Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ИНСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВИРУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ им МЛ. Чумакова

на правах рукописи

ПРИПУЗОВА НАТАЛЬЯ СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ХИМЕРЫ ФЛАВИВИРУСОВ ЛАНГАТ И ДЕНГЕ 4 КАК КАНДИДАТА В ЖИВУЮ ВАКЦИНУ ПРОТИВ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА.

03.00.06. - вирусология

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в ГУ Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им МЛ. Чумакова РАМН

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Карганова Галина Григорьевна

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович, Доктор медицинских наук, профессор Воробьева Мая Сергеевна Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор»

Защита состоится

/щ

2005 г. в

/£'тс/^ми]

на заседании диссертационного

совета Д.001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им М.П. Чумакова РАМН.

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Медвекина OA.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В настоящее время для профилактики клещевого энцефалита (КЭ) существует несколько эффективных препаратов инактивированной концентрированной очищенной вакцины. Основными недостатками этих препаратов является необходимость ревакцинаций и возможность аллергических реакций. В связи с этим в течение многих лет ведется разработка живой вакцины. Благодаря прогрессу в молекулярной биологии появились новые стратегии получения вакцин, такие как химеризация разных флавивирусов, специфический мутагенез вирусных детерминант вирулентности и другие. При создании живой вакцины помимо получения аттенуированного иммуногенного вируса необходимо уточнение критериев его оценки, поскольку предложенные ранее требования к вакцинным штаммам могут не учитывать специфику генно-инженерных вирусов.

Американскими учеными (Pletnev et al., 1998) была сконструирована жизнеспособная химера TP21/DEN4, содержащая гены РгеМ и Е штамма ТР21 вируса Лангат (ВЛ), относящегося к комплексу КЭ, и остальную последовательность РНК вируса Денге 4 типа (рис. 1).

Цели и задачи исследования Целью данной работы было изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 ТР21/DEN4 и на модели этого вируса уточнение критериев оценки аттенуированных штаммов - кандидатов в живую вакцину против КЭ. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить степень аттенуации химерного вируса TP21/DEN4 на модели лабораторных мышей.

2. Оценить уровень вирулентности химеры TP21/DEN4 при периферическом и интрацеребральном (i/c) введении обезьянам.

3. Охарактеризовать степень иммуногенности химерного вируса, эффективность и длительность защиты против вирусов комплекса КЭ по сравнению с инактивированными вакцинами производства ФГУП "ПИПВЭ им М.П.Чумакова" и "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия) на модели лабораторных мышей и обезьян.

4. Изучить генетическую стабильность вирусной популяции и стабильность аттенуированных свойств посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO и через мозг мышей.

5. Оценить экологическую безопасность химерного вируса TP21/DEN4 в опытах на иксодовых клещах.

6. Использовать данные, полученные на модели химерного вируса TP21/DEN4, для уточнения критериев оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ.

Научная новизна. Химера TP21/DEN4 является уникальным генно-инженерным вирусом, поэтому все исследования по изучению свойств этого вируса проводились впервые или существенно дополняли данные об этом вирусе, полученные ранее.

1. Впервые проведено всестороннее изучение свойств и уровня аттенуации химерного вируса TP21/DEN4 в экспериментах на мышах разного возраста и обезьянах двух видов при i/c и периферическом введении.

2. Изучены иммуногенность химеры, уровень и длительность протективного иммунитета, индуцируемого химерой TP21/DEN4, в экспериментах на мышах и обезьянах для защиты от высоковирулентных штаммов вируса КЭ (ВКЭ), относящихся к разным субтипам, и вируса омской геморрагической лихорадки (ОГЛ).

3. Показана стабильность атгенуации посевного вируса ТР21 /DEN4 при пассажах в культуре клеток VERO и определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3NTR, связанные с адаптацией к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС мышей. Получена новая информация по функциональному картированию белка Е.

4. Впервые показана возможность передачи химерного вируса клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши, а также возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 в организме клеща Ixodes ricinus.

Практическое значение работы. Проведен первый этап изучения свойств химеры TP21/DEN4 и показана его перспективность, как кандидата в вакцинный штамм для защиты от ВКЭ с точки зрения уровня атгенуации и иммуногенности.

В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов -кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ.

Показано, что для химерных вирусов наиболее информативными являются эксперименты по изучению уровня атгенуации и протективности на обезьянах и подобран вид обезьян для этих исследований.

Для химерных вирусов показана необходимость проведения экспериментов по экологической безопасности.

Получены следующие новые данные по протективности инактивированной цельновирионной вакцины производства ФГУП "ПИПВЭ им М.П. Чумакова":

- преимущество внутримышечной (i/m) иммунизации по сравнению со стандартно применяемой подкожной (s/c),

- длительность протекгавного иммунитета на модели мышей более 1 года,

- эффективность иммунизации вакциной против вируса (ОГЛ) на модели мышей.

Положения, выносимые на защиту.

1. Химера TP21/DEN4 высоко аттенуирована для лабораторных мышей. Показано отсутствие персистенции TP21/DEN4 в организме мышей на отдаленные сроки после внутримогового, внутрибрюшинного и интрасшшального введения.

2. Показана аттенуация химеры TP21/DEN4 для приматов при внутримозговом введении зеленым мартышкам (Cercophithecus aethiops) и при периферическом введении зеленым мартышкам и яванским макакам (Macacafascicularis). Степень остаточной вирулентности химерного вируса для приматов выше, чем для мышей.

3. Изучена иммуногенность химерного вируса TP21/DEN4 на мышах, по сравнению с инактивированной вакциной при различных способах иммунизации. Показано, что двукратная внутрибрюшинная иммунизация мышей химерой TP21/DEN4 обеспечивает эффективную защиту против всех трех субтипов ВКЭ и вируса ОГЛ. Длительность протективного иммунитета, индуцируемого химерой, больше, чем при иммунизации инактивированной вакциной. Показана высокая иммуногенность и протективная активность химеры TP21/DEN4 при подкожной иммунизации обезьян Cercophithecus aethiops.

4. Показана стабильность аттенуированных свойств посевного вируса ТР21 /DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO. Определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3NTR генома химеры TP21/DEN4, связанные с адаптацией вируса к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС мыши, которые могут быть использованы для контроля генетической стабильности вирусной популяции.

5. Впервые показана возможность передачи TP21/DEN4 клещу bodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши и возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 из организма клещей Ixodes ricinus.

6. На модели аттенуированного химерного вируса ТР21 /DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы для защиты от КЭ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 4-х заседании

Межлабораторого ученого совета ИПВЭ им М.П. Чумакова РАМН (апрель 2001г., апрель

2002г., апрель 2003г., 20 января 2005г.), 14th European Congress of Clinical Microbiology

and Infectious Deseases (Prague, Czech Republic, 1-4 of May, 2004), FEBS International

Summer School on "Molecular Mechanisms in Homeostasis and Disease" (Spetses, Greece, 28 of August-10 of September, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в научных журналах, 2 - в сборниках материалов конференций и 6 тезисных сообщений.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы». Работа изложена на 172 страницах и включает 17 рисунков, 31 таблицу и список литературы, содержащий 211 ссылок. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы. В работе использовали химерный вирус TP21/DEN4, полученный из лаборатории Инфекционных болезней Национального института аллергологии и инфекционных болезней США (NIAID, NIH) (Pletnev et al., 1998, 2000) (рис.1). В работе использовали штаммы Абсеттаров и Васильченко ВКЭ и штамм Никитина вируса ОГЛ из коллекции ИПВЭ им М.П. Чумакова, штамм ТР21 вируса Лангат, предоставленный Доктором Плетневым (Rockefeller Foundation Collection, USA). Для получения и титрования вирусов использовали культуру клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) и сертифицированную перевиваемую культуру клеток почек зеленых мартышек VERO (WHO Seed; Novavax, Inc. Rockville, Md). В опытах также использовали инактивированные вакцины ФГУП "ПИПВЭ им М.П.Чумакова" или "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия). Исследования проводили на зеленых мартышках (Cercophithecus aethiops) и яванских макаках (Масаса fascicularis), полученных из питомника African Animals Ltd., Tanzania, мышах линии BALB/c, полученных из питомника "Столбовая" (Россия, Москва), клещах Ixodes ricinus и Ixodes persulcatus, собранных весной 2002-2003 годов в Московской области ст.н.с. ГУ ИПВЭ им М.П. Чумакова Буренковой Л.А. Использовали стандартные вирусологические и иммунологические методы: титрование вируса методом бляшек в культуре клеток и на мышах, титрование противовирусных антител в сыворотках крови в реакции нейтрализации и с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Гистологические исследования выполнены совместно с к.м.н. Терешкиной Н.В. (ГИСК им Л.АЛарасевича). Кроме того, применяли биохимические и молекулярно-биологические методы: иммунопреципитацию вирусспецифических белков, выделение вирусной РНК, обратную транскрипцию (ОТ) и полимеразную цепную реакцию (ПЦР), определение нуклеотидной последовательности (секвенирование), анализ нуклеотидных последовательностей с использованием программ Vector NB Suite 5.5 и GeneRunner.

Результаты и обсуждения.

Основным показателем аттенуации вируса для мышей является величина дозы вводимого вируса, необходимая для гибели 50% животных (LD50). Поэтому мы сравнили LD50 химеры TP21/DEN4, высоковирулентного штамма Абсеттаров ВКЭ и родительского штамма ТР21 вируса Лангат при различных способах введения лабораторным мышам линии BALB/c разного возраста (Таблица 1).

Таблица 1. LD50, выраженная в БОЕ, для мышей линии BALB/c разного возраста химерного вируса TP21/DEN4, ВКЭ и ВЛ при различных способах введения.

Вирус, штамм Модель в способ введения вируса

4-5-дневные сосунки Ус Мыши весом 10-12 г

1/р 1/вр 1/с

ТР21/ОЕК4 6310 БОЕ >200000 БОЕ 250000 БОЕ >200000 БОЕ

ВКЭ, Абсеттаров 0,06 БОЕ 1 БОЕ н/о 0,1 БОЕ

Лангат, ТРИ н/о н/о 3 БОЕ 5 БОЕ

Условные обозначения: н/о - не определяли, (/р - интраперитонеально, (/-р - интраспинально, (/с - интрацеребрально.

На модели мышей химера оказалась значительно аттенуирована по сравнению с родительским вирусом Лангат и ВКЭ.

