Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ВИРУСОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИХ ИММУНОДИАГНОСТИКИ

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ВИРУСОВ САХАРНОЙ СВЕКЛЫ И РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ИХ ИММУНОДИАГНОСТИКИ"

А-тт

ордвш лвшод I ордвна дрибы народов шдоия1:,;.. . - наук украинской сср . . v и;.,,,,

ордвна трудового красного знамбяи институт иикрс6и0д0гии и вирусологии шл д. к. завоютного

На правах рукописи

рогов владимир вшнтиювич

изучений свойств вирусов сахарной свеклы и разработка хктодов их юшунодиагкостики

03.00.06 - вирусология

. Автореферат

■ диссертации и**Ъоискакив учомоВ степени ■ кандидата биологических наук

Киев - 19Э1

Работа выполнена в Среднеазиатском научно-иооледова--тельскои институте фи »патологии ива кафедре вирусологи» Биологического факультета ^ооновского государстве итого университета яневн Ц.В. Ломоносове^ '

Научный руководитель! член-корр. АН СССР, ' ' академик ВЛСХНИЛ,

доктор биологических наук, профессор И.Г.Атабеков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук* % .' . член-корр. УА АН,

ч профессор А.Л. Бойко ..

канаидот биологических наук ст.н.с. Д.П.Гране

. Ведущая организэцин: НПО "Сахсввкла"

Занята состоится* Л^"" С* НА- 1991 года ж У О, чао на заседаем Спецяалманроввпного совета 3 016.06.01 при Имстнтухе микробиология и вирусология им. Д.К. Звболотного АН УССР по адресу: 252143, Кнев-143, ул. Институт микробиологии а вирусологии нн.

Заболотного, 26, Д.К. Заболотного.

С диссертациейможно ознакомиться в тута микробиологии! вирусологии мм. Д.К, АН УССР» ;

ОиС ли оте иеИ не тв-Эаболотного •: .

■ Автореферат разослан ■ /£?■ ■> Дг^у^сууд 199 года

Ученей секретарь Специализированного совета., кандидат биологических наук

Э.А. Коваленко

ОБЩАЯ ХАРАКЕРИСГИКА РАБОТЫ,

Актуальность проблемы. В последние года с увеличением площадей под сахарной свеклой и ростом ихудельного secs в структуре севооборотов значительно повысилась вредоносность ряда болезней свеклы, особенно вирусных. Желтуха и мозаика широко распространены во всех районах.взращивания сахарной свеклы« в той числе и в СССР, и являются одними из основных заболеваний ею И культуры. При ранней поражении потери урожэ я корнеплодов могу ï составлять 3Q-40ÎÎ, семян W-бСИь, сахаристость о махается на 1,3-5?.

Симптомы вирусной инфекции-на растениях часто не позволят достаточно надежно дифференцировать вирусы в полевых условиях, так как они пало специфичны, з пожелтение имоэеичность листьев может вызываться и другими причинами. Для правильного прогнозирования и своевременного проведения необходимых защитных мероприятий важно уметь точно определять характер заболевания. Немалое значение диагностика приобретает при оценке исходного и селекционного материала на устойчивость к вирусным болезням*

Таким образом, диагностика является одной из важнейших -задач в общей системе мероприятий по защите растений от вирусов. Вместе с тем, в нашей стране до .настоящего времени надежных истодов быстрой иммунодиагностики вирусов сахарной свекль: разработано не было. . "

Цель и задзчи работы. Основная, цель на стоящего,-исследования состояла в создании диагностикумоз и разработке метода раннего обнаружения вирусных болезней сахарной свеклы на основе иммуно-ферментного анализа.

В связи с эти» предстояло изучить следующие вопросы: I. Разработать методы выделения восокоочищенных препаратов.вирусов желтухи (ВЖС)'и иоззики {ЕМС)'сахарной свеклы, обеспечивающих достаточно высокий выход и .сохранение натчвиости вирусных частиц. 2. Получить высокоспецифические не хороагии1титром антисыворотки к этим вирусам и приготовить ва их основе специфические иммуно-пероксидааные коныогаты. 3. Отработать условия тестирования ВЖС и прямым, непрямым и сэндвич вариантами ИФА в очищенных препаратах и растительном материале; оптимизировать условия диагнос-- тики вирусов свеклы .методом Р1ФА в листьях и корнеплодах сахарной свеклы, а также в основной переносчике этих вирусов-персиковой тле. Изучать физико-химические.и серологические свойства вирус- ■ них иэолятов. 5. Изучить круг растения-хозяев вирусов желтухи и . мозаики, выявить резерва тори вирусной инфекции, а-тзкже опреде-

ЦЕНТРАЛЬНАЯ Научная бибЛИОТЕКЛ ^•оск. сельскохоз. академии

лить динамику накопления восновкыххозяевэх-яакопиталях. 6. Изготовить опытные партии диагяостикумов.на, основе имыунофермватного • анализа к испытать их г производственных условиях с целью опреде- -ления ВлС и Ы!.С в Среднеазиатском регионе.. *_-'■

Научная новизна работы Д настоящей работ« впервые в СССР разработана методы получения эдсокоочмщешых препаратов вирусов желтухи и мозаика' сахарной свеклы. Изучены физико-химические свойства ВШ1 и BUC."Впервые установлено, что PHiC ВЖСниевтна S1 конце кзл структуру, а иаЗ* конца ие содержит поли А блока. В бесклеточнои вел ок-син тез врущей системе HJK ВЖС направляет синтез высокомоле- . кулярного продукта 250 кДв * ряд более коротких.продуктов, среди которых отсутствует,белок'оболочки. Сйределен моле куля рны as ео белка.оболочки ШС -* 34Í¿7 кДа ¿ Впервые'в.СССР разработан метод КФ4 для диагностики вирусов свеклы, чувствительность которого состав- . ляда 1-2 иг/мл для BIC и 5-5 нг/нл для ВМС- Прав еденный сравнитель ный анализ антигенных свойств-изолятов ВХС и ВМС ИЗ географически отдаленных регионов мирз показах высокое антигенное родство между украинский и английским изолятаил MCj казахский мэолят 35JC проявлял тесное серологичеекое родство с японским я португальским изолят а ии ЬЬС и несколько более отдаленное о изолятон из Германии.

