Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств интерполиэлектролитных комплексов для ингибирования вирусной репродукции in vitro

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств интерполиэлектролитных комплексов для ингибирования вирусной репродукции in vitro"

Российская академия медицинских наук Научно-исследовательский институт гриппа

СЛИТА Александр Валентинович

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ИНТЕРПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ВИРУСНОЙ РЕПРОДУКЦИИ /Л УГПЮ

(03 00 Об - вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

003162068

Санкт-Петербург 2007

003162068

Работа выполнена в отделе молекулярной вирусологии ГУ Научно-исследовательский институт гриппа

Научный руководитель

академик РАМН, профессор, доктор биологических наук Киселев Олег Иванович

Ведущая организация

ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов»

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Перевозчиков Андрей Петрович

доктор биологических наук, Еропкин Михаил Юрьевич

Защита диссертации состоится ноября 2007 г в 4Р_Ч ^.шн на

заседании Диссертационного совета Д 001 043 01 при ГУ НИИ гриппа РАМН по адресу 197376 Санкт-Петербург, ул проф Попова, д 15/17

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ гриппа РАМН Автореферат разослан

_" октября 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 001 043 01 кандидат медицинских наук

ЛобоваТ Г

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Отсутствие на фармацевтическом рынке достаточного выбора противовирусных химиопрепаратов обусловлено, прежде всего, особенностями жизненного цикла возбудителей вирусы являются клеточными паразитами, подчиняющими себе репликативный и метаболический аппарат клетки-хозяина, и невозможно влиять на жизненный цикл вируса, не затрагивая клетку, поэтому для большинства веществ существует проблема общей и селективной токсичности Кроме того, в результате мутаций появляются устойчивые к действию данного вещества вирусные субпопуляции, вакцинопрофилактика вирусных инфекций в ряде случаев затруднена появлением новых антигенных вариантов возбудителя, а значит, химиотерапия вирусных инфекций часто является единственным средством лечения Поэтому поиск новых препаратов и подходов в терапии инфекционных вирусных заболеваний остается крайне актуальным

Можно выделить две группы веществ, используемых в терапии вирусных инфекций вещества, непосредственно ингибирующие вирусную репродукцию на разных стадиях и вещества - индукторы эндогенного интерферона, а также коммерческие препараты интерферона

Известные индукторы интерферона - циклоферон, неовир, камедон ,амиксин (тилорон) - обладают широкой противовирусной активностью, иммуно мо дул ирую щ им и противоопухолевым действием Вместе с тем, учитывая разнообразие их фармакологических свойств, изучены они недостаточно

Поиск новых веществ, имеющих противовирусные свойства, ограничивается, в основном, производными пуринов и пиримидинов, и, как правило, это дериваты уже известных препаратов, например, ацикловира или зидовудина (с1е С1еп^ Е, 1997, Киселев О И и др , 1999) В то же время, многие проблемы, связанные с применением противовирусных препаратов, можно решить включением их в полимерную матрицу (Плата Н А , 1986) Благодаря этому повышается их эффективность, снижается токсичность, преодолевается эффект вирусной резистентности, регулируется продолжительность действия и скорость выведения из клетки и организма (Киселев О И , 1999)

Одним из направлений в разработке новых препаратов направленного противовирусного действия является использование специфических

олигонуклеотидных последовательностей, которые взаимодействуют только с комплементарными нуклеотидными участками соответствующих нуклеиновых кислот Поскольку используемые олигонуклеотидные последовательности комплементарны участкам кодирующих, т е смысловых (sense) цепей нуклеиновых кислот, их принято называть антисмысловыми (antisense) олигонуклеотидами Антисмысловые олигонук-леотиды могут выступать в качестве ингибиторов вирусной репликации Так, препарат фомивирсен, представляющий собой антисмысловой оли-гонуклеотид, эффективен при терапии ретинита, вызванного цитомега-лов иру сом, у больных СПИД (Wiegand Т W , Young L Н, 2006) Однако лишь малая часть чужеродной ДНК проникает через клеточную мембрану, и, попав в цитоплазму, очень быстро деградирует под действием клеточных ферментов Полимерные катионы образуют с ДНК устойчивые комплексы, с высокой эффективностью транспортируют ее внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз, и имеют ряд преимуществ удобство в хранении и очистке, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений Наиболее широко используются в генотерапевтических исследованиях поли(Ь-лизин), поли-этилснимин, полидиметиламиноэтилметакрилат, полиамидоамины и дендримеры на их основе, катионные липиды, хитозан - катионный полимер глюкозамина

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилась характеристика биологических и физических свойств комплексов полиал-лиламина, полидиметиламиноэтилметакрилата и их производных с плаз-мидной ДНК и антисмысловыми олигонуклеотидами для ингибирования репродукции вируса герпеса 1-го типа и цитомегаловируса человека

Задачи исследования.

1 Изучить эффективность связывания исследуемых полиаминов с ДНК

2 Исследовать токсичность полиаллиламина, полидиметиламиноэтил-метакрилата и их производных в культуре клеток

3 Изучить трансфекционную активность интерполюлектролитных комплексов полиамин-ДНК in vitro

4 Исследовать противовирусное действие полиаминов в культуре клеток

5 Изучить влияние интерполиэлектролигных комплексов полиаминов с антисмысловыми олигонуклеотидами на репродукцию вируса простого герпеса 1-го типа и цитомегаловируса в культуре клеток

Научная новизна.

1 Впервые показано вирулицидное действие полиаллиламина, полиди-метиламиноэтилметакрилата и их производных в отношении вируса простого герпеса и цитомегаловируса in vitro

2 Впервые показано, что низкомолекулярные полиаллиламин и полиди-метиламиноэтилметакрилат в низких концентрациях эффективно переносят ДНК в эукариотические клетки m vitro, не проявляя токсичности

3 Разработан высокоэффективный способ трансфекции эукариотиче-ских клеток

4 Впервые показано, что антисмысловые олигонуклеотиды в составе ингерполюлектролитных комплексов с полиаллиламином, полиди-метиламиноэтилметакрилатом и их производными способны проникать в клетки и ингибировать вирусную репродукцию

Научно-практическая значимость работы. Полученные в рамках проведенных исследований данные о физико-химических и биологических свойствах интерполиэлектролихных комплексов синтетических поликатионов с ДНК имеют большое практическое значение для развития генотерапевтических методов Разработан быстрый и эффективный способ трансфекции эукариотических клеток с помощью катионных полимеров В результате проведенных исследований показана возможность использования интерполиэлектролитных комплексов ангисмысловых олигонуклеотидов с синтетическими поликатионами для ингибирования вирусной репродукции, что представляет большой интерес для поиска новых подходов в терапии вирусных инфекций

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и их производные образуют устойчивые комплексы с ДНК, обеспечивая ее трансмембранный перенос и защиту от клеточных гидролаз

2 Антисмысловые олигонуклеотиды в комплексе с синтетическими поликатионами способны проникать в инфицированные клетки и ингибировать вирусную репродукцию

3 Ингерполиэлектролитные комплексы полиаллиламина и полидиме-тиламиноэтилметакрилата с ДНК способны с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки и могут быть использованы для разработки средств генной терапии

Апробация работы.

Материалы по теме диссертации были представлены

1 3-й международный симпозиум "Molecular mobility and order in polymer systems", С - Петербург, 1999 г

2 II Всероссийский Каргинский симпозиум "Химия и физика полимеров в начале XXI века", Черноголовка, 2000

3 Всероссийская научная конференция "Современные аспекты вакци-нопрофилактики, химиотерапии, эпидемиологии, диагностики гриппа и других вирусных инфекций", С -Петербург, 2001

4 Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003

5 III Всероссийская Каргинская конференция "Полимеры - 2004"

6 5th Int Symp «Molecular mobility and order m polymer systems», S Petersburg, 2005

7 IV Всероссийская конференция, посвященная 100-летию акад В А Каргина «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007

Публикации. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит ß таблиц, рисунков Список литературы содержит наименований на русском и английском языках

Материалы.