При ¡/р введении химеры ТР21^Е№ в дозе 6,3 ^ БОЕ взрослым мышам весом 1012 г вирус не проникал в ЦНС (Табл. 2) и не вызывал клинических проявлений и гибели животных. Кроме того, на 5-7 дни с помощью ОТ-ПЦР было показано отсутствие в мозге вирусной РЖ. В то же время, у мышей, зараженных 1/р 3 БОЕ штамма Абсеттаров,

вирус в мозге регистрировался с 5-го дня после введения. У части животных, зараженных ¡/р химерой (в 1 из 2-х проб, полученных в один день от 5 животных), на 3 и 7-8 сутки в клеточной фракции крови регистрировался вирус в титрах 2,34,5 ^ БОЕ/мл. Первый пик виремии у мышей, зараженных химерой, совпадал с размножением вируса в региональных лимфатических узлах. В других внутренних органах мышей на 2-9 сутки после ¡/р заражения вирус не выявляли. Таким образом, было показано отсутствие вирусной инфекции в ЦНС мышей при периферическом введении химеры в высокой дозе, низкая и нерегулярная виремия и отсутствие репродукции вируса в висцеральных органах.

Поскольку ¡/с введение 5,3 ^ БОЕ химеры не вызывало клинических проявлений у взрослых мышей было важно оценить способность химерного вируса размножаться в ЦНС. Был изучен уровень репродукции ТР21/БЕ№ по сравнению со штаммом Абсеттаров ВКЭ и штаммом ТР21 вируса Лангат в ЦНС после ¡/с инокуляции мышам (Табл. 2). Было показано, что химера, хоть и с низкой скоростью, но все же способна размножаться в ЦНС мышей, поскольку регистрировалась в головном мозге на 5-7 сутки после ¡/с введения. На 14 и 21 сутки вирус из мозга элиминировался.

Таблица 2. Титры инфекционного вируса после введения химеры TP21/DEN4, штамма Абсеттаров ВКЭ и штамма ТР21 ВЛ в головном мозге после ¡/с, i/sp и ¡/р введения мышам линии БЛЪБ/с весом 12-14 г.

Вирус Вводимая доза (lg БОЕ) Способ введения Титр вируса в головном мозге БОЕ/мл)

Дни после заражения

2 5 7 14 21

TP21/DEN4* 5,3 Ус 0 за 6,4 0 0

4,5 I/sp 0 0 5,3 0 0

6,3 1/р 0 0 0 0 0

ШтАбсеггаров ВКЭ** 1,7 Ус 5,4 9,3 9,9 г г

0,9 Vsp 3,3 7,0 Г г г

3 1/р 0 4,8 7,8 г г

Шт. ТР21 Лангат** 4,7 Ус - 8,8 - г г

3,9 1/sp 3,6 7,1 Г г г

Примечания: 0 - < 1 БОЕ/О,3 мл;"-" - не исследовали, Г - гибель животных; * - вирус титровали на культуре клеток VERO; ** - вирус титровали на культуре клеток СПЭВ

Для определения скорости распространения химеры ТР21/БЕ№ по ЦНС нами были проведены эксперименты по выявлению вируса в головном мозге после

интраспинального (i/sp) заражения мышей BALB/c (Табл. 2). Химера не регистрировалась в мозге в первые 5 суток после введения и на 7-е сутки была обнаружена в дозе 5,3 Ig БОЕ/мл в головном мозге больных мышей, что указывает на способность этого вируса распространятся по ЦНС, но значительно медленнее, чем вирусов Лангат и КЭ. После введения химеры у животных без клинических проявлений вирус в головном мозге не выявлялся. При введении 5,3 lg БОЕ химеры 50% заболевших животных выздоравливали. На 14 сутки у выздоровевших мышей вирус уже не регистрировался, а при анализе с помощью ОТ-ПЦР было показано отсутствие в головном мозге вирусной РНК на этот срок.

Таким образом, в экспериментах на мышах при разных способах введения химера оказалась высоко аттенуированным вирусом.

Была проведена оценка возможности персистенции химеры в отдаленные сроки у нескольких групп мышей, зараженных разными способами. Попытка активации персистентной инфекции у мышей линии BALB/c на отдаленные сроки после заражения TP21/DEN4 была проведена с помощью i/p введения циклофосфана (ЦФ) двукратно: в дозе 0,05 мг/г -1 введение и в дозе 0,1 мг/г - 2 введение.

Через 14 дней после 2-го введения ЦФ у животных всех групп для проведения вирусологического исследования и анализа на наличие вирусной РНК с помощью ОТ-ПЦР были взяты внутренние органы и головной мозг. Было показано отсутствие персистенции химеры в организме мышей на срок от 1 до 2,5 месяцев после i/c, i/sp и i/p введения. Налюдение за мышами, получившими ЦФ велось в течение 21 дня. Никаких клинических проявлений не наблюдали.

При изучении аттенуированных штаммов ВКЭ и ВЛ многими авторами было показано, что существует корреляция между вирулентностью вируса для мышей при периферическом введении и обезьян при внутримозговом (Price et al., 1961;Thind et al., 1966; Nathanson et al., 1966; Дубов и др., 1969; Майер и др., 1975). Нами была проведена оценка остаточной нейровирулентности химеры TP21/DEN4 в экспериментах на 4 зеленых мартышках (Cercopithecus aethiops) при i/c введении 6,3 lg БОЕ. В качестве положительного контроля был выбран штамм Абсеттаров ВКЭ в дозе 5,2 lg БОЕ. У обоих животных, инфицированных ВКЭ, наблюдали типичную для этого заболевания неврологическую симптоматику (Дремов, 1977, Камалов, 1991). Животные были умерщвлены в состоянии агонии. Из 4 обезьян, инфицированных химерным вирусом, признаки заболевания были отмечены только у одного животного. Наблюдали судороги всего тела после эмоциональной или физической нагрузки, тремор конечностей, нарушение походки, слабость.

Таблица 3. Оценка морфологических изменений в различных ядерных структурах

ЦНС у обезьян, зараженных интрацеребрально химерой TP21/DEN4 и ВКЭ.

Вводимый вирус 5,2 lg БОЕ nrr. Абсетгаров ВКЭ 6,3 lg БОЕ Tp21/DEN4

№ обезьяны 15 7 2 6 10 14

Ядра 1

N.caudatus 1.5 1.5 1 1.5 0 0

N.pallidum 2 3 0.5 0.5 0 0

Putamen 1 2.5 0.5 1.5 0 0

N. med.thalami 2 1.5 0.5 1 0 0

N. lat. Thalami 1.5 1 1.5 1 0.5 0

Religion inoculation 1.5 1.5 1 1 0.5 0.5

Midbrain

N. oculomotorius 1 3 0 1.5 0.5 0

N. ruber 1 2 1 0.5 0 0

Subst. Nigra 1.5 2.5 1 1.5 0 0

Cerebellum

Cortex 2 2.5 1.5 1.5 0.5 0

N.dentatus \S 3 1.5 0.5 0 0

Other nuclei 2 3 1.5 0.5 0 0

Medulla

N.hypoglossi 2 0 0 0.5 0 0

N.vestibulari 2 2 0 1.5 0 0

N.trigemeni 2 1 0 0 0.5 0

N.ambigius 1 0 0 0 0 0

Reticular. Form 1.5 1 0 0.5 0.5 0

Oliva inf. 0.5 0.5 0 0 0 0

Spinal cord

Cervical 1.1 2.8 0.9 0.1 0.08 0

Lumbar 0.6 3 0.7 0 0 0

6-1.:.C/.-j.' kjlm -s i-.v1 JU-VStj-USL. ILihiVU, .^-,'Vv. А'УЛ.

Степень гистологических изменений оценивали по шкале, близкой к шкале Натансона (Nathanson et э1., 1966) (Табл. 3). У двух из 4 зараженных химерой обезьян поражения в ЦНС были незначительными. В тоже время у двух животных в ЦНС были отмечены более значительные морфологические изменения, однако, степень выраженности последних, в том числе и поражения нейронов, была значительно слабее (средние суммарные баллы - 0,9 и 0,5), чем у обезьян, зараженных ВКЭ (средние суммарные баллы -1,2 и 2,4). У обезьяны №6, зараженной химерой, с клиническими проявлениями (убита на 14 сутки) патологический процесс ограничивался головным

мозгом (очаговый энцефалит) и преимущественно был связан с местом инокуляции (Табл. 3). У второй обезьяны имел место менингоэнцефаломиелит с преобладанием очаговых воспалительных изменений, выраженными изменениями в коре мозжечка и распространением процесса на спинной мозг (Таблица 3).

Поскольку химера ТР21^Е№ - это новый вирус, для него было важно определить таргетные зоны в ЦНС. В нашем эксперименте было показано, что после заражения химерой поражаются в основном те же ядра, что и при введении вирулентного шт. Абсеттаров ВКЭ (Табл. 3). Таргетными зонами для химерного вируса, по-видимому, являются подкорковые ядра, черная субстанция и кора мозжечка, то есть они совпадают с таковыми для ВЛ и ВКЭ, но степень выраженности морфологических изменений значительно ниже, чем при инфекции ВКЭ.

Таблица 4. Титры вируса в ЦНС и висцеральных органах обезьян после внутримозгового введения штамма Абсеттаров вируса КЭ и химеры TP21/DEN4.

Титры вируса (lg БОЕ/мл)

Вводимый вирус 6,3 lg БОЕ химера TP21/DEN4* 5,2 lg БОЕ шт. Абсеттаров**

№ обезьяны 2 6 10 14 7 15

День эвтаназии 30 14 14 31 15 8

Головной Лобные доли 0 0 0 0 3,2 3,8

мозг Мозжечок 1 и 0 0 5,1 5,7

Спинной грудной отд. 0 0 0 0 5,3 н/и

мозг каудальный 0 0 0 0 53 6,2

Внутрен- Печень 0 0 0 0 2,5 0

ние Селезенка 0 0 0 н/и 2,5 0

органы Почки 0 0 0 0 0 2,1

Лимфоузлы 0 0 0 0 2,7 0

Н/и - не исследовали; 0 - < 1 БОЕ/О,1мл; *-титры вируса определяли с помощью титрования по бляшкам в культуре клеток СПЭВ; ** - то же в культуре клеток Vero.

У животных, зараженных ¡/о штаммом Абсеттаров, инфекционный вирус был выявлен во всех отделах ЦНС и во внутренних органах (Табл. 4). У обезьян, зараженных химерой, вирус был обнаружен только в мозжечке на 14 и 30 дни. Полученные нами результаты показывают, что при ¡/о введении химерный вирус может размножаться в клетках ЦНС обезьян, вызывать их разрушение и распространяться по ЦНС, хотя и в меньшей степени, чем ВКЭ.