. Практическая ценность работы. В данной.диссертации разработаны методы очистки ВЖС и ШС, обеспечивающие получение иэтаввых вирусных частиц с высоким выходок (150-510 мг ВЖС и 15-30 мг EUC изх кг зараженного материала) я приготовлены высокоспецифическив: сыворотки на их основе с титром 1-2*10""6 в непрямом ИФА. Оптимизированы условия проведения МА для определения BSC и ВМС в листьях: и корнеплодах свеклы, позволяющие выявлять вирусы.в низких концентрациях при проведении полевых обследований,фабричных посадок свеклы, а также в селекции и семеноводстве этой культуры. Изучен круг растений-хозяев и определены возможные, природные резерва торы вару сов сахарной свеклы. Подобраны условия для диагностика ВХС в его основном переносчике - персиковой тле, что может оказаться; важным при определении необходимости■ и оптимальных.сроков-боръСы -о этим переносчиком. ^ - г, ■ ч

Изготовлены диагностические наборы - для детекции вирусов: методом ИФА, которые была апробированы,в полевых условиях на фабричных и селекционных посадиах сахарной свеклы в Казахской и Киргизской ССР, а также на посевах'кормовой свеклы в Узбекистане.

Апробация работы, материалы работы были доложены не Всесоюзной конференции по ивдройиологическим и Сиотехнологическим осно- .

вам интенсификации растениеводства и кориопроизводства (Алиэ-Ата, 1990), ка.обилейнои научной конференции Среднеазиатского нэучно-ясследовательского института фитопатологии по защите сельскохозяйственных растений от болезней (Ташкент, 1989), на кафедра вирусологии биологического факультета ¡¿ГУ ян. И.В. Ломоносова /1990/. .

(1убликаци1>. Основное содер*ание работ' отражено в б публикациях. '

Объем работы. Диссертационная работа содержит введение, обзор литературы, поев »ценный характеристика, вирусов сахарной свеклы и методов их диагностик», описание материалов и методов, собственные результаты исследований,^обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы. Общий объем диссертации составляет 149 страниц, включая 12 таблиц, .1 cxeuy и 46 рисунков; список литературы содержит 192 наименования.'., -" * ■'■

'■; . клта'ИАлы .и. мвт<ш ■. исследований .

Изолдт BiC, любезно предоставленный ПорекбсноЙ Н.Б. (Институт . микробиологии и вирусологии,АН:УССР),'.поддер.*ива'ли на растениях . : сахарной свеклы- сорта Я л ту шов с кн И односеи?нный-30. Для накопления . вируса' молодые растения - Те tragonía еяряпва '.-»; ■ Hurr'- заражали

О поноцьи тлей ' Kyzüa'pareícae ,3ül2 (Bar-Joseph M, and Hull R. ,; , , ; 1971)'.' .'.. . -'j; . ..: .

■ ;Изолят BÜC,' используемый в данной работе; был' заде лен из растений'сахарной свеклы 6 симптомами'мозаики,.добранных при .проведении долевых Обследований в Каскеленсхом райове. iлна-Атинекой ой.' ласти. Для'накопления патогена использовали растения stallaría ше-diAV-'(b-) a Spinaoea olerecce ' .сорт Виктория, которые в стадии - соответственно 10-12 и'6-8'лнстьев инокулироввл». механически,'ис-: пользуй карборунд в качестве абразива. Зараженные растения содержали в теплица при'температуре 23-27°С.

Tax как разработка методов очистки.входила в задачу неких исследований, их описание подробно приводится при.излежении результатов работы'. Спектры поглощения УФ-света очищенными препаратами BJ.C и 5IÚC были-получены на спектрофотометре Хитачив интервале длин волн 230-500 нм. Определение концентрации вирусов в очиценпых препаратах проводили спектрофотометрическм, используя коэффициенты ЭКОТИН^ВИ.Ь^*^^, I СМ. = 2,4"для" EiC' /КаазаШз В.' et al., ■ 1977/ ' " ^Io^HM* 1 Са 2t6 ДЛЯ ЗКС / :. Pujisawa I. et al .. 1980/. . . Kpotie того, препараты.ЗйС оценивались по инерционности путем под. счета некрозов на Chenopo¿i\im ,aiñ&ranticolor .Coste et Reyn

через 7-10 ¿ней после инокуляции.■ _

Электроннош.крос коли ческу» характеристику очинённых препаратов ЫС и ШС определяли на электронном микроскопе £нрмк JE» . 100 В при 80 килоьольтах. Измерения цроьодили ттра увеличении -50000. Образцы очнщешшх вирусных препаратов наносили на углеродную или ксшюдневую дленку, -затем высушивали на воздухе при +20°С и далее негативно окрашивали фосфорновольфраыовой кислотой рН 3,5-3,6 или уранилацетатом рН 6,0. Ультратонкие срез« из ли- ■ стьев сахарной свеклы, порэяенной ВМС, готовили как описано Колесник Д.!/1985/ и Hóefert i. . /1Э69Д используй ультра той XJÍB ■ (Швеция), • ■ ■

Определение молекулярного веса капсидиых белков БЖС и БИС проводили в помощью электрофореза вирусных белков.в градиенте (6-20%) полиакрилаыидногогеля в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия СДСК)/ leemall'U .' , 1970/. Стандартные белки фарш Phwr-ш&с1а:ЮТ использовали в качестве «эркеров: фос^рилаза б (94 кДа), бычий сывороточный альбумин (6? кДа), овальбумин (43 кДа), угольная зкгидраза (30 кДа), ингибитор соевого трипсина {20Л кДа) a t -альбумин (14,4 яДэ).

