов в реакционных центрах Rhodobacter sphaeroides. Доклады Академии Наук. 399 № 1, 114-117.

16. Hankamer В., Barbe J., Boekema E.J. (1997) Structure and membrane organization of photosystem II in green plants. Plant Physiology, Plant Mol Biol, 48, 641-671.

17. Ermler U., Fritzsch G., Buchanan S., Hartmut M. (1994) Structure of the photosynthetic reaction centre from Rhodobacter sphaeroides at 2.65 A' resolution: cofactors and protein-cofactor interactions. Structure, 2,10, 925 936.

18. Kok В., Forbush В., and McGIoin M. (1970) Cooperation of charges in photosynthetic 02 evolution. I. A linear four-step mechanism. Photochem. Photobiol. 11, 467-475.

19. Рубин А.Б. (1999) Биофизика: В 2 т. Т. 1.: Теоретическая биофизика: Учебник для вузов. -2-е изд., М.: «Книжный дом «Университет»,. 448 с.

20. Gantt Е. (1994) Supramolecular membrane organization. In: Biyant D.A. (ed.) The Molecular Biology of Cyanobacteria, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers. 119-138.

21. Vierling E., Alberte R. S. (1980) Functional organization and plasticity of the photosynthetic unit of the cyanobacterium Anacystis nidulans, Physiologia Plantarum, Blackwell Publishing Ltd,, 50, 93-98.

22. Стадничук И. H. (1990) Фикобилипротеины. Итоги науки и техники. М.: Биологическая химия. 40. — 196 с.

23. Arteni A.A., Ajlani G., Boekema E.J. (2009) Structural organisation of phycobilisomes from Synechocystis sp. strain PCC6803 and their interaction with the membrane. Biochim Biophys Acta. 1787(4), 272-279.

24. Zhao K.-H., Su P., Böhm S., Song В., Zhou M., Bubenzer C., Scheer H. (2005) Reconstitution of' phycobilisome core-membrane linker, LCM, by> autocatalytic chromophore binding to ApcE. Biochim Biophys Acta. 7;1706(l-2), 81-87.

25. MacColl R. (1998) Cyanobacterial Phycobilisomes. J. Struct. Biol. 124. 311-334.

26. Rippka, R., Deruelles, Waterbury, J.B., Herdman, M., and Stanier, R.Y.1979) Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111. 1-61.

27. Ajlani G., Vernotte C. (1998) Construction and Characterization of Phycobiliprotein-Less Mutant of Synechocystis sp. PCC 6803. Plant Mol. Biol. 37. 577-580.

28. Thomas J.C., Ughy В., Lagoutte В., Ajlani G. (2006) A second isoform of the ferredoxin: NADP oxidoreductase generated by an in-frame initiation of translation. Proc Natl Acad Sei USA 103,18368-18373.

29. Glazer, A. (1984) Phycobilisome. A macromolecular complex optimized for light energy transfer. Biochim. Biophys. Acta. 768, 29—51.

30. Grossman A.R., Schaefer M.R., Chiang G.G., Collier J.L. (1993) Microbiol. Rev. 57. 725-749.

31. Betz M., (1997) One century of protein crystallography: the phycobiliproteins, Biol. Chem. 378, 167- 176.

32. Mullineaux C.W., Holzwarth A.R., (1991) Kinetics of excitation energy transfer in the cyanobacterial phycobilisome-photosystem II complex. Biochim. Biophys. Acta. 1098, 68-78.

33. Rakhimberdieva M.G., Stadnichuk I.N., Elanskaya I.V., Karapetyan N.V.2004) Carotenoid-induced quenching of the phycobilisome fluorescence in photosystem II-deficient mutant of Synechocystis sp. FEBS Lett, 574, 85-88.

34. Kirilovsky D., (2007) Photoprotection in cyanobacteria : The Orange Carotenoid Protein (OCP)-related-Non-Photochemical-Quenching mechanism. Photosynth. Res. 93, 7-16.

35. Leclerc J.C., Hoarau J., Re my R., (1979) Analysis of absorption spectra changes induced by temperature lowering on phycobilisomes, thylakoids and chlorophyllprotein complexes, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Bioenergetics, Vol. 547,1. 2, 398-409.

