Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональной роли линейных плазмид митоходрий кукурузы

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональной роли линейных плазмид митоходрий кукурузы"

ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ДРУЖБЫ НМОДОВ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ

ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

На правах рукописи МАРТЫНОВ Сергей Августович

УДК 577.218

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РОЛИ ЛИНЕЙНЫХ ПЛАЗМИД МИТОХОДРИЙ кукурузы

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Киев - 1992

Работа выполнена а отделе генной инженерии Института молекулярной биологии и генетики АН Украины.

Научный руководитель:

доктор биологических наук С. С. Малюта;

Официальные оппоненты:

член-корр. АН Беларуси доктор биологических наук Н. А. Картель;

канд. биол. наук Н. А. Чащин;

Ведущая организация:

Институт физиологии растений и генетики АН Украины.

Защита диссертации состоится » мая 1992 г. в 10 часов на

заседании Специализированного совета Д 016.11.01 Института молекулярной биологии и генетики АН Украины по адресу: 252143, Киёв-143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН Украины.

Автореферат разослан «26» апреля 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Л. Л. ЛУКАШ

Тип. КВВАИУ. 1,25 иеч. л. Тираж МО. За«. 582.

Актуальность темы. Явление цитоплазыатическоп иужгкой . стабильности /ШС/у высших растений известно с 19С0 года и до сих пор продолжает оставаться предметом интенсивного изучения. Во-первых, признак 1_1!<С широко используется в современной селекционно-семеноводческой практике, поскольку «значительно облегчает перекрестное опыление при создании продуктивных гибридов и позволяет избежать дорогой процедуры ручной кастоаиии растений. Во-вторых, этот признак наиболее приемлем для молекулярно-биологического анализа ядерно-йитоПлазмати-ческого взаимодействия.•

Большое число »кспеоиментальных данных, полученнх в последние годы . свидетельствуют о том, что генетические детерминанты, определяющие етот признак у высших растений, находятся в составе митохоняриольной ДНК. ОдМим из интеоеснейши-аспектов изучения ШС является ее связь* .с наличием в митохондриях растений наряду с высокомолекулярной ПНЯ во многих, хотя и не во всех случаях, плазмидоподобных кольцевых и линейных ЛНК. Положительная корреляция между наличием или отсутствием плазмидоподобных ЛНК и признаком ШЛО была отмечена у кукурузы, сорго, кормовых бобов, сахарной свеклы, риса и др. Для кукурузы", генетика Ш.С которой изучена наиболее детально, характерно налич.че трех типов стерильности - С. Т.о. Мито-хоняриальная ДНК 5 типа характеризуется присутствием двух плазмид 31 и 5?. • Транспозоноподобная структура этих эписом. а также другие структурно-функциональные особенности предполагают их участие в ре+сомбинашонных событиях, являвшихся причиной пеоестроек в митохондризльной и ядерной ЛНК. что в свою очередь и приводит к появлению 1Ж1 у растений.

Однако, несмотря на интенсивно ведущиеся исследования, сведения о генетических функциях и биологической роли плазми-доподобных ЛНК митохондрий растений остаются весьма ограниченными. Поэтому любые попытки приблизиться к объяснению функциональной роли плазмидоподобных ДНК митохондрий кукурузы теоретически и практически обоснованы.

Цель и задачи исслепоЕЕания. Целью данного исследования является изучение структурных изменений ттохонприального и ядерного геномов кукурузы и выяснение возможного влияния на метаболизм растительной клетки линейных плазмид митохондрий в составе рексьйинантных структур.

_ п _

Исходя из цели работы в холе ее выполнения были поставлены следушие валами:

1/ выделение и 4иаико-химический анализ плаэмидоподобных ДНК иитохондрий кукурузы с молдавским типом Ш«С;

С/ создание рекоьй.пнантныл плаамна на основе SI и SC послепогiW-льносгей алл обработки имтлктных растений кукугузы;

3/ выяснение возможности включения в метаболизм растительной • кЛотии лхнойних плаамид митохондрий в составе рекомоиилнтньос структур.

Научная К'ризна о.^оты. Впервые показано, что клонированные в бактериальном векторе с собственным ori репликации. S1 и 32 последовательности цитохондриальной ИНК кукурузи с двумя разнонаправленными инвертированными повторами а центре, подавляют репликацию плазмидной и хромосомальной ДНК в клетках E.coli. 8 м к вреуя SC последовательность в такой же канс'трукиш в составе гибридной плаамиди без бактериального ori репликашн осуществляет б них репликативную Функцию, н* имея при »тон свойств автономно реплицирующихся последовательностей для клеток прежней. . • .

