Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и особенностей регуляции гена mts1

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и особенностей регуляции гена mts1"

российская академия наук

(

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УЖ 571:591

. РЕШЕТНЯК Елена Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ОСОБЕННОСТЕЙ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНА КГ51

Специальность 03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992 год

Работа выполнена в лабораториях биосинтеза нуклеиновых

кислот Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта

зав.лаоораториея академик РАН Г.П.Георгиев, и в лаборатории л •

молекулярной генетики рака Института биологии гена,

зав. лабораторией академик РАЕН Е.М.Луканидин

Научные руководители - доктор биологических наук,

академик РАЕН Е.М.Луканидин кандидат биологических наук Тул^чинския Е.М. Официальные оппоненты - доктор биологических наук

А.Д.Альтштейн доктор биологических наук А.В.Иткес

Ведущая организация - Институт биоорганической химии • им.М.М.Шемякина

Зашита состоится 1992г. в /Л часов на

заседании Специализированного Совета Д 002.79.01 при Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва, ул.Вавилова, 32. ^

Автореферат разослан 2г.

С диссертацией моаио ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им. в.А.Энгельгардта РАН,

Ученый секретарь /; /' ¿.С/

Специализированного совета / А.М.Крицин

канд.хим.наук ^

_4К1УЗЛьндс1ь_ЛЕОблему_.

При сравнительном изучении двух генетически близких линий, • <меносаркомы КСМЛ-0 и К.СМЛ-100[ Ebralldze, 1969 ) .обладаоидох разним метастатический потенциалом, в нашей лаборатории была клонирована кДНК транскрипта гена mtsl мыши 1 Tulchlnskl,1990 ). Выяснилось,что активно транскрибирующийся в клетках метастазируюших опухолей ген mtsl кодирует кальцийсвяэываюиш белок,который, исходя из его

I

аминокислотной последовательности, относится к 5100 семейству малых кальцийсвяэывающих белков ¡Kllgraan, 1935 1.

Интересно отметить, что при неопластическоп трансформации-часто наблюдаются изменения во внутриклеточном . содержании различных кальцийсвязывайщих белков. Так, например, продукция белка s100 увеличивается при злокачественной трансформации меланоцитов iHarks,1990 I, хотя в норме присутствует в астроглиальных клетках центральной нервной системы и клетках Шванна.в клетках периферической нервной системы,а также в низких концентрациях во множестве других тканей , включая жировую ткань, семенники, кожу. Калыдийсвязываюшия белок онкомодулин определяется первоначально в значительных количествах только в клетках гепатомы, в то время как в клетках нормальной печени обнаружен не оыл.При этом было показано, что регуляция экспрессии гена онкомодулина осуществляется- на уровне транскрипции (Gllien,1987 !. Отмечено такай увеличение содержания кальмодулина при трансформации фибробластов грызунов вирусами RSV и SV40 [ Chatouleas ,1991 !.

Таким образом, повышение уровня экспрессии кальциясвязываюших' белков может быть достаточно широко распространенный признаком неопластической трансформации клетки. Кроме того, согласно данный, полученным в нашей лаборатории (Григорян М.С..19В9), высокий

уровень транскрипции гена пЛб1 может коррелировать с такой фенотипическои .особенность» опухоли, как ее способность

метастазировать. «

&

В связи с вышеизложенным, изучение структуры и осооенностея регуляции гена шгв1 представляет собой актуальную задачу. Шаь_и_задачи_исслей0ванияЛ

Основная цель настоящей работы состояла в определении структурной организации гена человека 1шшЛ81, сравнениии и исследовании промоторных областей генов плв1 мыши и человека.

Экспериментальные задачи . исследования • заключались в следуошем:

, 1. Получение геномного клона, содержащего ген Штиля 1, гомологичный агв1".

2. Определение экзон-интроннои структуры гена ШшЛб1.