Клеточные культуры. Для тестирования противовирусного действия и токсичности растворов исследуемых веществ и трансфекционной активности интерполиэлектролитных комплексов использовались следующие культуры клеток Vero - клетки почки зеленой мартышки, Т-98G - клетки астроцитомы человека, ФЛЭЧ - фибробласты легких эмбриона человека, U 937 - лимфобластоидные моноцитарные клетки человека Все клеточные культуры были получены из Банка клеточных культур НИИ гриппа РАМН

Вирусы. Вирус простого герпеса 1 типа (ВПГ 1) - штамм ЕС, получен из Музея вирусов Института вирусологии им Д И Ивановского

Цитомегаловирус (ЦМВ) человека - штамм AD 169, получен из American Type Culture Collection (АТСС)

Плазмиды и олигонуклетвды. Зкспрессионные векторы - плазми-ды, содержащие маркерные гены ß-галактозидазы (LacZ) Е coli, зеленого флуоресцирующего белка (GFP) и тимидинкиназы вируса простого герпеса (ТК HSV), под контролем цитомегаловирусного промотора Плаз-миды очищали в градиенте плотности CsCl и ресуспендировали в 0,15 М NaCl в концентрации 0,5 мкг/мл, аликвоты хранили при - 20°С

Олигонуклеотиды - меченные ФИТЦ олигонуклеотиды "FITC Gene Block" (Atugen, Германия)

Антисмысловые олигонуклеотиды против ВПГ1 АС 1 — (5 '-AGGGCGTTCCTCCJG-3') - комплементарен акцепторному сайту сплайсинга предранней пре-мРНК (Shoji Y et al, 1996),

ISIS 4015 — (5'-GTTGGAGACCGGGTTGGGG-3') - комплементарен 5'-некодирующему региону UL 29 мРНК (Flores-Aguilar М et al, 1997)

Антисмыслоеой олигонуклеотид против ЦМВ

ISIS 2922 — (5'-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3') - комплементарен предраннему региону 2 мРНК, кодирующих 55- и 86-kDa пептиды, ответственные за экспрессию вирусных генов (Flores-Aguilar М et al, 1997)

ДНК для опытов по двойному лучепреломлению, вискозиметриче-ских и спектральных исследований использовали ДНК из тимуса теленка (Sigma) ММ 9 х 10б г/моль

Поликатионы. В исследованиях были использованы поликатионы ряда полиаминов, имеющие аминогруппу во вторичном, третичном и четвертичном положениях поливиниламин PVA (ММ 15000), полиаллила-мин РАА(ММ 10000, 18400, 50000), полидиметиламиноэтилметакрилат PDMAEM (ММ 21000,55000,78000) (рис 1)

abe d

A\k

Рис 1 Структурные формулы поликатионов a -PVA (15000), b -РАА (8000, 12000 и 25000), с -PDMAEM (9000, 20000, 30000, 40000, 50000, 80000, 150000), d -сополимер PDMAEM-PDMAEM Alkl (Alk = СН3, С4Н9, С8Н17, 30000 или 40000)

Методы

Получение вируссодержащей жидкости. Вирус простого герпеса накапливали в культуре клеток Vero в поддерживающей среде DMEM, О, 5 % сыворотки крупного рогатого скота О наличии вируса судили по формированию характерного ЦПД Тигр вируса в полученной вируссодержащей жидкости определяли методом конечных разведений, он составлял 7-8 lg ТЦД50/мл

Цитомегаловирус накапливали в культуре ФЛЭЧ в поддерживающей среде О наличии вируса судили по формированию характерного ЦПД Титр вируса в полученной вируссодержащей жидкости определяли методом конечных разведений, он составлял 5 lg Т1_Щ50/мл

Получение электролитных комплексов и оценка эффективности связывания поликатионов с ДНК. Для определения оптимальных соотношений аминогрупп поликатионов и фосфатных групп ДНК (N Р) в интерполиэлектролитных комплексах (ИПЭК) смешивали 2 мкл раствора ДНК в 0,15 М NaCl (0,1 мкг/мкл) с 10 мкл раствора поликатиона в 0,15 М NaCl (100 мг/мл, 10 мг/мл, 1 мг/мл, 0 1 мг/мл, 0 01 мг/мл) и инкубировали 40 мин при 37°С Эффективность связывания ДНК с полимерными катионами оценивали по гашению флуоресценции бромистого этидия после электрофореза ИПЭК в 0 8 % агарозном геле при силе тока 90 тА

Исследование физических свойств интерполиэлектролитных комплексов. Для изучения концентрационных параметров образования ИПЭК, размеров образующихся комплексов, оценки нативности компак-тизованной ДНК использовались методы низкоградиентной вискозиметрии, динамического двойного лучепреломления и спектральные исследования

Определение токсичности поликатионов и их комплексов с ДНК.

Токсичность веществ для культур клеток определяли, используя растворы поликатионов различной концентрации, с помощью МТТ-теста, основанного на способности митохондриальных дегидрогеназ жизнеспособных клеток превращать желтую соль метилтетразолия в формазан, имеющий фиолетовую окраску Количество формазана определяли фотометрически, измеряя оптическую плотность растворов при длине волны 550/590 нм

Трансфицирование клеточных культур ин герполиэлектролит-ными комплексами. Трансфицирование клеточных культур произво-

дили двумя методами 1 - трансфицирование клеток в монослое, 2 -тр анс фициров анис клеток в суспензии

1 Перед проведением процедуры трансфицирования клетки выращивали в 35 мм чашках Петри ("Sarstedt", Германия) до 60-80 % монослоя Клетки трижды отмывали от сыворотки бессывороточной средой, наносили на них 300-500 мкл полученного раствора ИПЭК в 0, 15 М NaCl и инкубировали 3 ч при 37° С в атмосфере 5 % С02, нагрузка плазмидной ДНК на чашку составляла 2 мкг По окончании инкубации к клеткам добавляли ростовую среду DMEM с 10 % сыворотки плода коровы В чашки с клетками, трансфицированными ИПЭК с геном ТК HSV, через 24 ч вносили ацикловир в концентрации 150 мкг/мл Эффективность трансфекции оценивали через 48-72 ч

2 Клетки снимали с поверхности субстрата раствором химопсина, суспендировали в бессывороточной среде и центрифугировали 20 мин при 1500 об/мин Полученный осадок ресуспендировали в 100-200 мкл раствора ИПЭК и инкубировали 1 ч при 37° С, периодически взбалтывая По окончании инкубации клетки разводили ростовой средой до концентрации 2 105 кл/мл и сеяли в 35 мм чашки Петри, при этом нагрузка плазмидной ДНК на чашку составляла 0,4-0,5 мкг К клеткам, трансфицированным ИПЭК с геном ТК HSV, через 24 ч

после процедуры трансфекции добавляли ацикловир в концентрации 50 мкг/мл Эффективность трансфекции оценивали через 48-72 ч

Оценка эффективности трансфекции. Эффективность трансфекции оценивали по количеству клеток, в которых экспрессировался тот или иной маркерный белок

По окончании культивирования клетки, трансфицированные ИПЭК с геном ß-галактозидазы, суспендировали, отмывали 0,15 М NaCl и фиксировали После фиксации клетки отмывали 0,15 М NaCl, к осадку7 добавляли раствор X-Gal и инкубировали во влажной камере при 37°С 3-5 ч X-Gal, являясь хромогенным субстратом для ß-галактозидазы, при взаимодействии с ней образует преципитат голубого цвета По окончании реакции 10 мкл клеточной суспензии помещали в камеру гемоцитометра и определяли процент окрашенных клеток Для каждого образца процедуру повторяли не менее 10 раз

Клетки, трансфицированные ИПЭК с геном ТК HSV, окрашивали гематоксилин-эозином, заключали в бальзам и наблюдали в световом микроскопе, оценивая количество погибших клеток

Наличие GFP в транефицироваиных клетках наблюдали в люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ И-3 (ЛОМО) с водной иммерсией по характерному зеленому свечению Количество транефицироваиных клеток определяли в проточном цитофлуориметре ("Dako", Дания)

Определение вирусингибируницей активности активности исследуемых веществ. Вирусингибируюшую активность поликатионов определяли следующим образом 300 мкл вирусного инокулята (6 lg ТЦД50/МЛ ВПГ 1) смепшвали с 300 мкл раствора поликатиона с концентрацией 100 мкг/мл и инкубировали 30 мин при 37° С После инкубации 10-кратные разведения жидкости наносили на клетки и культивировали 48 ч до появления вирусного ЦПД в контроле

Исследование вирусингабирующего действия антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК. Клетки Т 98G и ФЛЭЧ выращивали в 96-луночных планшетах до образования монослоя и инкубировали с 100 мкл раствора ИПЭК с различной концентрацией антисмысловых олигонуклеотидов в 0,15М NaCl 0,1, 1, 10, 100, 1000 мкМ 1 ч при 37°С В качестве контроля использовали растворы антисмысловых олигонуклеотидов в тех же концентрациях, ганцикловир и ацикловир 50 мкг/мл После инкубации в лунки вносили 100 мкл вирусного инокулята ВПГ 1 или ЦМВ соответственно Вирусингибирующее действие определяли по степени проявления цитопатогенного действия ВПГ 1 0 - без изменений, 1 - слабые изменения клеток без выраженного ЦПД, 2 - ЦПД < 25% монослоя, 3 - ЦПД 25-50% монослоя, 5 - ЦПД 75-100% монослоя.