Введение «ьрагмента SC. последовательности митохондриальной ШК кукуруаы посредством пыльцы в интактные растения повышает ,. обаяй энергетический уровень и хианеспособность кукурузы.Пока-вано. что такой вфо^кт обусловлен изменениями структуры миго-хоняриального и ядерного геномов. "

Поакгич^ск^а значимость работы. Разработанная система проверки способности митохондри&пьиых плазмид растений реплицироваться в клетках. E.coli целесообразно использовать для анализа происхождения и Функции такого тиЬа плазмид. Полученная результаты преастагляюг интерес при разработке методов пс-Сасения продуктивности чертильних линии кукурувы с ислодьвова-ниеы б качестве биолоически активного ь«ш*ства различных ген-н>-инженерных конструкций с плаамивоповобными митохондриальна-. ш OK.t

„ДПтцф&ция с-дботы, Представ, лунные в диссертации ыпатериалы аонлааьзвлисьвна V и VI -съездах УОГИС ( Киев, 1S63; Полтаьа, ЗЭ5Г); Вг«оеэны8 конференциях " Новые направльния биотехнология" i ПГ01НО, 1S88. 1990)! Всесоюзном совещании " Генетика aaaeisvsa " « Тааг«?кт. 12S0).

Jü2iiK2Süat 1Ьт*риляы взееертецми кэлокены в 9 печатных

РПбОТЗХ.

Структура и объем диссертации. Диссе-рация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора лэтературы. экспериментальной части, выполов и списка аитируе-tíC-Я литературы, включаоекего наииеноеений. Диссертация сод?ри1Т 1S рисунков и 4 таблиц«.

МАТЕРИАЛЫ ИШТОДЫ.

S работе Оьши использованы • а/ линия кукурузы ВИР 44 и ее WC аналог Е№ 44КС. полученные из Кубанской опытной станции Всесоюзного института растениеволства; б/ттамыа E.coU: HB101. DH1.JC51B3, полученные из коллекции культур отпела'генной инженерии ИМВиГ АН Украины; в/ иташ S.cerevisiae LL СО (leu Г-З leu ¡?-ll¡? hlâ 3-П his 3-15). получении* иа коллеги культур И>,-~кГ АН Украины: г/ плаз кипы: pBR ЗСГ, PLGV ГЗ пеоГ RB4. pYF 40. Y1 pî.

Среди,. В работ^были использованы стандартные способи Биравмвания имкроорганионов /КМллер. 197*5: Горлов. 1985/.

Длаэмидц, их характеристики и выделение ДНК. Выделение ллаэмиямой ЛНК. проверку биологической активности, рестрикция, лигирозание. трансформацию клеток Е.соН, електрофоретическоо разделение Фрагментов ШК провопили по общепринятым метопикаы /Ыаниатис, 1984/.-

.Выделение митохонрриальной и ядерной ДНК кукурузы проводили по модифицированному метолу /bblecular Biology of Plants, 1984/.

Электронную «интроскопии митохондриалъной ШК кукурузы провопили по ыетолике /Davis et al.. 1974/.

Выделение низкомолекулярньк ыитохонприапьньк ЛНК кукуруза просо1пили электроэяюциеЯ из агароэного геля /Мачиатис. 1984/.

Трансформацию 1:леток S.cerevisiae гибридны» si плазиидаыи провопили по ыояи&г^шропанноиу ыетоду. осноёшшс'.г/ на обработка интактных слеток прожуй солями палочных ь»таплоз /¡to. 1983; Горлов. 1985''.

- ОСслДотку pacTf-кий плаэыидныыи ДНК проводили по ыотоду /Lor z et al..'930/ путем спсыскиааикд раствора ДНК (50 иу/ил ) о ае.?."эь из расчета 1.5 - 2.0 мл иа початок через <1-5 часоз поел .i опулэккя. Параллельно для езф&ония эгсэогфккой ДНК з im-

тактные растения кукурузы нами был применен к-. топ /ОЫа. 15-36/, основанный на использовании пасты, состоящей иэ растительной пыльцы, 0,3 М Сахаровы и плазмидной ДНК < 40 мкг/мл ).

Изучение всхожести и динамики роста семян провопили на чалках Петри, залитых 0.7бх голодной агариэованной средой. 8 каждую чашку высаживали по 5 зерен, всхожесть учмтыали на 3-й сутки. Динамику рос', л определяли на 3-й, 5-ые и 7-ые сутки /Сереева.1963; Ракитин.1967/,

Статистическую обработку полученных данных проводили по /Плохинский, 1966/.