3. Сравнительный анализ стру.сгурноя организации генов mtsl и

4. Структурно-функциональный анализ промоторноя области гена тгё1, изучение особенностей регуляции экспрессии этого гена.

В настоящей работе был впервые получен клон А44, содержащий геномную копию гена шпиле 1. Была определена нуклеотидная последовательность этого гена. Выяснилось, что ген Ьшпиге1 весьма консервативен в эволюции млекопитающих.

Получен ряд данных, относительно механизмов регуляции транскрипции гена пЛЕ1. Так, впервые Оыло показано, что метилирование ЛИК является важным механизмом регуляции экспрессии этого гена.

Следует отметить, что образование метастазов, удаленных от первичной опухоли, является основной причиной смерти онкологических Сольных IНаг1г1069 1. Ранее в нашей лаборатории было

обнаружено,что повышенный уровень экспрессии гена игз1 коррелирует с развитием метастатического фенотипа опухолей. Практическое значение настоящей работы определяется возможностью использования этого ■ феномена для диагностики и прогноза в онкологической, практике. При такого рода использовании гена пЛб! необходимо знание структурных особенностей человеческого гомолога этого гена.Изучение особенностей регуляции генов, так или иначе вовлеченных в, формирование метастатического фенотипа опухолей, практически важно, так как позволяет пролить свет на те или иные особенности этого процесса.

Материалы диссертации были представлены на 1У Всесоюзной иколе-семинаре молодых ученых "Перспективные направления и новые методы в молекулярной биологии" ( г .Рига,1990г. ).

Публикации..

По материала« диссертации опубликоване £~ печатных работ работЛ принята в печать.

25ьеи_и_С1руктуЕа_йиссертации, Работа изложена на страницах машинописного текста. Она

включает : введение, обзор литературы, экспериментальную часть, обсуждение результатов, пыволы и список цитированной литературы (всего -/XВ названий) Диссертация содержит рисунков,

пометенных в тексте.

СОДЕРЖАНИЕ__ЕАбОТЫ^.

Ранее, с помошью дифференциального скрининга кДНК библиотек, полученных из линии клеток КСМЛ-0 и КСМЛ-ЮО 1Е&га1Шге,1959 ] била клонирована кДНК-копия гена гаги1 мыта (плаэиида р27п. Била продемонстрирована специфичность экспрессии клонированной

последовательности в клетках метастазирующих опухолей различной природы.

Для конструирования геномной библиотеки в векторе ЕМВ1.-4 нами

был клонирован неполный гидролизат рестриктаэоя ЗаиЗА ДНК,

выделенной из селезенки человека, больного лимфогрануломатозом.

После упаковки материала в фаговые частицы и высева на чашки нами

было получено около 10® рекоыбинантных фаговых клонов. Б

результате скрининга амплифицированного банка с помощью меченого 32 '

сгР-5'-концевого Есой1-фрагмента плазмиды р271 мы обнаружили 5 одинаковых клонов, имеющих встцвку приблизительно \6 тысяч пар нуклеотидов 1т.л.н.). Отобранный клон, который мы обозначили \44, , был затем подробно изучен. Рестриктная карта клона Л44 представлена на рис.1.

ЕВ X Е В Н

_.^жХ-______

1гмь <Dr.au-

Рис.1. Рестриктная карта вставки клона Л44. На рисунке обозначены следующие рестрикгазы: Е-ЕсоШ, ¡5-За1С1, Х-ХЬа1, В-НавНГ, Н-ШпсШ I, Ве-Вд;1П;--ЁМВ1-4.

Гидролиз вставки клона Л44 рестриктаэой BaoHI приводит к образованно двух фрагментов размерами 5.7 и 10 т.п.н., меньший из которых гибридизуется со вставкой плазмиды р271. Этйт 5.7 т.п.н.^ Фрагмент был далее переклонирован в плазмидный вектор pUC19, в результате чего получили субклон р49.