Результаты и обсуждение

Исследование физических свойств интерполиэлектролитных комплексов. Было показано, что в комплексе, соответствующем компактной форме ДНК, макромолекула надежно защищена от агрессивных факторов Например, в области Спол/Сднк < 1 присутствие поликатиона в растворе не влияет на протонирование ДНК, которое мы наблюдаем при том же значении рН, что и для свободной ДНК, фиксируя изменения в спектрах поглощения, характерные для протонированной формы дву-спиральной ДНК При больших же Спол образуется комплекс, в котором поликатионы полностью защищают ДНК от агрессивных факторов, к которым относится пониженная кислотность среды, вызывающая протонирование азотистых оснований макромолекулы и дестабилизацию ее вторичной структуры Результаты исследования специфической вязкости

растворов высо ко молекулярной линейной ДНК разной концентрации (от 6,0x10 М до Зх10"4М) показали, что основную роль в определении повеления систем в условиях описываемого эксперимента играет именно концентрация поликатиона в растворе: увеличение концентрации полШ-аМиламина выше 2.5■ 10-3М приводило к выпадению ДНК в осадок. Последующее добавление избытка раствора полиаллнламнна той же концентрации не приводило к переходу нерастворимого комплекса в состояние растворимого При меньших концентрациях по ли катионов в растворе в достаточно широком диапазоне Спол/Сднк специфическая вязкость сохраняла неизменное значение, то есть в этих условиях ДНК как бы не чувство ват а присутствия подикатионов. Опыт показал, что в условиях эксперимента при Спол/Сднк< ! перснстенгная длина ДНК не меняется (таблица I). При Спол/Сднк >3 оптическая анизотропия раствора падает практически до нуля вследствие образования компактных структур.

Оценка эффекпшдоста связывания поли катионов с ДНК. Степень связывания поликатионов с ДНК определяли методом гашения флуоресценции бромистого этидия. Ьыло показано, что все исследованные пол 1 [катионы связывают ДНК. На рис. 2 представлен электрофорез ИПЭК. образованных плазмиднон ДНК с РУЛ ММ 15000, РА А ММ 25000 и РОМА ЕМ ММ 30000. Можно наблюдать, что флуоресценция

Рис 2. Гашение флуоресценции бромистого этидия. связанного с плазмиднон ДНК. при повышении концентрации поликатиона:

I -5 PVA {100 мг/мл. Ю мг/мл, 1 мг/мд, 0.1 мг/мл, 0.01 мг/мл); 6- 10 РА А (100 mi/мл. 10 мг/мл, ! мг/мл, 0.1 мг/мл. 0.0 ¡ мг/мл);

12 - 16 PDMAFÍM (100 мг/мл. 10 мг/мл, ! мг/мл, ОЛ мг/мл, 0.01 мг/мл);

II - контроль плазмиднон ДНК (0.1 мг/мл).

бромистого этидия возрастает при понижении концентрации поликатиона (дорожки 2-5, 8-10, 13-16) и ослабевает до полного исчезновения при ее повышении (дорожки 1, 6, 7, 12) Это позволяет предположить, что исследованные катионные полимеры при образовании ИПЭК экранируют ДНК от поступления красителя, и окрашивается лишь некомплекси-рованная ДНК

Полученные результаты показывают, что минимальное молярное соотношение азот фосфор (И Р), при котором происходит полное гашение флуоресценции бромистого этидия, зависит от химической структуры поликатиона (табл 1) полимеры, содержащие четвертичные аминогруппы, более эффективно связывают ДНК (обр 12-15) Близкими по эффективности связывания оказались РУА и РАА сходной молекулярной массы, имеющие первичные аминогруппы в боковой цепи (обр 2 и 4)

Определение токсичности поликатионов и их комплексов с ДНК. Сравнительный анализ токсичности показал, что все соединения обладали дозозависимой цитотоксичностъю Средние ингиб игорные концентрации 1С50, на 50% подавляющие активность митохондриальных ферментов, для препаратов РЭМАЕМ, алкилированный СДЫ и С2ЬЫ составили 3,30 ±0,2 мкг/мл и 1,12 ± 0,03 мкг/мл соответственно Из трех РАА наибольшую цитотоксичность проявил РАА (12000), и его 1С50 составила 2,4 ± 0,14 мкг/мл Повреждающее действие РАА (8000) и РАА (25000) в отношении клеток было близким и ГС50 этих препаратов оказались 4,5 ± 0,6 и 4,1 ± 0,5 мкг/мл соответственно Комплексы ДНК с исследованными поликатионами в тех же концентрациях практически не токсичны При этом концентрации поликатионов, используемые в опытах по трансфекции, значительно ниже, чем их минимальная токсическая доза

Трансфекционная активность поликатионов и корреляция между структурой молекулы и эффективностью транспорта ДНК в клетки. В табл 1 суммированы результаты исследований трансфекци-онной активности РАА, РБМАЕМ и его производных в клеточной культуре астроцитомы Т 98С отчетливо видно, что эффективность трансфекции с данными полимерами высока и может достигать практически 100% (рис 3) Анализ структуры исследованных полимеров показывает, что на трансфицирующие свойства ИПЭК не влияет структура амина

Табл 1 Значения минимальных соотношений N Р, обеспечивающих полное связывание плазмидной ДНК, и эффективность трансфекции клеток Т98С интерполиэлектролитными комплексами поликатион/риС 19/р-Оа1

N Поликатион ММ N Р Окрашенные клетки, %

1 РУА 15000 1 1 22±9

2 РАА 8000 2 1 100±15

3 РАА 12000 1 1 94+15

4 РАА 25000 1 1 96±12

5 РВМАЕМ 9000 1 2 92±Ю

6 РВМАЕМ 30000 1 2 96+10

7 РВМАЕМ 40000 1 2 97±10

8 РВМАЕМ 50000 1 3 88+9

9 РВМАЕМ 80000 1 3 36+6

10 РВМАЕМ 150000 не опр 5±3

11 РВМАЕМ - РВМАЕМ •С2Н51 (47,8 моль%) 40000* 1 4 92+12

12 РВМАЕМ - РВМАЕМ •С4Н^ (45,0 моль%) 40000* 1 4 94+10

13 РВМАЕМ - РВМАЕМ •С8Н171 (3,5 моль%) 30000* 1 3 37+8

14 РВМАЕМ - РВМАЕМ •С8Н171 (13,8 моль%) 30000* 1 3 32 +6

15 РВМАЕМ-РВМАЕМ •С8Н171 (28,6 моль%) 30000 1 2 20±4

* - ММ исходного ПДМАЭМ

Так. например, РОМАЕМ является третичным амином, а РАА - первичным. С другой стороны, азот во всех с тру ктурах содержится не в составе основной цепи, а св'л лан с ней ко валентно через спейсеры различной длины, что позволяет говорить о роли сферических факторов в образовании комплексов ДНК-поликатирд, Эффективность трансфекции завнелт от состава ИПЭК. Как показали проведенные исследования, наибольшей трансфекцнонной активностью обладают гомополпмеры - РАА и РОМАЕМ причем эффективность трансфекции при их использовании практически одинакова и достигает 80-100 % (рис. 3).

Рис. 3. Ктсткн Т 98С. трансфииированные ИПЭК РОМАЕМ/ р>-Са1 гшеле реакции с Х-Оа). Увеличение х 360.

На рис.4 представлены гистограммы, полученные на проточном ци-то^туориметре, иллюстрирующие различия с трансфекцнонной активности комплексов, образованных РАА и РОМАЕМ с ол иго ну клеотн дамп. меченными ФИ 1 Ц. при трансфекции ими лимфобластопдных клеток И937

Из приведенных гистограмм видно, что наибольшая эффективность трансфекции достигается при использовании комплексов на основе РАА (с) - пик флуоресценции сдвигается до 100. в то время, как при использовании РЭМАЕМ (Д) и некомплексироваиных олигонукдеотндов (Ь) флуоресценция трансфиыц¡рованных клеток практически не отличается от фоновой (а). Включение в состав молеку лы алк]пьных заместителей с разной длиной цепи не улучшало их трансфскционных качеств, и сополимеры обладали более низкой трансфекцнонной активностью по сравнению с го мопол им ер ам и (табл. I). Обшей закономерностью для всех полнкатионов явилась строгая зависимость трансфекцнонной активности ИПЭК от молекулярной массы полимера.

<ivn Til ClMll ¥¿79

Gm fi1 сж 4 3'

а.

I 1 10

í-:: ft 5f«

C.

ífi IIK IO00 FL1 -

d.

Рис. 4. Эффективность трансфскцпп лимфобластоидных клеток U937 олигонуклеотнд-ФИТЦ - пол1 ikanюнными комплексами по данным проточной цитофлуоримстрни: а — фоновая флуоресцендия нетрансфнцпро-в энных jtn сто к: b - флуоресценция клеток, трансфипиро ванных неком-плексировэнными олигонуклеотидамн; с — флуоресценция клеток, трансфпшгрованных комплексами меченых олигонуклеотидов с РАА 0000); d - флуоресценщ и клеТОк, трансфицировйнных комплексами меченых ол иго ну к. icoTi став с PDMAEM (ЗО(ЮО).