Гибрипзацию рестрицированнуой митохондриальной и ядерной ШК провопили по методу /Маниатис. 1984/.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Клонирование и 3? плазмидопопобных митохондриапьных ДОК кукурузы линии ВИР 44 МС в бактериальных и дрояме-вых плазидах

Выделение плазмидопопобных ШК из линии кукурузы ВИР 44 № проводили ив Фракции очищенных митохондрий. Полученный препарат анализировали под -электронным микроскопом. Исследуе-ьше образцы содержали высокомолекулярную ШК. обнаруживались также линейные молекулы небольшого молекулярного веса и ниэко-.молеулярные кольцевые структуры. Проводили измерение контурных плинн ниакомопекулярной ДНК. Полученные данные приведены ка гистограмме /рис.1/.

1.8

2,0

Рис.1. Гистограмма контурной длины молекул плаэкздопсдоб-ных митохондриальных ЛЖ кукурузы линии ЕИР44?.С.

- Б -

Наличие в препаратах кольцевых молекул с характерной белковой глобулой на цепочке ДНК /рис.С/ объясняется присутствием ковапентно связанной с ДНК ыолекулой белка, расположенной а области инвертированных повторов.

кь кь

м, ■й •"'*«!

л-*,.*!!

,

К А-;

Рй 9Щ

И

шмь!

»1 ДМ

— —а

Рис.2. Электронномикроскоическая фотография 31 и ЗС мигохон-дриальных плаамиа кукуруаи

Рио.з:

ЭлектроФореграмма кситохондриальных ДНК линии ВВИР44КСЗ

Очинённый'ливат митохондрий анализировали в О,ВТ. агароа-ноы геле. Как видно из электрофореграммы / рис. 3/, исследуемый препарат содержит высокомолекулярную ДНК и две фракции низкомолекулярных ДНК с молекулярным весом 5.4 и 4.1 мД, что находится в соответствии с данными, полученными при злектрон-но-микроскопической исследовании этих препиратоа. Рестрикцн-монный анализ злюиирсванных иа агарооного г-еля низкомолекулярных ДНК покаа^л их идентичность описанный в литература 21 и Бк последооателЬнсстям шг.охондриалыюй ДНК кукурузы.

Для изучения биологической и Функиионлльной роли 2-плаз-мия митохондрия нами были сконструированы рекомбинантнь® структуры, содержащие (сак фрагменты, так и полные их последо-«вательнгсти. Поскольку в обеих митохондриальных плазиидах им> «тм область гомологии, являющаяся наиболее клнсераативкоп и.

очевидно, ¿уикциональио значимой чсртьв, представлялось тересныы сконструировать тоиие гибридна® плазьашу. которь» См включали область гоаологии Sin Sí последовательностей. соответственно содержащую инвертированный повтор. Такие структура предполагалось в дальнейшей использовать длй ваеденил о растительную клетку с целью изучения возиэлльа иэнгиеиий кги l.:.íc-коняриального тек и ядерного геноаос.

В качестве еечясра быт использована пл&ациса pER . Срагиэнт SI последоо&тельности, содераажий участок гомологии а S2 последовательностью. получали путей обработка SI Д-К рестриктаэой Sal ül н S1- нуклеааой / с изльк получен;« "туги«" концов /. Фрагмент 32 последовательности, coflí?p;^Li;»¡ участок гомологии с S1 последовательность», получали путей обработки S2 ШК рестриктааой HindH и Бг-нуилечаой.Шгиройщг.г фрагментов с векторной гшазиидой ооуоствлзли при лсшин Т4-РНХ-лигааы. Схеиа клонигевьниа при&ашчш не р;ю.4.

я

se

pimSb

Рис 4.Cxeua клонкрасуш <1рагыонтоо SI и S2 последова? ель ногте Л ьытохонсриалъигЛ JKí кукурузы

С.гэнгтрумрозанн^л наш пг.£_зглща pDS В соцгрхзсла ¿р^-тис-нт SI последовательности от уникального сайта Sal G1 / раамэр юарсааяной последоваг ельности сосг£ЗЛ;?е? 6330 пара cchquí^uv.í/ . Сгорал пяазшаа. oZí-íS 6ü, ¿>jnep»rr враги: нт S2 послгдосетель-«зсти от уникального слйга íiirtí И и kvjot р&зис-р кяспироешно-го C^orítóHta окало 3300 тр оенб&вммя. В еОохх слуадд* сетрся-caiüi© прсзс&шс-сь па "тульг.!" кониаа. Епл efea юхэьад карск» topws» HiSM^ví отк^игой pc»5Kii ечктшанял CX-2 /Ш~п.о./.»«о '.соответствует SS9 сьикжслоткаа остатка.*!. Л у пямьъы pZbSS в кяомрогонксп повяэас&сгояькое»« етсутстау«' епЬцаь.! pascwa счгаззяия .СРО-4 /ГС'Бп.о./.что езот&гтетвт £53