Нуклеотиднуо последовательность гена hummtsl определяли по методу Сэнгера (Sanger, 1977 1. Для получения.субклонов, удобных для чтения последовательности, использовали нуклеазу Ва131.

I

Стратегия секвенирования представлена на рис.2.

Нами была определена нуклеотидная последовательность 2.7

<

т.п.н. EcoRI-фрагмента плазмиды р49, а также области в 340 п.и.,' прилегающей к ЕсоВ1-участку с 3*-конца. Таким образом, суммарный размер определенной нуклеотидной последовательности оказалйя равным 30 40 п.н.Участки узнавания рестриктазоя PstI имеют координаты-576, +509, +599 и +1546 п.н, относительно старта транскрипции гена. Лятья PstI саят картируется в составе плазмиды р49 на расстоянии приблизительно 2т.п.н. от сайта с координатой +1546. Таким образом, рестриктная карта плазмиды р49 соответствует данным гибридизации Pstl-гидролизата геномной ДНК человека с mtsl-специфическоя пробой (размеры выявляемых фрагментов приблизительно 1т.п.н. и 2т.п.н., Ebralldze,l9e9I,

Границы экаонов гена hummtsl определяли на основании их гомологии с последовательностями экэоров гена ratsl мыши, учитывая соответствия границ последовательностея интронов усредненной последовательности донорных и акцепторных участков сплайсинга (Kozak, 1984 I. Исходя из этих критериев, три экзона hummtsl имеют следующие координаты:+1+54,+994+1149 и +1872+2034п.н. Первый экзон кодирует часть 5' -нетранслируемой области мРНК, тогда как второй экзон содержит участок инициации трансляции. Третий экзон включает

• ^ - ■ «т™ . . г, . * _^ * * * У *

рН4

■ Рнг

рН6

-^—р"11

-

——

Рис.2. Стратегия секвенирования части вставки плаэмиды р49, содержащей 1штпЛ81. На рисунке приведена рестриктная карта секвенированноя части вставки плаэмиды р49. Стрелками обозначены границы субклонов, полученных с помощь» нуклеазы Ва101, и "использованных для секвенирования. Названия субклонов даны в йравой частирисунка. В верхней части приводится шкала координат, в которой нулевой координате соответствуеи старт транскрипции гена, еэ ~ экзоны гена йиттге! .Р-РвП .З-ЗрМ ,Н-Н1пГ1,А-Зас1, ■ Х-ХЪоХ,М-Хта1,В-ХЬа1.Е-ЕсоИ!.

в своп состав терминирушия кодон TGA. 3' -нетранслируемыя радон

содержит сигнал полиаденилирования 5'-ААТААА-3',а в 2в-ми п.н"нижэ

по течению" от этой сигнальной последовательности расположен.

GT-богатый район, ответстветшя за формирование 3' -конца мРНК,

(Kozak,1984 ), Экзоны разделены интронаки следующей длины: 1й -

929н. и 2й - 722н.Донорные последовательности сплайсинга для

первого интрона (TTG/GTGAGT) и второго интрона (GGG/GTGAGT) ииеот

tío 7л.н. из 9,идентичных консэнсусной донорноя последовательности

i

зплаясинга, описанной (Mount,198e). Акцепторные последовательности :плаясинга CAG/A содержат пиримидин-богатые участки в 17п.н. для 1ервого интрона и в 14п.н. для второго интрона. Эти' юлипнримидиновые мотивы вовлечены в образование сллапсосок.

Гены mtsl мыши и человека весьма сходны по своей структурной рганизации.Оба гомолога содержат две открытые раыкн считывания, оотиетствутиие 33 и 101 аминокислотным остаткам. Причеи.рамка читывания для 39 аминокислот является нефункциональной.Кодирующие оследовательиости прерываются ыежду 47 и 49 трипл«таыи зследовательиостыо второго интрона. При сравнении аминокислотных эследователъностея генов otsl мыши и человека ген hunititsl 5нарумщает 7 аминокислотных замен,как показано на рис.3. Эти шены приходятся на За, 7я, 12П, 32й, 59й, 92п, и 96и триплеты. >и этом Зя и 7ая, 92ая и 9бая замены соответствуют линкерноп !ласти, 12ая и 59ая - a-спирали, а 32ая - петле, непосредственно !Полняющей функцис связывания Са2*(рис.3).