Оптимальную активность проявляли полимеры с молекулярной массой от 25 до 5(1 kDa Повышение молекулярной массы поликатнонов более 150 kDa. вероятно, ведет к прекращению их трансмембранного транспорта (табл. 1) Это свидетельствует о том, что молекулярные размеры полимера и комплекса имеют критическое значение для преодоления клеточного барьера (плазматических мембран) В то же время, экспонированные на поверхности комплекса положительно заряженные группы токсичны при взаимодействии с фосфолпгшдами клеточных мембран, поэтому при использовании гомополимеров остаточная токсичность после комплсксообразованпя с ДНК неизбежна, но она несуще* ствснно снижает эффективность трансфекции и не отражается в целом на

экспрессии генов, перенос которых осуществляется с помощью комплекса полимер/ДНК.

Определение вирусингибирующей активности активности нс-следудоых веществ. По результатам проведенных экспериментов все исследованные вещества в той или иной степени обладали вирусингиби-рующей активностью, однако было показано, что она обусловлена виру-лицидным действием поликатионов. На рис. 5 (а. Ь) показано действие РАА и PDMAEM на Bill 1 через 10 мин инкубации; наблюдается разрушение оболочек вирионов.

hie. 5. Разрушение оболочек вирионов В! N I под действием: а - РАА, b- PDMAEM,

Вирусишибируюшее действие ангисмы еловых олигонук. leorn-дов it составе ИПЭК. Исследования вifpyсингибирующего действия ан-тнсмысловых олшонуклеоптдов в составе ИПЭК in vitro в отношении ВПГ 1 потжалн, что для олигонуклеотида ISIS 4015 50%) ийгибируюшая Концентрация сос тавила J мкМ, что совпадает с показателем аиюсловира. Олигонуклеотпд AC I обладает значительно более низкой протнвовп-р> смог"? активностью, даже в концентрации 1000 мкМ не достигая 50% ингмбирования Bi II' I.

Активность олигонуклеотида ISIS 2922 в отношении цитомс гало вирус а была высока, хотя и несколько ниже, чем у ганцикловира, и его 50% ингибир) ющая концентрация состав!ила 10 мкМ. 1 Iomhmo свойств самого ISIS 2922, это может объясняться более длинным циклом репродукции ЦМВпо сравнению с В! 11' 1,

а.

Выводы

1 Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и его производные образуют стабильные интерполиэлектролигные комплексы с плазмидной ДНК и олигонуклеотидами, экранируя ДНК от связывания с бромистым этидием и защищая от действия клеточных эндо-нуклеаз

2 Полиаллиламины проявляют значительно более высокую токсичность для in vitro по сравнению с полидиметиламиноэтилметакрила-том и его производными Интерполиэлектролитные комплексы цито-токсичность не проявляют

3 Полиаллиламин и полидиметиламиноэтилметакрилат обладают ви-рулицидной активностью

4 Наибольшей трансфекционной активностью обладают интерполиэлектролитные комплексы на основе гомополимеров - полиаллила-мина и полидиметиламиноэтилметакрилата Включение б состав молекулы поликатиона алкильных заместителей не улучшает его трансфекционных качеств

5 Исследованные поликатионы обеспечивают транспорт ДНК через клеточную мембрану и экспрессию трансгенов

6 Антисмысловые олигонуклеотиды против ВПГ 1 и ЦМВ в составе интеполиэлектролитных комплексов с полиаллиамином и полидиме-тиламиноэтилметакрилатом эффективно ингибируют вирусную репродукцию в культуре инфицированных клеток, в то время как виру-сингибирующее действие свободных антисмысловых олигонуклео-тидов не наблюдалось

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Киселев О И , Слета А В , Грудинин МП идр/ Трансформация эу-кариотических плазмидной ДНК в комплексе с полимерными катионами // Доклады Академии наук, 1999, том 366, № 5 С 699-701

2 Nazarova OV, Panarm EF, Slita AV, Sushko ML, Klenm SI, Kiselev 01/ Transmembrane transfer of polyelectrolite DNA-polycation complexe // Molecule mobility and order in polymer systems Abstracts 3rd Int Symp S-Petersburg, 1999 P-118

3 Сушко М JI, Панарин Е Ф , Назарова О В , Кленин С И, Слита А В , КиселевО И / Полиэлектролитные комплексы синтетических поликатионов и ДНК //Тезисы докладов II Всероссийского Каргинского симпозиума (с международным участием) "Химия и физика полимеров в начале XXI века", Черноголовка, 2000 С 4-37

4 Киселев О И , Деева Э Г , Слита А В /Новые подходы в конструировании антивирусных препаратов //Экология человека, Архангельск, 1999, №4, с 18-21

5 Киселев О И , Деева Э Г , Слита А В , Платонов В Г /Антивирусные препараты для лечения гриппа и ОРЗ //Дизайн препаратов на основе полимерных носителей СПб, 2000

6 Слита А В , Назарова О В , Решетникова О Ю , Бузицкая Ж В , Сту-кова М А, Грудинин МП/ Подавление репликации вируса простого герпеса 1 типа m vitro с помощью антисмысловых олигонуклеоти-дов// Материалы международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003 г, с 65

7 Стукова М А, Смирнова Т Д, Слита А В , Грудинин М П , Киселев О И / Исследование влияния ряда химических соединений на репродукцию цитом егаловиру с a m vitro// Материалы международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003 г С 179

8 Смирнова Т Д , Стукова М А, Слита А В , Сироткин А К, Прочуха-нова А Р , Грудинин М П /Моделирование хронической формы ци-томегаловирусной инфекции в ряде перевиваемых клеточных культур// Материалы международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003 г С 178

9 Комплексы ДНК с поликатионами и их применение для направленной передачи генетической информации в клетки / А В Слита, Н А Касьяненко, О В Назарова, И И Гаврилова, О И Киселев, Е Ф Панарин // III Всеросс Каргинская конф "Полимеры-2004", М 2004 С 374

10 Ковтун Н Б , Матвеева О В , Слита А В , Касьяненко Н А, Назарова О В , Панарин Е Ф / Сравнение физико-химических свойств комплексов ДНК с различными сополимерами на основе диметиламино-этилметакрилата в растворе // Тез Докл II С -Петербургской конф Молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», С -Пб, 2006 Ч 3 С 31

11 Слита А В , Назарова О В , Касьяненко Н А , Леонтьева Е А , Киселев О И , Панарин Е Ф / Изменение биологических свойств поли-электролигных комплексов в зависимости от состава поликатиона // IV Всеросс конф , посвящ 100-летию акад В А Каргина «Наука о полимерах 21-му веку», М 2007 Т 2 С 424

12 А V Slita, N A Kasyanenko, О V Nazarova, 11 Gavnlova, Е М Eropkma, А К Sirotkin, Т D Smirnova, ОI Kiselev, Е F Panann / DNA-Polycation Complexes Effect of Polycation Structure on Physico-chemical and Biological Properties // J Biotechnology 2007 V 127 P 679-693

13 Касьяненко H A , Захарова H Б , Мухин Д A , Слита А В , Назарова О В , Леонтьева Е А , Панарин Е Ф / Комплексы ДНК с поликатионами, используемые для доставки ДНК в клетки //Биофизика 2007 (В печати)

14 N A Kasyanenko, А V Slita, О V Nazarova, Е F Рапагш/ Formation of nanoparticles on the base of DNA complexes with polycations as nonviral gene vectors// Book of abstracts of XVI International Conference on Chemical Thermodynamics m Russia and X International Conference on the Problems of Solvatation and Complex Formation m Solutions Suzdal, July 1-6, 2007, II P 5S-537-538

г

Подписано в печать 08 09 2007 Формат 60x88 1/16 Печать оперативная Бумага офсетная Гарнитура тип "Тайме" Уел -печ л 1,2 Тираж 100 экз Зак № 496

Изготовлено в ООО «Полиграф экспресс» 194223, Санкт-Петербург, ул Курчатова, 9 Тел (812)702-14-15

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слита, Александр Валентинович

Введение

Цель исследования

Задачи исследования

Научная новизна

Научно-практическая значимость работы

Основные положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Обзор литературы