РНК B¡£C вкделяли из очищенного вирусного яре пара та с помочь» . фенольвой депротеинизации /. Curpenter J. и t- al, , 1977/. Препарат РНК анализировали в 0,85« агароэном геле после денатурации.в. присутствии глиоксаля /. Mentar О . , 1977/. Трансляцию РНК BSC проводили ín vttro 'в экстрактах из клеток .КгеЪа -2 / SvitJcin т. , and A«oI V . , 1978; SvitJcin • et' ' ni. ,1981/. Продукты -трансляции анализировали.¿ градиенте .(8-20» полмакрилемидного геля по:..'1лвщш'и о. /1970/и оценивали авторадио графи чесни; , Длинную хроматографию ,на колонке ó олиго { dt) - целлюлозой про. водили, как описано ранее / кегвлочъУу К* 'aj»d Dolía V,,. is83 /.

.Антисыворотки'^АС) к вирусам поручали иммунизацией 5-6 месяч-;

кроликов весом 2-2,5' кг, Дочищенными'препаратам» вирусов по -.комбинированной схеме /Гнутова р.," 1985/, с неполным-адьювантом ФреИндэ '/dífeo - / в. соотношении Iil. ' Через 7-14 дней после' последней инъекдо» отбирали кровь п опредаляли титр,антител в реакции' капельной агглютинации^ а также-непряшм методой И ФА... ' - Иииуноглобулиновкефрэкции из АС k.SíC'h Bííc; получали путей .-..■ двукратного.осазденвя равным объемом 20/»--ногс> водного раствора Г/ЭГ-йСЮОс вооледjipейм: цектрифу гирован нем при бООО об/аия. в .тече-' ■'вне 20 мин.'.Осадок 'растворяли и дНализоваля;против .0,01 tí К-фос- -ратного буфере рК; 7;4,'содердащегс 0,1.4 MeCJ. (Ф.Б.).

' Jg в -фракцию выделяли хромаю графи чески фракционирование« uusjj- . .ноглобулиноа не колонке (1x10 с») с ДЕАВ-52'целлоозоа;(я;з1агтап ; Biochemical ltd. "),'Полученные иммуноглобулины хранил« либр в ' 50^£-ном-глицерине при -го°С, лиао в растворе о конечной концентрацией белка! мг/мл при.той же температура* ■. ■ : ■ •■■■■' йнкунопероксидазный нонютэт (пероксидаз ч хрена. произволе твз ■ ■ НПО "Биолар", г. Олайне Латвийской Ш>; С величиной r^' /Еадз/Б^сК =3,0)» получали до методу Wakene.it. - /I97V» основанному вэ окислении углеводных групп ферменте периодами натрия. Очистку : конъюгата от несвяззвшгося фермента проводили наколонка (J»5x. • 100 см) й сефадеясо* в . -200, зрэвноъеиениым ф.Б.ПолученвыЙ конъюгат хранили длительное время s. 5W" глицерине при -20В качестве cjCctpaTOB пероксидазы мспольэовалирастворы.5-эиипосэли- ; .'- циловой кислоты и ортофенилеВднамнна; '.;■'■..

": Йммувоферментный-анализ провадил*^ как опиевно Clark,и. и-'.' Adams А. /1977/.■ Оптическую плотность продукта фермента»явной . реакции измеряли Ha npM6ope:Titertek nultiscan - (Plow ) при длине вол ни 492 ни. Эа чувствнтельвость 'мвтодаЙФА принимали ков- . , * центрации вируса (или раэведвиие анализируемого экстракта растения) при которой регистрируемая оптическая .плотность продукта фермента-. : - тввной реакции в трираэа превыЕЭлаее-значениав: контроль вой;-. / ' пробе. ■ ■■;.": ■,'■;■■■' '■»■'■'-;'';■* ■ .,'.

■ Для определения антигенного родотва,использовали разработав- . , ну и нами ¿юдификациюконкурентного ИФА (к ЙФА);' на- первой-с тадии.-' анализа адсорбировали,.иш1уаоглоаулииа;к;казахсноау ВМС (ВЫСЧС). или; -.украинскому BSC- (ВЖС-у), (5 мяг/вя)- н.плэяиэтыипяубнраввлв 2 часа; ■".при 37°С.;Зааеи\йваЬсили, очищенный препарат БУС-К ила BIC-J • • : .• . (I- мкг/ыл) и планшеты ".оставляли на ночь при ^0С. Нв/слёдусй1ИЙ^ 'день после, промывки 'планшет Ф.Б.с тритоном X-lOCi (-Т.Ф.БО наслаивали тестируемые иммуноглобулины.-Через'2 .часа .после..инкубирования Врй; отмывнн от. н есв яза в иихся-ам тв те лв лунки: вн ос ил ur он О-;

;.'■. логичный конъмгат к ШС-К.илн ВЖС-У; И .шмсуОирсиаляД час при 37°С.' Результаты ферментативной реакции регистрировали с пектр офо том е три-чески» как описано'выше. ' • -.'.." ■. ■■' е' '."■■

При проведении полевых обследований'и^обходаио;авеяизировать ■'■' больное'количество проб, что связано «..трудностями лриготозлзния из них экстрактов. Обычный метод растирания, в ступке мало приго-, ■■. 'Два-,из-за его большой трудоемкости. Поэтому наш был разработан .: прием приготовления образцов■ непосредственно в плзняетах для серо-\. логических анализов (объем лунки - 2 ыл),' когда "образцы растирали

при помощи стеклянной,палочки «в определенном объеие буфера (для. . biii). Статистический аналиа зксперивента дьных данных проводили по Сведвкору /1961/.

: РЕЗУЛЬТАТЫ и' ОБСУаНЁНИЕ .

I. Приготовлений дм а гностика а к В&С ■

■ Вирус желтухи свекла типоиой представитель клостеровирусов," переносится тлями додуперсистентиым способом, длена ките видных вирионов составляет 1250-1450 ни.' '■ v

При разработка способа.очистки ВЮ'за основу был Ьзнт'метод, v првдложеняий KaEsenie В. at al /19?7/.'1ля ОЧИСТКИ Отбирались' . верхние листья т. expanse. : через 3-7,недель после ээрзленяя о характерными сииптомаии (гравировка, пожелтение). Внесенные нами модификации, включающие центрифугирование частично .'очищенного, препарата через,30£-нуа сахарозную подушку, содержащую 7,4% ПЗГ-6000 и . 0,1 М HaCl у яри,30000 06/мвн. в течение 2 часов в, др.» позволили, сократить время.очислея в 3-4 раэа- Выход очищенного препарата,БЖС составлял 150-Я0 иг иэ I кг зараженных.листьев.. ' ,

.Спектр У ф-поглоаен и я очищенн о го препарата' совпадал, с описанным " для.В1С.в лвтературе'/Kaaeanis a. «t ei . .. . 1977/. 'Яря*центри~ фугировании в градиенте."сульфата-цезия препарат формировал одну , . зону с плавучей пяотн ос* ь» Ч,29г/с м3.Анализ .кетодом глектрофореза

в пол и акрила ми дном, геле показал, что в соста вевирвонов имеется . один тип белка'с'молекулярной .массой околокДа (рис. I),. что хорошо оогдаёуемя'о известными данными / Bar-Joeeph и. and Hull H., 19741 'r carpenter J. .et al. , 1977/ И свидетельствует о высокой . степени очистки препарата;. ■■;V-I,v •.