ЛИНКЕР а-СПИРАЛЬ ПЕТЛЯ а-СПИРАЛЬ ЛИНКЕР

ИМТ31 . МАеРГЕ^АЬВУ ¡УЗТГНКУ 3 ОСЕСШ ? К1Ж1Е ЬКЕИТЙЕ ЬРЗРЮ47 НиМНТЗ! МАСР1ЕКАИ)У |«ЗТРШ Э СЖЕЯСК р КШКЗЕ 1КЕИ.ТНЕ ^РЬС47

ЛИНКЕР в-СПИРЛЛЬ ПЕТЛЯ а-СПИРАЛЬ

ММТ31 4вШ0ЕАА Г0К?КЗМ1 ОЗМШЕУОРОЕ УСУП.ЗС1 никяз! 4ЭКЯТОЕАЛ РОК^КЭШ. 1Ш1!ДОЕУ1>Р13Е УСУР13С1 ЛИНКЕР

ММГ31 АММСМЕРГЕСдР1)К5РЙКК101 нижгз! АМИСНЕГРЕСЕРВКЭРВКК101

. Рис.3.Гомология аминокислотных последовательностей в открытых раык&х считывания генов вшАб! и 1шшвгв1.

Анализ нуклеотидной последовательности генов мыши и

человека выявил область высокой гомологии между их промоторными районами, которая прослеживается на протяжении 129 нуклеотидов от старта транскрипции, а затем исчезает. Это хорошо видно на рис.4. 5'-фланкирующая промоторная область йиштгв ) содержит последовательность 5'-ТАТАААТ-Э'с координатами от -30 до -24 п.к., соответствующую консенсусной последовательности ТАТА-бокса Последовательность 5'-СААТ-3' в 5'-фланкирующей области гена отсутствует. На расстоянии 24л.н.от 3'-конца ТАТА-бокса в ПиштгБ1 располагается. ТС-богатая последовательность .которая соответствует первому зкзону. В мышином гене п£б1 также имеется в этом районе ТС-богатая последовательность, хотя и отличающаяся по своем1 нуклеотидному составу.

ю

гссаисис1да8аассисаддссас»с1дссассси»с1сса1са1ддссисид -518 дсаеадссааадсадШсдааскадддсиааагдаЧссигд^еадсМс^да (-531)

дШадсс1сс1ас»са1асс1дддд1дд1:ссаадд1ссси1........-.....— -473

сидс1дддасис1ддс^асадса1дсд(дсссадаааиаа1шаааааидии (-471)

.............дас«дса1дссШаис1дд1сиссгдаид1дасаадаадс»1 -426

!:: : :::::: :: ::: * ::: 1сси1иаидадасадаад1сиии1дидсс1гддс1дд1сидаас1сс*---- (-415)

т»дде1ддадддаад1дс1даеа«д1ессас1ддс1дддд1сасе1ссисдиссЛ -366 „«

::: :: :: : : : ¡:: : : и:::: : ----ддссиадсдиссгсссаШсссссс^адсии^д^ассас---------- (-359)

дддссаса1атссадддсадс1ссиаиссидссса1агса1;с1с'са1с1сс1.и -307 --------'»аиисадддсаа<хиссасс1д1сасссассассссс1дса1еиси1 (-318)

сс-------------------1:а>.ддсссасасс1са1д1ссгдзидсссдис1 -270

:: :;: :::! ! :: :

сс18м1сссса1дддасгас1ссс1д1ссссса,дс1ссаддсасаддсГдссссИсс (-258)

I .. *.