1. Проблемы химиотерапии вирусных инфекций

1.1. Резистентность вирусов

1.2. Индукторы интерферона в терапии вирусных инфекций

1.3. Побочное действие противовирусных препаратов

2. Физиологически активные полимеры как лекарственные средства

2.2. Обоснование применения полимеров в фармакологии

2.3. Принципы создания полимерных препаратов

2.4. Свойства полимерных препаратовП

3. Генотерапия - новое направление в медицине

3.1. Механизмы действия олигонуклеотидов

3.2. Развитие генотерапевтических подходов от лаборатории к клинике

3.3. Доставка и защита нуклеиновых кислот: проблемы и пути их решения

3.3.1. Клеточные барьеры защиты от чужеродной ДНК

3.3.2. Химическая модификация плазмид и олигонуклеотидов

3.3.3. Недостатки использования модифицированных нуклеиновых кислот

3.4. Векторы для доставки ИНК в клетки

3.4.1. Свойства липосомных векторов

3.4.2. Свойства ретровирусных векторов

3.4.3. Свойства аденовирусных векторов

3.4.4. Достоинства и недостатки вирусных и липосомных векторов

3.5. Белковые трансфекционные векторы

4. Полимерные катионы как транфекционные векторы

4.1. Токсичность трансфекционных поликатионов

4.2. Образование комплексов ДНК-поликатион

4.3. Перемещение ИПЕК через клеточную и ядерную мембраны

4.4. Повышение эффективности трансфекции клеток ИПЕК

4.4.1. Свойства ИПЕК на основе катионных блок-сополимеров

4.4.2. Свойства ИПЕК на основе дендримеров полиамидоаминов

4.4.3. Рецептор-опосредованный транспорт ИПЕК

4.4.4. Перенос ДНК с помощью хитозановых наносфер

Материалы и методы

Клеточные культуры

Вирусы

Плазмиды и олигонуклеотиды

Поликатионы

Получение вируссодержащей жидкости

Получение интерполиэлектролитных комплексов и оценка эффективности связывания поликатионов с ДНК

Исследование физических свойств интерполиэлектролитных комплексов a. Низкоградиентная вискозиметрия b. Динамическое двойное лучепреломление c. Спектральные исследования

Электронная микроскопия

Определение токсичности поликатионов и их комплексов с ДНК

Трансфицирование клеточных культур интерполиэлектролитными комплексами

Оценка эффективности трансфекции

Определение вирусингибирующей активности исследуемых веществ

Исследование вирусингибирующего действия антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК

Результаты и обсуждение

1. Образование и физические свойства интерполиэлектролитных комплексов

1.1. Оценка эффективности связывания поликатионов с ДНК

1.2. Низкоградиентная вискозиметрия

1.3. Спектральные исследования

1.4. Динамическое двойное лучепреломление

1.5. Электронно-микроскопические исследования

2. Биологические свойства интерполиэлектролитных комплексов

2.1. Токсичность поликатионов и их комплексов с ДНК

2.2. Оценка эффективности трансфекции

3. Вирусингибирующая активность исследуемых веществ

3.1. Определение вирусингибирующей активности поликатионов

3.2. Определение вирулицидного действия веществ

3.3.Определение виростатического действия веществ

3.4. Определение влияния веществ на связывание вирусных частиц с клеточной мембраной

3.5. Вирусингибирующий эффект антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИГТЭК против ВПГ 1 в культуре инфицированных клеток Уего

3.6. Морфологическое изучение противовирусной активности антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИГТЭК против ВПГ

3.7. Ультраструктурное изучение противовирусной активности антисмысловых олигонуклеотидов в составе ИПЭК против ВПГ

3.8. Вирусингибирующий эффект антисмысловых олигонуклеотидов в составе

ИПЭК против цитомегаловируса человека в культуре клеток ФЛЭЧ

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств интерполиэлектролитных комплексов для ингибирования вирусной репродукции in vitro"

Отсутствие на фармацевтическом рынке достаточного выбора противовирусных химиопрепаратов обусловлено, прежде всего, особенностями жизненного цикла возбудителей: вирусы являются клеточными паразитами, подчиняющими себе репликативный и метаболический аппарат клетки-хозяина, и невозможно влиять на жизненный цикл вируса, не затрагивая клетку, поэтому для большинства веществ существует проблема общей и селективной токсичности. Кроме того, в результате мутаций появляются устойчивые к действию данного вещества вирусные субпопуляции, вакцинопрофилактика вирусных инфекций в ряде случаев затруднена появлением новых антигенных вариантов возбудителя, а значит, химиотерапия вирусных инфекций часто является единственным средством лечения. Поэтому поиск новых препаратов и подходов в терапии инфекционных вирусных заболеваний остается крайне актуальным.

Можно выделить две группы веществ, используемых в терапии вирусных инфекций: вещества, непосредственно ингибирующие вирусную репродукцию на разных стадиях и вещества - индукторы эндогенного интерферона, а также коммерческие препараты интерферона.

Известные индукторы интерферона - циклоферон, неовир, камедон, амиксин (тилорон) - обладают широкой противовирусной активностью, иммуномодулирующим и противоопухолевым действием. Вместе с тем, учитывая разнообразие их фармакологических свойств, изучены они недостаточно.

Поиск новых веществ, имеющих противовирусные свойства, ограничивается, в основном, производными пуринов и пиримидинов, и, как правило, это дериваты уже известных препаратов, например, ацикловира или зидовудина (de Clercq Е., 1997). В то же время, многие проблемы, связанные с применением противовирусных препаратов, можно решить включением их в полимерную матрицу (Платэ Н.А., 1986). Благодаря этому повышается их эффективность, снижается токсичность, преодолевается эффект вирусной резистентности, регулируется продолжительность действия и скорость выведения из клетки и организма.

Одним из направлений в разработке новых препаратов направленного противовирусного действия является использование специфических олигонуклеотидных последовательностей, которые взаимодействуют только с комплементарными нуклеотидными участками соответствующих нуклеиновых кислот. Поскольку используемые олигонуклеотидные последовательности комплементарны участкам кодирующих, т.е. смысловых (sense) цепей нуклеиновых кислот, их принято называть антисмысловыми (antisense) олигонуклеотидами. Антисмысловые олигонуклеотиды могут выступать в качестве ингибиторов вирусной репликации. Так, препарат фомивирсен, представляющий собой антисмысловой олигонуклеотид, эффективен при терапии ретинита, вызванного цитомегаловирусом, у больных СПИД (Wiegand Т. W., Young L. Н., 2006). Однако лишь малая часть чужеродной ДНК проникает через клеточную мембрану, и, попав в цитоплазму, очень быстро деградирует под действием клеточных ферментов. Полимерные катионы образуют с ДНК устойчивые комплексы, с высокой эффективностью транспортируют ее внутрь клетки, защищая от действия эндонуклеаз, и имеют ряд преимуществ: удобство в хранении и очистке, простота тестирования токсичности и безопасности и, что особенно важно для генной терапии, снижение риска патогенетических и иммунологических осложнений. Наиболее широко используются в генотерапевтических исследованиях поли(Ь-лизин), полиэтиленимин (Demeneix В.A., Ghorbel М., 2000) полидиметиламиноэтилметакрилат, полиамидоамины и дендри-меры на их основе, катионные липиды, хитозан - катионный полимер глюкозамина.

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилась характеристика биологических и физических свойств комплексов полиалли-ламина, полидиметиламиноэтилметакрилата и их производных с плазмид-ной ДНК и антисмысловыми олигонуклеотидами для ингибирования репродукции вируса герпеса 1-го типа и цитомегаловируса человека.

Задачи исследования.

1. Изучить эффективность связывания исследуемых полиаминов с ДНК.

2. Исследовать токсичность полиаллиламина, полидиметиламиноэтилме-такрилата и их производных в культуре клеток.

3. Изучить трансфекционную активность интерполиэлектролитных комплексов полиамин-ДНК in vitro.

4. Исследовать противовирусное действие полиаминов в культуре клеток

5. Изучить влияние интерполиэлектролитных комплексов полиаминов с антисмысловыми олигонуклеотидами на репродукцию вируса простого герпеса 1-го типа и цитомегаловируса в культуре клеток.

Научная новизна.

1. Впервые показано вирулицидное действие полиаллиламина, полидиме-тиламиноэтилметакрилата и их производных в отношении вируса простого герпеса и цитомегаловируса in vitro.

2. Впервые показано, что низкомолекулярные полиаллиламин и полиди-метиламиноэтилметакрилат в низких концентрациях эффективно переносят ДНК в эукариотические клетки in vitro, не проявляя токсичности.

3. Разработан высокоэффективный способ трансфекции эукариотических клеток.

4. Впервые показано, что антисмысловые олигонуклеотиды в составе интерполиэлектролитных комплексов с полиаллиламином, полидимети-ламиноэтилметакрилатом и их производными способны проникать в клетки и ингибировать вирусную репродукцию.

Научно-практическая значимость работы.

Полученные в рамках проведенных исследований данные о физико-химических и биологических свойствах интерполиэлектролитных комплексов синтетических поликатионов с ДНК имеют большое практическое значение для развития генотерапевтических методов. Разработан быстрый и эффективный способ трансфекции эукариотических клеток с помощью катионных полимеров. В результате проведенных исследований показана возможность использования интерполиэлектролитных комплексов антисмысловых олигонуклеотидов с синтетическими поликатионами для инги-бирования вирусной репродукции, что представляет большой интерес для поиска новых подходов в терапии вирусных инфекций.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и их производные образуют устойчивые комплексы с ДНК, обеспечивая ее трансмембранный перенос и защиту от клеточных гидролаз.

