Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры и функции антисмысловых транскриптов генов AFAP1, ASCL1,MAP3K13 человека

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры и функции антисмысловых транскриптов генов AFAP1, ASCL1,MAP3K13 человека"

На правах рукописи

Марахонов Андрей Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ АНТИСМЫСЛОВЫХ ТРАНСКРИПТОВ ГЕНОВ АРАР1, АБСЫ, МАРЗК13 ЧЕЛОВЕКА

03.02.07 — генетика , _

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-2 ДЕК 2010

Москва — 2010

004615400

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

Скоблов Михаил Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

член-корр. РАМН, проф. Киселев Федор Львович

доктор биологических наук, доцент

Голденкова-Павлова Ирипа Васильевна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московский государственный

университет имени М. В. Ломоносова»

Защита состоится «Об» декабря 2010 г. в «'7 » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при МГНЦ РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478 Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан ноября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, . доктор медицинских наук, профессор ¿,

Р. А. Зинченко

Актуальность проблемы

Определение первичной последовательности генома человека в 2001 году проявило парадокс, заключающийся в отсутствии пропорционального увеличения количества генов с усложнением организации организмов. Только отчасти данный феномен можно объяснить увеличением разнообразия протеома за счет альтернативного процессинга мРНК и посттрансляционной модификации белков. В настоящее время общепринято, что возрастающая сложность связана с усложнением регуляции экспрессии генов, в частности, за счет некодирующих РНК. По современным оценкам, порядка 30 % белок-кодирующих генов имеют эндогенные, или природные, антисмысловые транскрипты (ПАТ). Своей последовательностью АТ частично или полностью комплементарны другим, как правило, кодирующим, транскриптам. Исследования, проведенные на различных организмах, позволяют предполагать, что ПАТы могут участвовать в обширном ряде регуляторных событий, таких как РНК-интерференция, альтернативный сплайсинг, ДНК метилирование, геномный импринтинг и другие. Однако, каждая из этих регуляторных моделей была исследована лишь в единичных экспериментальных работах, поэтому общая биологическая функция и регуляторный механизм ПАТов являются до сих пор неясными.

Известно, что в процессе неопластической трансформации происходит изменение в транскриптоме, с активацией одних и репрессией других транскриптов. Особый интерес представляют данные, подтверждающие вероятную связь между изменением экспрессии ПАТ и развитием онкологических заболеваний. Так, для смыслового транскрипта гена СЮЕВ кодирующего белок, способствующий апоптозу, увеличение доли антисмысловой РНК в опухолевой ткани негативно влияло на экспрессию этого потенциального противоопухолевого гена. Для полного понимания роли ПАТов в процессе развития опухолей необходим анализ большего количества примеров такого рода.

В последние годы было показано, что некоторые природные антисмысловые транскрипты играют важную роль в экспрессии смысловых генов, в том числе участвующих в патогенезе ряда социально-значимых заболеваний. Несмотря на частую встречаемость антисмысловых транскриптов, об их функции и механизмов действии известно пока немного. Так, до недавних пор считалось, что антисмысловые транскрипты должны подавлять экспрессию смысловых. Однако в последнее время появились работы, показывающие, что в некоторых случаях антисмысловые транскрипты стабилизируют смысловую РНК, тем самым, увеличивая уровень ее трансляции. На сегодняшний день не известно, в каких случаях реализуется негативный или позитивный механизм регуляции.

Таким образом, функциональная характеристика антисмысловых транскриптов является важной фундаментальной задачей. Цель и задачи исследования

Целью исследования явилось изучение антисмысловой регуляции генов АГАР!, МАРЗК13 и АБСИ человека, чьи антисмысловые транскрипты представлены на высоком уровне в опухолевых тканях

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. охарактеризовать функциональную роль смыслового транскрипта,

2. исследовать экзон-интронную структуру антисмысловых транскриптов,

3. изучить профиль экспрессии смыслового и антисмыслового транскриптов с количественной оценкой в нормальных и опухолевых тканях,

4. определить возможную роль антисмысловых транскриптов. Научная новизна полученных результатов

В работе впервые анализируется антисмысловая регуляция генов AFAP1, ASCL1 и MAP3K13 человека. В работе дано научное обоснование необходимости экспериментальной проверки результатов автоматического аннотирования и картирования экспрессирующихся последовательностей. Исследование дает возможность пересмотреть известные данные и проводит анализ нового механизма регуляции экспрессии изучаемых локусов в геноме человека. Практическая значимость результатов исследования

Практическая значимость исследования заключается, прежде всего, в том, что разработанные подходы могут являться основой для поиска диагностических маркеров некоторых заболеваний, в частности, онкологических. Положения, выносимые на защиту

1. Антисмысловой кластер транскриптов в локусе MAP3KI3 человека представляет собой молчащий псевдоген и является ошибкой картирования данного кластера антисмысловых РНК.

2. Локус гена ASCL1 человека содержит новый антисмысловой некодирующий транскрипт ASCL1AS.

3. Антисмысловой транскрипт в локусе гена AFAP1 человека представляет собой двухэкзонный некодирующий трансрипт антисмыслового кластера транскриптов гена AFAP1 человека. Установлена экзон-интронная структура антисмыслового транскрипта AFAP1AS. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.

4. Смысловой AFAP1 и антисмысловой AFAP1AS гены человека дифференциально экспрессированы в различных тканях.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были доложены на 3-й и 4-й Московских международных конференциях по молекулярной и компьютерной биологии МССМВ'07 и '09 (Москва, 2007 и 2009), на Конференции молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике, посвященной 120-летию Н. И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), на Европейской конференции по генетике человека ESHG-2008 (Барселона, Испания, 2008), на Съезде генетиков и селекционеров, посвященном 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), на VII Конференции по биохимии и молекулярной биологии им. Парнаса (Ялта, Украина, 2009). Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании Ученого совета МГНЦ РАМН 22 сентября 2010 г. Личный вклад автора в проведение исследования. Автором лично определены задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения, проведен биоинформатический анализ, выполнены молекулярно-генетические эксперименты, сделан анализ, обработка и обобщение полученных результатов, написание и оформление рукописи.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (2 статьи, 7 тезисов научных докладов), в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК МОН РФ.

Внедрение результатов работы. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных EntrezGene под номером GenelD 84740. Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из оглавления, введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения,

выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации изложен на _

страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 88 источников отечественных и иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали общедоступные программы пакета BLAST [Altschul S.F. et al., 1990].

При анализе EST использовали UniGene — экспериментальную систему автоматического подразделения последовательностей EST из GenBank на ген-ориентированные кластеры [Schuler G.D. 1997]. Каждый кластер UniGene содержит последовательности, которые представляют уникальный ген, а так же содержит информацию о тканевой принадлежности соответствующих EST.

В работе были использованы штаммы клеток Е. coli NM522, JM109, XLl-Blue. Штаммы Е. coli с плазмидами сохраняли при -70 °С в жидкой среде YT с криопротектором (30 % глицерин). Клетки Е. coli растили при температуре 37 °С в среде 2xYT.

Выделение плазмидной ДНК из Е. coli проводили методом щелочного лизиса [Lee S.Y., Rasheed S., 1990] с модификациями.

Электрофорез фрагментов ДНК проводили в присутствии 0,5 мкг/мл бромида этидия в горизонтальном 0,5—2 %-ном агарозном геле. В качестве электрофорезного буфера использовался 1* трис-ацетатный (ТАЕ) буфер.

Элюцию фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы проводили в соответствии с методикой [Wieslander А., 1979].

Рестрикцию, лигирование проводили в условиях рекомендованных производителем.

Для трасформации клеток Е. coli использовали методику с полиэгиленгликолем 3350 [Chung С.T. et al., 1989].

Выделение геномной ДНК из крови здоровых доноров производили по методу высаливания [Miller S.A. et al., 1988].

Выделение тотальной РНК из образцов нормальных и опухолевых тканей и линий клеток человека проводили фенол-хлороформной экстракцией [Chomczynski P., Sacchi N., 1987] с модификациями.

Для проведения реакции обратной транскрипции использовали систему ImProm-II™ Reverse Transcription System (Promega).

Праймеры для ПЦР подбирали с помощью программы OLIGO 4.0.

Реакционные смеси для проведения ПЦР готовили по стандартной схеме. В качестве флуоресцентной краски для ПЦР в реальном времени использовали интеркалирующий краситель >1 EvaGreen (Biotium, 1пс1)еакции проводили на приборе RotorGene3000 (CorpettResearch).

Относительную количественную оценку уровня экспрессии генов и статистический анализ данных проводили с использованием GED-формулы (gene expression's Ст difference) [Schefe J.H. et al., 2006] и программы LinRegPCR [Ramakers С. et al., 2003].

RACE-PCR. Реакционные смеси для проведения ПЦР готовили по стандартной схеме. В качестве основы для RACE-амплификации использовали протокол набора BD SMART™ RACE cDNA Amplification (Clontech).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование антисмысловой регуляции экспрессии гена MAP3K13 человека

Ранее в нашей лаборатории был проведен полногеномный поиск цис-антисмысловых кластеров транскриптов в геноме человека in silico, оценка профилей экспрессии смыслового и антисмыслового транскриптов каждой пары в различных тканях, и выявлен ряд пар, состоящих из смыслового и антисмыслового транскриптов, в которых антисмысловой транскрипт экспрессировался преимущественно в опухолях [Klimov D. et al., 2006]. Среди найденных кластеров антисмысловых транскриптов одним из интересных оказался кластер asLZK, который находится в первом интроне гена МАРЗК13ILZK, расположенного на хромосоме 3 в локусе q27 и состоящего из 454 экспрессирующихся нуклеотидных последовательностей (EST). Схема локуса генов MAP3KI3/LZK и asLZK приведена на рис. 1. В базе данных UniGene транскрипт asLZK описан под названием LOC647276. Проведённый анализ тканевого распределения клонотек кДНК показал, что только 60 из 186 (32,3 %) EST, принадлежащих гену MAP3K13ILZK, происходят из образцов первичных опухолей или опухолевых клеточных линий человека, в то время как транскрипту asLZK соответствует 376 опухолеспецифичных EST (82,7 %) и лишь 76 EST из нормальных тканей. Поскольку в базе данных dbEST только 43 % EST получены из образцов опухолевого происхождения, можно заключить, что asLZK преимущественно экспрессируется в опухолевых тканях.