С помощью анализа в . 0,ef artpomou- геле было показано, что-.. . препарат ВЖС содержит одя«:тяп молекух РНК размером " " 1^500 кук-леотндов. При трансляция in vitro в белок-свнтеэирущеЯ спехе- ■ ■ ме из клеток' trabe-2 сиЗрааоаавзлся один поляпептид с ыолекуляр-' ной: массой 25о Ма я несколько более легких продутом (рис.. 2, до-Р0жка-2). Синтеэвсех.полипептидов блокировался при добавлении ■■,. ■ 'аналога кэп-в7орр. '■ (рве; г, дорожка-з к »), что может свидетель- ;. стзоъать о'наличии кэн-структуры на 5* коние виряонкой fffit BiC. Kpoitó том Сило показано отсутствие ^оли А блокэ на i1 донце РНК . о поаоцьв ефйннсв хроматографии на кодов ка с олиго ( dt )-целлв~ лозой.' .: - '■- ■■"■■. ; .:■.-..■..

■ 3íeiCTp04H0vWp0C копи ческа Я анализ счинекных препаратов ¿1С /обнаруживал Читзвндмые частицы с характерной для клос«еровкрусов tjTpjKTypoft. " -i.'' '."'■'■.■.■■■':'* ' " ■ ' У ':

т,

р г» -

■■ - • -V ■-■ *Г"

■ > г ■ "'''У''

> Peo. I. Электрофорез белкоа

ПААГ (8-205») I - препарат ВЖС после первого . . цикла д*4ферен- ; * «иальаоро центри-- * фугирования через сахарозную по- ' "душку;-Z - то же после'двух ' .- аикчов;",, ... 3,-вирус втрмховэ-: той мозаики . . ячменя; : 4 - маркерные белки ;

_ 43.

Л- ' ' S - ^ .у. : . * » ■ . - ' .

^"^'ÎtfeSSi®^- 1 ■ "» — портупее ивлки

f-^îh Ît^-^îVÎ'v .Г. - ' .'■" ■ .. ■■.

.. , Очищенный вирусный-препарат использовал» для приготовления антисыворотки.'Титр порченной ¿Р'состзвлял:1:102^ «.реакции ка- ' ' пвльноя агглютинации;« -I^xio"^я непрямом варианте им. Оча ве реагировала о .экстрэктзии эдорошх растевий; а"так«е е гетерологич-ныы антйгеном» .После, проведения реинкунизации тктр АС.удалось .по- • высить в два раза'; Полученная АС', использовалась :для приготовления ' диогноствкума вэ .основа', КФА; . ■■ ' ''.. : : • .

. ' При оптимизации .условий 'диагностики ВЕС ^'использовали "раз-.' личнt!e :вариэнта:. ЙфД. (пряыо.й,'^в чувстви-

тельней и1 ссе цифи чкки"ока"э алс я 'с s ндви ч: вер иа н 1которвй ■' поз во ля л', вияалять >.о 1-2 нг/мл,вируса желтухи- (рас. 3); Сптгиальаыо концен-';Тр а у: ик н оглобу ла н ов. Яконьага тэ Ьоставлйлй;!-^ мкг/мл. Сок'

эдор оеы х. рэ сте ш! Й j .добавленный ' к .-очи щенн ом у ■ Jipé пер ату i £С, ' не ока-'■ . эывал влияния на,показания; :£ыло устаховлено,".что'нааболве прием- .'.'. летам для определения ESC-в'лаОтьЬе свеклы является разведение ая- . стракта в' 30-300 раз (рис1.: 3).Л1рв этом разница в'оптической плотности пра использовании больного и здорового кетериава составляла более 1 о.е., что позволяет, уверенно проводить.-оценку иоследуеыых- ■ ■ обраэцов.не только ¿П0ктро4отометрически,:но и визуальной Положи- ■-'

I 1 1 4 - * ■ к 1 » Г

Рис.; 2. Влияние:аналога НЭП (т^орр ) нз трансляцию '/■■■РНК ВлС В экстрактах из гсгеъа -2: Г - Оез РНК;, ; '"'2,3 —^трансляция'РКК в экстрактах, нё содер-' кащих ю Орр у (2), с одер я этих' I м" - »Лрр (3), содержащих 2 ыЯ * т^йрр (4); 5,6,7 - трансляция ; РНК Х-вируса картофеля без добавления т^йрр .(5), с I ыМ п7оРР (б), с 2 Ш т7врр, (7); ; 8,9 - трансляция РНК ВМ.(Тг ) без добавления /- .щ7арр- (8) а о г ыМ сЛрр изркершо

белки: два основных продукта трансляции РНК ЕШ .' (183 кДа и 126 «Да), фосфорилаза :<5':дЕа;, бычий сывороточный альбушн (6? .кДа), оввдьбуыин ■ ■(43 ЮЦа), угольная.акгидраза (30-кИэ^ ингибитор соевого трипсина (20,1 К^э), Ь - лзкто- ■ альбунав' (14,<1-"кДэ>.