Мы провели сравнительный анализ наших результатов с представленными в литературе данными о степени нейровирулентности штамма Абсеттаров ВКЭ, ранее полученного аттенуированного штамма Еланцев ВЛ и вируса Денге 4 (табл. 5). Сравнение полученных нами и другими авторами данных для штамма Абсеттаров ВКЭ показывают, что наша модель является адекватной для оценки нейровирулентности ВКЭ при интрацеребральном введении. При анализе данных, представленных в таблице 5, можно сделать вывод о меньшей степени вирулентности исследуемого нами химерного вируса, по сравнению со штаммом Еланцев вируса Лангат и родительским штаммом ТР21. По степени морфологических изменений в ЦНС химерный вирус ТР21/ЭЕ№ в среднем по 4 обезьянам занимает промежуточное положение между родительскими вирусом Денге 4 и штаммом ТР21 вируса Лангат.

При сравнении степени вирулентности химерного вируса и штамма Еланцев, который был использован в расширенных эпидемиологических испытаниях и вызвал поствакцинальные осложнения у реципиентов вакцины с частотой 1:18500, очевидно, что химера ТР21/ЭЕ№ менее вирулентна для низших приматов, следовательно, можно ожидать и меньшую ее степень вирулентности, чем у штамма Еланцев, для людей.

Несмотря на наличие вируса в мозжечке у двух обезьян, ни у одного животного нам не удалось выявить химерный вирус в сыворотках крови, в висцеральных органах и лимфоузлах. Это может говорить, как о неспособности химерного вируса проникать через гематоэнцефалический барьер, так и о низком висцеротропизме или быстрой элиминации вируса из кровотока с помощью антител. В любом случае это также очень важный показатель аттенуации вируса.

Нами также исследовалась периферическая вирулентность ТР21/ЭЕ№ для обезьян по сравнению с высоко вирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ на модели зеленых мартышек, оцениваемая по уровню вирусемии и уровню размножения вируса в органах иммунной системы и внутренних органах.

Таблица 5. Сравнение нейровирулентности штамма Абсеттаров ВКЭ, штаммов ВЛ, вируса Денге 4 и химеры ТР21 /ЭЕ№ при ¡/е введении обезьянам различных видов на основе экспериментальных и литературных данных.

Две зеленые мартышки (Cercophithecus aethiops) были подкожно (в/о) инфицированы 4,7 ^ БОЕ шт. Абсеттаров ВКЭ и 4 обезьяны 6,7 ^ БОЕ того же вируса. 6 зеленых мартышек были заражены в/о 6,8 ^ БОЕ и 3-7,1 ^ БОЕ химерного вируса, У животных ежедневно в течение 8 дней определяли наличие вируса в сыворотке крови. Только при инокуляции высокой дозы штамма Абсеттаров вирус в сыворотке крови

удалось выявить у 3 из 4 (75%) зеленых мартышек в низких титрах. При введении химерного вируса у двух из 9 обезьян (22%) был выявлен вирус в сыворотке крови. При введении 6,8 ^ БОЕ химеры виремия у обезьян была ниже, чем при введении 6,7 ^ БОЕ ВКЭ (рис. 2).

Рисунок 2. Уровень виремии у обезьян двух разных видов после s/c введения шт. Абсеттаров ВКЭ и химеры TP21/DEN4.

Другая серия экспериментов была проведена нами на яванских макаках (Масаса fascicularis). 6 обезьян было заражено 5,4 - 6,4 lg БОЕ штамма Абсеттаров ВКЭ. Одной обезьяне Macacafascicularis был введен s/c химерный вирус TP21/DEN4 в дозе 5,5 lg БОЕ. Вне зависимости от дозы штамма Абсеттаров ВКЭ виремия у яванских макак была намного выше, чем у зеленых мартышек (рис. 2). У всех яванских макак виремия регистрировалась в сыворотках крови в течение первых 4 дней в титрах 1-4,9 lg БОЕ/мл. У макаки, зараженной химерой, была зарегистрирована лишь однодневная виремия на 3 день в титре - 3,8-3,9 lg БОЕ/мл в сыворотке и в сгустке. Вирус КЭ выявлялся в периферических органах яванских макак, в органах иммунной системы и во всех отделах ЦНС только на ранние сроки после заражения - 8-10 дни (табл. 6).

Химера регистрировалась в подчелюстных лимфатических узлах, в селезенке, печени и почках яванской макаки на 21 день после заражения, что, по-видимому, говорит о более медленной скорости репродукции и элиминации этого вируса из внутренних органов, чем ВКЭ (таблица 5). У обезьяны, зараженной s/c химерой, на 21 день инфекционного вируса в ЦНС выявлено не было. С помощью ОТ-ПЦР было показано отсутствие в ЦНС вирусной РНК. Таким образом, в экспериментах на обезьянах химера TP21/DEN4 оказалась достаточно аттенуирована, однако более вирулентна, чем это можно было ожидать по результатам экспериментов на мышах. Нужны дополнительные

эксперименты для доказательства полной элиминации химеры из внутренних органов Масаса fascicularis после s/c введения. Полученные данные показывают, что низшие приматы являются более адекватной моделью для оценки периферической вирулентности химерных вирусов. Кроме того, показано, что опыты на яванских макаках позволяют более адекватно оценить уровень виремии, чем опыты на зеленых мартышках.

Таблица 6. Содержание ВКЭ и химеры TP21/DEN4 в висцеральных органах обезьян Масаса fascicularis на различные сроки после s/c введения.

Вирус и вводимая доза в lg БОЕ День после заражения Титр вируса Ig БОЕ/мл

Лимфатические узлы тимус селезенка ¡а Р и С почки

подмышсч ные паховые подчелюст ные

Абсеттаров ВКЭ 5,4 8 3,2 4,6 0 н/о 5,1 0 23

Абсеттаров ВКЭ 5,4 10 0 0 2,6 н/о 3,6 0 0

Абсеттаров ВКЭ 6,4 10 0 0 0 н/о 3,2 0 0

Абсеттаров ВКЭ 6,0 27 0 0 н/о 0 0 0 0

Абсеттаров ВКЭ 6,0 22 0 0 0 0 0 0 0

Абсеттаров ВКЭ 6,0 28 0 0 н/о 0 0 0 0

Основным показателем эффективности вакцинного препарата считается уровень индуцируемого протективного иммунитета в экспериментах на мышах. Мы оценивали степень защитного эффекта и иммуногенности химеры на модели лабораторных мышей по сравнению с инактивированной вакциной производства ФГУП "ПИПВЭ им МЛ. Чумакова" при в/с, ¡/т и 1/р способах введения (рис. 3). Для иммунизации мышей использовали разведенный в 20 раз препарат однодозовой человеческой вакцины или химеру в дозе 6,3 ^ БОЕ.

При двукратной в/с, ¡/т и ¡/р иммунизации инактивированной вакциной производства ФГУП "ПИПВЭ" с интервалом в 1 месяц или с интервалом в 1 неделю защита против 100 ЬЭ50 высоковирулентного штамма Абсеттаров была 100%. При любом способе иммунизации после введения ВКЭ регистрировался быстрый синтез противовирусных антител к ВКЭ на 1-2 день (320-640 - по результатам ИФА) (рис. 3).

Рисунок 3. Протективный иммунитет против 100 ЬЭ50 шт. Абсеттаров ВКЭ и бустер антител в сыворотках мышей после разрешения при в/о, ¡/т и ¡/р иммунизации химерой ТР21/ОЕ№ и инактивированной вакциной ФГУП "ПИПВЭ" по результатам ИФА (в качестве антигена использовали сконценрированную КЖ клеток СПЭВ, инфицированных шт. Абсеттаров ВКЭ).

При двукратной ¡/р иммунизации живым химерным вирусом, так же как и вакциной ФГУП "ПИПВЭ", защита от 100 ЬЭ50 штамма Абсеттаров ВКЭ была 100%. Титр антител до разрешения в сыворотках мышей, иммунизированных химерой, был значительно выше, чем у животных, иммунизированных инактивированной вакциной (640-2560).

Однако при двукратной в/о или 1/т иммунизации химерой защита была лишь 50% или 60% соответственно, титры антител в сыворотках мышей по данным ИФА до разрешения (80-160), были чуть выше, чем у мышей, иммунизированных вакциной ФГУП «ПИПВЭ» (<20-40), но бустера после разрешения не регистрировалось. При трехкратной

s/c и i/m иммунизации химерой титры антител перед разрешением были чуть выше - 80320 и 640 соответственно, однако бустера также не регистрировалось, а защита была 75 % и 88% соответственно (рис. 3).

При использовании сочетанной i/p иммунизации вакциной ФГУП «ПИПВЭ» и химерой защита была 100%, а при сочетанной s/c иммунизации, несмотря на отсутствие бустера после разрешения, защита была 67%, то есть уровень защиты был все же выше, чем при двукратной s/c иммунизации химерой (50%) (рис. 3).

Основным преимуществом живой вакцины по сравнению с инактивированной является длительность иммунитета. Мы сравнили длительность иммунного ответа против ВКЭ, индуцируемого при двукратной i/p иммунизацией химерой, с длительностью иммунного ответа после иммунизации инактивированными вакцинами "FSM-IMMUN inject" (Австрия) и ФГУП «ПИПВЭ» (Москва, Россия). Инактивированная вакцина "FSM-IMMUN inject" (Австрия) уже через 5 месяцев обеспечивала лишь 40% уровень защиты против разрешения 100 LD50 штамма Абсеттаров ВКЭ. Вакцина ФГУП «ПИПВЭ» обеспечила 100% уровень защиты через 8,5 месяцев, несмотря на низкий уровень антител в сыворотках и отсутствие бустера после разрешения. Через 12 месяцев уровень защиты после иммунизации вакциной ФГУП «ПИПВЭ» составил 80%.

У мышей, иммунизированных химерой, высокий бустер на 2 день после разрешения (с 640 до 1280) регистрировался до 5 месяцев после 2-й иммунизации. Но даже при отсутствии бустера через 8,5 и 12 месяцев, защита после i/p двукратной иммунизации химерой была 100%, следовательно, она обеспечивалась, по-видимому, факторами клеточного иммунного ответа.