EST А1ЛРЗК13: 186(32.39 EST получены из опухолей)

f-51 jt> «ж fr .115.1 " 1:30 i:is! s':

'"О——^—i—и—б—в—HI—ei Б 2—щ—j—j—л—-

{ asI-ZK \

\ _J

187 f 1460 SH) 1K4 I'll IJ'JISV III'/ 110 117 UK 7Я7 "iI IWi 46И

EST uiLZK: 454 (82.7% EST получены iij опугсолеЯ}

Рис. 1. Схема геномного локуса MAP3K13/LZK и asLZK. Некодирующие экзоны выделены серым. Кодирующие экзоны смыслового транскрипта LZK показаны черным. Цифры под экзонами и над интронами соответствуют их длине, измеренной в п.н.

1п яШсо анализ нуклеотидной последовательности аэЕ2К выявил девять локусов в геноме человека, сходных с аэГ^К. Эти локусы находятся в восьми разных хромосомах человека (табл. 1). Наиболее вероятно, что все найденные локусы, сходные с asLZK, представляют собой молчащие псевдогены гена RPL4, кодирующего рибосомный белок Ь4, и расположенного на хромосоме 15. Степень сходства asLZK с «родительским» транскриптом ЯРЬ4 составляет 98 %.

Таблица 1. Локусы генома человека, имеющие высокое сходство с RPL4 и asLZK

Расположение па хромосоме Название или ближайший аннотированный ген Сходство с ЛРЬ4, % Уровень экспрессии *

15q22 мРНК ЯРЬ4 100 (составил основу для выравнивания последовательностей) 7179 (68,6% опухолевых)

3q27 азИК (первый интрон ШРЗЮЗ/ИК) 98 454 (82,7% опухолевых)

9q24.1 ШС158345 95 Нет

lq24.1 ШС646688 93 Нет

lq24.1 ШС391135 92 Нет

14q 11.2 Интрон ТКАа (локус Т-клеточного рецептора а) 90 Нет

22ql3 Интрон МКЫ (мегакариобластный лейкоз(транслокация)1) 86 Нет

2q33.1 Интрон АЖ№44 85 + инверсия Нет

1 Op 12.31 Интрон гена СиЬШп (внутренний фактор рецептор Ви) 77 (254 п. н.) Нет

* Уровень экспрессии определяли путем анализа картированных EST.

Следующим этапом исследования стала проверка гепотезы о том, действительно ли локус asLZK транскрибируется в клетках человека или является молчащим псевдогеном. Как правило, функциональные элементы генома человека изучают с использованием высокопроизводительных экспериментальных систем [The ENCODE Project Consortium. 2004]. Однако первоначальное предсказание псевдогенов, которые составляют один из классов таких элементов, основано почти исключительно на компьютерном анализе [Zheng D. et al., 2007]. Зачастую псевдогены, картированные in silico, так и остаются функционально неподтвержденными. Некодирующие РНК, возникшие в результате ретропозиции, представляют собой своего рода переходную область между экспрессирующимися белоккодирующими генами и нетранскрибируемыми псевдогенами. Ошибки автоматической функциональной аннотации, в том числе ошибки секвенирования, неправильные и неоднозначные выравнивания, а также присутствие химерных и неверно кластеризованых EST приводят к появлению неверных аннотаций, которые копируются в базах данных из версии в версию [Wang J.P. et al., 2004; Lindlôf A., 2003]. Единственный способ устранить такие ошибки — экспериментальное изучение аннотированных последовательностей.

Для экспериментальной проверки были разработаны праймеры, способные специфично амплифицировать транскрипт asLZK. С этой целью было проведено множественное выравнивание нуклеотидных последовательностей мРНК гена RPL4, asLZK и остальных псевдогенов с использованием программы ClustalW 1.83 [Jeanmougm F. et al., 1998] (рис. 2). С помощтю внешней пары праймеров амплифицируется как кДНК гена RPL4, так и кДНК, которая может быть получена на матрице любого из его псевдогенов: RPL4-f, 5-CAGAGTAATTCCAGGGATGTT-3'; RPL4-r, 5'-CATGTCTAAAGGTCATCGTAT-3'. Внутренняя пара праймеров позволяет

провести локус-специфичную амплификацию аз12К. Специфичность отжига внутренней пары ПЦР праймеров была повышена путем введения в позицию, соседнюю с З'-положением каждого праймера, некомплементарные матрице нуклеотиды: ' 5-ТССТСАТТАТАОАТСАТССАТА-З'; аэЬгК-г, ' 5-

СТТССТС ААсттсстттесттт-з'.

5'-конец

ИР14 САейЕТЛАТТССАТССАТСи // ТССТСЛТТЛТЛСАТСАТОСАССССССС // ИЧЗА

ШС158345";л".:;:."0".ц....................д...... и

ачьгк..................... // ....................тл.....// -С- •

22ч 13----А......Т---А..... // --Т......0---С......Т,.т. .. ц .-те

ШСЗУП35..................... // ..................I-.......Т //

ШС646688 ..................... И ............................ /У

14-411.2 --Т.................. // .........С.........С--С----//

2ч33.1......с-С............ // .........С--ВСЛ........ТАТ- //

З'-конец

СТЛССАЛАЙСААСТТСЛСОДАС // АТАСвЛТЙАССТТТАП&САТв

шс 158345 -д.................... //

^ЬгК АА.................... // .....................

22Ч13 -С.......ДА........... // ---Т........С........

1.0С391Ш ...................... и ----Т..............Т--

ШС6-1Ш8 ..........А........... // 'Т.....Т...........

14Чи.2....................а- II ...........с.......е-

2Ч33.1 -С- • -а.............. " И----А................

Рис. 2. Множественное выравнивание локусов-паралогов гена ЯРЬ4 человека, и положение праймеров для ПЦР. Универсальные праймеры показаны пунктирной стрелкой. счЬХК-специфичные праймеры — сплошной стрелкой. Дополнительные нуклеотидные замены, введенные в прилегающие к 3'-концу позиции а^2/Г-специфичных праймеров, подчеркнуты.

С целью оптимизации локус-специфичной ПЦР, была разработана тестовая система на основе плазмид, полученных путем клонирования ПЦР-фрагментов локусов ЯРЬ4 и саЬгК в рвЕМ-Т-вектор (рвЕМ-аэЬгК и рвЕМ-Ш>14). Скрининг кДНК, полученной из образцов нормальных и опухолевых тканей человека не выявил а?1Ж-спсцифи'шого фрагмента (рис. За, б) при корректном прочтении контролей.

a i: J 456789 ¡0 M

12 3 4

а и

ПЦР с

универсальных ; ^ ираймеро» I

Ж

ПЦР с J

араймеров. 1

специфичных L К. к usLZK

* « -

■

П 1 2 3 4 5 6 7 .Vi - -- » -

Рис. 3. Результаты ПЦР-анализа ДНК образцов опухолей человека, а - Нормальная шейка матки, образец 1 (У); рак шейки матки, образец 1 (2); Нормальная шейка матки, образец 2 (3); рак шейки матки, образец 2 (4)', нормальная шейка матки, образец 3 (5); рак шейки матки, образец 3(6); рОЕМ-ЯРЬ4 (7); рОЕМ-азЬгК (5); геномная ДНК человека (9); отрицательный контроль (70); маркер молекулярных масс (А/). Контрольную ПЦР с праймерами на САРйН проводили на образцах нормальной шейки матки, рака шейки матки и отрицательного контроля. На нижней трети геля с контрольной ОАРОН-ПЦР отрицательному контролю соответствует дорожка 7, маркер молекулярных масс нанесен на дорожку 8. б- Рак матки (/); рак поджелудочной железы (2); почечноклеточный рак (3); рак яичника (4); рак прямой кишки (5); нормальный головной мозг (б); нормальная скелетная мышца (7); отрицательный контроль (5); маркер молекулярных масс (М). На данном геле отрицательному контролю соответствует дорожка 7. маркер молекулярных масс нанесен на дорожку 8.

Несмотря на то, что эти ткани представлены в базе данных EST как ткани с относительно высоким уровнем asLZK (табл. 2), ни в одной из них не обнаружено экспрессии asLZK. На основании полученных результатов было сделано заключение о том, что антисмысловой локус asLZK не экспрессируется в геноме человека, a EST, принадлежащие данному локусу, картированы неправильно вследствие ошибки аннотации.

Правильность данного заключения была подтверждена с помощью скрининга участка размером 1 т. п. н., расположенного непосредственно перед локусом asLZK, с использованием пяти различных алгоритмов, предсказывающих промоториые элементы. Три из пяти алгоритмов (McPromoter MM:II [Ohler U. et al., 2000], Promoter 2.0 [Knudsen S., 1999] и PROSCAN v.l.7 [Prestridge D.S. etal., 1995]) не обнаружили в изученной области никаких промоторных структур. Программный инструмент CorePromoter [Zhang M.Q., 1998] выдал относительно слабое предсказание для позиции-240 (score 0.746), а алгоритм NNPP 2.2 [Reese M.G., 2001] предсказал

промотор в позиции -180 (score 0.94).

Таблица 2. EST, полученные из нормальных и опухолевых тканей и аннотированные, как asLZK

Ткань Количество EST

Нормальная ткань Опухоль

Шейка матки 0 21

Тело матки 1 15

Поджелудочная железа 0 13

Почка 2 9

Яичник 2 8

Прямая кишка 2 15

Головной мозг 12 17

Скелетная мышца 4 14

Таким образом, попытки обнаружения промотора asLZK с помощью данных алгоритмов не увенчались успехом, показав противоречивые результаты или отсутствие таковых, в то время как контрольное предсказание промоторных элементов в районе, прилегающем к гену RPL4, достоверно указало на присутствие сайта инициации транскрипции (TSS) в области от -100 до 0: McPromoter MM:II предсказал позицию -8; CorePromoter указал ряд TSS, расположенных между-59 и -48; инструмент NNPP выделил позицию -13; Promoter 2.0 идентифицировал элемент в позиции-99. В дополнение к этому ка к Prosean 1.7, так и NNPP обнаружили дополнительный промотор-подобный элемент в положении от-600 до -400 относительно 5' конца гена RPL4.

Наиболее правдоподобно объяснение, согласно которому asLZK представляет собой молчащий процессированный псевдоген гена RPL4. Анализ последовательностей, фланкирующих локус asLZK, позволил выявить дуплицированный участок-мишень размером 9 п. н. (AAGAACATG; выделен рамкой на рис. Аа). Подобные дупликации часто сопутствуют ретропозиции [Weiner A.M. et al., 1986]. Однонуклеотидную замену (А —► G) в одном из дуплицированных участков можно объяснить мутацией, произошедшей после ретропозиции. Олиго(А)-участок в составе З'-концевой последовательности локуса asLZK/y/RPL4 также указывает на его происхождение от транскрипта, подвергнутого обратной транскрипции.