_ . концентрация виру--£ со (нг/ыл)

степень разведения экстракта ■ ; ■

Рис.. 3.. Тестирован^ вас ь очищенном препарате и рас- Л-■ ' твтельном материала сэндвич методом ИФА: . ■ - ■ I - очищенный препарат Е1С1 2 - екстракг аз ли-

■ стьев сахарной, свеклы, зараженной В&С; -3 -препарат гетер о логичного вируса -'ВМС. (конт-1 *роль)1-4- экотракт. здоровых листьевг сахарной '

' свеклы (контроль). , '

тельная реакция с сотой из листьев заракенниХ растений яаблвдалась до разведения 1хЮ~5. :

. 2. Ппиготовдение диагностик ум а к ВМС -ВМС - представитель группы потивирусов, переносится тлями не-персистентшм способом и, в отличие от ВХС, легко передается механически, длина нитевидных частиц-ооставлявт 730 нм.

При проведении полевых: обследований в сентябре 1987 года не-далеко от Алма-Аты были обнаружены растении сахарной свеклы с симптомами мозаики1. ,С помощью КФА-были отобраны образцы,, даваие отрицательный результат при тестировании на ВДС. Идентификация возбуди-

' .. .'•. .. . :io • v/V; ..• . •; ....... ; .

тедя проводилась и^ осиовзаив.иэ/чения кйга рэстениЙ-асраявв и ' симптомов ваиих, .способа передачи, свойств .in vitro , мэрфологив: .частиц и др. Похииптоыаи аа'Диф$ереациру|хщх_рас1ени1К.иэ.всех-' исследуемых обрэацов о'мозаикой выделен один .возбудитель,идентя-фицированиыЯ век'вирус мозаики сахаряоЯовеюш,; Температура инак-: ■ тязацян, предельное разведение сока, длительность сохранения в со. ке. казахского вэолята виру ¿¿хорошо согласовывались.« литературными дввдымв для BUG /ПереентдагВ. ,:I&90t'RiBeeil .ff v»I97I/i,Kpo-: ме того, было.уставовдено ^ч тов яру с передается яря пом'оад- тлей . ' . неперсистеатным способом (период доступа составляя не более I * мин., сохранение в" пере носчике меле в 4 час.) .Нзу л ьтра тонк из^с ре- , sax в клетках рэстени! сахарпой свеклы'; зараженной ВЫС, обнаружа- .

■ вы тела-вквтенвя,'.харвктерныедля потивврусов.;",7 Л

Пмучеаяеочичеииьалрепа^^^^ ся к гру п пепока в ярусов ,ts груднительно в ■ связи с их низкой ков-; Л дев тр ацией рэ стена aii склоки остью в агрегации в вес те Сильно с тью:■/ в процессе очисгкв. Бкио устваовлеиоу что лучяевсего ШС'накапли- ' ' вается- в растеявяг.мокрица. иапинатасор та Виктория. Использование-;

'иаввстша -из'лятаратура .мвтодол .очистки Е»С а других потивярусов "■ *:не'дало удовлетв^ательных реауаьтатов' ■ Pujieana i., et' ai.,I983; '■■ ' ■ OrQn tzig ti. ' and Г - rt^hi . Поэтомувами 'предложен'

.евойиетодвыделевия,"скщ6внней*аш^^^ рйстиракие'-

- материала, соб!«иото'ддя очистки;^ сту^ н эцетатным Оу- -

; фером; ссдержащмм .0,02 Й!ВДТ1 я 0,02 й -диэтаддвтиокарба мата натрия "■'. в соотио^нвi - 1:4,;ооввтлеиие эксjrpeкта тритоном Х-100 я центри-

'фугирование ■д^aжjщ"Iп>И;ЗSCW*■oC/uия^■в^тe_чaниe^З^ мия.сяспользо-; -'.'.ввваем - 305S-agfl сакаров вой -подувк* ,;содержащеЯ-.4,5ЯПЭГ-6000. Все ■'эта пы: очис тки^проводили' ;пр'й,'44°С; '.Выход -.¿вру с а; со ста вам Vjs-30 ■ мг' ■}. из I кг эереженяых листьев.' ; ./ ; ::V'" • ..' •'•. • '.".«• '■•i^v'V'._■

. спектр-У^поглоценна:рчи«е1тых' препаратов ВИС характеризовав«— ■■'-. с я максимумом" при • 260 вы -я нмамиумои'лря '243. вы, отношение ' 1 ' ^260/280 С0£*8влял0 1,31;~м совпадало с описанным для ВМС в лито-.

рвтуре /; rujtoaw« i..'•' ei. ¿''1963; • crOntxig- я.7' et -!-iai;' , .1979/. -. • • В составе вирионов выявлен одия"тип волияёптидоз.с молекулярной . \ массой 34,7 к2а (рир, 4); Лрм эдектроиномикроскопическом анализе ••'••• . очищенных вируоных,пр?парзтов ябнаружён".один,^^тип-ннтевидных5час^ .;::-

■ " тец с характерной дла потивирусЬв:Структурой. ; \\\ ■■..-

..|ОчаиендыаварусныЯ'лрепарвт'мспольз^ дляподученияанти- ;; сыворотки. Титр сыворотки составлял 1:4096 в реакции:капелькой . - эгглютиаацки:« 2хЮ~°.в непрямом';вариантеПолученные :сив'бро^'

МгХ10

. „г '. V ?И0. 4. ЭЛвКТрОфОр ;

; ■ - у :■, ■ -скйЙ ;анализ ;белков'. ' ■; вируса: мозаики са-•

' •.'>'.'• свеклы, ¿ВМС)

; грели вате полиак-;.; ;'.'■ -рвламидного геля »..V*^ (в-205Ь)I.... " ';'•.'

.И - ..■;' ---.'•'1''-.маркерные белки,

■■-, г ^ препэрат ЖС •л '. "■/;■'." У";1 ^послв очяоткп,;■

'*'^врез* подзвиу;/ 1

.• . /. •• • - С . " розы •'<.