2. Антисмысловые олигонуклеотиды в комплексе с синтетическими поликатионами способны проникать в инфицированные клетки и ингибиро-вать вирусную репродукцию.

3. Интерполиэлектролитные комплексы полиаллиламина и полидимети-ламиноэтилметакрилата с ДНК способны с высокой эффективностью трансфицировать эукариотические клетки и могут быть использованы для разработки средств генной терапии.

Апробация работы.

Материалы по теме диссертации были представлены:

1. 3-й международный симпозиум "Molecular mobility and order in polymer systems", С.- Петербург, 1999 г.

2. II Всероссийский Каргинский симпозиум "Химия и физика полимеров в начале XXI века", Черноголовка, 2000.

3. Международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», Санкт-Петербург, 2003.

4. III Всероссийская Каргинская конференция "Полимеры - 2004"

5. 5th Int. Symp. «Molecular mobility and order in polymer systems», S.Petersburg, 2005.

6. IV Всероссийская конференция, посвященная 100-летию акад. В.А.Каргина «Наука о полимерах 21-му веку», Москва, 2007.

Обзор литературы.

Лечение вирусных заболеваний в большинстве случаев основано на симптоматической терапии, что обусловлено, прежде всего, отсутствием на рынке лекарственных средств достаточно широкого выбора специфических противовирусных химиопрепаратов. Можно выделить две группы веществ, используемых сегодня в терапии вирусных инфекций: вещества, непосредственно ингибирующие вирусную репродукцию на разных стадиях и вещества - индукторы эндогенного интерферона, а также коммерческие препараты интерферона. Между тем, известные и хорошо зарекомендовавшие себя противовирусные препараты запатентованы более 20-ти лет назад: ацикловир - 1977 г. (Elion G.B. et al, 1977; Schaeffer H.J. et al, 1978), рибавирин (виразол) - 1972 г. (Sidwell R.W. et al, 1972), амантадин и вида-рабин - 1964 г. (de Garilhe М. & de Rudder J., 1964; Schabel F.M, 1968). Индуктор интерферона поли(А-Ц) описан в 1970-е г.г. (de Clercq Е., 1982). Собственно же история противовирусной химиотерапии начинается с 1950 г., когда для противотуберкулезного препарата тиосемикарбазона была описана активность в отношении вируса осповакцины (Hamre D. et al, 1951).

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Слита, Александр Валентинович

Выводы

4. Полиаллиламин, полидиметиламиноэтилметакрилат и его производные образуют стабильные интерполиэлектролитные комплексы с плазмид-ной ДНК и олигонуклеотидами, экранируя ДНК от связывания с бромистым этидием и защищая от действия клеточных эндонуклеаз.

5. Полиаллиламины проявляют значительно более высокую токсичность in vitro по сравнению с полидиметиламиноэтилметакрилатом и его производными. Интерполиэлектролитные комплексы цитотоксичности не проявляют.

6. Полиаллиламин и полидиметиламиноэтилметакрилат обладают виру-сингибирующей активностью.

7. Наибольшей трансфекционной активностью обладают интерполиэлектролитные комплексы на основе гомополимеров - полиаллиламина и полидиметиламиноэтилметакрилата. Включение в состав молекулы поликатиона алкильных заместителей не улучшает его трансфекционных качеств

8. Исследованные поликатионы обеспечивают транспорт ДНК через клеточную мембрану и экспрессию трансгенов.

9. Антисмысловые олигонуклеотиды против ВПГ 1 и ЦМВ в составе ин-теполиэлектролитных комплексов с полиаллиамином и полидиметила-миноэтилметакрилатом эффективно ингибируют вирусную репродукцию в культуре инфицированных клеток, в то время как вирусингиби-рующее действие свободных антисмысловых олигонуклеотидов не наблюдалось.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слита, Александр Валентинович, Санкт-Петербург

1. Биченков Е. Е., Будкер В. Г., Зарытова В. Ф., Иванова Е. М., Лохов С. Г., Савченко Е. В., Теплова Н. М. Биол. мембраны. 1988. -Т. 5. - С. 735-741.

2. Изумрудов В.А. , А.Б. Зезин, В.А. Кабанов. Равновесие интерполиэлек-тролитных реакций и явление молекулярного "узнавания" в растворах ин-терполиэлектролитных комплексов // Успехи химии. 1991. - Т. 60. - С. 1570-95.

3. Кабанов В.А. . Полиэлектролитные комплексы в растворе и в конденсированной фазе // Успехи химии. 2005. - Т. 74. - С. 5-23.

4. Позмогова Г.Е., Д.Г. Кнорре. Белковые и пептидные конструкции для доставки в клетку олигонуклеотидов и ДНК // Вопросы медицинской химии. 1999,- Т.6.

5. Гринева Н.И.,Зарытова В.Ф.,Кнорре Д.Г. Алкилирующие производные компонент нуклеиновых кислот // Известия Сибирского отделения Академии наук СССР. Сер. химических наук. 1968. - Т.12. - С. 118124.

6. Кабанов В.А. Физико-химические основы и перспективы применения растворимых интерполиэлектролитных комплексов // Высокомолекулярные соединения. 1994. - Т. 36(2). - С. 183-197.

7. Фрисман Э. В., Цветков В. Н. // Журн. эксп. и теор. Физики, 1952, т. 23. С. 690 702.

8. Фрисман Э. В., Сибилева М. А., Красноперова А. В. // Высокомолекулярные соединения, 1962, т. 1, с. 597 -606.

9. Abdallah В., Goula D., Ghorbel М., et al. Nonviral gene transfer for studying signaling in comparative developmental biology // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1998.-V. 839.-P. 87-92.

10. Abdallah В., Hassan A., Benoist C., et al. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: polyethilenimine // Hum. Gene Ther. 1996. - V. 7 - P. 1947-1954.

11. Anderson WF. Human gene therapy // Nature. 1998 Apr. 30. -392(6679 Suppl)-P. 25-30.

12. Arigita C., Zuidam N.J., Crommelin D.J., Hennink W.E. Association and dissociation characteristics of polymer/DNA complexes used for gene delivery//Pharm. Res. 1999. - V. 16, 10-P. 1534-1541.

13. Baba M., Pauwels R., Balzarini J., Arnout J., Desmyter J., De Clercq E. Mechanism of inhibitory effect of dextran sulfate and heparin on replication of human immunodeficiency virus in vitro // Proc Natl Acad Sci U S A.-1988.- V. 85.(16)-P. 6132-6.

14. Baker JR Jr, Bielinska AU, Kukowska-Latallo JF. Dendrimer-mediated cell transfection in vitro // Methods Mol Biol. 2004. - V. 245. - P. 67-82.

15. Basu S, Wickstrom E. Synthesis and characterization of a peptide nucleic acid conjugated to a D-peptide analog of insulin-like growth factor 1 for increased cellular uptake // Bioconjug Chem. 1997. - V. 8(4). - P. 481-8.

16. Behr JP. Gene transfer with amino lipids and amino polymers // С R Seances Soc Biol Fil.- 1996. V. 190(1). - P. 33-8.

17. Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery.// Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - V. 10(5). - P. 440-447.

18. Briones J., Puig Т., Limon A., et al. Retroviral gene transfer into human hematopoietic cells: an in vitro kinetic study // Haematologica. -1999. V. 84(6).-P. 483-488.

19. Brunner S., Sauer Т., Carotta S., et al. Cell cycle dependence of gene transfer by lipoplex, polyplex and recombinant adenovirus // Gene Ther. -2000.-V. 7(5).-P. 401-407.

20. Bueler H. Adeno-associated viral vectors for gene transfer and gene therapy // Biol. Chem. -1999. V. 380(6). - P. 613-622.

21. Carrio M., Romagosa A., Mercade E., et al. Enhanced pancreatic tumor regression by a combination of adenovirus and retrovirus-mediated delivery of the herpes simplex virus thymidine kinase gene // Gene Ther. 1999. — V. 6(4).-P. 547-553.

22. Chen J, Stickles RJ, Daichendt KA. Galactosylated histone-mediated gene transfer and expression // Hum Gene Ther.- 1994. V. 5(4). - P. 429-35.

23. Cheng P.-W., Yin W. Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - V. 30.205 (1). -P. 826-33.

24. Cho MJ, Juliano R. Macromolecular versus small-molecule therapeutics: drug discovery, development and clinical considerations // Trends Biotech-nol. 1996. - V. 14(5). - P. 153-8.

25. Curiel DT, Wagner E, Cotten M, Birnstiel ML, Agarwal S, Li CM, Loechel S, Hu PC. High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes // Hum Gene Ther. 1992. - V. 3(2). - P. 14754.