поли(Л)сиптл 1431

0.156

Геномный сайт пнссрции \yRPL4 0,02

2q33.1

0.039

0.012

0.076

0.033

~ LOC391135/1 q24.1 LOC64668K/lq24.1

0.020

RPL4 00-U,a.sLZK/3q27

0.028

0.059

0.096

LOC158345/9q24.1

- 14qll.2 _ 22q 13

Рис. 4. Структура участка ретропозиции в гене MAP3K13 (а) и филогенетическое дерево псевдогенов, сходных с RPL4, построенное с помощью метода объединения соседних пар (neighbor-joining method) (б). Нуклеотидная последовательность' 5 - и 3-концов встроенной мРНК RPL4 и фланкирующие ее участки генома указывают на факт ретропозиции. Дуплицированный участок встраивания обведен рамкой.

Филогенетическое древо сходных с RPL4 псевдогенов построено с помощью метода объединения соседних пар (neighbor-joining method) (рис. 46). Как видно из рис. 4, нуклеотидная последовательность asLZK наиболее сходна с исходным геном RPL4. Последовательности, родственные asLZKIfRPL4, найдены таюке в гене MAP3K13/LZK шимпанзе, в то время как геномы грызунов этого псевдогена не содержат. Следовательно, ретропозиция y/RPL4 в локус MAP3K13/LZK произошла уже после дивергенции предков грызунов и приматов. Несмотря на то, что ретропозиция произошла относительно недавно, в открытой рамке считывания asLZK уже возникли два стоп-кодона.

Таким образом, было показано, что asLZK не участвует в регуляции экспрессии гена MAP3K13, поскольку представляет собой молчащий псевдоген гена RPL4, возникший путем ретропозиции его мРНК в первый интрон гена MAP3K13.

2. Анализ антисмыслового кластера к гену-4.SCZJ.

Вторым среди найденных кластеров антисмысловых транскриптов был выбран кластер с геном ASCL1 (Achaete-Scute Complex-Like homolog 1 [Drosophila]). Анализ кДНК библиотек показал, что всего в смысловом кластере ASCLI было 306 транскриптов, 96 % из которых получены из опухолевых клонотек. Антисмысловой кластер содержал 144 транскрипта, из которых 74 % являются опухолевыми (рис. 5).

Notl

anti-ASCL1

ASCL1

Рис. 5. На рисунке показано расположение EST (зелёным) и мРНК (синим) на основной (справа) и комплементраной (слева) цепях генома человека в локусе гена ASCL1 человека.

Известно, что ASCL1 является членом содержащих домен bHLH (basic helix-loop-helix) семейства транскрипционных факторов, гомологичным Achaete-Scute комплексу дрозофилы [Ball D.W. et al., 1993]. Данный белок играет роль в нейрональном коммитировании и дифференцировке [Letinic К. et al., 2002; Kim E.J. et al., 2008]. Он высоко экспрессируется в различных опухолях: медуллярном раке щитовидной железы [Chen Н. et al., 2005], нейроэндокринных опухолях легкого [Osada Н. et al., 2008] и желудочно-кишечного тракта [Shida Т. et al., 2005], мелкоклеточном раке легкого [Jiang Т. et al., 2009], астроцитоме [Somasundaram К. et al., 2005] и др.

Однако детальный анализ антисмысловых транскриптов кластера ASCL1 показал, что большинство EST получены из библиотек созданных по одному следующему принципу. С выделенной мРНК ставили реакцию обратной транскрипции используя праймер олиго-dT на 5'-конце которого находился также сайт эндонуклеазы рестрикции Notl. Полученную кДНК переводят в двухцепочечную форму и лигируют к ней адаптеры содержащие сайт эндонуклеазы рестрикции EcoRl. Далее кДНК клонируется по сайтам Notl и ЕсоШ и осуществляют секвенирование клона с векторных праймеров, фланкирующих заклонированную ставку.

При анализе последовательности локуса ASCL1 был найден сайт рестрикции Notl (рис. 5) на границе З'-конца антисмыслового кластера. Была выдвинута гипотеза, что из-за специфики методики создания кДНК библиотеки и расположения сайта Not\ в локусе ASCLI, произошло неверное картирование части EST, принадлежащих смысловому кластеру.

Для проверки высказанной гипотезы была разработана система для количественной оценки экспрессии локуса ASCL1, чтобы определить существует ли антисмысловая транскрипция или нет. Для этого были подобраны три пары праймеров, последовательности которых указаны в Табл. 3. Первая и третья располагалась слева и справа от антисмылового кластера, вторая отжигалась в области перекрывания смыслового и антисмыслового кластеров и, таким образом, измеряла овокупный уровень экспрессии (рис. 6).

Табл. 3. Последовательности праймеров для амплификации локусов гена ASCL1.

Наименование праймера Последовательность праймера Размер ампликона, п. н.

ASCLl-lf 5'-GCGTGCAGGGAGGAGAAAA-3' 151

ASCLI-Ir 5'-AG AG AACTTGGGTGCAGG AA-3'

ASCLI -2f 5'-GCCCAAGCAAGTCAAGCGA-3' 81

ASCLI-2r 5'-CCAAAGCCGCTGAAGTTGA-3'

ASCLl-3f 5 '-GCTTTCTTGTCAGTGGCGTT-3' 197

ACSLl-3r 5'-CGTGAATGATTGGAGTGCAAA-3'

ASCL1-1r ASCL1-1f х

\л

V

ASCL1 -2f / ASCL1-2t

ORF Sense tran t

Antisense ASCL1

Рис. 6. Схема расположения праймеров в локусе ASCL1.

Рис. 7. Электорофорограмма продуктов ПЦР локусов в гене ASCL1.

Отработав условия прохождения ПЦР на геномной ДНК (Рис. 7), была поставлена количественная ОТ-ПЦР на панели 11 кДНК, полученных из нормальных и опухолевых тканей. Анализ данных показал, что в трёх тканях — мозге, легких и раке груди — присутствует экспрессия всех трех исследуемых локусов. При нормализации данных экспрессии в тканях на данные амплификации на матрице геномной ДНК была обнаружена разница в представленности амплификатов друг относительно друга (рис. 8).

мозг рак груди легкое

Ткани человека

Рис. 8. Представленность трех локусов ASCL1 в тканях: мозг, легкое и рак груди. За 100 % принят относительный уровень экспрессии гена домашнего хозяйства HPRT1.

Таким образом, видно, что антисмысловой кластер реально существует и дифференциально экспрессируется в тканях. Судя по тому что в одних тканях преобладает экспрессия антисмыслового транскрипта, и в то же время в других тканях преобладает экспрессия смысловго транскрипта, можно сказать, что в данном случае возможно реализуется негативная антисмысловая регуляция.

Для установления точных границ антисмыслового транскрипта ASCL1 были выравнены экспрессирующиеся последовательности EST на геноме и отобраныи самые удаленные друг относительно друга концы. Полученная последовательность составила 596 нуклеотидов.

Таким образом, последовательность антисмыслового транскрипта ASCL1AS представляет собой:

1 AGAACCAGTT GGTGAAGTCG AGAAGCTCCT GCTCCTCGGG GCTGAGCGGG TCGTAAGAGC

61 CCTCGTCCGA CGAGTAGGAT GAGACCGGCG AGCCGGCCAT GGAGTTCAAG TCGTTGGAGT

121 AGTTGGGGGA GATGGTGGGC GACAGGACGC CTGCCTGGAA GGCGGCGCTC ACCGCGTCAT

181 GCTCGTCCAG CAGCTGCTGC AGCGCGCGGA TGTACTCGAC CGCCGAGCGC AGTGTCTCCA

241 ССТТАСТСАТ CTTCTTGTTG GCCGCGCCGT TGGGGACGTG CTCCCGAAGG GTGGCAAAGC

301 CCAGGTTGAC CAACTTGACG CGGTTGCGCT CGCGCTCGTT GCGGCGCGCC ACGGCGGCCG

361 GCTGCTGCTG CGGCAGGCTG TAGCCAAAGC CGCTGAAGTT GAGCCGGCGT TTGCAGCGCA

421 TCAGTTCGGG CGAAGACGAG CGCTGTCGCT TGACTTGCTT GGGCGCTGAC TTGTGACCGC

481 CCCCTGAGGG CTGGCCGTCG GCCGCCGGTC TCAGCTGCGG CGCCTGCTGC TGCTGCTGCT

541 GCTGCTGCTG CTGCTGCTGC GCGCTCTGCG CTGCCGCTGC GGCGGCTGCG GCCGCC

Полученную последовательность ASCUAS была проанализирована на содержание открытых рамок считывания (ОРС). Было найдено 7 ОРС разной длинны, но ни одна из них не показала какой-либо гомологии с известными белками. В таких случаях, подобные транскрипты считаются некодирующими.

При проведении сравнительно-геномного анализа у млекопитающих не было обнаружено в ортологичных локусах антисмысловых транскриптов. Не смотря на то, что сам ген ASCL1 является высоко консервативным.

Из особенностей локуса стоит также отметить наличие протяженных CpG-островков, около 3,3 т. п. н. на смысловой цепи и 2,9 т. п. н. на антисмысловой цепи. Возможно, что метилирование данных CpG-островков оказывает влияние как на наблюдаемую редкую экспрессию в нормальных тканях, а также и в процессах озлокачествления.

Таким образом, было показано существование гена ASCL1AS, экспрессирующего антисмысловой некодирующий транскрипт, участвующий в негативной регуляции по отношению гена ASCL1.

3. Исследование антисмысловой регуляции экспрессии гена AFAP1 человека.

Третьим интересным случаем пар смысловой — антисмысловой транскрипт оказались транскрипты из локуса гена AFAP1. Ассоциированный с актиновыми филаментами белок AFAP1, имеющий молекулярную массу 110 кДа (а потому получивший известность под названием AFAP-110), был открыт в начале 1990-х как один из главных субстратов онкогенной тирозинкиназы v-Src [Kanner S.B. et al., 1990; Flynn D.C. et al., 1993]. Дальнейшие работы показали, что С-концевой актин-связывающий домен белка AFAP1 образует поперечные сшивки (cross-linking) между актиновыми филаментами [Qian Y. et al., 2000] и играет важную роль в их перестройках [Baisden J.M. et al., 2001а,б]. В зависимости от своей концентрации и статуса фосфорилирования AFAP1 собирает актиновые филаменты либо в рыхлую ячеистую структуру, либо в плотные пучки [Qian Y. et al., 2004]. Другие партнеры белка AFAP1 включают протеинкиназу С (РКС), способную фосфорилировать этот белок и значительно усиливать его способность к образованию актиновых сшивок [Qian Y. et al., 2002], онкогенную форму протеинкиназы Src [Guappone А.С. et al., 1997], белки, содержащие повтор WD40, например, рецептор активированной протеикиназы С (RACK1), а также фосфолипиды плазматической мембраны [Baisden J.M. et al., 20016]. Таким образом, AFAP1 функционирует как адаптерный белок, который отвечает за привлечение сигнальных молекул к специализированным сигнальным комплексам и/или внутриклеточным компартментам, изменяя локализацию и взаимодействие этих молекул, подвижность которых ограничена процессами формирования и разрушения актиновых структур.