Тракспсзонопогобкая структура 31 и 52 последовательностей митох-ондраяьной ДНК кукуруэн. а именно: наличие в их составе на концах длинных инвертированных повторов предполагает су-тестоовакие воз »/ом па механизмов интеграции в ядерную или ыи-тохондриальную ДНК. Вероятность такого события явилась предпосылкой для конструирования рекомбинантних плазмид.в которых бы присутствовали*^ гртирораниые повторы в обшей структуре плаэмиды. Кроме того, область гомологии не исчерпывает пол-

ностью всей функциональной нагрузки 51-

-структур в' расти-

тельной клетке, так как известно, что ядерный геной ревертан-тов содержит полную S1 последовательность, а ьитохондриальныЯ -полные S1 и Sí последовательности.

Схема клонирования полных последовательностей 51 и SS в клетках E.coli представлена на рис. 5.. При конструировании плаэмид такого типа концы каждой клонируемой последовательности были лигкрованы в присутствии Т4-ДНК- -и Т4-РНК - лигаз. Полученные в результате кольцевые формы рестрицированы по уникальный сайтам Sal G1 для 51 и Н1псш!-д!ля S2 ДНК. Развернутые линейнц?ыолекулы. содержащие по два инвертированных повтора, прмкающих друг к другу, были лигированы с плазмидой pBR322 по указанным сайтам. Плаз ми да с S1 последовательностью была названа' pZM3"5, а с SS - pZMH¡?6. . •

¿i

-3

Hindi!

гп-

JUndM

Рис.5. Схема клонироания полных 51 и S2 последовательностей ыотохондриальной . ДНК кукурузы

ргтнев

С целью проверки способности 32 плаэмиды реплицироваться э E.coli была сконструирована плазыида pZMH9 /рис.6/.Развернутая S2 последовательность с двумя ^вертироЕаннмии повторами s центре была вырезана из полученной нами ранее плаамиды pZMH26

по сайту Н1гх1Ш, после чего лигировапи с нереплицируюшимся фрагментом, несущим маркер устойчивости к канамицину. Источником Фрагмента с геном устойчивости к канаыишну служила плаз-мида р16Уеа*ю, В результате нш удалось получить гибридную плаямиду. у которой отсутствовала бактериальная область инициации репликации, но имелась область инициации репликации мито-хондриальной ЗР-плаэмигч. расположенной Енутри инвертированных повторов.

ри^мим V4-

Кт'Рг*«'

- 1 ч

Sae

Лг«Г

У1р152

Рис.6. Схема получения плаэмипы рХ№9 с 32 фрагментом ми-тохондри&льной ПНК кукурузы

Рис.?". Схема получения рекембинантных плаамид на основе векторов яоолоией

Для проверки способности инициировать реплиикашю в ге-терологичных системах, в частности в клетках лрожжей. нами были сконструированы плазмиды рУТ40-51 и У1 р1-2?.не имеющие дрожжевых областей инициации репликации. Схема клонирования предстаалена на рис.7.

- g -

П. Определение биологической активности сконструированные рибридных плазмид

Опыт получения гибридных плааиид, имеющих в своем составе р&авернутые S1 и S2 последовательности иитохондриалной ДНК ку-куруаы с двумя инвертированными повторам в центре. гГокавал их отличие от плазмид с Фрагментами 31 и S2 последовательностей не только структурно, но и по ростовым характеристикам содержащих их бактериальных культур. Отмечался слабый рост всех клонов, особенно в случае клонирования S1 последовательности. Создается впечатление, что присутствие в плаамипе двух лигированных разнонаправленных повторов, принадлежащих концам клонированных последовательностей, затрудняет репликацию не только соответствующей рекомбинантной плаэмиды, но и хромосомы. Одной ив воеможных причин могло бы оказаться наличие сайта инициации репликации в области, примыкающей к инвертированным повторам, и " столкновение " репликативных комплексов плаэмидного и растительного происхождения. Вместе с тем подобное объяснение совершенно не подходит для бактериальной хромосомы. Для подтверждения / или отклонения / выдвинутого предположения мы решили проверить способность 51-, 52- мигохондриальных плазмид /плазыиды второго типа / реплицироваться в клетках дрожжей. О етой целью представлялось возможным использование системы по клонировании и отбору b клетках дрожжей последовательностей, обеспьчиваюаих автономную репликацию плаэмидньш ДНК. Эти последовательности были обозначены кал AR3 /по autonomously replication sequence/. О наличии или отсутствии репликации судили по уровню трансформации компетентных клеток дрожжей соответствующими плазмидами. О компетентности клеток судили по уровню траяеформаиии дрожжей двурепликонной плаямидоя RB4,