26. De Clercq E. Acyclic nucleoside phosphonates in the chemotherapy of DNA virus and retrovirus infections // Intervirology. -1997. V. 40(5-6). -P. 295-303.

27. De Clercq E. In Search of a selective antiviral chemotherapy // Clin. Microbiol. Rev. 1997. - V. 10(4). - P. 674-693.

28. De Clercq, E. Synthetic interferon inducers // Top. Curr. Chem. 1974. -V. 52.-P. 173-208.

29. De Garilhe M. P., De Rudder J. Effect of 2 arabinose nucleosides on the multiplication of herpes virus and vaccine in cell culture // Bull Soc Chim Biol. 1969.-V. 51(10).-P. 1521-38.

30. Demeneix B, Behr JP. Polyethylenimine (PEI) // Adv Genet. 2005. -V.53. - P. 215-230.

31. Demeneix B.A., Ghorbel M., Goula D. Optimizing polyethylenimine-based gene transfer into mammalian brain for analysis of promoter regulation and protein function // Methods Mol. Biol. 2000. - V. 133. - P. 2135.

32. Demeneix В., Behr J., Boussif O. Gene transfer with lipospermines and polyethylenimines // Adv. Drug. Deliv. Rev. 1998. - V. 30(1-3). - P. 8595.

33. De Smedt S.C., Demeester J., Hennink W.E. Cationic polymer based gene delivery systems // Pharm. Res. 2000.- V.17(2). - P. 113-126.

34. Editorial GT News // Gene Therapy. 1998,- V. 5.- P. 861-862.

35. Elion G. В., Furman P. A., Fyfe J. A., de Miranda P., Beauchamp L., Schaeffer H. J.Selectivity of action of an antiherpetic agent, 9-(2-hydroxyethoxymethyl)guanine // Proc Natl Acad Sci USA. -1977.- V. 74(12).-P. 5716-5720.

36. Ernst N, Ulrichskotter S, Schmalix WA. Interaction of liposomal and polycationic transfection complexes with pulmonary surfactant // J. Gene Med.- 1999.-V. 1(5).-P. 331-340.

37. Findeis MA, Wu CH, Wu GY. Ligand-based carrier systems for delivery of DNA to hepatocytes // Methods Enzymol. 1994. - V. 247. - P. 341-51.

38. Fink DJ, DeLuca NA, Yamada M, Wolfe DP, Glorioso JC. Design and application of HSV vectors for neuroprotection // Gene Ther. -2000. V. 7(2).-P. 115-9.

39. Fisher KJ, Wilson JM. Biochemical and functional analysis of an adenovi-rus-based ligand complex for gene transfer // Biochem J. 1994. - V. 1.299. -P.49-58.

40. Fisher KJ, Wilson JM. The transmembrane domain of diphtheria toxin improves molecular conjugate gene transfer // Biochem J. -1997. V. 1.321. -P. 49-58.

41. Florence Morfin and Danielle Thouvenot. Herpes simplex virus resistance to antiviral drugs // Journal of Clinical Virology.- 2003. V. 26. - P. 29-37.

42. Fominaya J, Uherek C, Wels W. A chimeric fusion protein containing transforming growth factor-alpha mediates gene transfer via binding to the EGF receptor // Gene Ther. 1998. - V. 5(4). - P. 521-30.

43. Fominaya J, Wels W. Target cell-specific DNA transfer mediated by a chimeric multidomain protein. Novel non-viral gene delivery system // J Biol Chem. 1996. - V. 18. - P. 10560-8.

44. Fonseca M.J., Storm G., Hennink W.E. Cationic polymeric gene delivery of beta-glucuronidase for doxorubicin prodrug therapy // J. Gene Med. -1999.-V. 1(6).-P. 407-414.

45. Freeman S., Abboud C. N., Whartenby K. A. et al. The "bystander effect": tumor regression when a fraction of the tumor mass is genetically modified // Cancer Res. 1993. - V. 53. - P. 5274-5283.

46. Frisman E.V., Schagina L.V. Vorob'ev V.I. // Biorheology 1965.- V.2.-P.189 -194.

47. Frisman, E. V., Sibileva, M. A., Krasnoperova, A. V. Hydrodynamic and optical properties of polymers in high concentration solutions. Vysokomolec. Soed. -1959. V. 1. - P. 597-606.

48. Goula D., Becker N., Lemkine G.F. Rapid crossing of the pulmonary endothelial barrier by polyethylenimine/DNA complexes // Gene Ther. -2000. -V. 7(6).-P. 499-504.

49. Guo Z., Shen J., Mital D. Efficient gene transfer and expression in islets by an adenoviral vector that lacks all viral genes // Cell Transplant. 1999. -V. 8(6).-P. 661-671.

50. Haldar J, An D, de Cienfuegos L.A, Chen J, Klibanov A.M. Polymeric coatings that inactivate both influenza virus and pathogenic bacteria // PNAS -2006.-V. 103(47)-P. 17667-71.

51. Hamre D, Brownlee К A, Donovick R. Studies on the chemotherapy of vaccinia virus. II. The activity of some thiosemicarbazones // J Immunol. -1951.-V. 67(4).-P. 305-12.

52. Hatta T, Ishikawa M, Takai K, Nakada S, Yokota T, Hata T, Miura K, Takaku H. Inhibition of influenza virus RNA polymerase by 5-capped short RNA fragments // Biochem Biophys Res Commun. 1998. - V.I0. - P. 103-6.

53. Howard M.K., Kershaw Т., Gibb B. High efficiency gene transfer to the central nervous system of rodents and primates using herpes virus vectors lacking functional ICP27 and ICP34.5 // Gene Ther. 1998. - V. 5(8). - P. 1137-1147.

54. Huckett B, Ariatti M, Hawtrey AO. Evidence for targeted gene transfer by receptor-mediated endocytosis. Stable expression following insulin-directed entry of NEO into HepG2 cells // Biochem Pharmacol. -1990. V. 15. - P. 253-63.

55. Jones J. C., Turpin E. A., Bultmann H., Brandt C. R., and Schultz-Cherry S. Inhibition of Influenza Virus Infection by a Novel Antiviral Peptide That Targets Virai Attachment to Cells // J.Virology. 2006. - V. 80. - P. 119601196.

56. Iida J., Nishi N., Saiki I. Macrophage activation and host augmentation against Sendai or herpes simplex virus (HSV) infections with synthetic polypeptides in mice // Int. J. Immunopharmacol. -1989. V. 11(3). - P. 249-258.

57. Kay MA, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy // Proc Natl Acad Sci USA.- 1997. V. 25. - P. 12744-6.

58. Kinchington D. Recent advances in antiviral therapy // J Clin Pathol. -1999.-V. 52(2).-P. 89-94.

59. Kremer EJ, Perricaudet M. Adenovirus and adeno-associated vims mediated gene transfer // Br Med Bull. 1995. - V. 51(1). - P. 31-44.

60. Kukowska-Latallo J.F., Bielinska A.U. Efficient transfer of genetic material into mammalian cells using Starburst polyamidoamine dendrimers // Proc. Natl. Acad. Sci.U S A. 1996. - V. 93(10). - P. 4897-4902.

61. Langer J.C., Klotman M.E., Hanss В., et al. Adeno-associated virus gene transfer into renal cells: potential for in vivo gene delivery // Exp. Nephrol.1998.-V. 6(3).-P. 189-194.

62. Lee R.J, Huang L. Lipidic vector systems for gene transfer // Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 1997. - V. 14(2). - P. 173-206.

63. Lemkine G.F., Goula D., Becker N., et al. Optimisation of polyethylen-imine-based gene delivery to mouse brain.// J. Drug Target. 1999; 7(4): 305312.

64. Leong K.W., Mao H.Q., Truong-Le V.L., et al. DNA-polycation nano-spheres as non-viral gene delivery vehicles // J. Controlled Release. 1998. -V. 53(1-3).-P. 183-193.

65. Li Y., Starr S.E., Lisziewicz J., Ho W.Z. Inhibition of HIV-1 replication in chronically infected cell lines and peripheral blood mononuclear cells by retro virus-mediated antitat gene transfer // Gene Ther. -2000. V. 7(4). - P. 321-328.

66. Lieber A., Steinwaerder D.S., Carlson C.A., et al. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes // J. Virol.1999. V. 73(11). - P. 9314-9324.

67. Lin X. Construction of new retroviral producer cells from adenoviral and retroviral vectors // Gene Ther. -1998. V. 5(9). - P. 1251-1258.

68. Ma DD, Wei AQ. Enhanced delivery of synthetic oligonucleotides to human leukaemic cells by liposomes and immunoliposomes // Leuk Res. -1996.-V. 20(11-12).-P. 925-30.

69. Maes R.F., Vieira A., Gomes I., et al. Potentiation of FMD vaccines with polycationic-nucleic acid complexes // Arch. Virol. -1977. V. 55(4). - P. 275-285.