пааадсПссЛ ааасисиосгпадаогддсгпсиддгоотссассссаисаад -210

: :: :! :« л:::::; ::::::

1ссасси1с1аа»£Ма-дда$4дс1а1д1аса1д-дд1ддЦсссаи1саисад1 (-200)

-150

: г и : :::

ессадаад1а>сс9с1адддсиасесдиассаддгдсдасЬдддаасададдМдд (-140)

I .

\ ' .

ддаадсаада1£&£ада£1Ш£1аз1едаддд1дега1дасатас1аса1саасса -90 3 ::: ::::::::: :: ::: ::: на; :: ............саддс1дддс(дд1ддаддд1дс1д1ддса1-иссдсаиадссс (-92)

асадсаададсасад1а1еса1диссссс«ЛсасЧдс-а1дддсадддсс1ддсаддд -31

:::::: :: :::::!:: ::::; ::: пи :::;::!::I::;::: :::

асадсаддаад9сад1а1ссдс1с1сссс1д1ссесгдс1а1дддсадддссгддс1ддд (-32) '111Шга99*сада«дидддсгс1сс<;С +1 (И)

»•»•••• м «•••• •«»*» •«••«

•»«••«•»• »••«• ? « « « « •*«•«

9ШШ4а9-^саз>сс1с1ддзссд1ссссА (И)

Рис.4. Сравнение 5'-фланкируютих областей геноз вгз1 цыии и человека.

С помошьо компьвтерного анализа в составе 5'-фланкирующего

района гена mtsl идентифицировали последовательности, гомологичные

участкам знхансера вирусЬ SV40 и промотора гена протромбина о

человека. Интересно, что эти известные последовательности расположены внутри области высокой гомологии между генами mtsl мыши и человека. Можно предположить, что консервативный характер этих районов ДНК связан с их участием в регуляции транскрипции гена tctsl.

Для выявления участков связывания регуляторных белков в области "выше по течение" от . старта транскрипции гена mtsl, проводились эксперименты по торможение фрагментов ДНК в геле. При использовании HlndlII-HaelII рестрикционного фрагмента (его концы имеют координаты -130 И -41п.н. относительно старта транскрипции! и ядерных экстрактов из клеток линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 были обнаружены два мажорных (С1 и С2) и два" минорных 1С1а и С1в ¡комплекса (рис.5а1. Несмотря на то, что транскрипция гена mtsl наблюдается в клетках линии KCMJK100, а в клетках линии КСМЛ-0 - нет, ыы обнаруживали приблизительно одинаковую картину торможения вне зависимости от того, какуо из этих клеточных линий использовали в качестве источника для получения ядерных экстрактов (рис.5а).

PC3CI

KCtiA

О 400

сг

Га)

cu f ci cuca

• « •

-90

»-в

iili

-70

41

♦•я

-120

«вв

в!)

•п j

Г

0?.

Рис ,5а.Торможение в геле HlndIII-HaeIII-рестриктного фрагмента ДНК. Использовали ядерные экстракты из клеток линия КСМЛ-0 и КСМЛ-100.

Рис.Ьб.Эксперимент по интерференции ыетилирования с использование)! кодирующей (справа) и некодируощей (слева) цепей HlndIII-HaeIII-рестрикционного фрагмента ДНК.Черными кружкеш» обозначены гуанидиновые остатки, участвующие в образовании комплекса С2, пустыми кружаии - остатки, участвующие в образовании комплексов С1, С1а и С1б,

в

Лля точного определения нуклеотидных последовательностей, участвующих в формировании С1, С2, С1а и С1б комплексов, нами были проведены эксперименты по« интерференции метилирования В этих ошгАх. .использовалась , кодирующая и некодируюшая цепи HlndlII-HaelII фрагмента плазмиды рХ-130САТ (схемы конструирования всех полученных плазмид представлены на рис. 6а ). Как видно из рис.56 гуанидиновые остатки, участвующие в формировании

С1 комплекса расположены между -Пйп.н. и -Юбп.н. Комплекс С2 образуется.в результате взаимодействия ядерных белковых факторов с нуклеотидной последовательностью,, заключенной между -76 и -ббп.н.В формирование С1а и СЮ комплексов, видимо, вовлечена та же нуклеотидная последовательность, .что и образующая мажорный ДНК-белковый комплекс С1.