имевшей область инициации реЛмкации как для клеток дрожжей, ' к

так и для киш.-чной папочки. Несмотря на то. что нам не удалось ' покааать способность к репликации в ярож*<:*вой системе S1 и S2 последовательностей. из данных литературы известно, что в митохондриях растительной клетки эти структуры реплицируются автономно. Сб этом свидетельствует их пятикратный молярный- избыток по отношению к митохондриальчой хромосоме. С другой' сторон:! имеются пантм. согласно которым,и интектных мнто-*хонврнях способны реплицироваться бактериальные плазыиды. Это обстоятельство позволяет предполагать, что SI, S2 isrro-

аондриальные плаамиды в свою очередь ысгли бы обнаружить способность к репликации в системе прокариотических клеток.

В связи с етим нами была предпринята попытка изучения функциональных свойств плазмиды pZMH9. содержащей Si? последовательность в гетероло^чной для нее бактериальной системе. г&м ©том основная ik-ль заключалась в оценке целесообразности такого подходи длл анализа происхождения я функции игго-кондриальных ллавмд |застаний. Суть эксперимента сводилась к проверке способности S2 последовательности реплицироваться в клетках Е. coli. Ванной плаэмидой трансформировали клетки E.coli HB 101. селекции проводили на среде с канамицином. Уровень трансформации был нипкиы и лишь у незначительной части клонов.■ устойчивых к Канамицину обнаруживались плаамиды. что вероятно объясняется застройкой ллазмлды или ее Фрагмента в f хромосому бактерии. Характерно также, что в результате шо-■ гскратных пассажей Кт-у<;т.ойиаые клетки теряют чувствительность во иноим бактериоыагам E.coli,но сохраняют ее в отношении <£а-гоб серый QXS. специфичным для некоторых мембранных мутантов E.coli Это. очевидно, является результатом присутствия пдаами-ца в трансформированной клетке., • • •

Таким обравом, полуенные нами данные позволяют считать,

что S2 плаамида растительных митохондрий сохраняет репликатиа-

■кую функцию в клетках Е.coli, обеспечивающую слабоаффе'ктивную

репликацию гибридных плаэммд е гетерологичной системе. Подоб-

t»

; ный подход к изучение происхождения и функций плавмид мито-, хонприй растений достатс^о целейообраеен и молет-Сыть использован длл других про- и 1«укариетич^ских систем.

д, ' О

^ ..

И- Изучение функциональной рьЛи линейных плазмид мито-■ хондрий кукурузы на икт&угных потениях ■ Исплльеуя методы генной инхенерии растений, можно подойти •к.рвяени» вопроса о регупяторнсй фуы^хии S1 и S2 последовательностей «йтохондриалвной ЩК кукурузы в ядре путем прямого .'Еввд&ния в клетку этих ЛНК.

^ Среди епсообов.' разработанных для введения с-каогенной ХШ' ■^в рсспк&льяую клетку, определенные преиыусгетйа имеет исполь--еоваиие тмышвой еиотеш. По сравнений с системами. осноеан-¿"ГН&и ка 'под^чакки протсгйагтсз, это? способ nposa и поэеолае? 4 геЗс;у с сйнгаэльный! уресьа сяре-олда оаетений. .

- и -

¿активность генетической трансформации при использовании пыль-язвой системы показана для различных растительных видов и ге-нгтаческих иаркеров. Таким обраэоы, иыоются достаточные основания считать, что обработка кукуруеных рылец сиесыэ пиг.ьцы и плазмидной ДИК обеспечивает вхождение последней в илеточноэ ядро аародьгад будущего верна. Сравнение растений, полученных о рбзультЕте прор&пхвания такого зерна с [контрольными позволит судить о наличии или отсутстнии физиологического шМянсга подобной обработки. Обработку р<истений мы прозодили в условие* полевого опыта. Полученные семена растений каждого варианта, ЕНсееали и самоопыляли. Физиологические последствия обработка растений кукурузы гибридными плаашдами первоначально анализировали на уровне пыльцы по признаку количественного соотношения стерильных и фертильных гранул и по числу растений со стэрмлыюйл пильцой / теблица 1 /.

Относительное количество стерильны:« пыльцевых гранул

и стерильных растений В разных вариантах спита

Варианты Пьшьцевыа аерна

всего стерильные гранулы

число

Растения

всс-го со стерильнсЛ пильцой

число

контроль еооо бо о.огг о.сз? аз ю

СЗ.Б^З.ОЗ

СЗраВотка

ГО5йвм!ИП0$ 4700 26

ргкевшч

0,05"й0.011 33 й

8.0324.24

Обработка ,

плсаиидоЯ ЕО-ОО' 10

о.оа-ао.ою ез 4

С6р?йот»лнь® ллаэыидами растения яер&ктеркэуютея ста-!7!<с?ичзек:1 достоверяим ениякниеы числа стерильно: пульиаыгя грлнуя и еос«в»?с?вт*ыч уммьаенкем одеял растении, у нотср^аг ,

- 12 -

были обнаружены стерильные пыльцевые гранулы.