70. Mahato R.I. Non-viral peptide-based approaches to gene delivery 11 J. Drug Target. 1999. - V. 7(4). - P. 249-268.

71. Mahato R. I., Takakura Y., Hashida M. Development of targeted delivery systems for nucleic acid drugs // J. Drug Targeting. 1997. - V.4. - P. 337357.

72. McConnaughie A.W., Spychala J., Zhao M., et al. Design and synthesis of RNA-specific groove-binding cations: implications for antiviral drug design // J. Med. Chem. 1994. - V. 37(8). - P. 1063-1069.

73. Mecs I, Ganti T, Kotai A. Enhancement of interferon induction in mice by polycationic modified polypeptides // Acta Virol. -1976. V. 20(2). - P. 164-166.

74. Mesnil M., Piccoli C., Tiraby G. et al. Bystander killing of cancer cells by herpes simplex vims thymidine kinase gene is mediated by connexins // Proc. natl. Acad. Sci. 124. USA. 1996. - V. 93. - P. 1831—1835.

75. Miyazawa N., Leopold P.L., Hackett N.R., et al. Fiber swap between adenovirus subgroups В and С alters intracellular trafficking of adenovirus gene transfer vectors // J. Virol. -1999. V. 73(7). - P. 6056-6065.

76. Morris MC, Vidal P, Chaloin L, Heitz F, Divita G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 15. - P. 2730-6.

77. Nagahiro I., Mora B.N., Boasquevisque C.H., et al. Toxicity of cationic liposome-DNA complex in lung isograft // Transplantation. -2000. V. 69(9).-P. 1802-1805.

78. Nguyen H.K., Lemieux P., Vinogradov S.V., et al. Evaluation of poly-ether-polyethyleneimine graft copolymers as gene transfer agents // Gene Ther.- 2000. V. 7(2). - P. 126-138.

79. Nielsen РЕ, Egholm M. Strand displacement recognition of mixed ade-nine-cytosine sequences in double stranded DNA by thymine-guanine PNA (peptide nucleic acid) // Bioorg Med Chem. -2001. V. 9(9). - P. 2429-34.

80. Palmer D.H., Chen M.J., Kerr D.J. Taking Gene Therapy into the Clinic // J Biomed Biotechnol. 2003. - V. 1. - P. 71 -77.

81. Pichon C, Freulon I, Midoux P, Mayer R, Monsigny M, Roche AC. Cyto-solic and nuclear delivery of oligonucleotides mediated by an amphiphilic anionic peptide // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. -1997. V. 7(4). - P. 335-43.

82. Pollard H, Remy JS, Loussouarn G, Demolombe S, Behr JP, Escande D. Polyethylenimine but not cationic lipids promotes transgene delivery to the nucleus in mammalian cells // J Biol Chem. 1998. - V. 27. - P. 7507-11.

83. Ram Z, Walbridge S, Shawker T, Culver KW, Blaese RM, Oldfield EH. The effect of thymidine kinase transduction and ganciclovir therapy on tumor vasculature and growth of 9L gliomas in rats // J Neurosurg. -1994. V. 81(2). -P. 256-60.

84. Roizman B. The Human Herpesviruses, N.Y. 1993.

85. Rose JK, Buonocore L, Whitt MA. A new cationic liposome reagent mediating nearly quantitative transfection of animal cells // Biotechniques. -1991-V. 10(4).-P. 520-5.

86. Schabel FM Jr. The antiviral activity of 9-beta-D-arabinofiiranosyladenine (ARA-A) // Chemotherapy. 1968. - V. 13(6). - P. 321-38.

87. Schaeffer HJ, Beauchamp L, de Miranda P, Elion GB, Bauer DJ, Collins P. 9-(2-hydroxyethoxymethyl) guanine activity against viruses of the herpes group // Nature. -1978. V. 13. - P. 83-5.

88. Schaffer D.V., Fidelman N.A., Dan N., et al. Vector unpacking as a potential barrier for receptor-mediated polyplex gene delivery // Biotechnol. Bioeng. -2000. V. 67(5). - P. 598-606.

89. Siddhesh D. Patil, David G. Rhodes, Diane J. Burgess. DNA-based Therapeutics and DNA Delivery Systems: A Comprehensive Review // AAPS Journal. 2005 - V. 07(01). - P. 61-77.

90. Sidwell RW, Huffman JH, Khare GP, Allen LB, Witkowski JT, Robins RK.Broad-spectrum antiviral activity of Virazole: 1 -beta-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide // Science. 1972. - V. 25. - P. 705-6.

91. Stephenson ML, Zamecnik PC. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide // Proc Natl Acad Sci U S A. 1978. - V. 75(1). - P. 285-8.

92. Tamura M., Nagano Y. Modulation by polymyxin В of the effects of interferon on human myelogenous leukemia cells // Microbiol. Immunol. -1994.-V. 38(5).-P. 407-411.

93. Tomita N, Morishita R, Yamamoto K, Higaki J, Dzau VJ, Ogihara T, Kaneda Y. Targeted gene therapy for rat glomerulonephritis using HVJ-immunoliposomes // J Gene Med. 2002. - V. 4(5). - P. 527-35.

94. Touze A., Coursaget P. In vitro gene transfer using human papillomavi-rus-like particles // Nucleic Acids Res. -1998 V. 26(5). - P. 1317-1323.

95. Turunen M.P., Hiltunen M.O., Ruponen M., Virkamaki L., Szoka F.C. Jr., Urtti A.,Yla-Herttuala S. Efficient adventitial gene delivery to rabbit carotid artery with cationic polymer-plasmid complexes // Gene Therapy. 1999 -V. 6.-P. 6-11.

96. Vile R.G. Viral mediated cell fusion: viral fusion~the making, or breaking, of a tumour// Gene Ther.- 2006. -V. 13(15).-P. 1127-30.

97. Vinogradov S.V., Suzdaltseva Y.G., Kabanov A.V. Block polycationic oligonucleotide derivative: synthesis and inhibition of herpes vims reproduction // Bioconjug. Chem. 1996. - V. 7(1). - P. 3-6.

98. Wagner E, Zenke M, Cotten M, Beug H, Birnstiel ML. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells // Proc Natl Acad Sci USA. -1990. V. 87(9). - P. 3410-4.

99. Wagstaff M.J., Lilley C.E., Smith J., et al. Gene transfer using a disabled herpes vims vector containing the EMCV IRES allows multiple gene expression in vitro and in vivo // Gene Ther. -1998. V. 5(11). - P. 15661570.

100. Wu CH, Walton CM, Wu GY. Targeted gene transfer to liver using pro-tein-DNA complexes // Methods Mol Med. 2002. - V. 69. - P. 15-23.

101. Wu G. Y., Wu C.H. Receptor-mediated gene delivery and expression in vivo // J Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 14621-24.

102. Wu G.Y., Wu C.H. Evidence for targeted gene delivery to Hep G2 hepatoma cells in vitro // Biochemistry. -1988. V. 27. - P. 887-892.

103. Wu GY, Zhan P, Sze LL, Rosenberg AR, Wu CH. Incorporation of adenovirus into a ligand-based DNA carrier system results in retention of original receptor specificity and enhances targeted gene expression // J Biol Chem. -1994.-V. 15.-P. 11542-6.

104. Xiao W., Chirmule N., Berta S.C., et al. Gene therapy vectors based on adeno-associated virus type 1 // J. Virol. 1999. - V. 73(5). - P. 3994-4003.

105. Xu M., Chen Q.R., Kumar D., et al. In vivo gene therapy with a cationic polymer markedly enhances the antitumor activity of antiangiogenic genes // Mol. Gen. & Metabolism. 1998. - V. 64. - P. 193-197.

106. Xu R, Li H, Tse LY, Kung HF, Lu H, Lam KS. Diabetes gene therapy: potential and challenges // Curr Gene Ther. -2003. V. 3(1). - P. 65-82

107. Yeh P., Perricaudet M. Advances in adenoviral vectors: from genetic engineering to their biology // FASEB J. 1997 - V. 11(8). - P. 615-23.

108. Yin W, Cheng PW. Lectin conjugate-directed gene transfer to airway epithelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - V. 30. - P. 82633.

109. Yla-Herttuala S., Martin J.F. Cardiovascular gene therapy // Lancet. -2000.-V. 355. -P. 213-222.

110. Zallen D.T. US gene therapy in crisis. TIG, June 2000, V.16, N 6: 272275

111. Zamecnik PC, Stephenson ML. Inhibition of Rous sarcoma virus replication and cell transformation by a specific oligodeoxynucleotide // Proc Natl Acad Sci USA.- 1978. V. 75(1). - P. 280-4.

112. Zhou J, Wu J, Hafdi N, Behr JP, Erbacher P, Peng L. РАМАМ den-drimers for efficient siRNA delivery and potent gene silencing // Chem Commun (Camb). 2006. - V. 14. - P. 2362-4.