Ранее была проведена оценка эффективности иммунизации мышей химерой TP21/DEN4 против штамма Софьин ВКЭ, относящегося к дальневосточному субтипу ВКЭ (Pletnev et al., 2000). В наших исследованиях была показана эффективность иммунизации химерой против штамма Абсеттаров, западно-европейского субтипа ВКЭ. Мы также провели оценку эффективности иммунизации мышей химерой против штамма Васильченко ВКЭ, относящегося к сибирскому субтипу, и вируса ОГЛ, относящегося к серокомплексу КЭ. Степень защиты против штамма Васильченко в наших экспериментах после i/p двукратной иммунизации химерой составила 90-100%. Защита от разрешения вирусом ОГЛ после двухкратной иммунизации составила 70-90%, трехкратная i/p иммунизация защищала 90% мышей при разрешении через месяц после последней иммунизации.

Нами также была изучена эффективность инактивированной вакцины против вируса ОГЛ. Инактивированная вакцина производста ИПВЭ показала хороший уровень

защиты против вируса ОГЛ при i/p (100%) и i/m (70%) иммунизации. Подкожная иммунизация оказалась недостаточно эффективной для зашиты от вируса ОГЛ (43%).

Далее мы провели опыты по s/c иммунизации 9 зеленых мартышек химерой. TP21/DEN4 в дозе 7 lg БОЕ. Иммуногенные свойства химеры были оценены по уровню антител против ВКЭ в сыворотках обезьян в реакции нейтрализации и ИФА. Химерный вирус индуцировал продукцию нейтрализующих антител против ВКЭ у 6 из 9 (67%) обезьян после однократного введения. Уровень антител достигал максимума на 2-3 неделю после иммунизации (1/64), а затем быстро снижался. Три обезьяны с более низким уровнем антител были иммунизированы повторно той же дозой химерного вируса. Вторая иммунизиция индуцировала иммунный ответ с быстрым повышением титра нейтрализующих антител против ВКЭ.

Для сравнения две обезьяны были s/c иммунизированы дважды человеческой дозой инактивированной вакцины против ВКЭ "FSM-MMUN inject" в качестве положительного контроля. Обе обезьяны продемонстрировали более высокий уровень антител против ВКЭ в сыворотке крови по сравнению с обезьянами, иммунизированными химерным вирусом.

Все обезьяны были s/c разрешены дозой 6,7 lg БОЕ высоковирулентного штамма Абсеттаров ВКЭ. Чтобы оценить степень бустерного эффекта, мы проанализировали динамику изменения титра антител сразу после введения ВКЭ (таблица 7). Повышение уровня антител наблюдали уже на 1-й день после разрешения у всех обезьян, иммунизированных химерным вирусом и инактивированной вакциной. Наши результаты показали, что даже однократная иммунизация обезьян химерой выразилась в компетентном иммунном ответе с формированием клеток памяти.

У неиммунизированных животных инфекционный вирус был обнаружен в селезенке, печени, почках, подмышечных и подчелюстных лимфоузлах через 3 недели после заражения (таблица 8). В то же время, инфекционный вирус не был найден в висцеральных органах ни у одной из обезьян, иммунизированных химерным вирусом или инактивированной вакциной. Таким образом, иммунизация обезьян химерой и инактивированной вакциной защитила животных от репродукции ВКЭ в висцеральных органах.

Таким образом, однократная и двукратная подкожная иммунизация химерой TP21/DEN4 обезьян Cercop hithecus aethiops индуцирует высокий уровень синтеза антител, обеспечивает формирование иммунологической памяти и предотвращает размножение ВКЭ в висцеральных органах после разрешения.

Таблица 7. Титры противовирусных антител на ранние сроки после разрешения 6,7 ^ БОЕ шт. Абсеттаров ВКЭ в сыворотках обезьян, иммунизированных химерой, инактивированной вакциной и без иммунизации (по результатам ИФА).

Иммунизация

Без иммунизации

г. a t

í- ^ S* ¡.i -"V 'л.. » '

Ш, j... V.:i j 'Т . ЯЖ» .-Í- • "

Инакгивированная

Дни после разрешения ВКЭ

» ' п - íJ'

* * Л • " *

вакцина двукратно

Примечания:"-" - не исследовали, в качестве антигена использовали сконценрированную

КЖ клеток СПЭВ, инфицированных шт. Абсеттаров ВКЭ

Таблица 8. Титры вируса (^ БОЕ/мл) в органах иммунной системы иммунизированных и не иммунизированных зеленых мартышек после «/с введения 6,7 ^ БОЕ ВКЭ.

Иммунизация День после Лимфатические узлы | Селезенка

введения ВКЭ подмышечные подчелюстные

Без 23 1,7 2,6 2,5

иммунизации 26 2,9 2,6 3,4

Убитая 27 0 0 0

вакцина 27 0 0 0

Важным критерием для выбора вакцинного штамма является стабильность его аттенуированных свойств. Ранее химера TP21/DEN4 была адаптирована к культуре клеток VERO, как к приемлемому субстрату для производства вакцины для людей (Pletnev et al, 2000). Полученный вирус оценивался как посевной Степень вирулентности трех независимых линий вируса, полученных нами в результате 12-14 пассажей на культуре клеток VERO, изучалась в тесте по i/c заражению 4-5-дневных сосунков мышей. По результатам i/c титрования на сосунках степень вирулентности вирусов, полученных в результате пассажей химеры TP21/DEN4 на VERO, не изменилась. Степень вирулентности 1 из линий (№ 1) в сравнении с исходным вирусом была также проверена в тесте по i/sp титрованию на взрослых мышах линии BALB /с. Было показано, что PDso вируса №1, полученного в результате 14 пассажей на культуре клеток VERO, не отличалась от PD50 родительского вируса и составила 4,3 lg БОЕ.

Для оценки генетической стабильности популяции вируса TP21/DEN4, адаптированного к культуре клеток VERO, который мы считали посевным, нами была определена последовательность фрагментов генома каждой из трех линий пассажей. Была отсеквенирована последовательность кодирующей области генома, включающей ген ргМ, ген, кодирующий белок Е, и часть гена, кодирующего белок NS1.

Нами была найдена 1 замена в последовательности, кодирующей белок ргМ, и 10 нуклеотидных замен в последовательности, кодирующей белок Е (Таблица 9). По личному сообщению Доктора Плетнева большая часть замен уже содержалась в геноме посевного вируса TP21/DEN4 после адаптШ^ИИ к культуре клеток VERO. Таким образом, в результате пассажей в культуре клеток VERO в популяции посевного химерного вируса были выявлены мутанты, имеющие 4 дополнительные нуклеотидные замены в последовательности РНК, кодирующей белок Е.

Таблица 9. Замены выявленные в геноме трех независимых линий TP21/DEN4, полученных в результате 12-14 пассажей в культуре клеток VERO.

Локали зация № и.о. Аминокисло тная замена ТР21/ DEN4 #1-14 #2-12 #3-12a

РгМ 957 Alai6o-> Val C-»U C->U с-»и C->U

«ff ¿ьлщщ

1567 U-*A U-+A U->A U-»A

1823 Ser2g5->Gly A->G А-ИЗ A->G A-»G

1856 LÍS296 ->Gln A-»G A->G A->G A-»G

1898 Thr3,0->Ala A->G A->G гетер A-»G A->G

1968 Ser333-> Phe G->U

1973 Thr335->Ser A-»U A->U A->U A->U

■тв жд ¡ЮишгшИЖ®»

2371* CyS480-> Phe G->U G->U G->U G->U

шггт "ГГ v"S apw'fsw ti. ,t'¿ .I«.-. , 4 írt.'-ii tí -jUZ -i' - ъ г>* -«'л1.? * JS*/m>

УШШ штштш

Условные обозначения: * - по последовательности Денге 4, гетр. - гетерогенность, жирным выделены дополнительные замены, приобретенные в процессе 12-14 пассажей посевного вируса в культуре клеток VERO.

Кроме того, была отсеквенирована З'^ТИ. (10262-10664 н.о.) полученных 3 линий пассажей. При сиквенировании ЗМТЯ была найдена одна замена по позиции 10452 (и—»С) у всех 3 линий 12-14 пассажей.

Нами было проведено картирование мутаций, найденных в последовательности РНК TP21/DEN4, кодирующей белок Е, на модели эктодомена белка Е с использованием программы RasWin Molecular Graphics. 4 аминокислотные замены, найденные при адаптации к культуре клеток VERO, локализованы в домене III, связанном с тропизмом вируса, I замена в IA петле и 1 замена - в шарнирной области между доменами I и II, ответственной за конформационные изменения во время фьюзжена и гемагглютинирующую активность вируса (рис. 4). 2 аминокислотные замены по позициям 480 и 491 локализованы в области мембранного якоря белка Е и не обозначены на рис. 4.

Рисунок 4. Локализация аминокислотных замен в эктодомене белка Е (Rey et al., 1995), найденных при секвенировании последовательностей РНК трех независимых линий 12-14 пассажей химеры TP21/DEN4 в культуре клеток VERO и 2 вирусов, выделенных из мозга мышей, зараженных TP21/DEN4.

Поскольку найденные замены появились в нескольких независимых линиях пассажей, это свидетельствует о том, что они не случайны и связаны с адаптацией вируса к культуре клеток VERO. При этом найденные замены не повлияли на степень вирулентности химеры TP21/DEN4.

Для выяснения, какие ревертанты способны появляться при репродукции химеры в ЦНС, нами также были изучены свойства вируса, выделенного из мозга здоровой мыши на 7 день после i/c введения химеры, прошедшего 2 дополнительных пассажа на VERO (который был назван № 6266-2V). По результатам i/c титрования на сосунках степень вирулентности вируса, выделенного из мозга, слегка повысилась по сравнению с родительским вирусом.

Кроме того, был получен вариант TP21/DEN4, выделенный из мозга заболевшего сосунка мыши после i/c заражения вирусом № 6266-2V, названный нами №6266-2V-

Домен ] 14 петля

Дм

)- CD петля

Ibrain. Последовательность фрагментов РНК двух данных вирусов была определена. Кроме адаптивных замен, приобретенных во время пассажей в культуре клеток VERO, в последовательности белка Е вирусов № 6266-2V и №6266-2V-lbrain было найдено 4 дополнительных аминокислотных замены по позициям 69,109,115 и 138 (рис. 4). Три из них расположены в домене II белка Е и одна - в шарнирной области между доменами I и II.

Полученная информация в дальнейшем позволит определить, какие из выявленных мутаций могут быть связаны с повышением вирулентности и включить их в контроль генетической стабильности химерного вируса.