Для определения функциональной значимости различных участков 5'-фланкирующей области гена mtEl нами были получены 16 САТ-содержаших плазмид - Х-серия (рис.ба ). В качестве контроля использовались конструкции p+65CAT, р+261САТ, р+651САТ(рис.66). Клетки линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 трансфицировали всеми 16-ю конструкциями Х-серии. Данные представлены на рис,7а и 76.Для определения эффективности экспериментов по транэиторной трансфекиии использовалась плазмида pBgal.содержащая ген бактериальной 8-галактозидазы.

Уровни САТ-активности, детектируемые в экстрактах клеток, приблизительно одинаковы. При использовании в аналогичных экспериментах контрольных плазмид уровень САТ-активности экстрактов был соответственно в 13, 7 и 15 раз ниже, чем в случае Х-серии. Для того, чтобы исключить влияние на результат эксперимента функционирующих в искусственной системе промоторов, нами была сконструирована '/-серия плазмид (рис.бв ). Различные последовательности, располагавшиеся "выше по течению" гена mtsl,

i i

и в/вн

(Н) ВН/Е

»¿А

•Vм

И Р Р Р с

вн

Н В/ВН н I

| + Н Е (Ю ' ЕН/Е (.:...

н в/вн н

+

(М) ЕН/Е

-1....... рХ-4ШС»Г

| +5. +С. +К

(И) ВН/Е

ы-Т—

Е

(Н) РН/Е

--4—1-

(и) ен/Е

■г?

+ .......

(м) вид

=1......

"Л

..............--£=]

н

ЕИ=Н-Ц~

(ОН)

н н

I_I

(ВН) (М)

<М)

(0Н) 1

Рис .6а. Схема конструирования ' плазыид серии X. Н-Н1псШ1, ВН-ВатН1, Е-ЕсоИ, В-Вг1П, N-№01. 3-3а1«, С-Ва131, К- фрагмент; Кленова днк-полимеразы I, I- ДНК-лигаза. г . -ген САТ, полилинкер риС19, Щ - экзоны «Лв1 , —,--риС19.

н

н

Н (ВН) л (N) I

F р

pi(-пат

н А

S А

+ г, +S, +1)

(N)

+а. +3, +d hi,

fgfCAT

+р, +s, +d 4L

(n)

S/P

Г'

(n)

- ¡¡tiUCAT

s/fi

Рtic .63. Схема конструирования контрольных плазиид р+бЗСАТ,

Р+201САТ м р+651CAT. H-HlndIII. BH-BamHI, S-SphI, N-Ncol, A-SacI,

F- Hhel, D- ДНК-полинеразаVI ,P-PstI. I-1. -ген CAT, ш -

полилинкер pUC19, Ш экзоны mtsl,-----pUC19, (j-Af/«-/\nrd3A

«гага ТА

и u

s

ф Ф ■ <f»

H '

fS"1

* *

о

. -h

К

t- 1

>L B'3W VJ 41 N* i. C*' § ¡JJ •a.

r&w

I

I 4 4

U-.D--.il

I t

а

•а. f! М-

о

Ф c&

j

Dl -

Ш

i*

£®3 Fifel

Рис.бв. Схема конструирования плазмид серии У. H-HlndIII, F неплный гидролиз Mhel, f-Nhel, P-PstI, N-Ncol, E-EcoEI, X-Xbal,

D- T4 ДНК-полимераза, |-1 - ген CAT, jg - энхансер SV40,

СЕЭ " полилинкер pUC19, Щ - зкзоны mtsl.