36. Hai-Bin Mao, Guo-Fu Li, Dong-Hai Li, Qing-Yu Wu, Yan-Dao Gong, Xiu-Fang Zhang, Nan-Ming Zhao, (2003) Effects of glycerol and high temperatures on structure and function of phycobilisomes in Synechocystis sp. PCC 6803. FEBS letters, vol. 553 i. 1, 68-72

37. Davey L., Cotlet M., Schryver F.D., Habuchi S., and Hofkens J. (2004) Single-molecule spectroscopy selectively probes donor and acceptor chromophores in the phycobiliprotein allophycocyanin. Biophysical Journal. 87, no. 4, 2598-2608.

38. MacColI, R., Eisele, L.E. and Menikh, A. (2003) Allophycocyanin: trimers, monomers, subunits and homodimers. Biopolymers 72: 352-365.

39. Colvin, V. L.; Schlamp, M. C.; Alivisatos, A. P. (1994) Lightemitting diodes made from cadmium selenide QDs and a semiconducting polymer. Nature, 370, 354 357.

40. Achermann, M.; Petruska, M. A.; Kos, S.; Smith, D. L.; Koleske, D. D.; Klimov, V. I. (2004) Energy-transfer pumping of semiconductor QDs using an epitaxial quantum well. Nature, 429, 642 646.

41. Murray C.B., Norris D.J., Bawendi M.G. (1993) J. Am. Chem. Soc., 115, 8706.

42. Hines M.A., Guyot-Sionnest P. (1996) // J. Phys. Chem. B, 100, 468-472.

43. Baranov A.V., Rakovich Yu.P., Donegan J.F., Perova T.S., Moore R.A., Talapin D.V., Rogach A.L., Masumoto, Y., Nabiev I. (2003) Phys. Rev. B, 68,165306.

44. Олейников B.A., Суханова A.B., Набиев И.Р. (2007) Флуоресцентные полупроводниковые нанокристаллы в биологии и медицине: Российские Нанотехнологии, т. 2. №1-2, 160-173.

45. Leatherdale С. A., Woo W.-K., Mikulec F. V. and Bawendi M. G., (2002) On the Absorption Cross Section of CdSe Nanocrystal Quantum Dots, The Journal of Physical Chemistry В 106 (31), 7619-7622.

46. Sukhanova A., Baranov A.V., Klinov D., Oleinikov V., Berwick K., Cohen J.H.M., Pluot M., Nabiev I. (2006) Nanotechnology. 17. 4223.

47. Gaponenko S.V., (1997) Optical Properties of Semiconductor Nanocrystals. Cambridge University Press, 263.

48. Medintz I.L., Mattoussi H. (2009) Quantum dot-based resonance energy transfer and its growing application in biology. Phys. Chem. Chem. Phys. 11, 17—45.

49. Вавилов С. И. (1952) Собр. Соч. Т. 2. М.: Изд-во АН СССР, 356 с.

50. Галанин М. Д. (1969) Труды ФИАН. Т. 12. С. 3.

51. Dexter D. L. (1953) J. Chem. Phys. 21, 836.

52. Левшин JI.B., Салецкий A.M., (1989) Люминесценция и её измерения: молекулярная люминесценция. М.: Изд-во МГУ,. -272 с.

53. Cheung, Н. & Dong, W.-J. Geddes, С.; Lakowicz, J. & Geddes, С. D. (Eds.) (2006) Fret Studies of Conformational Transitions in Proteins. Reviews in Fluorescence, Springer US, 445-462.

54. Владимиров Ю.А., Потапенко А.Я. (2006) Физико-химические основы фотобиологических процессов. — М.: Дрофа, 285 с.

55. Williams А. Т. R., Winfield S. A. and Miller J. N., (1983) Relative fluorescence quantum yields using a computer controlled luminescence spectrometer, Analyst, 108, 1067.

56. Фадеев B.B. (1983) Лазерная спектроскопия водных сред. Диссертация на соискание ученой степени доктора'физ.-мат. наук. М.: МГУ, физический ф-т, 455с.