94 _

/67 ,._

43 ;•

зо' _ ; гол _

14.4 _

кя' испольвоваля с: целью 'ра эра вбтки'каагковтикума для иммунофвр- , МеНТКОГО'вНаЛЯза.ВШ^'.гХ.';'-.■'.■:■;"-V.4- ;•

При проведении анэлваа оОрэвцов'сахэриоЙсв^^^ ность. ВМС.отмеча лея повышенный фон/е юятрадеы-зкетра ктс« ,ив :-вдо-р^ых, растений. ^ Этого можно было ожидать,, так'как нативная АС '.;. • реагировала' .о, контролем' дора ¡»веденмя .1:4-1гЭ* Лтобы 'снизить .'фЬЬ пров одил'в';осэздеии е ^ из;-»нтиоыворотки^неопецяфичеоких; аз ти тея белками здоровых ' ¡растений сахарное, свеклы . фракцяй. яшуногл обулинов/ доочикали путец гельфильтра ции 'черад/вблояву-* с; ДЫБ^цазищоаой.-^.у Е р и ^ поста нов не сэ ндви ч: вар ив н»1 Иф д "'■ о . адсорбировта ш м;' ди а гностику чу вс тви те льв оо т ь' ксп е циничность' е наяи за зна чительво'_ловШиа г.-, лась:а • фон;был/весьма низким. '"•/• ' ?;' •.'•• ;'' У.-.^

,'. ' -Сравнение трех'вариантов ИФА Сказало вреивдвдствб.евндвич V ' метода ^ ч'увотви тельное 1Ь:которого; сосаа вляла',3-5 ,,нГ/мй,: (рио.- 5) Экстракты для анализа следует разводить в40^100 раа,. лрн этои чувствительность: ме тода" п о авадяет'/оценш а ть-рез у ль^а ты/визуально'" по .иптенсивности. окраски субстрата. '»Г." ' ' ■V" ' 'т ' •"'' ;> ^ Оптииизация услсдиЯргоеделения^ВЖСи.ВМС' в' копна плодах ■', ■и тлях «етодом ИФД '.л

! - С целью.оптимизации условий'оп'ределения в)£С:и ВЙС .В - корне-.'лходах и тлях/был мспольэован.сэндвич-вариент", разработанный :для. 'диагностики ,?тих вирусов в лйсмвом'материале'.1 .Было устанозлено,.

I0~2\- I0~5

концентрация виру-J ca (нг/мл)

степень разведения

10"

■ '■ ■ £,'■: экстракта 9x10 4 ■■;>■...■

Рис. 5. Тестирование ВИС в,очищенном препарате И рас-: ' - ' тигельном материале сэндвич,методом ■ , I - очинённый препарат ESC; 2 - экстракт из .лиотьев сахарной овекли, зараженной ВМС; ■ .' ■■ 3 ~ препарат гетеродогичного Енрусэ-ВЙХ (коит- : : роль); 4 - экстракт здоровых листьев сахарной ■''■■',. .свеклы (контроль).

что оба вируса накапливаются в максимальной концентрации в верхней трети корнеплода; причем предельное разведение для ШС состав-

ляло 5хЮ~г (рис, 6), а для БХС более .чем 2x10"" (рис^ 7). Рабо- ■ чее рззведеииа экстракта для ШС равно Ii4-I:B, а для BSC - 1:301:300 при оптимальной концентрации иммуноглобулинов и кон-ьвгэта I мкг/мл; при этом разница в- оптической плотности больного-и здорового материала Сила достаточна для визуальной оценки. Полученные диагностику«*, позволили проследить динамику.сохранения ВХС и Ы4С в корнеплодах различных разновидностей свеклы (сахаряая, кормовая, столовая, мангольд); » период .зимнего хранения. Так BSC-сохранялся в корнеплодах в уечение всего периода хранения, лишь

,-4 .i

Рис. 6. Определение Е!1С сэндвич иетодои ЙФА в экстрактах на коркеетодоз ■ сахарной евеми, зараженной ВКС (I) и'здорового корнеплода-,■ /коатрогь/ (2). .

рис, 7.. Определение ШС сэндвич мел дои КФА з экстрактах из корнеплодов сахарной свеклы, зараженной : ВьС (I) и здорового корнеплоде . /контроль/ (2).

постепенно снижая кошгентрацня,.; тогда как МС уже череэЧ месяца практически не обнаруживался.;Однако растения, выросшие иа этих ' • корнеплодов,.будучи;проанализированы;методом КФй, показали высокое содерха н и е в иру са У ч то . по д таерхда е г. важную - роль семеянияов кэи лс-точкикоа "вирусной инфекции и ■ говорит о том, что . выбраковку ■ семенников :на ВМЗ и ВМС лучив ,проводить;осень», когда.' концентрация ви-: руса в корнеплодах высока и получаются- очень четкие результат-: -

Знание ур овня инфи циров'ан кос тв - природной популяции тлей прзд-отавляется-вакным.дляшрогнозировавий-воэыожных потерь, плвниро- ■■ вения и ововврввенногопроведеаия зэщитиыхмероприатвй. Всвяэв . о этим был»'предприняв!;попытка:диагностировать вирусы ■>:тле-пере* : носчике. В результате подобрены оптимальные условия проведения. ИФА .для обнврулевва^ВАС в его осврвном переносчике-; тле.;. My айв,. peraiei* , позволящие достоверна выявлять вирус:дахе в единичных; особях, а, проба аз:го.'мей давала достаточную разницудля.ввэуаль-¿Ой бценкн (рис! fejii' 'г :. ^-V.'.v '"У \ ■ . ■ ■ "."■'." *.'•.. '"'■'' -:

■ Рис. S. Определение ВХС;методом "АН в экстрактах ••• -- ••. 'из тлей, патевшихся na заражение* сахарной "

- .■'■ . .'свекле (1)'и на табако (2) /контроль/.- . . '

При выявления'В!*С в этомхэ-переносчике получены 'менее четкие результаты .'(отличие;инфицированных titea oi здоровы*"устанавливалось. только на. фотометре).'- ■■■■■■'■ . ; ■.'*• ■ . - ' .