А

I 2,3

В

о

I 2 3

Рис.7а.Сравнение САТ активностей, детектируемых в экстракта)

ьлеток КСМЛ-О, трансфицировашшх конструкциями :доро»а >

1-РХ-16Э7САТ, 2-рХ-41САТ, Э-вектор р(/£^САТ,не содеряавд! вЛб1-специфических последовательностей.

Рис.76. Тот же эксперимент, что и рис.7а, но трансфицировалис! клетки линии КСМЛ-100. •

были субклонированы в вектор pCAT^-enhaneerl "ProBega").B составе этого САТ-содержащего вектора клонирован энхансер вируса SV40, в то время , как эукариотический промотор этом векторе отсутствует. Все latsl -специфические фрагменты, клонированные нами в этот вектор, имели одинаковые 3'-концы - участок Nhel, находящийся на 5'-конце первого интрона и имевший координату +63 относительно старта транскрипции. Тем самым были элиминированы внутренние промоторы, клонированные в составе всех плаэмид Х-серии 5 '-концы клонированных .фрагментов имели координаты -1897, -266. -121, -7Э и -41 (см. рис.бвЬ Все конструкции Y-серии обладали приблизительно одинаковым уровнем проноторноя активности (рис.8К Мы обнаруживали некоторые различия в САТ-активмостях между экстрактами, однако, эти различия были невелики и имели невоспроизводимый характер.

Таким образом, небольшой, в 41 нуклеотид фрагмент области, фланкирующей ген jotsl с 5' -конца, обнаруживает максимальную промоторнус активность (конструкции рХ-41САТ и pY-41CATI.

Кроме того, интересным представляется также факт, что все конструкции Х-серии оказались способными экспрессировать ген CAT после трансакции, в клетки' КСМЛ-0 (рис. 9 ), в которых транскрипция гена mtsl Не обнаруживается. Этот феномен может объясняться гиперметилированирм ДНК в клетках этой линии.

о

•Т*1 (1) •' {Щ

г 3

о ^

© №

У

у- т

Рис.8.Сравнение САГ активностей, детектируемых в экстрактах клеток КСШ1-100, трансфицированных конструкциями Х-серии рХ~41САТ (дорожа II, р Х-121САТ (дорожка £ I и тремя контрольными 'конструкциями 3-р+еаСАТ, 4-р+2б1САТ, 5-р+б51САТ, 6-векториая плаэиида р^Я^САТ Се э вставки.

О -«*

о

о о

' » £

Рис.9. Сравнение CAT активностей, детектируемых а экстрактах клеток КСМЛ-100, трансфицированньх конструкциями Y-серии: 1-рУ—41САТ, 2-pY-75CAT,3-pY-121САТ, 4-рУ-26бСАТ, 5-рГ-1397САТ. '

Высокомолекулярная ДНК была выделена из клеток КСМЛ-0 и КСМЛ-100. Затем ДНК обрабатывали иэсшизомерами Mspl и Hpall, гибридизовали с меченым EcoRI-фрагментом р271. Для того, чтобы удостовериться в полноте рестрикции ДНК, фильтр повторно -ибридизовали с пробой. гомологичной второму экзону гена ;альциклина человека. Было■ показано, что , в отличие от гена :альциклина, ген mtsl гиперметилирован в клетках линии КСМЛ-0 рис.10 ). Для того, что(1ь определить, является ли метилирование ниверсальным механизмом, регулирующим транскрипцию гена mtsl, НК, выделенную из различных органов .мыши, подвергали описанному .

выше MspI-HpaII-тесту. Как видно из рис.11 , ген mtsl гипериетилирован в 'нормальных тканях мыши. В печени, почках и мозге, где транскрипция гена mtsl не детектируется (Григорян М.С., 1989 1, не удалось обнаружить и неметилированных последовательностей mtsl.