Известно, что вирусы, переносимые клещами, не размножаются в комарах. Изученный нами вирус является химерой комариного и клещевого флавивирусов. Ранее было показано, что несмотря на способность размножаться в комариных клетках С6/36, химерный вирус TP21/DEN4 не реплицировался в комарах Toxorhynchites spkndens после интраторакальной инокуляции (Pletnev et al., 2001).

Нами был проведен эксперимент по оценке возможности репродукции химеры TP21/DEN4 в организме клещей Ixodes ricinus. Клещи были заражены парэнтерально химерой или штаммом Абсеттаров ВКЭ. Титры вируса в клещевых суспензиях, полученных из зараженных клещей, определялись непосредственно после заражения, на 2 день и на 7 сутки после заражения (рис. 5). Повышение титров ВКЭ в организме клещей наблюдали уже на 2 день в 100% случаев. Химера на 7 сутки была выявлена у 50% клещей в тех же титрах, что и сразу после введения. Таким образом, химерный вирус не элиминировался из организма 50% зараженных клещей, по крайней мере, в течение 7 дней после заражения. Для выяснения возможности репродукции химеры в клещах необходимы дополнительные исследования.

Мы провели серию экспериментов по возможности передачи химерного вируса TP21/DEN4 от зараженных мышей клещам Ixodes ricinus и hodespersulcatus при питании в лабораторных условиях. Несмотря на низкий уровень виремии у мышей при i/p введении 6,3 lg БОЕ химерного вируса в одном из И случаев из клещевой суспензии, приготовленной из самки bodes ricinus, питавшейся на зараженной мыши в течение 8 дней, был выделен вирус. Далее нами было проведено исследование вируса, выделенного из клеща и прошедшего 4-5 дополнительных пассажей в культуре клеток VERO. Изучение фенотипических свойств данного вируса не выявило никаких изменений. При секвенировании генома этого вируса в последовательности, кодирующей белки ргМ и Е, и 3'NTR не было выявлено специфических замен, не связанных с пассированием вируса в

культуре клеток VERO. Полученные нами результаты показывают необходимость проведения исследований экологической безопасности химерных вирусов.

Рисунок 5. Скорость репродукции ВКЭ и химеры TP21/DEN4 в организме клещей bodes ricinus и процент зараженности клещей после парентерального введения вируса.

Таким образом, мы провели первый этап изучения химеры TP21/DEN4 с точки зрения возможности использования в качестве вакцинного штамма и показали ее перспективность. Наши исследования позволили уточнить критерии оценки атгенуированных химерных вирусов.

ВЫВОДЫ

1. По показателям степени нейровирулентности и нейроинвазивности в опытах на лабораторных мышах химера TP21/DEN4 является высокоаттенуированным вирусом. Получены данные, указывающие на отсутствие персистенции TP21/DEN4 в организме мышей.

2. Химера TP21/DEN4 высоко аттенуирована для приматов по следующим показателям: низкий уровень виремии и репродукции вируса в висцеральных органах, отсутствие вируса в ЦНС при периферическом введении, низкий уровень репродукции и степень морфологических изменений в ЦНС при внутримозговом введении. При этом степень остаточной вирулентности химерного вируса для приматов выше, чем для мышей.

3. Химерный вирус TP21/DEN4 низкоиммуногенен на мышах, по сравнению с инактивированной вакциной при подкожной и внутримышечной иммунизации. Двукратная внутрибрюшинная иммунизация мышей химерой TP21/DEN4 обеспечивает эффективную и длительную защиту против всех трех субтипов ВКЭ и вируса ОГЛ. Однократная и двукратная подкожная иммунизация химерой TP21/DEN4 обезьян Cercophithecus aethiops индуцирует высокий уровень синтеза антител,

обеспечивает формирование иммунологической памяти и предотвращает размножение вируса клещевого энцефалита в висцеральных органах.

4. Показана стабильность аттенуированных свойств посевного вируса ТР21 /DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO. Определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3NTR генома химеры TP21/DEN4, связанные с адаптацией вируса к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС, которые могут быть использованы для контроля генетической стабильности вирусной популяции.

5. Впервые показана возможность передачи TP21/DEN4 клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши и возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 из организма клещей hodes ricinus.

6. В результате работы на примере атгенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы для защиты от КЭ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Припузова Н.С., Дживанян Т.И., Карганова Г.Г. Протективные свойства химеры между флавивирусами Лангат и Денге 4 для защиты против вируса клещевого энцефалита в экспериментах на лабораторных мышах. IIМатериалы Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы ващинно<ывороточного дела вXXI веке». Пермь-2003 - С. 53-55.

2. Припузова Н.С., Дживанян Т.И., Карганова Г.Г. Механизмы аттенуации химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 и ее стабильность при пассажах в культуре клеток VERO. ПМатериалы Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы эпидемиологии и профилактики инфекционных болезней». Самара-2004 - С. 216-218.

3. Ворович М.Ф., Хапчаев Ю.Х., Припузова Н.С., Нагирева Л.И., Грачев В.П. Российская инактивированная сухая вакцина против клещевого энцефалита. // Биопрепараты -2004 - №2.-С. 17-20.

4. Карганова Г.Г., Припузова Н.С., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Дживанян Т.И., Румянцев A.A., Лашкевич ВА. Оценка остаточной нейровирулентности химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 при интрацеребральном заражении обезьян. // Вопросы вирусологии. - 2005 - №1 - С. 27-31.

Результаты работы изложены в тезисах следующих конференций

5. Припузова Н.С., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Дживанян Т.Н., Карганова Г.Г. Безопасность и протективность химеры вирусов Лангат и Денге 4 - кандидата в вакцинный штамм для защиты от клещевого энцефалита. // Сборник трудов

Всероссийскойнаучно-практическойконференции смеждународнымучастием «Медицинские науки: от идей до новых технологий». - Москва, 10-11 декабря 2001. -С. 185.

6. Лашкевич В.А., Карганова Г.Г., Терешкина Н.В., Припузова Н.С., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Дживанян Т.И., Плетнев А.Г. Унифицированный подход к оценке безопасности и иммуногенности претендентов в вакцинные штаммы для защиты от вируса клещевого энцефалита, II Материалы VIIIсъезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - Москва, 26-28 марта 2002г., С. 192193.

7. Припузова Н.С., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Дживанян Т.Н., Карганова Г.Г. Нейровирулентность химеры между флавивирусами Лангат и Денге 4 для лабораторных мышей и обезьян. // Тезисы докладов научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине». - Санкт-Петербург, 5-6 декабря 2002г. - С. 272-273.

8. Карганова Г.Г., Припузова Н.С., Терешкина Н.В., Дживанян Т.Н., Гмыль Л.В., Румянцев A.A., Плетнев A.A., Лашкевич ВА. Оценка нейровирулентности химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как вакцинного штамма для защиты от клещевого энцефалита. // Тезисы докладов Шестого Международного форума по глобальной вакцинологии «Вакцины и иммунизация». - Минск, Белорусь, 25-26 сентября 2003 - С. 36-37.

9. Pripuzova N.S., Gmyl L.V., Dzhivanyan T.I., Rumyantsev A.A., Lashkevich V.A., Karganova G.G. Protective Effect in Monkeys Following of Immunization with a Live Attenuated Chimeric Flavivirus Against Tick-borne Encephalitis // Clinical Microbiology and Infection. - Vol. 10 - Sup. 3 - 14th ECCMID, Praha, Czech Republic, 1-4 May 2004 - P. 53-54.

10. Карганова Г.Г., Припузова Н.С., Терешкина Н.В., Гмыль Л.В., Лашкевич ВА. Критерии отбора аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы для защиты от клещевого энцефалита. // Тезисы первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинскиеиммуно-биологическиепрепараты дляпрофилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». Москва, 10-11 ноября 2004г. - С. 30-31.

Подписано в печать 05.02.2005 Объем 1.5усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 171 Отпечатано в ООО «Соцветие красою) 119992 г.Москва, Ленинские горыт д. 1 Главное здание МГУ, к. 102

t

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Припузова, Наталья Сергеевна

список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. общая характеристика рода flavivirus.

1.1 Химические и физические свойства флавивирусов.

1.2 Структура генома флавивирусов.

1.3 Функциональные характеристики белков.

1.4 Проникновение вириона в клетку.

1.5 Трансляция и протеолитический процессинг.

1.6 Репликация РНК.

1.7 Сборка и освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток.

1.8 Антигенная классификация.

1.9 Роль структурных и неструктурных белов в иммунном ответе.

2. Генетические маркеры вирулентности и тропизма флавивирусов.

2.1 Мутации в 5' и 3'NTR, влияющие на вирулентность и тропизм.

2.2 Мутации в поверхностном гликопротеине Е, влияющие на вирулентность, тропизм и связывание с моноклональными антителами.

2.3 Мутации, влияющие на вирулентность флавивирусов, в других структурных белках.

2.4 Влияние на вирулентность флавивирусов мутаций в последовательности неструктурных белков.

3. Способы профилактики клещевого энцефалита.

4. История получения и изучения вариантов живой вакцины против вируса клещевого энцефалита.

5. новешие исследования в области получения живой вакцины против вкэ.

6. Критерии отбора и методы оценки предложенных аттенуированных вариантов живых вакцин против ВКЭ.

6.1 Критерии безопасности.

6.2 Стабильность свойств и генетическая стабильность.

6.3 Оценка возможной персистенции аттенуированных вирусов.

6.4 Способы оценки эффективности вакцин.

Материалы и методы.

1. вирусы.

2. Эксперименты на обезьянах.

3. Приготовление образцов органов обезьян для гистологического и вирусологического анализов.

4. гистологическое исследование ЦНС.

5. эксперименты на мышах.

6. приготовление образцов крови.

7. определение виремии в сгустках крови обезьян с помощью титрования на мышах.

8. определение титров штамма абсеттаров ВКЭ в органах и в сыворотках или сгустках крови методом бляшек.

9. определение титров химеры ТР21 /DEN4 методом бляшек.

10. активация персистентной инфекции у мышей.

11. Проведение пассажей TP21/DEN4 на VERO.

12. выявление вирусной РНК в мозге мышей.

13. секвенирование последовательностей РНК вирусов, полученных в результате пассажей химеры на VERO.

14. иммуноферментный анализ (ИФА).

15. Реакция нейтрализации.

16. Иммунопреципитация вирусспецифических белков с использованием протеин-А-сефарозы.

17. Опыты с использованием клещей.

Результаты собственных исследований.

1. оценка степени аттенуации химеры ТР21/DEN4 в экспериментах на лабораторных мышах.