Участие AFAP1 в канцерогенезе подтверждают следующие данные. Во-первых, экспрессия мутантного варианта AFAP1 с делецией домена лейциновой застежки в фибробластах приводит к появлению фенотипического сходства с клетками, трансформированными v-Src. Во-вторых, было показано, что AFAP1 играет важную роль в формировании специализированных актиновых структур, необходимых для миграции и инвазии злокачественных клеток, таких как подосомы, индуцируемые РКСа [Qian Y. et al., 2000; Gatesman A. et al., 2004]. В-третьих, AFAP1 обладает способностью активировать киназу Src, и эта способность регулируется его фосфорилированием протеинкиназой РКС [Baisden J.M. et al., 20016; Gatesman A. et al., 2004]. Как Src, так и РКС при аберрантной экспрессии или активации вызывают широкий спектр изменений во внутриклеточных путях передачи сигнала и влияют на процессы клеточной адгезии, миграции, пролиферации и апоптоза [O'Brian С.А., 1998; Summy J.M., Gallick G.E., 2003]. Пока не известно, влияют ли изменения экспрессии AFAPI, также приводящие к нарушению целостности акгинового цитоскелета и нарушению регуляции внутриклеточных сигнальных каскадов, на развитие опухолей и их метастазирование. Однако показано, что экспрессия гена AFAPI увеличена в клетках карциномы простаты и ускоряет ее прогрессию путем РКС-зависимой регуляции процесса образования фокальных контактов [Zhang J. et al., 2007]. Показано также, что полиморфный вариант AFAP1 избыточно экспрессирован совсестно с cSrc киназой в карциноме яичника [Clump D.A. et al., 2010].

Нами было проведено детальное биоинформатическое и экспериментальное исследование экспрессии гена AFAP1, а также антисмысловых транскриптов, перекрывающих некоторые экзоны этого гена.

1. Анализ локуса AFAP1 и tis-антисмыслового транскрипта

Ген AFAP1 расположен на хромосоме 4 в районе р16.1. Этот ген кодирует две изоформы белка. Основная изоформа, AFAP-110 (NP_940997), соответствует 17-экзоному транскрипту NM_198595 длиной 7534 нуклеотидов. Более длинная изоформа AFAP-120 (NP_001128119), также известная как 18-экзонный транскрипционный вариант «а» (NM_001134647, 7786 нуклеотидов), содержит удержанную интронную последовательность, описанную под названием NINS (novel insert) [Qian Y. et al., 1998].

Анализ нуклеотидной последовательности локуса AFAP1 выявил, чтб в 3 -области гена AFAP1 на противоположной цепи расположены 2 антисмысловых кластера EST. Дистальный по отношению к смысловому гену кластер имеет двухэкзонную структуру, при этом четкую'З -границу этого кластера определить не удается: все EST обрываются в разных точках и не содержат последовательностей полиА. Проксимальный кластер имеет один экзон, с четкс/й 3 -границей, при этом многие EST содержат полиА последовательности (Рисунок 9).

Рис. 9. На рисунке показано расположение EST (зелёным) и мРНК (синим) на основной (сверху) и комплементарной (снизу) цепях генома человека в локусе гена AFAPI человека.

При сравнении профиля экспрессии антисмысловых кластеров и смыслового гена AFAP1 было выявлено, что антисмысловые транскрипты более представлены в опухолеых образцах: из 54 антисмысловых транскриптов 89 % были получены на материале клонотек опухолевого происхождения, в то время как из 102 EST, соответствующих смысловому траснкрипту AFAP1, только 33 % были получены из опухолей. Zft/с-антисмысловые кластеры к гену AFAP1 имели схожие профили экспрессии.

2. Установление экзон-интронной структуры цис-антисмыслового транскрипта AFAP1.

Поскольку структура дистального кластера антисмысловых EST в локусе AFAP1 указывает на его незавершенность, было выдвинуто предположение о том, что проксимальный кластер является продолжением дистального, и, таким образом, эти два кластера представляют собой единую транскрипционную единицу, возможно,

содержащую (второй) интрон. Анализ с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров, фланкирующих этот гипотетический интрон, выявил образование одного ампликона, длина которого соответствует теоретически рассчитанной для безынтронного фрагмента (Рис. 10).

1 2 М 1 2

Ш0ШШ

'' "' ..... МмШщ^

ф- ¡ЦП genome myoma

Рис. 10. Электорофограмма агарозного геля продуктов ПЦР с геномной матрицы (слева) и с матрицы кДНК, полученной из миомы (справа). По краям геля нанесены отрицательные контроли.

Таким образом, два ранее описанных г/ис-антисмысловых кластера к гену AFAP1 были объединены в единый двухэкзонный транскрипт asAFAPl длиной 6,8 т. п. н. Область перекрывания между данными цис-антисмысловыми транскриптами и геном AFAP1 составляет 471 нуклеотидов и охватывает 3 экзона мРНК, кодирующей изоформу AFAP-110 (экзоны 14—16 в последовательности NR_026892) (рис. 11).

Antisensc ЛЕНЧ AS transcript

Рис. 11. Схема локуса AFAP1. Указаны экзон-интронная стурктура смыслового AFAP1 и антисмыслового AFAP1AS генов.

3. Установление границ антисмыслового транскрипта гена АРАР1

Для полной характеристики антисмысловго транскрипта необходимо было установить его границы. Известно, что многие транскрипты в клетках эукариот являются неполиаденилированными. Первоначально, последовательность антисмылового транскрипта была проанализирована на наличие сигналов полиаденилирования. Для этого примелялся онлайн алгоритм ро1уасЦ [ТаЬавка ТЕ.,

Zhang M.Q., 1999], который проводит поиск мажорных сигналов полиаденилирования ААТААА и АТТААА в геноме человека. В качестве анализируемой последовательности выступил фланкирующий антисмысловой кластер фрагмент геномной ДНК размером 30 т. п. н., имеющий геномные координаты 7,805К-7,835К на хромосоме 4, с отступлением от предполагаемых границ гена на 1,5 т. п. н. Результаты биоинформатического предсказания приведены в таблице 4.

Таблица 4. Результаты биоинформатического предсказания сигналов полиаденилирования на антисмысловой цепи локуса AFAP1.

Prediction Site Sequence Scorc

POS 3567 AATAAA 0.487088

POS 10793 AATAAA 0.518114

POS 21322 ATTAAA 0.211881

POS 22258 AATAAA 0.320038

POS 26535 AATAAA 0.457802

5 sites found out of 31 considered

Total sites found = 5

Total sites considered = 31

В результате проведенного биоинформатического анализа было предсказано 5 сигналов полиаденилирования, коллинеарных антисмысловому гену. Что интересно, все из найденных сайтов имели высокий балл при оценке алгоритмом.

Далее все пять потенциальных сайтов полиаденилирования были проанализированы по базе данных dbEST с целью выявления экспрессирующихся последовательностей, содержащих поли(А)-хвосты. Первые два сайта локализованы в последовательности интрона антисмыслового гена. Третий и четвертый сайты не имели подтверждения в виде экспрессирующихся последовательностей. Последний сайт имел явное подтверждение в виде нескольких EST, имеющих на своем" 3 -конце поли(А)-хвост (рис. 12). Таким образом, З'-граница гена была установлена с помощью биоинформатического анализа.

¿on Displayed ".tß LW-1.569 l>| "" RWlM

£¡¿£¡3 rdftnti!y=10№ 1.Й6Я0

polyA-сигнал

Рис. 12. На рисунке показаны стрелкой расположение предсказанного сигнала полиаденилирования и картированные на геноме экспрессирующиеся последовательности EST антисмыслового кластера AFAPIAS.

Для поиска 3 -границы гена была использована особенность конструирования библиотеки тотальной кДНК с использованием ImProm-II обратной транскриптазы, — SMART (Switching Mechanism at 5' End of RNA Template, механизм переключения на '5 -конце матрицы РНК) — нематричное добавление некоторыми обратными транскриптазами (в частности, ревертазой MMLV вируса лейкемии Молони мышей, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase) нескольких дезоксинуклеотидов (преимущественно, цитозийа) на 3 -конце вновь синтезированной цепи кДНК с последующей гибридизацией на них олигонуклеотида с комплементарными олиго-G нуклеотидами и «переключением» матрицы ревертазы с матрицы РНК на матрицу этого олигонуклеотида. Далее использование технологии RACE (rapid amplification of cDNA ends, RACE, быстрая амплификация концов кДНК) на матрице, подготовленной с использованием SMART синтеза, позволяет довольно специфично амплифицировать концы кДНК.

Были разработаны праймеры для проведения 5 -RACE амплификации антисмыслового транскрипта AFAP1 (рис. 13). Для контроля насыщения амплификата интересующими последовательностями были использован метод ПЦР с внутренними праймерами (nested PCR): 2F2 + 2R3 — 308 п. н. для первого раунда 5 -RACE и 2F2 + 2R6 — 201 п. н. на втором раунде.

2F2 2R6 2R3

3'

Рис. 13. Схема расположения праймеров для '5 -RACE антисмыслового транскрипта AFAP1.

В результате работы были подобраны оптимальные условия амплификации, и после второго раунда ПЦР был получен один фрагмент длиной 363 п. н., которая соответствовала теоретически рассчитанной (рис. 14).

ЯЩК

Рис. 14. Электорофограмма агарозного геля второго раунда 5'-КАСЕ ПЦР антисмыслового транскрипта АЕАР1АЗ.

Фрагмент был переамплифицирован и отсеквенирован. Анализ последовательности отсеквенированного фрагмента показал, что он представляет собой фрагмент последовательности повторяющегося элемента Е1МАЗ семейства Е1 класса длинных десперегированных повторов и имеет наибольшую гомологию с таким повтором, локализованным в предпоследнем интроне гена ОЗЕР По всей вероятности, наличие повтора в первом экзоне антисмыслового транскрипта значительно усложняет амплификацию 5 -конца гена, что привело к невозможности получить амплификат с него.

Анализ экспрессирующихся последовательностей в области потенциального начала антисмыслового гена позволяет предположить наличие нескольких сайтов инициации транскрипции, разнесенных на 35 п. о. (Рис. 15) По общепринятым правилам за 5'-конец был принят вариант с самым ранним стартом транскрипции.

22 Ha KHnJJXJ

Рис. 15. На рисунке показано расположение EST (зелёным) и мРНК (синим) 5'-конца антисмыслового кластера AFAPIAS человека.