57. Borissevitch Y.E. (1997) TABAK, М. Correction of Stern-Volmer fluorescence quenching constants at very low optical absorption of the quencher. In: ELAFOT -Encontro Latinoamericano de Fotoquímica e Fotobiologia. Los Cocos. Córdoba.

58. Lakowicz J.R., (1999) Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd ed, Kluwer Academic/Plenum Publishers, 465.

59. Becker W., Benndorf К., Bergmann A., Biskup С., König К., Tirlapur U., Zimmer Т., (2001) FRET measurements by TCSPC laser scanning microscopy, Proc. SPIE, 4431, 94-98.

60. Kautsky, H., Hirsch, А. (1931), Neue Versuche zur Kohlensäureassimilation, Naturwissenschaften, 19, 964-964.

61. Govindjee (1995), Sixty-three years since Kautsky chlorophyll a fluorescence, Aust. J. Plant Physiol. 22, 131-160.

62. Kolber Z.S., Falkowski P.G., (1993) Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ, Limnol. Oceanogr. 38(8)1, 9931, 646-1665.

63. Lazar, D. (1999), Chlorophyll a fluorescence induction, Biochim. Biophys. Acta 1412, 1-28.

64. Kolber Z.S., Prasil O., Falkowski P.G., (1998) Measurements of variable chlorophyll fluorescence using fast repetition rate techniques: defining methodology and experimental protocols, Biochimica et Biophysica Acta, 1367, 88-106.

65. David L. Nelson Michael M. Cox W. H. Freeman, Hardback (ed.), (2008) Lehninger: Principles of Biochemistry, Fifth edition,. 4to. xxix, 1158.

66. Дзялошинский И.Е., Лифшиц E.M., Питаевский Л.П. (1961) Общая теория Ван-дер-ваальсовых сил. Успехи физических наук, Т. LXXIII, 3, 347-358.

67. Voet, D. & Voet, J. (1990) Biochemistry. John Wiley and Sons. New York, 456.

68. Brown,T.L., LeMay,H.E., Bürsten,B.E., & Burdge,J.R. (2003) Chemistry The Central Science. Pearson Education, Upper Saddle River New Jersey.

69. Oklejas V., Zong С., Papoian G.A., Wolynes P.G. (2010) Protein structure prediction: do hydrogen bonding and water-mediated interactions suffice? Methods. Sep;52(l):84-90. Epub 2010 May 26.

70. Pace C.N., (2009) Energetics of protein hydrogen bonds. Nature Structural & Molecular Biology 16, 681 682 doi:10.1038/nsmb0709-681

71. Kabsch, W. & Sander, C., (1983) Dictionary of protein secondary structure: Pattern recognition of hydrogen-bonded and geometrical features, Biopolymers, Wiley Subscription Services, Inc., A Wiley Company,, 22, 2577-2637

72. Tarek, M. & Tobias, D. J., (2002) Role of Protein-Water Hydrogen Bond Dynamics in the Protein Dynamical Transition, Phys. Rev. Lett., American Physical Society, 88, 138101;

73. Кесслер Ю.М., Петренко В. E., Лященко A.K. (2003) Вода: структура, состояние, сольватация. Достижения последних лет (отв. Ред. А. М. Кутепов). М.: Наука,. 404с.

74. Эйзенберг Д., Каутцман В. (1975) Структура и свойства воды. JL: 279 с.

75. Nemethy G, Scheraga H.А. (1962) J. Chem. Phys. 36, 3382.

76. Самойлов О.Я. (1957) Структура водных растворов электролитов и гидратация ионов,— М.: Изд-во Академии наук СССР, 276.

77. Schulson Е.М., (1999) The Structure and Mechanical Behavior of Ice, JOM, 51 (2), 21-27.

78. Лобышев B.H., Калиниченко Л.П. (1978) Изотопные эффекты D2O в биологических системах. М.: Наука,. 215 с.

79. Liu J.-Y., Jiang Т., Zhang J.-P., and Liang D.-C. (1999) Crystal Structure of Allophycocyanin from Red Algae Porphyra yezoensis at 2.2-Â Resolution. J. Biol. Chem. 274, No. 24, 16945-16952.

80. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б., (2005) Физика Белка. М.: КДУ, 465 с.

81. Rapis, Е. (2007) On the nonequilibrium phase transition in protein. Technical Physics, MAIK Nauka/Interperiodica distributed exclusively by Springer Science+Business Media LLC., 52, 787-792

82. Nojima H., Ikai A., Oshima Т., Noda H. (1977) Reversible unfolding and refolding of thermostable phosphoglycerate kinase: Thermostability associated with mean zero enthalpy change. JMol Biol 116, 429-442.

83. Nojima, H., Nami, K.H.; Oshima, Т., Noda, H. (1978) Reversible thermal unfolding of thermostable cytochrome c-552. Journal of Molecular Biology, 122, 33 — 42.

84. Чернавская H.M., Чернавский Д-С. (1999)1 Белок-машина. Макромолекулярные биологические конструкции. 1-е изд. М.: Изд-во Моск. ун-та,; 2-е изд. - М.: Янус.

85. Ermakova-Gedes, S., Shestakov, S., and'Vermaas, W. (1995) Photosynthesis: From Light to Biosphere (Mathis, P., ed) Vol. 1, pp. 483^486, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

86. Rippka R., Waterbury J., Cohen-Bazire G. (1974) A cyanobacterium which lacks thylakoids. Arch. Microbiol. 100. 419-436.

87. Guglielmi G., Cohen-Bazire G. and Bryant D.A., (1981) The structure of Gloeobacter violaceus and its phycobilisomes. Arch. Microbiol. 129, 181-189.

88. Laemmli. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriphage T4. Nature. 227. 680-685.

89. Gottschalk L., Lottspeich F., Scheer H., (1993) Reconstitute of allophycocyanin from Mastigocladus laminosus with isolated linker polypeptide. Photochem. Photobiol. 58, 761-767.

90. Antal Т.К., Matorin D.N., Ilyash L.V., Volgusheva A.A., Osipov V., Konyuhov I.V., Krendeleva Т.Е., Rubin A.B. (2009) Probing of photosynthetic reactions in four phytoplanktonic algae with a PEA fluorometer. Photosynth Res DOI 10.1007/sl 1120-009-9491-6

91. Strasser R.J., Govindjee (1992) The FO and the O-J-I-P fluorescence rise in higher plants and algae. In: Argyroudi-Akoyunoglou JH (ed) Regulation of chloroplast biogenesis. Plenum Press, New York, 423^-26.

92. Strasser B.J., Strasser R.J. (1995) Measuring fast fluorescence transients to address environmental questions: the JIP-test. In: Mathis P (ed) Photosynthesis: from light to biosphere. Kluwer Academic Publishers; Dordrecht, 977-980.

93. Kolber Z.S., Falkowski P.G. (1993) Use of active fluorescence to estimate phytoplankton photosynthesis in situ. Limnol. Oceanogr. 38(8)1, 9931, 646-1665.

94. Погосян С.И., Гальчук C.B., Казимиренко Ю.В., Конюхов. И.В., Рубин

95. А.Б., (2009) Применение флуориметра «МЕГА-25» для определения количества фитопланктона и- оценки состояния его фотосинтетического аппарата. Вода: химия и экология, 6, 34-40.

96. Niyogi К.К., (1999) Photoprotection revisited: genetic and"molecular approaches, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 50, 333-359.

97. Horton P., Ruban A.V., Walters R.G., (1996) Regulation of light harvesting in green plants. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 655-684.

98. Glazer A.N. (1988) Meth. Enzymol. 167, 304-312.

99. Polivka Т., Kerfeld C.A., Pascher Т., Sundstrom V. (2005) Spectroscopic properties of the carotenoid 3'hydroxyechinenone in the orange carotenoid protein from the cyanobacterium Arthrospira maxima. Biochemistry. 44, 3994-4003.

100. Стадничук И.Н. (2010) Фикобилины, фикобилипротеины и фикобилисомы. Труды Института микробиологии им. С.Н. Виноградского. Вып. XV: «Фотосинтезирующие микроорганизмы». (Ред. Б.Ф. Гальченко) М.: Изд. МАКС-Пресс. 52-85.