1.1. Сравнение степени вирулентности химеры TP21/DEN4 с высоковирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ и родительским штаммом ТР21 вируса Лангат.

1.2 Разработка метода выявления вирусной РНК в мозге незаболевших мышей после i/p, i/сили i/sp введения TP21/DEN4.

1.3. Нейровирулентность химеры TP21/DEN4 в опытах по Ус заражению сосунков.

1.4. Сравнение уровня репродукции химеры TP21/DEN4, вируса Лангат и штамма Абсеттаров ВКЭ при Ус введении лабораторным мышам линии BALB/c весом 10-12г.

1.5. Степень вирулентности и скорость распространения по ЦНС химеры TP21/DEN4 в сравнении с вирусами Лангат и КЭ при Узр введении мышам.

1.6. Периферическая вирулентность TP21/DEN4 на мышах.

1.7. Оценка возможности персистенции химеры в организме мышей BALB/c (12-14 г) после Ур,

Ус и ysp введений.

2. ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРНОГО ВИРУСА TP21/DEN4 НА МОДЕЛИ ОБЕЗЬЯН.

2.1 Периферическая вирулентность TP21/DEN4 в экспериментах на обезьянах по сравнению с высоко вирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ.

2.2 Оценка остаточной нейровирулентности химеры TP21/DEN4 в экспериментах на зеленых мартышках (Cercopithecus aethiops) при интрацеребральном введении.

3. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ВИРУСА TP21/DEN4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO И ЧЕРЕЗ МОЗГ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ.

3.1 Оценка стабильности химеры при пассажах на культуре клеток VERO.

3.2 Оценка стабильности химеры при пассажах через мозг лабораторных мышей.

4. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ TP21/DEN4 ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПРОТИВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ВКЭ В ОПЫТАХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШАХ.

4.1. Оценка протективной эффективности и формирование иммунного ответа при различных схе.иах и способах иммунизации.

4.2. Дчительность защиты против ВКЭ при Ур иммунизации химерой в сравнении с инактивированными вакцинами производства ФГУППИПВЭ u "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия).

4.3. Протективная активность химеры TP21/DEN4 против других штаммов ВКЭ и вируса ОГЛ при Ур иммунизации в сравнении с инактивированной вакциной производства ИПВЭ.

5. оценка эффективности иммунизации химерой tp21/den4 против вкэ в опытах на обезьянах.

5.1. Оценка иммуногенности химеры при s/c иммунизации.

5.2. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против s/c разрешения ВКЭ.

5.3. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против Ус разрешения ВКЭ.

6. оценка экологической безопасности химеры tp21/den4 в опытах на клещах.

6.1. Моделирование передачи вирусов КЭ и химеры TP21/DEN4 иксодовым клещам при питании на зараженных мышах.

6.2. Изучение фенотипических и генетических свойств вируса, выделенного из взрослой самки I. persulcatus при питании на мыши, зараженной химерой.

6.3. Изучение способности химеры TP21/DEN4 к репродукции в иксодовых клещах

Обсуждение.

1. безопасность химеры tp21/den4 на модели лабораторных мышей и обезьян.

2. оценка протективности химеры tp21/den4 на модели лабораторных мышей и обезьян.

3. изучение генетической и фенотипической стабильности свойств химеры tp21/den4 при пассажах на культуре клеток vero и через мозг мышей.

4. характеристика мутаций, найденных в геноме химеры tp21/den4, при пассажах на культуре клеток vero и через мозг мышей.

5. оценка экологической безопасности химеры tp21/den4 в опытах на клещах.

6. разработка критериев оценки аттенуированных штаммов кандидатов в живую вакцину против вкэ.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита"

Клещевой энцефалит (КЭ) является природно-очаговой арбовирусной инфекцией с высокой 2-7 % смертностью. Около 30% заболеваний оканчиваются инвалидизацией. В настоящее время заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) регистрируется в Австрии, Германии, Польше, Чехии, Словакии, Финляндии, прибалтийских государствах, России, Италии, Швейцарии. Максимальные показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии. В Российской Федерации клещевой энцефалит распространен в европейской части страны, в Сибири и на Дальнем Востоке. Эпидемиологическая обстановка по КЭ во многих областях и регионах с каждым годом ухудшается, поскольку значительно снизилась интенсивность противоклещевых мероприятий и вакцинирования. Ведущим фактором, определяющим заболеваемость в последние годы, является посещение очагов неиммунными жителями городов, которые болеют в 2,5 раза чаще сельских жителей. В 1996 году - через 5 лет после запрещения проведения акарицидных обработок с применением ДДТ и на фоне резкого снижения охвата населения вакцинацией - было зарегистрировано более 10000 больных КЭ (6,8 на 100 тысяч населения). В 2001-2002 годах отмечается снижение заболеваемости за счет увеличения вакцинации и возобновления противоакарицидных мероприятий - 3,57-4,38 больных на 100 тысяч населения. В настоящее время для профилактики КЭ существует несколько эффективных препаратов инактивированной концентрированной очищенной вакцины. Основным недостатком этих препаратов является необходимость ревакцинаций с интервалом в три года и возможность аллергических реакций. Необходимы дополнительные разработки по усовершенствованию вакцин, направленные на увеличение длительности индуцируемого иммунитета, широты спектра действия вакцин и снижения стоимости их производства. В связи с этим в течение многих лет ведутся разработки по получению живых вакцин. В 60-е и 70-е годы в СССР, США и Чехословакии проводились исследования по получению живой вакцины против КЭ. В это же время вырабатывались и критерии отбора аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы. Восемь вариантов вирусов комплекса КЭ успешно прошли испытания на ограниченном контингенте добровольцев (9 - 2500 человек). Одна из вакцин на основе штамма Еланцев вируса Лангат была изучена в расширенном эпидемиологическом опыте на 649479 человек. Эффективность ее была признана высокой. Однако, было зарегистрировано 35 случаев вакциноассоциированных осложнений - лихорадящее заболевание, менингоэнцефалит, хронический клещевой энцефалит. Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии привел к появлению новых стратегий получения вакцин, таких как химеризация разных флавивирусов, специфический мутагенез вирусных детерминант вирулентности и другие. На данный момент активно разрабатываются живые аттенуированные флавивирусные вакцины для защиты от вирусов Денге и вируса Западного Нила (ЗН). Разработана живая вакцина против Японского энцефалита (ЯЭ). Живая аттенуированная вакцина против вируса желтой лихорадки на основе штамма 17D является одной из самых безопасных и наиболее эффективных вакцин. Этот штамм активно используется для создания химерных вирусов для защиты от вирусов ЗН и ЯЭ.

В последнее время в нескольких лабораториях мира проводятся исследования по получению аттенуированных вирусов, которые предполагается использовать в качестве живой вакцины для защиты от вируса КЭ. Исследования в этой области ведутся в основном в двух направлениях. Первый подход заключается в создании химер флавивирусов, которые содержат структурные белки РгМ и Е вирусов комплекса КЭ, второй подход направлен на выявление аттенуирующих мутаций в геноме ВКЭ и Лангат, и получение с помощью мутагенеза вирусов, несущих эти мутации. В обоих случаях кандидат в вакцинный штамм является вирусом, полученным генно-инженерным путем. При создании новой живой вакцины помимо получения аттенуированного иммуногенного вируса необходима разработка критериев его оценки, поскольку предложенные ранее требования к вакцинным штаммам могут не учитывать специфику генно-инженерных вирусов.

Американскими учеными (Pletnev et al., 1998) была сконструирована жизнеспособная химера TP21/DEN4, содержащая гены РгеМ-Е штамма ТР21 вируса Лангат, относящегося к комплексу КЭ, и остальную последовательность РНК вируса Денге 4 типа. На модели данного химерного вируса мы попытались определить критерии оценки аттенуированных вакцинных штаммов.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4, TP21/DEN4 и на модели этого вируса уточнить критерии оценки аттенуированных штаммов - кандидатов в живую вакцину против КЭ.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить степень атгенуации химерного вируса ТР21 /DEN4 и оценить возможность его персистенции на модели лабораторных мышей.

2. Оценить уровень вирулентности химеры TP21/DEN4 при периферическом и интрацеребральном (i/c) введении обезьянам.

3. Охарактеризовать степень иммуногенности химерного вируса, эффективность и длительность защиты против вирусов комплекса КЭ по сравнению с инактивированными вакцинами производства ФГУП ПИПВЭ им М.ПЛумакова и "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия) на модели лабораторных мышей и обезьян.

4. Изучить генетическую стабильность вирусной популяции и стабильность аттенуированных свойств посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO и через мозг мышей.

5. Оценить экологическую безопасность химерного вируса ТР21/DEN4 в опытах на иксодовых клещах.

6. Использовать данные, полученные на модели химерного вируса TP21/DEN4, для выработки критериев оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ. Научная новизна.

Химера TP21/DEN4 является уникальным генно-инженерным вирусом, поэтому все исследования по изучению свойств этого вируса проводились впервые или существенно дополняли данные об этом вирусе, полученные ранее.

1. Проведено всестороннее изучение свойств и уровня аттенуации химерного вируса TP21/DEN4 в экспериментах на мышах разного возраста и обезьянах двух видов при i/c и периферическом введении.

2. Изучены иммуногенность химеры, уровень и длительность протективного иммунитета, индуцируемого химерой TP21/DEN4, в экспериментах на мышах и обезьянах для защиты от высоковирулентных штаммов ВКЭ, относящимся к разным субтипам, и вируса омской геморрагической лихорадки (ОГЛ).

3. Показана стабильность аттенуации посевного вируса TP21/DEN4 при пассажах в культуре клеток VERO и определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3TNTTR, связанные с адаптацией к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС мышей. Получена новая информация по функциональному картированию белка Е.

4. Впервые показана возможность передачи химерного вируса клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши, а также возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 в организме клеща Ixodes ricinus.

Научно-практическая значимость работы. Проведен первый этап изучения свойств химеры TP21/DEN4 и показана его перспективность, как кандидата в вакцинный штамм для защиты от КЭ с точки зрения уровня аттенуации и иммуногенности.

1. В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ.

2. Показано, что для химерных вирусов наиболее информативными являются эксперименты по изучению уровня аттенуации и протективности на обезьянах и подобран вид обезьян для этих исследований.

3. Для химерных вирусов показана необходимость проведения экспериментов по экологической безопасности.