Анализ полученой полной последовательности антисмыслового транскрипта показал, что она содержит несколько открытых рамок считывания. Максимальная рамка имеет длину 519 нуклеотидов. Но ни одна из однаруженных рабомк не имеет какой-либо значимой гомологии с последовательностями других белков зарегистрированных в базе данных SwissProt. На сегодняшний день принято считать такие транскрипты некодирующими. Также полногеномный анализ последовательности показала, что она уникальна, и не имеет паралогов.

Таким образом, полученная последовательность была приоритетно зарегистрирована в виде нового некодирующего гена AFAPIAS в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.

4. Анализ транс-антисмысловых взаимодействий с геном АРАР1А5.

Полученная последовательность гена АРАР1А5 была проанализирована на предмет способности некодирующиего транскрипта взаимодействовать с другими РНК-партнёрами.

Проведенный анализ показал, что последовательность АРАР1А5 содержит ряд повторяющихся элементов (Рис. 16). Так, первый экзон аяАРАР1 длиной 70 нуклеотидов расположен внутри ТНЕ1А ретроэлемента класса ЬТЯ семейства МаЬЯ. Более того, область аяАРАР1, расположенная 3 -дистальнее районов его

перекрывания с 15-м и 16-м экзонами AFAP1, содержит короткий дисперегированный повтор семейства AluJb.

; TVE 1А (LTTi/MoL-Э) (512 864)

M)Rm(S№MIR)(19Q30 IS? И) , MIRm (SINE/MIR) (18250 18302V /

■ AluJü (SINE/Mi) (21571 21775) ;-L2 [LINE/L2) (22107. 22257) / >Mifl(f,fNE/MtR|(222flS 22501) / ¡¡ .-(TG)n (23003 23043)

j1 ,.....12 (UNE/12) (24365 24533)

MIR (SINE/MIR) (24699 248681

I 4p16 1 (7806K-7832K)

'Ехол 1 (738 788) ¿ „ kb

RepeatMasker Web Server (www.repeatmasker.org)

position In query-

E«wi 2 (18632..25817) J

L SCOCft div del. InE.

query sequence

begin end

-position In repeat-c matching repeat (left) end begin

(left) ♦ repeat class/family begin end (left) id/graphic

± 548 8.0 1 . 5 0 .0 AFAP1AS 1 81 (6729) + ТНЕ1А LTR/ERVL-HaLR 203 292 (72) 1

206 21.7 4 , ,3 0. ,0 AFAP1AS 274 319 (6491) 4- L2 С LIKE/L2 3299 3346 (41) 2

± 1293 17.6 1 .5 0 .0 AFAP1AS 2810 3014 <3796) ♦ Allí Jb SINE/Alu 84 291 121) 3

i 307 29.7 1 , .9 0. .0 AFAP1AS 3406 3496 (3314} + L2a L:WE/L2 3280 3426 (0) 4

± 679 23.2 7, ,7 0, ,7 AFAP1AS 3534 3740 (3070) + MIR SIHE/MIR 32 262 16) 5

+ 243 14 . 6 0, ,0 0. .0 AFAP1AS 4242 4282 (2528) + (TO)n simple^repeat 2 42 (Ol 6

180 34.6 0 , .0 4 . . 9 AFAP1AS 5604 5688 (1122) + L2b LI HE /1.2 3133 3213 (162) ■?

± 423 28 .6 2, ,9 5. .4 AFAP1AS 5938 6107 (703) ♦ MIR SiaE/MlF 34 200 (68) 8

Рис. 16, Положение повторяющихся элементов в составе антисмыслового транскрипта к гену AFAP1.

Наличие нескольких повторяющихся элементов в составе последовательности антисмыслового транскрипта asAFAPl позволяет предположить его трансвзаимодействия с другими смысловыми и антисмысловыми транскриптами, составляющими сеть взаимодействующих и регулирующих друг друга транскриптов. Был проведён анализ антисмыслового транскрипта AFAP1AS с целью поиска транс-антисмысловых взаимодействий. Для этого была использована специально созданая база данных /иранс-антисмысловых транскриптов Trans-SAMap [Li J.Т. et al., 2008]. Поиск выявил несколько потенциальных партнёров транс-антисмысловых взаимодействий (табл. 5).

Таблица 5. Результаты биоинформатического предсказания тра//с-антисмысловых партнеров гена AFAP1AS.

Смысловой транскрипт Score Область гомологии в asAFAPl, локализация в повторе Область гомологии в целевом гене

MCFD2 110 3—71, LTR 853—921

96 12—70, LTR 2721—2779

ШС440570 83.6 1—58, LTR 1225—1282

NBPF family — 6 genes 105 Alu regions NFBP family — 6 genes i

RPL7L1 101 2848—2985, Alu 37—175

Помимо использования общедоступной базы данный антисмысловых транскриптов Trans-SAMap, был проведен собственный биоинформатический анализ с использованием пакета программ BLAST. При введении низкого порога поиска и отключив фильтры, игнорирующие повторы было обнаружено, что антисмысловой транскрипт AFAP1AS также перекрывается как минимум с 50 последовательностями других генов за счет повтора AluJb.

Известно, что LTR-повторы содержат промоторные элементы, способные в системах in vitro инициировать транскрипцию [Kovalskaya Е. et al., 2006]. Как минимум 50 % всех LTR-элементов служат функциональными промоторами для транскрипции уникальной геномной ДНК человека [Buzdin А. et al., 2006]. К тому же, LTR часто локализуются в геноме в ориентации, противоположной направлению транскрипции близлежащего гена. Однако в целом, корреляция между промоторной активностью LTR, расположенных в антисмысловой ориентации, и соседних генов отсутствует [Buzdin А. et al., 2006]. Одним из немногих описанных случаев, когда LTR-элементы приводят к образованию антисмысловой РНК, описан в [Gogvadze Е. et al., 2009]-. так, LTR в интроне генов IFTI72 (selective LIM binding factor, rat homolog) и SLC4A8 (sodium bicarbonate cotransporter) служат промоторами для антисмысловых транскриптов, перекрывающихся с экзоном. По всей видимости, подобная ситуация может иметь место и в данном случае.

5. Сравнительно геномный анализ гена AFAP1AS.

Сравнительный анализ локусов гена AFAP1 в геномах млекопитающих показал, что антисмысловой транскрипт asAFAPl является видоспецифичным для человека. При этом смысловые гены AFAPI обладают высокой степенью сходства и синтенией, хотя у мыши имеется только один 17-экзонный транскрипционный вариант мРНК, кодирующий изоформу AFAP-110.

6. Экспрессионный анализ локуса AFAP1 и с\5-антисмыслового транскрипта

Для сравнения профилей экспрессии была выбрана панель нормальных и

опухолевых тканей человека, а также ряд линий клеток человека. Результаты количественной оценки экспрессии приведены на рис. 17.

Рис. 17. Относительная представленность локусов AFAP1 в тканях человека в логарифмической шкале. За 100% принят относительный уровень экспрессии гена домашнего хозяйства HPRT1.

Как видно из представленной диаграммы, AFAP1AS является низкопредставленным транстриптом.

Нарушение пропорциональности экспрессии перекрывающихся кластеров транскриптов, по всей видимости, говорит о возможной позитивной регуляции смыслового гена AFAP1 с помощью антисмысловой транскрипционной единицы. Однако для подтверждения данного предположения требуется проведение дополнительных экспериментов.

ВЫВОДЫ

1. В локусе MAP3KI3 человека выявлены молчащий псевдоген и ошибка картирования данного кластера аптисмысловых РНК.

2. Экспериментально установлено существование нового некодирующего гена ASCL1AS и исследованы спектры его экспрессии в тканях человека.

3. Установлена экзон-интронная структура антисмыслового транскрипта AFAPIAS. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных Entrez Gene под номером GenelD 84740.

4. При исследовании тканевых спектров экспрессии смыслового гена AFAP1 и антисмыслового гена AFAPIAS человека можно сделать вывод о наличии позитивной регуляции.

Часть работы выполнена в рамках плановых работ МГНЦ РАМН по теме «Выявление пар антисмысловых транскриптов человека и изучение принципов их взаимной регуляции» (номер государственной регистрации №01200951485), гранта РФФИ № 07-04-00379-а «Антисмысловые РНК в опухолевых клетках человека» и Государственного контракта от 18.05.2009 г. № 02.512.12.2060 «Разработка эффективных способов доставки генетической информации в клетки-мишени in vivo для генотерапии социально значимых заболеваний».

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1) A. Marakhonov, A. Baranova, Т. Kazubskaya, S. Shigeev, М. Skoblov (2007) Antisense regulation of human gene MAP3K13: true phenomenon or artifact? Proceedings of the 3rd Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'07, pp. 197—199, Moscow, Russia, July 27—31 2007.

2) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2007) Study of antisense regulation of human gene MAP3K13, Abstract book of the Conference for Young Scientists, PhD Students and students on Molecular Biology and Genetics, dedicated to 120th anniversary of M. I. Vavilov, p. 77, Kyiv, Ukraine, September 20— 22, 2007.

3) A. V, Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Y. Skoblov (2008) Study of the antisense transcript to AFAP1 himan gene. European Human Genetics Conference 2008, Barcelona, Spain, May 31 — June 3, 2008 / European Journal of Human Genetics, Vol. 16 Supplement 2, May 2008, p. 395—396.

4) Марахонов А. В., Баранова А. В., Казубская Т. П., Шигеев С. В., Скоблов М. Ю. (2008) Анализ антисмыслового транскрипта к гену AFAP1 человека, IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов 11—15 мая 2008 года / Новосибирск: изд-во «Арта», 2008. — с. 267.

5) А. В. Марахонов, А. В. Баранова, М. Ю. Скоблов (2008) РНК-интерференция: фундаментальные и прикладные аспекты. // Медицинская генетика. 2008. Т. 7. № 10 (76). С. 44—56.

6) А. В. Марахонов, А. В. Баранова, М. Ю. Скоблов (2008) Антисмысловая регуляция экспрессии гена MAP3K13 человека: факт или артефакт? // Молекулярная биология. 2008. Т. 42. № 4. С. 581—587.

7) A. Marakhonov, A. Baranova, Т. Kazubskaya, S. Shigeev, М. Skoblov (2009) In search of antisense to AFAP1 human gene. The Ukrainian Biochemical Journal, Vol. 84, № 4 (special issue) p. 104 / VII Parnas Conference on Biochemistry and Molecular Biology, Yalta, Crimea, Ukraine, October 3—7,2009.

8) A. Marakhonov, A. Baranova, T. Kazubskaya, S. Shigeev, M. Skoblov (2009) In search of antisense to AFAP1 human gene. Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology MCCMB'09, pp. 229, Moscow, Russia, July 20—23 2009.