Следует отметить, что. хотя снижение количества растений со стерильной пыльцой и выглядит статистически недостоверный, тем не менее наблюдается та же тенденция,что и со стерильными гранулами, а именно: * лаибольше«? снижение доли стерильных растений отмечоно а результате обработки их препаратом ДНК рексмбинантноГ плсмыиды р'^МНбЕ, содержала ии последовательность мигох'онпригишной ДНК кукурузы^ Следующим ■¿•талом изучения потомства рлстенля "после обработки плармияаш явилось определение осхожести и динамики роста семян /тьблица 2/.

Динамика роста огмяи кукурузы, полученных после , обработки ее гибридными плазмидами

Варианты Число Размер % ПО Размер X по Масса 1 по

опыта про- корня , , отно- стебля отно- про- оттно-

рос В5«Х /мм/ шению /мм/ .шению ростка теня»

из / 30 к контр ■к контр /г/ « к контр

Контроль С9 34 > 100 » •13" • 100 845 100

Обработка

плазыидой 26 5?1.45 63.0В 6.7 51. Б4 231 ег. гг

раШБЦ И

Обработка 'и •

плавкидей 30 43 126.47 153 467 136.38

ргКЯ65С523 «

Как видно га панных таьлиш^ в вариант* обработки растений 31--содержащей ялеамлиой она сдвинута в сторону уменьшения количественных привнаков, а при обрьбртк-- растений Е2-содержа-екЛ пяаамилой - в сторону их увеличения. Причины етого отличия Объяснить трудно, особенно если учитывать совпадение дайных Сбоих вариантов по пыльце во вторам и третьем поколении. В то . юе бремя следует помнить." если испольеуг-мьм гшазмиегш у дейтой ядра, то & случал пл&тмды р2М38 оно получит узеличен-■'«й -набор 51 посл«йе>егяр-»йьнос-тей. а г случае р2ЬС465 -•■^«л £Я — м 5^г«асяс-ййзз-г<ш>ко-ггай, -мотель» с5ычно г^мсутетеуют

в митохонндриальной ЕНК, кукурузы, что. очевидно, является наиболее Физиологичным для растительной клетки втого вида.

Следумее сравнение признаков обработанных плазмидами с контрольными вариантам кукурузы.проводили на уровне взрослых растений по высоте и массе: количеству, мас<;е и длине початков: а также по массе 1000 верен. По всем перечисленным параметрам потомство растений, обработанных 31-содержащей плазмидой. соответствовало контрольным растениям. ^В потомстве растений, обработанных БЕ-содерхадай плазмидой УУй VI поколения/ обнаружены статистически достоверные / при доверительном уровне 0.95/ отличия от контрольных по массе растений и средней массе всех початков на одном растении /таблица 3/.

Сравнительная характеристика потомствва растений, обработанной плазмидой рХМНбБСЗД

Вариант Масса X по Средняя X по .

опыта растения отно- ' -йасса всех отно-

/г/ шению ' початков.на шению.

к контр. ' одном раст. к контр.

/г/

Контроль 3586.7 £В.4 100 233.11 137.32 ' 100

Обработка

плазмидой 1040.3t69.13 292.38 384.80 123.52 .1С5.14

ргМНб5С52]

V роколение

Обработка • «

плазмидой 1141.8 £172.1 292.82 405.60 * 62.00 174.51

ргмнббсзгз

VI поколение

Таким образом, мы обнаружили, что у растений, обработанных -рекомбинантной плазмидой. содеряадей 52 последовательность. наблюдаются стойкие статистически достоверные отличия от контрольных вариантов в сторону усилении ростовых характеристик и увеличения доли Фертилькых пыльцевых гранул. Этот

вФйскт сравним с наблюдаемым при застройке ютозгонариельник плгзмкд в ыитохондриаяьную ЛЬСС в процессе иитсплсшаткиеской реверсии к Фортильности - повынением обкего енергетического уровня и жизнеспособности ратения. Следует отметить, что. как в случае описянноЯ о литературе цитоплакатичекой реверсии, ь наетя вкепериментах основные изменения прослеживались на растения*, обработанная плаамидой. содержащей 52 последовательность митохондриальной ДНК кукурузы. Сопоставление полученных нами экспериментальных результатов с данными литературы /(tetóle. 1983/. позволяет высказать предположение о том, что на уровне митохондриальной и ядерной ДНК жизнеспособность растительной клетки повышается при аайстраивении в них обеих типов илохснвриальныя пламид.