4. В экспериментах на мышах получены следующие новые данные по протективности инактивированной цельновирионной вакцины производства ФГУП ПИПВЭ им М.П. Чумакова:

- преимущество i/m иммунизации по сравнению со стандартно применяемой s/c,

- длительность протективного иммунитета более 1 года (то есть практически пожизненный иммунитет),

- эффективность иммунизации вакциной против вируса ОГЛ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Припузова, Наталья Сергеевна

выводы

По показателям степени нейровирулентности и нейроинвазивности в опытах на лабораторных мышах химера TP21/DEN4 является высокоаттенуированным вирусом. Получены данные, указывающие на отсутствие персистенции TP21/DEN4 в организме мьппей. Химера TP21/DEN4 высоко аттенуирована для приматов по следующим показателям: низкий уровень виремии и репродукции вируса в висцеральных органах, отсутствие вируса в ЦНС при периферическом введении, низкий уровень репродукции и степень морфологических изменений в ЦНС при внутримозговом введении. При этом степень остаточной вирулентности химерного вируса для приматов выше, чем для мышей.

Химерный вирус TP21/DEN4 низкоиммуногенен на мышах, по сравнению с инактивированной вакциной при подкожной и внутримышечной иммунизации. Двукратная внутрибрюшинная иммунизация мьппей химерой TP21/DEN4 обеспечивает эффективную и длительную защиту против всех трех субтипов ВКЭ и вируса ОГЛ. Однократная и двукратная подкожная иммунизация химерой TP21/DEN4 обезьян Cercophithecus aethiops индуцирует высокий уровень синтеза антител, обеспечивает формирование иммунологической памяти и предотвращает размножение вируса клещевого энцефалита в висцеральных органах.

Показана стабильность аттенуированных свойств посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO. Определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3*NTR генома химеры TP21/DEN4, связанные с адаптацией вируса к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС, которые могут быть использованы для контроля генетической стабильности вирусной популяции.

Впервые показана возможность передачи TP21/DEN4 клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши и возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 из организма клещей Ixodes ricinus.

В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов — кандидатов в вакцинные штаммы для защиты от КЭ.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность к.б.н Каргановой Г.Г. за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М.П.Чумакова кмн Дживанян Т.И., к.б.н Гмыль Л.В., к.б.н Буренкову Л.А., Романову Л.Ю., сотрудника ГИСК им Л.А. Тарасевича к.м.н Терешкину Н.В. и американского коллегу Доктора А. Плетнева за помощь и участие в настоящей работе. Я глубоко признательна академику РАМН Лашкевичу В.А. за внимание к работе и плодотворные научные дискуссии.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Припузова, Наталья Сергеевна, Москва

1. Воробьева М.С., Дзагуров С.Г., Ладиженская И.П., Чигиринский А.В., (1982) Изучение * аттенуированных вариантов вирусов комплекса клещевого энцефалита. Вопросывирусологии,3, 55-59.

2. Воробьева М.С., Эльберт Л.В., Грачев В.П. и др. (1983) Реактогенность и иммуногенная эффективность концентрированной очищенной вакцины против клещевого энцефалита. Вопр. Вирусол., 5,622-626

3. Дремов Д.П. (1977) Сравнительное патоморфологическое изучение нейровирулентности аттенуированных вариантов вируса клещевого энцефалита на обезьянах. "Научные основы производства вирусных и бактериальных препаратов", Томск.

4. Дубов А.В., Молотилов В. А. (19696) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 85-90.

5. Дубов А.В., Горожанкина Т.С., Смородинцев А.А. (1969г) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 16-26.

6. Дубов А.В., Горожанкина Т.С. (1969д) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3,27-34.

7. Дубов А.В., Кошуков С.Д., Григорьева Л.В., Костилев С.Г. (1969е) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 63-74.

8. Дубов А.В., Козлов Л.Б., Молотилов Б.А., Фенева Н.А. (1972) Живая вакцина противклещевого энцефалита. Антигенная активность. Вопр. Вирусол., 4,45-50.

9. Дубов А.В. Смородинцев А.А. (1980) Пути усовершенствования вакцинопрофилактикиклещевого энцефалита. Вестник АМН СССР, №10.

10. Дубов А.В.(1989) Клещевой энцефалит. Ленинград, 120-125.

11. Ерофеев B.C. (1969а) Вопросы эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXI, 11-15.

12. Ерофеев B.C., V.S. (1969b) Вопросы эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXI, 202-206.

13. Ерофеев B.C., Карпов С.П. (1972) Вопросы вирусологии, 5,591- 594.

14. Ерофеев B.C., Карпов С.П., Куликова Н.Н. (1976а) Конструирование и применениебиологических препаратов. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXVI, 223-228.

15. Иваненко А.И., Гольдфарб М.М., Лезина М.Н., Ладыженская И.П., (1969) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3,35-43.

16. Игнатьев Г.М., Отрашевская М.С., Воробьева М.С. (2003) Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещвого энцефалита в эксперименте. Вопр. Вирусол., №3, с. 22-25.

17. Ильенко В.И., Платонов В.Г., Прозорова И.Н., Смородинцев А.А. (1968а) Материалы к изучению изменчивости малайского вируса Лангат (штамм ТР-21). Бюллетень ВОЗ, Т.39, №3.

18. Каган Н. В. (1939) Экспериментальные материалы к активной иммунизации мышей против весенне-летнего (клещевого) энцефалита препаратами живого и убитого вируса. Арх. Биол. Наук, 56 (2), 97-111

19. Костилев С.Г., Дубов А.В. (1969) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 53-62.

20. Левкович Е.Н., Засухина Г. Д., Чумаков М. П., Лашкевич В. А., Гагарина А. Г. (1960) Вопр. Вирусол., 3,233-236

21. Левкович Е.Н., Карпович Л.Г., Логинова Н.В. (1966) Анализ неровирулентных и иммуногенных свойств клонов, выделенных из популяции вируса Лангат (штамм ТР-21). Вопросы вирусологии, 2,183-189.

22. Левкович Е.Н., Карпович Л.Г., Засухина Г.Д. (1971) Генетика и эволюция арбовирусов. Москва, Медицина, 264,229-231.

23. Остерман Л.А. (1986) Хроматография белков и нуклеиновых кислот, М., «Наука», 536 с. Погодина В.В. (1967) Сравнительное изучение вирусов группы клещквого энцефалита по признаку вирусемии. Acta virol., 8, с. 113-122.

24. Смородинцев А.А., Каган Н.В., Левкович Е. Н. (1941) Ж. Микробиол., 4, с. 3-12. Смородинцев А.А., Дубов А.В. (1986) Клещевой энцефалит и его профилактика. АМН СССР. Ленинград:Москва.

25. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В. (1994) Характеристики нейровирулентности, стабильности и ммуногенности ослабленных вариантов вируса Лангат ТР-21. Вопр. Вирусол., № 5, с. 220-223.

26. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В., Вейгман Н.З. (1994) Нейровирулентность вариантов вируса Лангат ТР-21 в опытах на низших обезьянах разных видов. Вопр. Вирусол., № 2 , с. 116-119.

27. Фролова Т.В., Погодина В.В., Ларина Г.И., Фролова М.П., Кармышева В.Я. (1982) Активирующий эффект циклофосфана на поздних этапах персистенции вируса КЭ. Вопр. Вирусол., № 5, с. 578-585.

28. Andhzaparidze, O.G.; Rozina, E.E.; Bogomolova, N.N.; Boriskin, Yu.S. (1978) Acta Virol. 22(3), 218-223.

29. Arroyo J., Guirakhoo F., Fenner S. et al. (2001) Molecular basis for atennuation of neurovirulence of a Yellow Fever virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE). J. of Virol., 75,2, p. 934-942.

30. Blok J, McWilliam M, Butler HC, et al. (1992) Comparison of a dengue-2 virus and its candidate vaccine derivative: Sequence relationships with the flaviviruses and other viruses. Virology, 187, 573-590.

31. Bray M, Lai CJ. (1991) Dengue virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response. Virology, 185,505-508.

32. Burke & Monath (2001) Flaviviruses. In Fields Virology. Forth edition, Lippincott Raven Publishers, Philadelphia, p. 965-1030.

33. Cahour A, Pletnev A, Vazielle-Falcoz M, Rosen L, Lai CJ. (1995) Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. Virology. 1995 Feb 20;207(l):68-76

34. Calisher CH, Karabatsos N, Dalrymple JM, et al. (1989) Antigenic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera. J Gen Virol, 70, 37-43.

35. Calisher CH. (1988) Antigenic classification and taxonomy of flaviviruses (family Flaviviridae) emphasizing a universal system for the taxonomy of viruses causing tick-borne encephalitis. Acta Virol, 32,469-478.

36. Cardiff RD, Lund JK. (1976) Distribution of dengue-2 antigens by electron immunocytochemistry. Infect Immunol, 3, 1699-1709.

37. Casals J, Brown LV. (1954) Hemagglutination with arthropod-borne viruses. J Exp Med, 99, 429-449.

38. Casals J. (1957) The arthropod-borne group of animal viruses. Trans N Y Acad Sci; 19:219-235. Casals, J. and Webster, L.T. (1944) J. Exp. Med., 79(1), 45-63.

39. Chen Y, Maguire T, Hileman RE, et al. (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat Med, 3, 866-871

40. Chiou SS, Chen WJ. (2001) Mutations in the NS3 gene and З'-NCR of Japanese encephalitis virus isolated from an unconventional ecosystem and implications for natural attenuation of the virus. Virology. Oct 10;289(l):129-36

41. Crooks AJ, Lee JM, Easterbrook LM, Timofeev AV, Stephenson JR. (1994) The NS1 protein of tick-borne encephalitis virus forms multimeric species upon secretion from the host cell. J Gen Virol. Dec;75 (Pt 12):3453-60

42. De Madrid AT, Porterfield JS. (1974) The flaviviruses (group В arboviruses): A cross-neutralization study. J Gen Virol, 23,91-96.

43. Dharakul T, Kurane I, Bhamarapravati N, Yoksan S, Vaughn DW, Hoke CH, Ennis FA. (1994) Dengue virus-specific memory T cell responses in human volunteers receiving a live attenuated dengue virus type 2 candidate vaccine. J Infect Dis. Jul; 170(1 ):27-33

44. Fokina G.I., Malenko G.V., Levina L.S., Koreshkova G.V., Rzhakhova O.E., Mamonenko L.L.,

45. Pogodina V.V., Frolova M.P. (1982) Persistence of tick-borne encephalitis virus in monkeys. V.

46. Virus localization after subcutaneous inoculation. Acta virol., 26, p. 369-375.

47. Gould EA, Buckley A, Barrett ADT, et al. (1986) Neuralizing (54 K) and non-neutralizing (54 Кand 48 K) monoclonal antibodies against structural and non-structural yellow fever virusproteins confers immunity in mice. J Gen Virol, 67,591-595.