9) Марахонов А. В., Баранова А. В., Казубская Т. П., Шигеев С. В., Скоблов М. Ю. Изучение антисмысловой регуляции локуса AFAP1 человека. Материалы Съезда генетиков и селекционеров, посвященного 200-летию со дня рождения Чарльза Дарвина и V Съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров, Часть II, Москва, 21—28 июня 2009 г. / Изд-во РГАУ — МСХА им. К. А. Тимирязева, 2009, —Ч. II.—с. 379.

СИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПАТ — природный антисмысловой транскрипт;

мРНК — матричная РНК;

РЖ — рибонуклеиновая кислота;

кДНК — комплементарная ДНК;

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота;

ОТ-ПЦР —ПЦР, совмещенная с обратной транскрипцией;

ПЦР — полимеразная цепная реакция;

т. п. н. — тысяча пар нуклеотидов;

п. н. — пара нуклеотидов;

ОРС — открытая рамка считывания;

EST — expressed sequenced tag (экспрессиругощаяся последовательность); LTR — long terminal repeat (длинный концевой повтор).

Подписано в печать:

01.11.2010

Заказ № 4434 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Марахонов, Андрей Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Марахонов, Андрей Владимирович

5. ВЫВОДЫ

1. В локусе MAP3K13 человека выявлены молчащий псевдоген и ошибка картирования данного кластера антисмысловых РНК.

2. Экспериментально установлено существование нового некодирующего гена ASCL1AS и исследованы спектры его экспрессии в тканях человека.

3. Установлена экзон-интронная структура антисмыслового транскрипта AFAP1AS. Полученная последовательность AFAP1AS приоритетно зарегистрирована в базе данных Entrez Gene под номером GeneID 84740.

4. При исследовании тканевых спектров экспрессии смыслового гена AFAP1 и антисмыслового гена AFAP1AS человека можно сделать вывод о наличии позитивной регуляции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Марахонов, Андрей Владимирович, Москва

1. Alsheddi, Т., Vasin, L., Meduri, R., Randhawa, M., Glazko, G., Baranova, A. siRNAs with high specificity to the target: a systematic design by CRM algorithm//Mol Biol (Mosk). — 2008. — Vol. 42. —№ 1. —p. 163—171.

2. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool // J Mol Biol. — 1990. — Vol. 215. — № 3. — p. 403—410.

3. Annilo, Т., Kepp, K., Laan, M. Natural antisense transcript of natriuretic peptide precursor A (NPPA): structural organization and modulation of NPPA expression//BMC Mol Biol. — 2009. — Vol. 10. —p. 81.

4. Baisden, J. M., Qian, Y., Zot, H. M., Flynn, D. C. The actin filament-associated protein AFAP-110 is an adaptor protein that modulates changes in actin filament integrity // Oncogene. — 2001b. — Vol. 20. — № 44. — p. 6435—6447.

5. Barik, S. Treating respiratory viral diseases with chemically modified, second generation intranasal siRNAs // Methods Mol Biol. — 2009. — Vol. 487.p. 331—341.

6. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function // Cell. — 2004. — Vol. 116. — № 2. — p. 281—297.

7. Beiter, T., Reich, E., Williams, R. W., Simon, P. Antisense transcription: a critical look in both directions // Cell Mol Life Sei. — 2009. — Vol. 66. —№ 1. —p. 94—112.

8. Bernstein, E., Kim, S. Y., Carmell, M. A., Murchison, E. P., Alcorn, H., Li, M. Z., Mills, A. A., Elledge, S. J., Anderson, K. V., Hannon, G. J. Dicer is essential for mouse development // Nat Genet. — 2003. — Vol. 35. — № 3. — p. 215—217.

9. Bitko, V., Musiyenko, A., Shulyayeva, O., Barik, S. Inhibition of respiratory viruses by nasally administered siRNA // Nat Med. — 2005.—Vol. 11. —№1. —p. 50—55.

10. Brennecke, J., Hipfner, D. R., Stark, A., Russell, R. B., Cohen, S. M. bantam encodes a developmentally regulated microRNA that* controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid m Drosophila II Cell. — 2003.—Vol. 113.—№ 1.—p. 25—36.

11. Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells // Science. — 2002. — Vol. 296. — № 5567. — p. 550—553.

12. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats // Nucleic Acids Res. — 2006b. — Vol. 34. — № 9. — p. e67.

13. Caplen, N. J., Parrish, S., Imani, F., Eire, A., Morgan, R. A. Specific inhibition of gene expression by small double-stranded RNAs in invertebrate and*vertebrate systems // Proc Natl Acad Sci USA. — 2001. — Vol. 98. — № 17. — p. 9742—9747.

14. Chen, C. Z., Li, L., Lodish, H. F., Bartel, D. P. MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation // Science. — 2004. — Vol. 303. — № 5654.p. 83—86.

15. Chen, H., Kunnimalaiyaan, M., Van Gompel, J. J. Medullary thyroid cancer: the functions of raf-1 and human achaete-scute homologue-1 // Thyroid. — 2005. — Vol. 15. — № 6. — p. 511—521.

16. Chendrimada, T. P., Gregory, R. I., Kumaraswamy, E., Norman, J., Cooch, N., Nishikura, K., Shiekhattar, R. TRBP recruits the Dicer complex to Ago2 for microRNA processing and gene silencing // Nature. — 2005. — Vol. 436. — № 7051. — p. 740—744.

17. Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal Biochem. — 1987. —Vol. 162,—№ 1. —p. 156—159.

18. Chu, J., Dolnick, B. J. Natural antisense (rTSalpha) RNA induces site-specific cleavage of thymidylate synthase mRNA // Biochim Biophys Acta. — 2002. —Vol. 1587. —№2-3. —p. 183—193.

19. Chung, C. T., Niemela, S. L., Miller, R. H. One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution // Proc Natl Acad Sci USA.— 1989. — Vol. 86. — № 7. — p. 2172—2175.

20. Doench, J. G., Petersen, C. P., Sharp, P. A. siRNAs can function as miRNAs // Genes Dev. — 2003. — Vol. 17. — № 4. — p. 438—442.

21. Dohner, H., Stilgenbauer, S., Benner, A., Leupolt, E., Krober, A., Bullinger, L., Dohner, K., B'entz, M., Lichter, P. Genomic aberrations and survivalin chronic lymphocytic leukemia // N Engl J Med. — 2000: — Vol. 343. — № 26.p. 1910—1916.

22. Dong, J. T., Boyd, J. C., Frierson, H. F., Jr. Loss of heterozygosity at 13ql4 and 13q21 in high grade, high stage prostate cancer // Prostate. — 2001. — Vol. 49. —№3.—p. 166—171.

23. Eis, P. S., Tam, W., Sun, L., Chadburn, A., Li, Z., Gomez, M. F., Lund, E., Dahlberg, J. E. Accumulation of miR-155 and BIC RNA in human B cell lymphomas // Proc Natl Acad Sci USA. — 2005. — Vol. 102. — № 10. — p. 3627—3632.

24. Elbashir, S. M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature. — 2001a. — Vol. 411. — № 6836. — p. 494—498.

25. Elbashir, S. M., Lendeckel, W., Tuschl, T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. — 2001b. — Vol. 15. — №2. —p. 188—200.

26. ENCODE Project Consortium. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project // Science. — 2004. — Vol. 306. — № 5696. — p. 636— 640.

27. Faghihi, M. A., Modarresi, F., Khalil, A. M., Wood, D. E., Sahagan,

28. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. — 1998. — Vol. 391. — № 6669. — p. 806— 811.

29. Flynn, D. C., Leu, T. H., Reynolds, A. B., Parsons, J. T. Identification and sequence analysis of cDNAs encoding a 110-kilodalton actin filament-associated pp60src substrate // Mol Cell Biol. — 1993. — Vol. 13. — № 12. — p. 7892—7900.

30. Galvani, A., Sperling, L. RNA interference by feeding in Paramecium I I Trends Genet. — 2002. — Vol. 18. — № 1. — p. 11—12.

31. Gatesman, A., Walker, V. G., Baisden, J. M., Weed, S. A., Flynn, D.

32. C. Protein kinase Ca activates c-Src and induces podosome formation via AFAP-110 // Mol Cell Biol. — 2004. — Vol. 24. — № 17. — p. 7578—7597.

33. Gil, J., Esteban, M. Induction of apoptosis by the dsRNA-dependent protein kinase (PKR): mechanism of action // Apoptosis. — 2000. — Vol. 5. — № 2. —p. 107—114.

34. Gogvadze, E., Stukacheva, E., Buzdin, A., Sverdlov, E. Human-specific modulation of transcriptional activity provided by endogenous retroviral insertions // J Virol. — 2009. — Vol. 83. — № 12. — p. 6098—6105.

35. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics // Nucleic Acids Res. — 2008. — Vol. 36. — № Database issue: — p. D154—158.

36. Grinchuk, O. V., Jenjaroenpun, P., Orlov, Y. L., Zhou, J., Kuznetsov, V. A. Integrative analysis of the human c/s-antisense gene pairs, miRNAs and theirtranscription regulation patterns // Nucleic Acids Res. — 2010. — Vol. 38. — № 2. — p. 534—547.

37. Guappone, A. C., Flynn, D. C. The integrity of the SH3 binding motif of AFAP-110 is required to facilitate tyrosine phosphorylation by, and stable complex formation with, Src // Mol Cell Biochem. — 1997. — Vol. 175. — № 12. — p. 243—252.

38. Guo, S., Kemphues, K. J. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed // Cell. — 1995. — Vol. 81. — № 4. — p. 611—620.

39. Halligan, D. L., Keightley, P. D. Ubiquitous selective constraints in the Drosophila genome revealed by a genome-wide interspecies comparison // Genome Res. — 2006. — Vol. 16. — № 7. — p. 875—884.

40. Han, J., Lee, Y., Yeom, K. H., Kim, Y. K., Jin, H., Kim, V. N. The Drosha-DGCR8 complex in primary microRNA processing // Genes Dev. — 2004.

41. Vol. 18. —№24, —p. 3016—3027.

42. Harfe, B. D., McManus, M. T., Mansfield, J. H., Hornstein, E., Tabin, C. J. The RNaselll enzyme Dicer is required for morphogenesis but not patterning of the vertebrate limb // Proc Natl Acad Sci USA. — 2005. — Vol. 102. — № 31.p. 10898—10903.

43. Harris, K. S., Zhang, Z., McManus, M. T., Harfe, B. D., Sun, X. Dicer function is essential for lung epithelium morphogenesis // Proc Natl Acad Sci U S A. — 2006. — Vol. 103. — № 7. — p. 2208—2213.