" 4. Применение ИФА для индикации BIG И ftbiC при изучении '■'■' " некоторых практических вопросов - . ■', '

.■■■ Полученные' диагностикумы к ВЖС.ч ШС были успеино апробирова- . вы л производственных условиях., Уетодом MA было проанализировано. около тысячи образцов листового материала свеклы,4 собранных на по- ,' лях Казахстана, Киргизии и Узбекистана. Кроме того анализировались ■ образцы сахарной*свеклы, присланные из'Всесоюзного Нйй сахарной свеклы'(Киев), ШС Сил Обнарукек на селекционных посевах ;во всех =" .'обследованных хозяйствах,. ВЖС выявлен только-в образцах с Украины . (табл. X). Представленные в таблице данные свидетельствуют'о высоком уровне зараженности украинских образцов сахарной свеклы ВДС и ВИС, причем инфекция чаще всего была смешанной. При'обследовании производственных посевов кормовой свеклы в'Узбекистане, почти на' ;всех' п(олях отмечалась высокая степень зараженности, ВКС, в то время как MC не был обнаружен, . " . V '.. ■■ / 1 ■

Для определения круга ^вства^-хоаяеа иззчедш* ¿»русов в выявления воэмохньбс природных, резерва торов инокулвровали растения " около 50 видов и сортов.'Используя.метод ИфА; установили» что к-В^С восприимчивы I4,-'ffit ВЖС 13.видов-.и,сортов из1 различных се- ''->

uefiCTBi Chenоpodiaceae, Аяanmth acsàe; Сагуophyllaco ав ,C(myolvu- ■,.

■ laeeae .,';.:Forty 1 ас eoef Al'zoaceae ■ , Кормовая И столовая свек-' ,. ле; а 'таtœe'и а н гольд'гзраадются'BÏC и:ВМС в такой *е .степени; квк. . и сахарная.;в£С. был обмеру*ен в повилике.*Это-суцесгвенпый факт, .;--,

. так как повилика, часто-засоряпщая,свекловичные поля,*,помимо это-,"";

- го может быть еще реэерваторои и переносчцк омы ру ско я инфекции. . ■Растения - McotianatabMwvli,-. H, debneylDoein.i'j/. glutinoaa. t. un, cltveiandi Cray. Л'оказадисьустоичнвымия заражению ВЮ Я вас. По-видимому, каши иаолятв BSC'в ВУС'отличг»тся отевропейсяих,

■ и американских изолятов,; способныхзаражать wicotiana '»ppi .

/ Bjorllng К. , 1958; Chevallier ; >1.; ,1962; ï^ffue ,' ' J. , 1973; Pelait J. , 1971; stepherd . «.' /,. 1965/. . .

При изучении длительности сохранения антигенных1'свойств вирусов сахарное свеклы в растительном.uiaTepuesa'методом.ПФА было установлено,'-что при -2Q°Cj концентрация BiC быстро снихается'п уже

через месяц происходит полная потеря антигенной активности в соке, • аI через тра' месявд я листьях свеклы. Лри.+4°С BiC.сохранялся в экстрактах из листьев сахарной.свеклы около.? дйей.-ВЫС сохранялся ; в листькх свеклы и.в экстрактах из. них до 5-6 месяцев при ,'-20°С И ; около 30 дней Ери t4°C. кроме того,; была установлено, чго - очайшные

- препарата BâC и B;iC могут*сохранять свои антигенное.свойства'бзлье

' f ■■.':'■■'■ ■■■ Таблица I Определение вараженноота образцов свеклы, из ■ Казахстана, КиргизииУкраины и Узбекистана

.кесто сбора .

:.*•, :Нол : пол я; во i . :об-I :■■ ;раз % ".' :цов

¡Зараженность» Средняя оптическая плотность I ■■ % : в ИФА fo.at i eu« - ßiC : БИС

'_ ;! EMG

т

¡контроль

18ДОРО-fBoa) .

BIC ¡контроль . :(здоро-гвое)

Киргизская 'I опытно- , а- А

64 В* '

селекционная стан-7 3 40 Ц»я ц 15

Казахский' I UM земле- - -делил .. с

Всесоюзный НИИ . сахарной свеклы

1

2 У А' ■V

«ю 44

: 5 14 . 25 . 13 ■ 16 •

. 13. ■ ■.

100 . -

? »5 -; А?.

' 7,5 - '

36.4 -

. 40.. ВО . .92,9 9?,9

.'.ioo:; ioo : 100 100

87.5 100

97

86 • -

0,965 - 0,037

1,015 0,025

1,118 0,014

1,526 . 0,029

0,045 0,045

0,0П 0,011 0,011 1,650 . 0,011 ■1,360 0,011

1,199 0,967

0,530 1,410 1,560.

.1,236 О

1',ззз": : о

0,014 , 0,0»: 0,014.

- • . о

0,014 0,014

0,905 0,015 1,210 0,015 0,420 0,015 1,300 '0,015 1,320 0,015

О О.

.Узбекская."у ССР: V \; " г : к-з 50 "лет ' vx ■' 84 : Узбекистана;-^-' '; - gg .

эксперимент-.* ■'■;: . '■.,■■ /.' ■

тальная . : . v .; -■■■-" '• -. .. .-.' .''.'■

база ' I 80 4 100 1,479 ' 0,076 ~ 0 .'.

"КрОСНЫЙ • •/. . : : '.■..■■'■■ : 1 : ' ■

■ водопад" ■:■■■;, :" / '■:!'■■'■.'.■' .;■-* '*--■■ :■ -.'.v'

3-лет.при хранения э 5051 глицерине при -гО°С,чтоочень'важно, так как делает возможным- хранение коллекции' вирусных антигенов. •

. 5.Изучение серологического родства междт различными. '.'¿Г , : изолятаии Big и ptlff ■.'■'-' ':.■'■ : ■;. ■ ■

При сравнении антигенных'свойств;нашего (украинского) иэолята БАС О ИЭОЛЯТОМ ИЗ Англии ( ' White В., EoÜnuneted Experimental Sta- . tion ) в;конкурентном ИФА было-установлено,'что иммуноглобулины •из антисыворотки к английскомуизоляту полностью.блокируют связы-" »ание коньюгата с гомологичным/препаратомукраинского иэоднта. Эти данные свидетельствуют, в пользу присутотвиявсех антигенных да тер-

минант jкрэкаского иэолята ЩЕС в английской изоляте, т.е. эти вирусные изоляты скорее всего антигенно идентичны.