IV. Структурные изменения митохондриальных и ядерных ДНК

кукурузы, обработанной ре ко мб и н ан т н н ШК Для того, чтобы проверить вероятность влияния рекомби-нантиьгх плазмид на структуру митокондриальной > и ядерной ДНК кукурузы , мы предприняли попытку проследить судьбу етих плаз-131Д в оргаяеллах обработанных растений.

4600 т.п.нг 4200 т.п.н. 2200 т.п.н.

600 т.п.н.

200 т.п.н.

а б

Г 2 3 4 I 2 3 4'

Рис.8. А.ЭлектрсФореграша: Б.Блот-гибридизашя с Р-32-иечен.чой плаамидой pZMH65

1.мтДНГС кукурузы линии BFHP44Í.C/ЦМ>S/;

2. я ДНК кукурузы лнкин БЯР44 ♦ SalGÍ:

3. ssEHK кукурузы линия ВИ?44. .обрабаганнся плаамидой PZMH65C ST1 + SalGÍ;

4. яШК кукурузы линии BHP44VC/UM>S/

- tQ -

tía яяяая Олг? гсЗеяся&ши /(ею. в/' ¡ rs, <гто гг> срсзмг-¡rcs с пси?твг?а э entrri»ti сбрг-зцэ иеЗсхсглгя Mir;«»-;» ц'*.:сял и г-'-.^аят-гра рггпгпкзгниэ рзсгрюлгкш (tpsrüTHrcs асгркез Eîî. ггСрггг-зуьт;;:;« e scHceseft ©St /S?-níu»».5tfioner,csí¡:e:i IK í. zits> гтт-л ra :í!toscí!Cp-i> «укурузи с антояла^-т^.-осгссп ««¡■e-r.Ls-HîîccPbы. "тот роэульт&т во®* е«!:сэг::ип- полегать.

гхя'гзсгп ^сатсййка 'пл-гуд-ла л дпcpuys

ГШ. КЙ?&т гйсто.гакггмческая р^икзм»'!«;';

С St о op:c!:cccwK?j г««тичэсю?и иат&рягшьа. У'-гячзля. что гл .¡•л нгЗппайгм су»яггрксЛ JSHX кукуруза э JISî rí-í^cí-

nu р£ЯЭЭг, WTHô sywiTb, что neta о c;iy»v? осотг^^'Л пр»121па. en Ouca и<-поя!ой и сопрсэояазлаоь ¿лздгккцгкг» em-•гсрокеЛ чгета fÄRrt^u- Иотераеио. «rro 1Я!г?нс:;:тл. lisS.-.-ssf г ::-.*> 'j cSp?j5o?eauc плездецг*». cürp^s-.r.n^i s» <rs>r«m>

ЙССРХ^Э, KD П ШТОПОНЕР'ЛСЛЬНУО XKt.

iJ

iiÉ'S

î Z 3 <1

—ЛЯ

ргл.З. Л. D.*:-?;í?rxíopsrp4?iías Б. о .

ч>?::ксй плгзкйхкя pZlSvSSC STJ î.iîtïî'X ívwpytsu сбрсЗо»с,нь'йЯ na»n.igea рШШСй?) , $лайгЛ ггукуруаи CH?4-î. са&'.ботайтЗ п&'хгчДО! pÄSCtSU«

3.ИГСЯ 2Г44}

4. щи«-»«*»*

'!л г'.о. ') г^у^ьт^м ОЯФР-гч^ЯК«

r^C^rv",^ 2HK раетен/Л кукудош, . at а Гч'-йй-

r:.?t;síu;?."f.i плзэьздедЬ о :«?«!<Н!оа P-!'?- »жп

коняри&льная ШК контрольного варианта /ВИР44/ не содержит свободных плаэмидоподобмых с-.руктур, в то в ре ил, как в обоих опытных вариантах наблюдается появление фрагментов, гибридиау-юшихея с зондом и примерно соответствующих по молекулярному весу S1 и S2 структура®.. Отсутствие полного соответствия и повеление мелких Фратмл-нтов можно объяснить, очевидно, неточный сышйплением данных стру:ггур из митохондриальной ШК. Не исключено. что такой еф^ект обусловлен изменением специфики контроле структуры к функции ШГОХОНДрИЙ со стороны ядерного геноиа в реаультате воздействия на ядро привнесенной информация.

вываш

1. Выделены и охаракте^эваны плаэмидоподобнш мито-хондриальные последовательности S1 и S2 из линии кукурузы Е№44Ю с молдавскими типоы штоплаа штической г^у»ской стерильности.

£. ГЬ;<&зшо. что развернутые линейные S1 и SS? структуры с вауьаа разнонаправленными инвертированными повтораыи в

• центре, встроенные в дрохкевые векторы, не осуществляют функции автономно реплицирующихся последовательностей в клетках Saccliaromices ct/revisiae.

В, Присутствие в рекомбинантных плазмидах двух лигирован-ных разнонаправленных повторов S1 и SS? последовательностей подавляют репликации в клетках E.coli плаыидной

• И* ^'РОкДЭСОЮЛЬНОЙ ДНК.

4, SS псследозательносгь ыитохолдриальной ДНК кукурузы с

• составе рекомбинантной плазыляы р2МН9 обеспечивает реп-

%

■ ликатианук сун^ию в-клетк&к E.coli.

В. Обнаругкено повышение жиэиеспособнсс&и растений кукурузы □ результате обработки гибрипньтми плазшдаии. содерзяа-, т- шцмм ¡Ьрагьгенты 52 тлазыидиповобной - штохондриальной

• ШК.

6. Выявлены структурные иэиен£ж>и в ядерной ДНК кукуруаи,

•у- oSpüÄoTfeiiiiori ргкоибинактиьми плазиидйыи с- фрагментами S1 и SC пояейовательностей. - В шгеохондриях Фертилькой-линии кукурузы.обработанной ' - гибридными плакатами с Фрагментами S1 и S2 последова-тепьноотей, сЗнаругккы гааологичша им ниако»,п:;=>ку/мр-

• а i.» Ш-С

- IT

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО TBS ДИССЕРТАЦИИ

1. Малюта С. С.. Мартынов С.А. Миникольиевыэ плггыидопо-добные ДНК растегний // V съезд генетиков и селекционеров Украины : Теэ. докл.- Киев, 19БЗ. - ч. 1.- С.78.

С. Телегеев Г.Д., Мартынов С.А. Выделение экстрачроыосо-мальной ПНИ из животных и растительных клнток //Сб. науч. трудов " Методы молекулярной биологии " - 1Сиеа, Наукова думка . 1386. -С. 59-63. 1

3. Мартынов С. А.. Бух И.Г., Даниленко Т.С., Шрюта А.Ю.. Перерва Т.П., Мал юта С.С. Изучение функциональной роли 31 и 52 плазмидоподобных ДНК митохондрий кукурузы // Осес. конЬ. " Новые направления биотехнологии ": Тез. докл. - Пуиино. 1988. С. 74.

4. Мартынов С. А. . Бух И.Г.,. Малюта С.С. "Взаимодействие ядерной и митохондриапьной генетических систем при ци-топлазматической мужской стерильности у кукурузы // Второе Всесоюзное совещание " Генетика развития ": Тез. докл. - Ташкент, 1990. - Т:1. 4.1. - С. 100.

Б. Martynov S.A.. Buch I.G.. Mlruta А. У..' Danllenko T.S.. Maliuta 5.5.. Pererva T.P. Structural modifications of naize mitochondrial DNA treated by SI-., 52- ccntainin? recorcbinant' Plasmids // V-th Scientific 'Symposium of Socialist Countries on Biotechnology - Balatcnszeplak,' Hungary, 19Б9. - V.2. - P. 79.

6. Мартынов С. А.. Бух И. P., Даниленко Т. С., !4фйта Л. D.. Перерва Т.П., Малюта С.С. Штохоняриальные плазииды кукурузы как возможные регуляторные элементы генома // Всес. кон®. " Новые направления биотехнологии ": Тез."* докл. - Пусино,'. 1990. - С. 12-13.

7. Мартынов С.А.. Бух И.Г., Малюта С.С; Клонирование плае-мипоподсбных ыитохоняриальных ДНК кукурузы и изучение некоторых свойств полученных рекслйинантных плаэыид // Биополимеры и клетка . - 1990. - Т.6, N 5. - С. 100105.

9. Мартынов С.А., Бух И.Р.. Шрюта А.Ю., Даниленко Т.С., Перерва Т.П., Малюта С.С. Изучение Функциональной роли линейных плоэмид митохондрий кукурузы на интектньм. растениях // Биополимеры и клетка. - 1992. - Т.8, М 4.

IS -

0. Uûpraics S.A., Dys И.Г.. '¿-¿дата С.С. Êysxsio-

енаяъсой para гикзкзшкш Ш-t штозгомарка кукурузы. ияо-i¡íspoza¡üíirj в бачтерааяьнш сектсраз // VI съсзд УСП2: Tfra. юш. - ГЬяуьза. 1Ю2. - T.l. - С. С4