44. He, Y., Vogelstein, B., Velculescu, V. E., Papadopoulos, N., Kinzler, K. W. The antisense transcriptomes of human cells // Science. — 2008. — Vol. 322. —№5909. —p. 1855—1857.

45. Humphreys, D. T., Westman, B. J., Martin, D. I., Preiss, T. MicroRNAs control translation initiation by inhibiting eukaryotic initiation factor 4E/cap and poly(A) tail function // Proc Natl Acad Sci USA. — 2005. — Vol. 102. —№47. —p. 16961—16966.

46. Hutvagner, G., Zamore, P. D. A microRNA in a multiple-turnover RNAi enzyme complex // Science. — 2002. — Vol. 297. — № 5589. — p. 2056— 2060.

47. Imamura, T., Yamamoto, S., Ohgane, J., Hattori, N., Tanaka, S., Shiota, K. Non-coding RNA directed DNA demethylation of Sphkl CpG island // Biochem Biophys Res Commun. — 2004. — Vol. 322. — № 2. — p. 593—600.

48. International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. — 2001. — Vol. 409. — №6822. —p. 860—921.

49. Janowski, B. A., Huffman, K. E., Schwartz, J. C., Ram, R., Nordsell, R., Shames, D. S., Minna, J. D., Corey, D. R. Involvement of AGOl and AG02 in mammalian transcriptional silencing // Nat Struct Mol Biol. — 2006. — Vol. 13.9. —p. 787—792.

50. Janowski, B. A., Younger, S. T., Hardy, D. B., Ram, R., Huffman, K. E., Corey, D. R. Activating gene expression in mammalian cells with promoter-targeted duplex RNAs // Nat Chem Biol. — 2007. — Vol. 3. — № 3. — p. 166— 173.

51. Jeanmougin, F., Thompson, J. D., Gouy, M., Higgins, D. G., Gibson, T. J. Multiple sequence alignment with Clustal X // Trends Biochem Sci. — 1998.

52. Vol. 23. — № 10. — p. 403—405.

53. Johnson, S. M;, Grosshans, Hi, Shingara, J., Byrom, M., Jarvis, R., Cheng, A., Labourier, E., Reinert, K. L., Brown, D., Slack, F. J. RAS is regulated by the let-7 microRNA family // Cell. — 2005. — Vol. 120: —№ 5. p. 635— 647.

54. Kanner, S. B., Reynolds, A. B., Vines, R. R., Parsons, J. T. Monoclonal antibodies to individual tyrosine-phosphorylated protein substrates of oncogene-encoded tyrosine kinases // Proc Natl Acad Sci USA. — 1990. — Vol. 87. — № 9. — p. 3328—3332.

55. Khvorova, A., Reynolds, A., Jayasena, S. D. Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias // Cell. — 2003. — Vol. 115. — № 2. — p. 209—216.

56. Kim, Y. K., Kim, Y. N. Processing of intronic microRNAs // EMBO J. — 2007. — Vol. 26. — № 3. — p. 775—783.

57. Kiriakidou, M., Nelson, P. T., Kouranov, A., Fitziev, P., Bouyioukos, C., Mourelatos, Z., Hatzigeorgiou, A. A combined computational-experimental approach predicts human microRNA targets // Genes Dev. — 2004. — Vol. 18. — № 10. —p. 1165—1178.

58. Kiriakidou, M., Tan, G. S., Lamprinaki, S., De Planell-Saguer, M., Nelson, P. T., Mourelatos, Z. An mRNA m7G cap binding-like motif within human Ago2 represses translation // Cell. — 2007. — Vol. 129. — № 6. — p. 1141—1151.

59. Klimov, D., Skoblov, M., Ryazantzev, A., Tyazhelova, T., Baranova, A. In silico search for natural antisense transcripts reveals their differential expression in human tumors // J Bioinform Comput Biol. — 2006. — Vol. 4. — № 2. —p. 515—521.

60. Knudsen, S. Promoter2.0: for the recognition of PolII promoter sequences // Bioinformatics. — 1999. — Vol. 15. — № 5. — p. 356—361.

61. Kovalskaya, E., Buzdin, A., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Sverdlov, E. Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions // Virology. — 2006. — Vol. 346. — № 2. — p. 373—378.

62. Kumar, M., Carmichael, G. G. Antisense RNA: function and fate of duplex RNA in cells of higher eukaryotes // Microbiol Mol Biol Rev. — 1998. — Vol. 62. — № 4. — p. 1415—1434.

63. Lapidot, M., Pilpel, Y. Genome-wide natural antisense transcription: coupling its regulation to its different regulatory mechanisms // EMBO Rep. — 2006. —Vol.7.—№ 12. —p. 1216—1222.

64. Lavorgna, G., Dahary, D., Lehner, B., Sorek, R., Sanderson, C. M., Casari, G. In search of antisense // Trends Biochem Sei. — 2004. — Vol. 29. — № 2.—p. 88—94.

65. Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14 // Cell. — 1993. — Vol. 75. — № 5. — p. 843—854.

66. Lee, S. Y., Rasheed, S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA // Biotechniques. — 1990. — Vol. 9. — № 6. — p. 676—679.

67. Lee, Y., Ahn, C., Han, J., Choi, H., Kim, J., Yim, J., Lee, J., Provost, P., Radmark, O., Kim, S., Kim, V. N. The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing // Nature. — 2003. — Vol. 425. — № 6956. — p. 415— 419.

68. Lee, Y., Hur, I., Park, S. Y., Kim, Y. K., Suh, M. R., Kim, V. N. The role of PACT in the RNA silencing pathway // EMBO J. — 2006. — Vol. 25. — № 3. — p. 522—532.

69. Letinic, K., Zoncu, R., Rakic, P. Origin of GABAergic neurons in the human neocortex // Nature. — 2002. — Vol. 417. — № 6889. — p. 645—649.

70. Leung, A. K., Sharp, P. A. microRNAs: a safeguard against turmoil? // Cell. —2007. —Vol. 130. —№4. —p. 581—585.

71. Lewis, B. P., Bürge, C. B., Bartel, D. P. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human genes are microRNA targets // Cell. — 2005. — Vol. 120. — № 1. — p. 15—20.

72. Li, J. T., Zhang, Y., Kong, L., Liu, Q. R., Wei, L. Trans-nataral antisense transcripts including noncoding RNAs in 10 species: implications for expression regulation // Nucleic Acids Res. — 2008. — Vol. 36. — № 15. — p. 4833—4844.

73. Li, L. C., Okino, S. T., Zhao, H., Pookot, D., Place, R. F., Urakami, S., Enokida, H., Dahiya, R. Small dsRNAs induce transcriptional activation in human cells // Proc Natl Acad Sci USA. — 2006. — Vol. 103. — № 46. — p. 17337—17342.

74. Lindlof, A. Gene identification through large-scale EST sequence processing // Appl Bioinformatics. — 2003. — Vol. 2. — № 3. — p. 123—129.

75. Liu, J., Carmell, M. A., Rivas, F. V., Marsden, C. G., Thomson, J. M., Song, J. J., Hammond, S. M., Joshua-Tor, L., Hannon, G. J. Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi // Science. — 2004. — Vol. 305. — № 5689. — p. 1437—1441.

76. Mahmoudi, S., Henriksson, S., Corcoran, M.,- Mendez-Vidal, C., Wiman, K. G., Farnebo, M. Wrap53, a natural p53 antisense transcript required for p53 induction upon DNA damage // Mol Cell. — 2009. — Vol. 33. — № 4. — p. 462—471.

77. Mattick, J. S., Makunin, I. V. Non-coding RNA // Hum Mol Genet. — 2006. —Vol. 15. —№SpecNo 1.—p.R17—29.

78. Matzke, M. A., Birchler, J. A. RNAi-mediated pathways in the nucleus // Nat Rev Genet. — 2005. — Vol. 6. — № 1. — p. 24—35.

79. Meister, G., Landthaler, M., Patkaniowska, A., Dorsett, Y., Teng, G., Tuschl, T. Human Argonaute2 mediates RNA cleavage targeted by miRNAs and siRNAs // Mol Cell. — 2004. — Vol. 15. — № 2. — p. 185—197.

80. Meister, G., Tuschl, T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA // Nature. — 2004. — Vol. 431. — № 7006. — p. 343—349.

81. Miller, S. A., Dykes, D. D., Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Res. — 1988. —Vol. 16. —№3. —p. 1215.

82. Mishra, P. J., Banerjee, D., Bertino, J. R. MiRSNPs or MiR-polymorphisms, new players in microRNA mediated regulation of the cell: Introducing microRNA pharmacogenomics // Cell Cycle. — 2008. — Vol. 7. — № 7. —p. 853—858.

83. Morris, K. V., Chan, S. W., Jacobsen, S. E., Looney, D. J. Small interfering RNA-induced transcriptional gene silencing in human cells // Science. — 2004. — Vol. 305. — № 5688. — p. 1289—1292.

84. Muljo, S. A., Ansel, K. M., Kanellopoulou, C., Livingston, D. M., Rao, A., Rajewsky, K. Aberrant T cell differentiation in the absence of Dicer // J Exp Med. — 2005. — Vol. 202. — № 2. — p. 261—269.

85. Murchison, E. P., Partridge, J. F., Tam, O. H., Cheloufi, S., Hannon, G. J. Characterization of Dicer-deficient murine embryonic stem cells // Proc Natl AcadSciUS A. —2005. —Vol. 102. —№34. —p. 12135—12140.

86. Napoli, C., Lemieux, C., Jorgensen, R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans // Plant Cell. — 1990. — Vol. 2. — № 4. — p. 279— 289.

87. Nilsen, T. W., Graveley, B. R. Expansion of the eukaryotic proteome by alternative splicing // Nature. — 2010. — Vol. 463. — № 7280. — p. 457— 463.

88. O'Brian, C. A. Protein kinase C-alpha: a novel target for the therapy of androgen-independent prostate cancer? (Review-hypothesis) // Oncol Rep. — 1998. — Vol. 5. — № 2. — p. 305—309.

89. Ohler, U., Stemmer, G., Harbeck, S., Niemann, H. Stochastic segment models of eukaryotic promoter regions // Pac Symp Biocomput. — 2000. — p. 380—391.

90. Ota, A., Tagawa, H., Karnan, S., Tsuzuki, S., Karpas, A., Kira, S., Yoshida, Y., Seto, M. Identification and characterization of a novel gene,

91. C13orf25, as a target for 13q31-q32 amplification in malignant lymphoma // Cancer Res. — 2004. — Vol. 64. -№9.~ p. 3087—3095.