48. Hahn CS, Dalrymple JM, Strauss JH, et al. (1987) Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it. Proc Natl Acad Sci U S A;84:2019-2023

49. Halstead SB. (1988) Pathogenesis of dengue: Challenges to molecular biology. Science, 239:476-481.

50. Harabacz I, Bock H, Jiingst C, et al. (1992) A randomized phase II study of a new tick-borne encephalitis vaccine using three different doses and two immunization regimes. Vaccine; 10:145150.

51. Hasegawa H., Yoshida М., Shiosaka Т., Fujita S., Kobayashi Y. (1992) Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice. Virology, 191, p. 158-165.

52. He RT, Innis BL, Nisalak A, et al. (1995) Antibodies that block virus attachment to Vero cells are a major component of the human neutralizing antibody response against dengue virus type 2. J Med Virol; 45:451-461.

53. Heinz FX, Berge R, Tuma W, et al. (1983) A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology, 126, 525-537.

54. Heinz FX. (1986) Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virus Res, 31, 103-168. Heinz, FX, Roehrig JT. Flaviviruses. (1990) In: Immunochemistry of viruses, vol II. Amsterdam-New York-Oxford: Elsevier, 289-305.

55. Heinz FX, Stiasny K, Puschner-Auer G, et al. (1994) Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology, 198,109-117.

56. Heinz FX, Allison SL, Stiasny K, Schalich J, Holzmann H, Mandl CW, Kunz C. (1995) Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogens for vaccination against tick-borne encephalitis. Vaccine. Dec, 13(17), 1636-42.

57. Henchal EA, Henchal LS, Schlesinger JJ. (1988) Synergistic interactions of anti-NSl monoclonal antibodies protect passively immunized mice from lethal challenge with Dengue 2 virus. J Gen Virol, 69,2101-2107.

58. Hill AB, Lobigs M, Blanden RV, et al. (1993) The cellular immune response to flaviviruses. In: Thomas DB, ed. Viruses and the cellular immune response. New York: Marcel Dekker, 363388.

59. Holbrook MR, Li L, Suderman MT, Wang H, Barrett AD. (2000) The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Res. Aug;69(l):31-9.

60. Jacobs SC, Stephenson JR, Wilkinson GWG. (1992) High-level expression of the tick-borne encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: Protection elicited in a murine model. J Virol, 66,2086-2095.

61. Kimura T, Kimura-Kuroda J, Nagashima K, Yasui K. (1994) Analysis of virus-cell binding characteristics on the determination of Japanese encephalitis virus susceptibility. Arch. Virol;139:239-251.

62. Klockmann U, Bock HL, Franke V, et al. (1989) Preclinical investigations of the safety, immunogenicity and efficacy of a purified, inactivated tick-borne encephalitis vaccine. J Biol Stand; 17:331-342.

63. Kofler RM, Heinz FX, Mandl CW. (2002) Capsid protein С of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence. J Virol. Apr; 76(7), p. 3534-43.

64. Kofler R. M., Judith H. Aberle, Stephan W. Aberle, Steven L. Allison, Franz X. Heinz, and Christian W. Mandl (2004) Mimicking live flavivirus immunization with a noninfectious RNA vaccine. PNAS, vol. 101, no. 7,p. 1951-1956.

65. Kreil TR, Burger I, Bachmann M, Fraiss S, Eibl MM. (1997) Antibodies protect mice against challenge with tick-bome encephalitis virus (TBEV)-infected macrophages. Clin Exp Immunol. Dec;110(3):358-61.

66. Kreil TR, Maier E, Fraiss S, Attakpah E, Burger I, Mannhalter JW, Eibl MM. (1998) Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease but not infection, although viremia is undetectable. Vaccine. Jul;16(l l-12):1083-6.

67. Kreil TR, Maier E, Fraiss S, et al. (1998) Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease but not infection, although viremia is undetectable. Vaccine; 16(11— 12):1083—1086.

68. Kunz C, Hofmann H, Stary A. (1976) Field studies with a new tick-borne encephalitis (TBE) vaccine. Zentralbl Bakteriol I. Orig A;243:141—144.

69. Kunz C, Heinz FX, Hofmann H. (1980) Immunogenicity and reactigenicity of a highly purifiedvaccine against tick-borne encephalitis. J Med Virol;6:103-109.

70. Maldov DG, Karganova GG, Timofeev AV. (1992) Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. Arch Virol.;127(l-4):321-5.

71. Mandl C. W., Kunz C. and Heinz F. X. (1991a) Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3' noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains. J Virol. August; 65 (8): 4070-4077

72. Mandl C.W., Iacono-Connors L., Wallner G., Holzmann H., Kunz C., Heinz F. X. (1991b) Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flavivirus Langat TP21 and Yelantsev, Virilogy, 185, 891-895.

73. Marianneau P, Megret F, Olivier R, et al. (1996) Dengue 1 virus binding to human hepatoma

74. HepG2 and simian Vero cell surfaces differs. J Gen Virol;77:2547-2554.

75. Mason PW, Pincus S, Fournier MJ, et al. (1991) Japanese encephalitis virus-vacciniarecombinants produce particulate forms of the structural membrane proteins and induce highlevels of protection against lethal JEV infection. Virology; 180:294-305.

76. Mayer, V. (1963) Acta virol., 7(5), 421-429.p

77. Mayer, V. (1966) Acta Virol., 10, 561.p

78. Mayer, V.; Ernek, E.; Blaskovic, D.; Kozuch, O. and Nosek, J (1967a) Acta Virol., 11, p 334345.

79. Mayer, V. (1967b) Acta virol. 11(3), 267-269.

80. Mayer V. (1975) A live vaccine against tick-borne encephalitis: Integrated studies. I. Basic properties and behavior of the ES "14" clone (Langat virus). Acta Virol (Praha); 19:209-218

81. McMinn P.C. (1997) The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. J. Gen. Virol., 78, 2711-2722.

82. Nathanson, N.; Goldblatt, D.; Thind, I.S.; Davis, M. and Price, W.H. (1966) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. II. Selection of indicator centers. Am J Epidemiol. Nov;84(3):524-40.

83. Phillpotts RJ, Stephenson JR, Porterfield JS. (1985) Antibody-dependent enhancement of tick-borne encephalitis virus infectivity. J Gen Virol;66:1831-1837.4

84. Pletnev, A.G., Bray, M., Huggins, J., Lai, C.-J. (1992). Constraction and characterization of » chimeric tick-born encefalitis/dengue type 4 viruses. Proc.Natl. Akad. Sci. USA 89,1053210536.

85. Pletnev, A.G., Karganova G.G., Dzhivanyan, T.I., Lashkevich, V.A., Bray M. (2000). Chimeric Langat/Dengue viruses protect mice from heterologous challenge with the highly virulent strains of tick-borne encephalitis virus. Virology 274,26-31.

86. Price, W.H., Thind, I.S., Teasdall, R., O'Leary, W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian Spring-Summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. WLD Hlth. Org. v. 42, p. 82-94.

87. Price W.H.and Thind I.S. (1973) Immunization of mice against Russian Spring-Summer (RSS) virus complex and monkeys against Powassan virus with attenuated Langat E5 virus. The American J. Tropical, medicine and Hygiene, v.22, No.2, p. 100-107.

88. Roehrig JT. (1986) The use of monoclonal antibodies in studies of the structural proteins of togaviruses and flaviviruses. In: Schlesinger S, Schlesinger MJ, eds. The Togaviridae and Flaviviridae. New York: Plenum Press, 251-278.т

89. Rothman AL, Ennis FA. (1999) Immunopathogenesis of Dengue hemorrhagic fever. Virology, 257:1-6.

90. Rothman AL, Kurane I, Lai C-J, et al. (1993) Dengue virus protein recognition by virus-specific murine CD8+ cytotoxic T lymphocytes. J Virol, 67, 801-806.

91. Ruoslahti E. and Pierschbacher M.D. (1987) New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science, 238, p. 491-497.

92. Salas-Benito JS, del Angel RM. (1997) Identification of two surface proteins from C6/36 cells that bind dengue type 4 virus. J Virol;71:7246-7252.

93. Schlesinger JJ, Brandriss MW, Walsh EA. (1987) Protection of mice against dengue-2 virus encephalitis by immunization with the dengue-2 virus nonstructural glycoprotein NS-1. J Gen Virol, 68, 853-857.

94. Schlesinger JJ, Brandriss MW, Putnak JR, et al. (1990) Cell surface expression of yellow fever virus non-structural glycoprotein NS1: Consequences of interaction with antibody. J Gen Virol, 71, 593-599.

95. Schlesinger JJ, Putnak JR, Eckels KH. (1992) New approaches to flavivirus vaccine development. Biotechnology, 20,289-307.

96. Smith C.E.G. (1956) Nature (Lond.), v.178, p. 581-582.

97. Sumiyoshy H., Tignor G.H., Shope R.E. (1995) Characterization of a higly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J. of Infect. Diseases, 171, p. 11441151.

98. Tan CH-C, Yap E-H, Singh M, et al. (1990) Passive protection studies in mice with monoclonal antibodies directed against the non-structural protein NS3 of dengue 1 virus. J Gen Virol, 71, 745-748.

99. Theiler, M. (1951). The virus, p. 46-136. In G. K. Strode (ed.), Yellow fever. McGraw Hill, New York, N.Y.

100. Thind, I.S., Price, W.H. (1966a) A chick embrio attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. III. The ability to protect against homologous virus and Powassan virus in cross-challenge experiments. American J. Epidemiology. V. 84, p. 225-233.

101. Thind, I.S. (1981) Attenuated Langat E5 virus as a liv virus vaccine against Kyasanur forest disease virus. Indian J. Med. Res., 73,141-149.

102. Timofeev A.V.& Karganova G.G. (2003) Tick-Borne Encephalitis Vaccine: From Past to Future, Moscow, 44 p.

103. Van Der Most RG, Murali-Krishna K, Ahmed R, Strauss JH. (2000) Chimeric yellow fever/dengue virus as a candidate dengue vaccine: quantitation of the dengue virus-specific CD8 T-cell response. J Virol., 74(17):8094-101.

104. Ting Liu and Thomas J. Chambers (2001) Yellow Fever Virus Encephalitis: Properties of the