Также было проведено сравнение антигенного, родства казахского и золя та ВИС (ВКСЧС) о и золи та ни вируса ко заики сахарной;свеклы из различных географически удаленных регионов. Установлено, что, ИММуноглобулина ИЗ антисывороток К японскому ( Puiieawa I, national. Agricultural Research Station , Но Гioka) .И ПОртуГВЛЬСКО-«у (Barges !>., Estacao Agronomic a Nacionsl , - Oslras ) ИЗОЛЯТЭМ . полностью блокировали связывание коньюгата с гомологичный .предара-то к казахского ШС (рис. 9). В то же время иммуноглобулины, специфичные к изоляту из Германии ( Riehter J.( Institut ftlr Phytopa-tologie, Aechersleben ), ингибировалн'реакци» не полностью: '■ разница с гомологичными глобул иааиа составляла — 10%. Такии образом,, была установлена'высокая степень антигенного родства BUC-K оо всеми испытанными изолятами кроые ВМС из Германии, что связано, по-видимому, о небольвими итанмовыии различиями. Более отдаленное серологическое родство ЬНС-К проявлял к вируоу желтой мозаики фасоли и вирусу мозаики сои..

." ВЫВОДЫ ' ■ ■

,1. разработаны методы получен ия■о чаден них препаратов вирусов сахарной свеклы,.обеспечавайдие высокий выход ВЖС (150-310 ыг/кг зараженных листьев) и;Б&й (15-31 йг/кг'зараженных листьев).,

2., Показано, что РНК БдС имеет;на 5' - конце К5П структуру, . а на 3* .конце не содержит поли. А 'блока. В бесклеточной балансин~ тезирующей системе РН1С.ВЖ направляет синтез высокомолекулярного продукта 250 каа-и.рй более коротких продуктов, среди которых отсутствует .белок оболочка. - •.'.'.-."■.' ..''' ■'.-',-

■ 3. Выделен-казахский азолят; ВМ* (ВМС-К), .определены его.ос- . яовные хэрэктериотикя, изучен вруг рэ 6 теи вй-х озяеа. Иолекул ярнв й вес белка оболочки равен 34,7. вДа." Установлено; что ВКС-К прояв- , ляет тесное серологическое родство:с японским и португальским изо-лятами и .несколько более, отдаленное с германским;азолятоа^ Кроме ■ ■ того, В^С-К проявлял очень отдаленное родство к.двум другим лоти-вкрусэм - БЫяО a ЗМсои. ' '

4. Разработан диагностикам на;.основе ИФА для, определения ; ВЯС и ВЖ а 'листьях, и .корнеплодах' свеклы. Чувствительность в-сэндвич варианте;йФА- составляла:для ВлС 1-2 нг/кл и 3-5 нг/wt для ЫХ- Этим иетодоы ыожно,било.обварукить;ВЛ;С,3 экстрактах йа листьев и корнеплодов при разведзниях'до 1x10"5 и 2х10~^.соотазт-

ственно. BUC детектировался в экстрактах из листьев при разведана и до 9x10""^, а в корнеплодах при разведении, экстракта более чем в 5x10"^ раз. " \

5. Оптимизированы условия проведения КФА для обнаружения Ш£С з его основном переносчике - персиковой тле.

6. Апробация длагностикуиов для HiА в производственных ус-яовиях показала их пригодность для проведения массовых анализов. Установлено, что в среднеазиатской зоне свеклосеяния (Казахстан, Киргизия, Узбекистан) широко распространен ВМС в отличи вот ВАС, ■ который ни в одном из обследованных районов не был обнаружен.

- Основ кое содержание диссертации отражено в следующих работах:

I. Рогов В.В., Еобкова А.ф., Керасев А;В., Аграновский А.А., * Горбунова ,К.И. Диа гност и кавнру с ам оза и кв'с аха рнойсвеклы методом якиуао'рерментяого анализа. - Доклады ЪАСХНМ, 19$9,й 8, с. 7-10.,

- 2. Рогов В.В., Бобкова.А.Ф.» Карасев А.В., Аграновский А.А., Горбунова Н.Й., Доля В.В., Атабеко» М;Г. .Вирус желтухи сахарной. ,', .; свеклы:.выделение, очистка и диагностика методом-мимуноферментно- .

. го авализа. --Селк1кохозяйотвеяная биология, 1990,.й I, о. .181-186.' ■

.3. Рогов В.В., Харзсев А.ВА гранов скийА.А.Горбунова Н.й. > Атабеков И.Г. Исследование; биологических и серологических,свойств. нэолята 'вируса мозаики ..свеклы,, выделенного в Южном Казахстане.. >-- Тезисы докл адов'.Всесоюзкой конференции."Микробиологические и'бко-технологическве основы интенсификации растениеводства' и кормопроиэ- ; водства, Алиа-Ата, 1990, с. 84^ ' ' ■.'

.4.-,Рогов'в.В:,'..Горбунова Н.И. 'Диагностика вирусов желтухи и мозаики сахаряов свеклы методом .иммуноферыентного анализа. , -Тезисы докладов Всесошной кснфервши!* "Микробиологические м био-. . технологическиа основы интенсификации растениеводства а кормопромз- ' водства, Алиа-Дта, I990,1 с. 85. •

• 5.' Karaeev A.V; ,' Aglwiovsky A. A.', Fogov. V^V. , Mirouhirieher.ico П.A.. Dolja V.V., AtEibekov J,.G. Virion HNA of Beet Yellowa Closterovinisi Cell-free Translation ana uorae Properties.- J.реп;Virol., 1983, 70, p. 241—245» -'...'■■,■/■'.; ; ,"

■ S.Karp.s^V A.V., Rogov'V.V,, Hikoloeva O.V., lUronlmichenki. H.A.',

Agranovsky A.A., Dolja V.V..Detection ofbeet:yellows virus Ъу means of dot and electro-blot iraaunobinding and.nucleic acid hybridisation • assays.--Int. Proceedings of: the .6 th Congress of Mediterranean Fhyto-pathological Union; Agadir, Morocco, 1Э90. ■ ■ .

Иодпжсано к печати 09.04.91г. 0&>ем 1,0 п.л., Тлрех 100 »xs. ■ :

' ' Заказ № 837 ,

Офоетиая лаборатории Госкомцен УзССР,Tsmwat,Аллея Парадов, 5