92. Paddison, P. J., Caudy, A. A., Bernstein, E., Hannon, G. J'., Conklin, D. S. Short hairpin RNAs (shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells // Genes Dev. — 2002. — Vol. 16. — № 8. — p. 948—958.

93. Palliser, D., Chowdhury, D., Wang, Q. Y., Lee, S. J., Bronson, R. T., Knipe, D. M., Lieberman, J. An siRNA-based microbicide protects mice from lethal herpes simplex virus 2 infection // Nature. — 2006. — Vol. 439. — № 7072.p. 89—94.

94. Patel, R. C., Sen, G. C. PACT, a protein activator of the interferon-induced protein kinase, PKR // EMBO J. — 1998. — Vol. 17. — № 15. — p. 4379—4390.

95. Pillai, R. S., Bhattacharyya, S. N., Artus, C. G., Zoller, T., Cougot, N., Basyuk, E., Bertrand, E., Filipowicz, W. Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells // Science. — 2005. — Vol. 309. — № 5740. — p. 1573—1576.

96. Poy, M. N., Eliasson, L., Krutzfeldt, J., Kuwajima, S., Ma, X., Macdonald, P. E., Pfeffer, S., Tuschl, T., Rajewsky, N., Rorsman, P., Stoffel, M. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion // Nature. -— 2004.

97. Vol. 432. —№ 7014. —p. 226—230.

98. Prasanth, K. V., Spector, D. L. Eukaryotic regulatory RNAs: an answer to the 'genome complexity' conundrum // Genes Dev. — 2007. — Vol. 21.1. —p. 11—42.

99. Prestridge, D. S. Predicting Pol II promoter sequences using transcription factor binding sites // J Mol Biol. — 1995. — Vol. 249. — № 5. — p. 923—932.

100. Ramakers, C., Ruijter, J. M., Deprez, R. H., Moorman, A. F. Assumption-free analysis of quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR) data // Neurosci Lett. — 2003. — Vol. 339. — № 1. — p. 62—66.

101. Reese, M. G. Application of a time-delay neural network to promoter annotation in the Drosophila melanogaster genome // Comput Chem. — 2001. — Vol. 26. — № 1. — p. 51—56.

102. Royo, H., Cavaille, J. Non-coding RNAs in imprinted gene clusters // Biol Cell. —2008. —Vol. 100. —№3. —p. 149—166.

103. Scheie, J. H., Lehmann, K. E., Buschmann, I. R., Unger, T., FunkeKaiser, H. Quantitative real-time RT-PCR data analysis: current concepts and the novel "gene expression's Qr difference" formula // J Mol Med. — 2006. — Vol. 84,—№ 11, — p. 901—910.

104. Scherer, S. A Short Guide to the Human Genome. — CSHL Press, 2008. —173 p.

105. Schratt, G. M., Tuebing, F., Nigh, E. A., Kane, C. G., Sabatini, M. E., Kiebler, M., Greenberg, M. E. A brain-specific microRNA' regulates dendritic spine development // Nature. — 2006. — Vol. 439. — № 7074. — p. 283—289.

106. Schuler, G. D. Pieces of the puzzle: expressed sequence tags and the catalog of human genes // J Mol Med. — 1997. — Vol. 75. — № 10. — p. 694— 698.

107. Schwartz, J. C., Younger, S. T., Nguyen, N. B., Hardy, D. B., Monia, B. P., Corey, D. R., Janowski, B. A. Antisense transcripts are targets for activating small RNAs // Nat Struct Mol Biol. — 2008. — Vol. 15. — № 8. — p. 842—848.

108. Schwarz, D. S., Hutvagner, G., Du, T., Xu, Z., Aronin, N., Zamore, P. D. Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex // Cell. — 2003. — Vol. 115. —№2.—p. 199—208.

109. Shendure, J., Church, G. M. Computational discovery of senseantisense transcription in the human and mouse genomes // Genome Biol. — 2002.

110. Vol. 3. — № 9. — pp. research0044.0041-research0044.0014.

111. Sheth, U,, Parker, R. Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies // Science. — 2003. — Vol. 300. — № 5620. — p. 805—808.

112. Shuey, D. J., McCallus, D. E., Giordano, T. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention // Drug Discov Today. — 2002. — Vol. 7. — № 20. — p. 1040—1046.

113. Summy, J. M., Gallick, G. E. Src family kinases in tumor progression and metastasis // Cancer Metastasis Rev. — 2003. — Vol. 22. — № 4. — p. 337— 358.

114. Tabaska, J. E., Zhang, M. Q. Detection of polyadenylation signals in human DNA sequences // Gene. — 1999. — Vol. 231. — № 1-2. — p. 77—86.

115. Tam, W., Ben-Yehuda, D., Hayward, W. S. bic, a novel gene activated by proviral insertions in avian leukosis virus-induced lymphomas, is likely to function through its noncoding RNA // Mol Cell Biol. — 1997. — Vol. 17. — № 3, —p. 1490—1502.

116. Tang, G. siRNA and miRNA: an insight into RISCs // Trends Biochem Sci. — 2005. — Vol. 30. — № 2. — p. 106—114.

117. Thrash-Bingham, C. A., Tartof, K. D. aHIF: a natural antisense transcript overexpressed in human renal cancer and during hypoxia // J Natl Cancer Inst.— 1999. —Vol.91. —№2. —p. 143—151.

118. Ting, A. H., Schuebel, K. E., Herman, J. G., Baylin, S. B. Short double-stranded RNA induces transcriptional gene silencing in human cancer cells in the absence of DNA methylation // Nat Genet. — 2005. — Vol. 37. — № 8. — p. 906—910.

119. Tochitani, S., Hayashizaki, Y. Nkx2.2 antisense RNA overexpression enhanced oligodendrocytic differentiation // Biochem Biophys Res Commun. — 2008. — Vol. 372. — № 4. — p. 691—696.

120. Wang, J. P., Lindsay, B. G., Leebens-Mack, J., Cui, L., Wall, K., Miller, W. C., dePamphilis, C. W. EST clustering error evaluation and correction // Bioinformatics. — 2004. — Vol. 20. — № 17. — p. 2973—2984.

121. Wassenegger, M. The role of the RNAi machinery in heterochromatin formation//Cell. — 2005. — Vol. 122. —№ 1. —p. 13—16.

122. Weiner, A. M., Deininger, P. L., Efstratiadis, A. Nonviral retroposons: genes, pseudogenes, and transposable elements generated by the reverse flow of genetic information // Annu Rev Biochem. — 1986. — Vol. 55. — p. 631—661.

123. Werner, A., Berdal, A. Natural antisense transcripts: sound or silence? // Physiol Genomics. — 2005. — Vol. 23. — № 2. — p. 125—131.

124. Werner, A., Sayer, J. A. Naturally occurring antisense RNA: function and mechanisms of action // Curr Opin Nephrol Hypertens. — 2009. — Vol. 18.'4. —p. 343—349.

125. Wienholds, E., Koudijs, M. J., van Eeden, F. J., Cuppen; E., Plasterk, R. H. The microRNA-producing enzyme Dicer 1 is essential for zebrafish development 11 Nat Genet. — 2003. — Vol. 35. — № 3. — p. 217—218.

126. Wieslander, L. A simple method to recover intact high molecular weight RNA and DNA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels // Anal Biochem. — 1979. — Vol. 98. — № 2. — p. 305—309.

127. Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans II Cell. — 1993. — Vol. 75. — № 5. — p. 855—862.

128. Vol. 25. —№ 10. —p. 1149—1157.

129. Xu, P., Vemooy, S. Y., Guo, M., Hay, B. A. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism // Cuit Biol. — 2003. — Vol. 13. — № 9. — p. 790—795.

130. Yi, R., Qin, Y., Macara, I. G., Cullen, B. R. Exportin-5 mediates the nuclear export of pre-microRNAs and short hairpin RNAs // Genes Dev. — 2003.

131. Vol. 17. —№24.—p. 3011—3016.

132. Yin, Y., Zhao, Y., Wang, J., Liu, C., Chen, S., Chen, R., Zhao, H. antiCODE: a natural sense-antisense transcripts database // BMC Bioinformatics.2007. —Vol. 8. —p. 319—323.

133. Yu, W., Gius, D., Onyango, P., Muldoon-Jacobs, K., Karp, J., Feinberg, A. P., Cui, H. Epigenetic silencing of tumour suppressor gene pi5 by its antisense RNA //Nature. — 2008. — Vol. 451. — № 7175. — p. 202—206.

134. Zamore, P. D., Tuschl, T., Sharp, P. A., Bartel, D. P. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals // Cell. — 2000. — Vol. 101. — № 1. — p. 25—33.

135. Zeng, Y., Wagner, E. J., Cullen, B. R. Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells // Mol Cell. — 2002. — Vol. 9. — № 6. — p. 1327—1333.

136. Zhang, M. Q. Identification of human gene core promoters in silico I I Genome Res. — 1998.—Vol. 8.—№3. —p. 319—326.

137. Zhang, Y., Li, J., Kong, L., Gao, G., Liu, Q. R., Wei, L. NATsDB: Natural Antisense Transcripts DataBase // Nucleic Acids Res. — 2007. — Vol. 35.

138. Database issue. — p. D156—161.

139. Zheng, D., Frankish, A., Baertsch, R., Kapranov, P., Reymond, A., Choo, S. W., Lu, Y., Denoeud, F., Antonarakis, S. E., Snyder, M., Ruan, Y., Wei,

140. C. L., Gingeras, T. R., Guigo, R., Harrow, J., Gerstein, M. B. Pseudogenes in the ENCODE regions: consensus annotation, analysis of transcription, and evolution // Genome Res. — 2007. — Vol. 17. —№6. —p. 839—851.

141. Zimmermann, T. S., Lee, A. C., Akinc, A., Bramlage, B., Bumcrot,

142. D., Fedoruk, M. N., Harborth, J., Heyes, J. A., Jeffs, L. B., John, M., Judge, A. D., Lam, K., McClintock, K., Nechev, L. V., Palmer, L. R., Racie, T., Rohl, I.,

143. Скоблов, M. Ю., Баранова, А. В. Подходы к терапии опухолевых заболеваний, основанные на антисмысловом подавлении экспрессии генов // Молекулярная медицина. — 2008. — № 5. — р. 12—19.1. БЛАГОДАРНОСТИ

144. Особую признательность автор выражает своему научному руководителю Скоблову Михаилу Юрьевичу за чуткое руководство, бесценный опыт и понимание.

145. Автор также благодарен Олесе Нурутдиновой за вовремя данный ценный совет.

146. Отдельные слова благодарности Шигееву Сергею Владимировичу и Казубской Татьяне Павловне за помощь в сборе первичного материала.

147. Особую благодарность автор выражает своей семье и друзьям за терпение и готовность помочь.