5Т.П.Н —

1т.п.й. _ '

(ХВтаи.—

I I I |

i Z i 4

(Л)

>4

Л

"I

■ ч

+4?

|l i » i г i

Рис. Юа.Блот-гибридизаиия ИгрГ-гидролизата ДНК (дорожки 1,31 и НраП-гидролиэата ДНК (дорожки 2,41 с аЛе1 -специфической пробой. ДНК выделяли из'клеток КСМЛ-0 (дорожки 1,2 1 и КСМЛ-100 (дорожки 3,41.

Рис .106.Повторная гибрйдизация этого же фильтра с. пробои кальциклина человека.

1 ¿34 ?<Т1$/С м 1111111111 I

и

л у, .1 ***

•Л

V» * -г

ы

г.»

а

т о

сэ

<г»

сз

С?'

с"»

111111111» ММ Н » М Н н н м н

с. 11. Блот-гиоридизация (йрШи НраПр?гидрслизатав ДНК из зличных органов мыши с ап^-специфической пробой.Дорожки 1,2 -К из мозга: дорожки 3,4 - ДНК из почек; 5,6 - ДНК из печени; 8 - ДНК из тимуса; 9,10 - ДНК из матки.

выводы

1. Проведено кло'нирование геномной копии человеческого гомолога

гена Btsl.

2. Определена нуклеотидная последовательность человеческого гена humuts1.

3. Б открытой рамке считывания hunmtsl обнаружены 7 аминокислотных аакен по сравнению с tsmtsl.

4. В промоторных районах генов nsptsl и liummtsl прослеживается область высокой гомологии на протяжении 129 нуклеотидов от старта транскрипции.

5. Максимальную активность промотора гена mints 1 в клетках линии К.СМЛ-100 обеспечивает последовательность размером с 41 нуклеотид "выше по течению" от старта транскрипции.

6. Гек atsl гиперметилирован в клетках тех органов мыши, где его экспрессия но обнаруживается. По всей видимости, метилирование ДНК является механизмом, обеспечивавшим негативную регуляции транскрипции гена mtsl в нормальных тканях.

СОДЕРЖАНКЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ

1.Решеткяк Е.Ю. .Тульчинский Е.М..Григорян М.С..Гураль Н.И.,Лукаиидин Е.Ы. Структурная организация генов mtsl, клонированных иэ геномов ыыш к человека. .Тезисы докладов 1У Всесоюзной ' школы-семинара ыолодых . ученых "Перспективные направления и • новые методы в молекулярной биологии", г.Рига,1990г.,с.41.

2.Grigorl&n H.Tulchlnskf Е..Ebraiidze A..Reshetnyak E.,Gural U. .Lukemldin E.Mtsl gatve is Involved in Eatastatic behavior of tutior. cells. In Sovlet-Gsraan <West-Europaan) Molecular Biology

Meet Ingf, Hons tanz, 1991 .

3.Tulchlnski E.,Ford K.,Kramerov D. .Reshetnyak £., Gr Igor lan M.,Zaln S.,Lukanldln E. Transcriptional analysis of the ntsl gsne with specific referense to 5' -flancing sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1992 , VBQ

4.Tulchinskl E..Kranerov D.,Ford H..Reshetnyak E..Lukanldin E.,Zaln S. Characterization of a positive regulatory element In ntsl gene. Oncogene } 1992 С In Pt-e?s),

5.Тульчинский E., Крамеров Д., Решетняк Е., Григорян И.,Гураль -1. .Луканидин Е. Структурный и- функциональный анализ проыоторноп области гена atsl. Генетика ,1992 , Т.28, ыЬ, с.¿2.-35", 5.Тульчинския Е..Крамеров Д., Решетняк Е., Григорян Е.,Гураль Н., 1уканидин Е. Позитивный регуляторнып элемент гена mtsl. Генетика 1932 , Т.2.6, C.lQ-iQ.