101. Kerfeld С.А., Alexandre М., Kirilovsky D. (2003) The orange carotenoid protein of cyanobacteria. In: (Larkum J.T. ed.) Carotenoids: Physical, Chemical, and Biological Functions and Properties, CRC Press, 3-17.

102. Rakhimberdieva M.G., Boichenko V.A., Karapetyan N.V., Stadnichuk I.N.2001) Interaction of phycobilisomes with photosystem II dimers and photosystem I monomers and trimers in the cyanobacterium Spirulina platensis. Biochemistry. 40. 15780-15788.

103. Wilson A., Ajlaini G., Verbavatz J.-M., Vaas I., Kerfeld C.A. Kirilovsky D.A2006) soluble carotenoid protein involved in phycobilisome-related energy dissipation in cyanobacteria. Plant Cell. 18. 992-1007.

104. Dale, R.E. and Eisinger J. (1974) Intramolecular distances determined by energy transfer. Dependence on orientational freedom of donor and acceptor. Biopolymers 13. 1573-1605.

105. Еремин E.H. (1976) Основы химической кинетики. Изд. 2-е. доп. М.:, "Высшая, школа". 375 с.

106. Paschenko V.Z., Evstigneeva R.P., Gorokhov V.V., Luzgina V.N., Tusov V.B., Rubin A.B. (2000) Photophysical properties of carborane-containing derivatives of 5,10,15,20-tetra(p-aminophenyl) porphyrin, J. Photochem Photobiology, 54. 162-167.

107. Marquardt J., Senger H., Miyashita H., Miyachi S. and Mörschel E., (1997) Isolation and characterization of biliprotein aggregates from Acaryochloris marina, a Prochloron-like prokaryote containing mainly chlorophyll d, FEBS Lett., 410, 428-432.

108. Porter G., Tredwell C.J., Searle G.F.W., and Barber J. (1978) Picosecond time-resolved energy transfer in porphyridium cruentum. Biochim. Biophys. Acta, 501, 232-245.

109. Jacobsen I.A., Kemp E., Starklint H., (1975) Glycerol used as a cryoprotectant in subzero preservation of rabbit kidneys, Cryobiology, 12, Issue 2, 123-129. DOI: 10.1016/S0011-2240(75)

110. Birks J. B., Munro I. H., (1967) The fluorescence lifetimes of aromatic molecules, Progress in reaction kinetics, 4, 239-246.

111. Levitt M., Warshel A., (1975) Computer simulation of protein folding. Nature, 253, 5494, 694-698.

112. Griko, Y. V., Venyaminov, S. Y., & Privalov, P. L. (1989) FEBS Lett. 244, 276278.

113. Damaschun G., Damaschun H., Gast K., Misselwitz Rl, Müller J.J., Pfeil W., Zirwer D., (1993) Cold denaturation-induced conformational changes in phosphoglycerate kinase from yeast. Biochemistry 32 (30), 7739-7746.

114. Taylor A.T.S. & Feller S. E., (2002) Structural Studies of Phycobiliproteins from Spirulina: Combining Spectroscopy, Thermodynamics, and Molecular Modeling in an Undergraduate Biochemistry Experiment. Journal of Chemical Education, 79, 1467.

115. Karp, G. (1996) Cell and Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y., 223, 277.

116. Chen Z.; Kaplan D.L.; Yang K.; Kumar J.; Marx K.A. & Tripathy S.K.,1996) Phycobiliproteins encapsulated in sol-gel glass. Journal of Sol-Gel Science and Technology, Springer Netherlands, 7, 99-108.

117. Maksimov E.G., Kuzminov F.I., Konyuhov I.V., Elanskaya I.V., Paschenko V.Z. (2011) Photosystem 2 effective fluorescence cross-section of cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 and its mutants, J. Photochem. Photobiol. B: Biol. 104 (1-2), 285 -291.

Информация о работе

Максимов, Евгений Георгиевич
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.02

Диссертация

Миграция энергии возбуждения в нативных и гибридных фотосинтетических антенных комплексах - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы