Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы

Тотменин, Алексей Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы"

На правахрукописи

ТотменинАлексей Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНОМА ВИРУСА НАТУРАЛЬНОЙ

ОСПЫ

03.00.03 -молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени канзидага биологических наук

Кольцово - 2004

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Щелкунов С.Н.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Рябчикова Е.И. кандидат биологических наук Филипенко М.Л.

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Зашита состоится 27 февраля 2004 года в 9 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» Минздрава РФ по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор», Кольцово Новосибирской области, 630559.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ РФ.

Автореферат разослан 26 января 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В 1980г. Всемирная Ассамблея Здравоохранения известила мир о ликвидации оспы на земном шаре. Это достижение явилось результатом осуществлявшейся Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) и продолжавшейся свыше 20 лет беспримерной международной программы. Завершающим шагом этой программы предполагалось уничтожение хранящихся в двух лабораториях мира (Сотрудничающие центры ВОЗ по ортопоксвирусам Российской Федерации и США) штаммов вируса натуральной оспы (ВНО). Однако, в целях сохранения информации об этом уникальном вирусе ВОЗ сочла необходимым предварительно осуществить исследования по расшифровке структуры его генома.

До начала этих исследований не существовало научно обоснованных заключений об эволюционном происхождении и взаимосвязях ортопоксвирусов, патогенных для человека. Отсутствовала информация о молекулярных факторах патогенности ВНО. Большинство исследований в этом направлении были выполнены на вирусе осповакцины (ВОВ).

Наиболее прямым подходом к решению стоящих вопросов является секвенирование и сравнительный компьютерный анализ организации геномов ВНО и ВОВ.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было создание и характеризация клонотек фрагментов ДНК высоко- и низковирулентного штаммов вируса натуральной оспы и выполнение работы по секвенированию и компьютерному анализу организации вирусных генов и их белковых продуктов. В процессе работы решались следующие задачи:

1. Получение представительных клонотек фрагментов генома вируса натуральной оспы штаммов Индия-1967 (ВНО-ИНД) и Гарсия-1966 (ВНО-ГАР) в плазмидных и космидных векторах. Надежная консервация полученного банка клонов фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО.

2. Проведение секвенирования полных последовательностей нуклеотидов геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР.

3. Построение полных генетических карт геномов двух изученных штаммов ВНО.

4. Осуществление подробного сравнительного анализа структурно-функциональной организации изучаемых геномов вируса натуральной оспы и вируса осповакцины штаммов Копенгаген (ВОВ-КОП) и Вестерн Резерв (BOB-WR).

5. Выполнение детального сравнительного анализа внутривидовых и межвидовых структурных перестроек ДНК ортопоксвирусов и выявление эволюционных взаимосвязей ВНО и ВОВ.

относительно ВОВ сделан вывод об их видоспецифичности и независимом эволюционном происхождении ВНО и ВОВ от общего прародителя. Проведена надежная консервация полученных клонотек фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО, что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях.

Публикации и апробация работы. По материалы диссертации опубликованы 17 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 9-th International Conference on Poxviruses and Iridovi-ruses (Les Diablerets, Switzerland, 1992), 9th International Congress ofVirology (Glasgow, Scotland, 1993), 10th International Conference on Poxviruses and Iridoviruses (Banff, Alberta, Canada, 1994), 11th International Meeting on Poxviruses and Iridoviruses (Toledo, Spain, 1996), 12th International Poxvirus Simposium (St. Thomas, USA, 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia, 2000), 13th International Poxvirus and lridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000)

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, раздела "Результаты и обсуждение", выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 216 страницах, содержит 26 рисунков, 5 таблиц и два приложения. Библиография включает 340 литературных источников.

Вклад автора. Создание и характеризация клонотек фрагментов геномной ДНК штаммов Индия-1967 и Гарсия-1966 ВНО, компьютерный анализ организации генома штамма Гарсия-1966 ВНО, анализ структурных' перестроек в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной оспы и осповакцины выполнены лично автором; анализ организации генома штамма. Индия-1967 ВНО выполнен автором совместно с В.М. Блиновым и сотрудниками лаборатории теоретической биологии и вирусологии. ГНЦ ВБ «Вектор»; секвенирование ДНК вирусов натуральной оспы выполнено сотрудниками отдела молекулярной биологии геномов и отдела молекулярной вирусологии ГНЦ ВБ «Вектор» при участии автора.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1, Создание плазмидных и космидных клонотек фрагментов ДНК ВНО

штамма Индия-1967

1.1. Получение и характеризация коллекций гибридных плазмид, содержащих Hindlll- и >Хйо/-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967

На первом этапе данной работы стояла задача создания и характеризации клонотек фрагментов ДНК высоковирулентного штамма вируса натуральной оспы, относящегося к подтипу variola major. В качестве объекта исследований был выбран штамм вируса ВНО-ИНД, выделенный на 11-й день болезни у мужчины 50-ти лет в одной из деревень штата Махараштра, Индия в августе 1967 г. Эпидемия оспы в том году в Индии характеризовалась уровнем летальности около 31%. Гидролиз ДНК ВНО-ИНД различными рестриктазами показал (рис. 1), что полученный препарат гомогенен и в целом соответствует по картине гидролиза описанным штаммам вируса натуральной оспы.

Геном вируса натуральной оспы представлен линейной двухцепочечной молекулой ДНК размером около 190 тыс. пар нуклеотидов (т.п.н.), цепи которой

соединены на концах ковалентной связью. При гидролизе ДНК данного вируса рестриктазой ИтЛП с последующим электрофорезом в агарозном геле было идентифицировано 17 фрагментов ДНК размером от 1,4 т.п.н. (ЯшаНТ-р-фрагмент ) до 44 т.п н (НтаШ-А-фрагмент) (рис. 1,2).

Рис. 1. Результаты электрофоретического разделения фрагментов ДНК вирусов вакцины, штамм ЛИВП (1) и натуральной оспы, штамм Индия-1967 (ВНО-ИНД) (i), полученных после гидролиза вирусных ДНК рестриктазами HindIII, Kpnl, Sail, Xhol и Sacl. X - Hindlll-гидролизат ДНК фага лямбда. 0,6% агарозный гель.

Рис. 2. ИтйШ- и Хйо/-рестриктные карты генома ВНО штамма Индия-1967. Серыми блоками обозначены фрагменты, клонированные в составе векторных плазмид н космид.

ДНК ВНО-ИНД, гидролизованную рестриктазой HindIII, лигировали с линеаризованной той же рестрикгазой ДНК вектора pUC18. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.eoli JM109 и на среде с ампициллином, X-gal и ИГПТ отбирали белые и светло-голубые колонии (клетки с исходной плазмидой на такой среде формируют синие колонии). Из колоний с таким фенотипом выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее на наличие встроек клонированных HindIII-фрагментов ДНК ВНО. Анализ около 300 независимых клонов позволил сформировать плазмидную библиотеку HindIII-фрагменгов генома ВНО-ИНД Последующий рестрикционный и гибридизационный анализ с использованием любезно предоставленных О.И. Рязанкиной клонированных фрагментов ДНК вируса осповахцины (штамм ЛИВП) позволил выявить в составе этой библиотеки все HindIII-фрагменты ДНК ВНО за исключением тех, которые принципиально не могли быть клонированы с использованием данной векторной системы - слишком крупных ЯшсПП-А-, -В-, и концевых, несущих на одном из концов терминальную шпильку HindIII-D- и -G.

Следующим этапом работы явилось создание дополнительной плазмидной клонотеки фрагментов генома ВНО-ИНД путем клонирования Xhol-фрагмснтов ДНК данного вируса в бактериальном векторе pUBS19. Конструирование данной плазмидной библиотеки позволило клонировать концевые видоспецифичные области генома ВНО-ИНД, а также получить протяженные HindIII-А и В-фрагменты в более удобной для дальнейшей работы форме - в виде набора нескольких субклонов, несущих средние по размеру Xhol-фрагменты.

ДНК ВНО-ИНД, гидролизованную рестриктазой Xhol, лигировали с линеаризованной рестриктазой SalI ДНК вектора pUBS19. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E.coli JM109 и на среде с ампициллином, X-gal и ИПТГ отбирали белые и светло-голубые колонии. Из колоний с таким фенотипом выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее на наличие встроек клонированных Xhol-фрагментов ДНК ВНО. Было проанализировано около 200 независимых гибридных клонов E.coli, образовавших в итоге плазмидную клонотеку клонированных Xhol-фрагментов ДНК ВНО-ИНД (см. рис.2).

Полученные плазмидные клонотеки HindIII- и Xhol-фрагментов ДНК (табл. 1, 2) покрывали в общей сложности 92% генома ВНО-ИНД, за исключением около 8 т.п.н. с правого конца HindIII-А-фрагмента, 7,9 т.п.н. с левого конца HindIII-В-фрагмента (см. рис. 2) и крайних 0,6 т.п.н. с обоих концов генома. Коллекции плазмид паспортизовали и помещали на хранение в Международный репозитарий ДНК ВНО (ГНЦ ВБ «Вектор»).

1.2. Получение и характеризация библиотеки космид, содержащих HindIII-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967

Поскольку перед нами стояла задача клонирования и определения первичной структуры всей кодирующей последовательности генома ВНО штамма Индия-1967, то целью следующего этапа работы стало клонирование крупных HindIII-А и HindIII-В фрагментов ДНК данного вируса в составе космидного вектора cosP. ДНК ВНО гидролизовали эндонуклеазой рестрикции HindIII, а ДНК вектора cosP -эндонуклеазами рестрикции Hpal и HindIII и лигировали с HindIII-гидролизованной ДНК ВНО-ИНД. Полученную лигазную смесь использовали как субстрат для упаковки ДНК in vitro в частицы бактериофага лямбда. Далее проводили адсорбцию и высев полученных фаговых частиц на клетках E.coli DH1. Эффективность получения

Таблица 1. Коллекция гибридных плазмид серии pVIH, содержащих клонированные HindIII-фрагменты генома ВНОИНД

М» Фрагмент Длина (пн.) Положение в геноме (п.н ) Номера клонов

Начало Конец

3 С 15993 18690 34682 5

5 Е 15161 34683 49843 174, 334, 105

6 F 13188 84703 97890 17

8 Н 8877 58051 66927 150

9 I 8670 76033 84702 15

10 J 7162 145187 152348 94, 143

11 К 6493 51558 58050 131, 263

12 L 4993 71040 76032 6, 57, 62

13 М 4112 66928 71039 345

14 N 2867 97891 100757 2

15 О 2203 16487 18689 33,71

16 Р 1558 14929 16486 21

17 Q 1441 50117 51557 263

Таблица 2. Коллекция- гибридных плазмид серии pVDC, содержащих клонированные Жо1-фрагменты генома ВНО-ИНД

№ Фрагмент Длина (пн.) Положение в геноме (п.н.) Номера клонов

Начало Конец

4 D 14601 111676 126276 21,25

5 Е 13805 12122 25926 22

6 F 10940 126277 137216 13

7 G 10641 160235 170875 34

8 Н • 8116 103560 111675 23, 32

9 I 7519 173940 181458 4,8,11

10 J 6366 5756 12121 39

11 К 5754 2 5755 1

12 L 5263 67535 72797 3,7

13 М , 4203 99357 - 103559 10, 14, 17

14 N 3451 72798 76248 20

15 О 3064 170876 173939 19

16 Р 2794 181459 184252 24,36

17 Q 1321 184253 185573 6

рекомбинантных космид составляла в среднем 105-10б колоний в расчете на 1 мкг вирусной ДНК.

Из полученных гибридных клонов выделяли космидную ДНК, которую далее подвергали рестрикционному (см. рис. 3) и гибридизационному анализу с использованием в качестве зондов клонированных ранее в составе плазмидных векторов ЫтаШ- и Хйо1-фрагментов ДНК ВНО. Созданная геномная библиотека ШпЛШ-фрагментов ВНО-ИНД в космидном векторе совР включала в себя клонированные ШпЛП-А и ШпёШ-Б фрагменты, а также ШМШ-фрагменты меньшего размера, которые уже были нами ранее клонированы в составе плазмидного вектора.

Таким образом, суммарные результаты выполненных экспериментов по клонированию фрагментов ДНК вируса натуральной оспы показывают, что нам удалось создать коллекцию гибридных молекул ДНК, перекрывающих весь вирусный геном. Данная коллекция явилась базовой для выполнения экспериментов по секвенированию ДНК ВНО штамма Индия-1967.

Полученная нами совокупность коллекций гибридных молекул ДНК обеспечила быструю и надежную расшифровку последовательности 185578 пар нуклеотидов (п.н.) всей ДНК изучаемого вирусного штамма за исключением коротких концевых сегментов размером около 600 п.н.

Рис. 3. Электрофореграмма рестрикционного анализа по ШпёШ гибридных космид, содержащих встройки клонированных ЯшйЩТ-фрагментов ДНК ВНО Индия-1967 (дорожки 1-5, 7-11). 6 - ЯшйЩТ-гидролизат ДНК ВНО Индия-1967. Справа указано положение соответствующих фрагментов генома данного вируса.

2. Получение и характеризация коллекции гибридных плазм ид, содержащих .Хйо1-фрагменты генома ВНО штамма Гарсия-1966

Следующим этапом явилось клонирование, секвенирование и анализ организации генома слабовирулентного (variola minor alastrim) штамма Гарсия-1966 ВНО (ВНО-ГАР). Штамм ВНО-ГАР был выделен в Бразилии во время вспышки оспы алястрим в 1966 г. из кожных поражений девочки 14 лет с интенсивной сыпью титрованием на ХАО РКЭ. От д-ра П.Гринэвея (Портон-Даун, Англия) нами была получена коллекция гибридных плазмид, содержащих часть ДшаШ-фрагментов ДНК этого штамма ВНО. Данная коллекция не позволяла осуществить секвенирование протяженных концевых видоспецифичных районов вирусного генома. Поэтому было решено осуществить клонирование Xhol-фрагментов ДНК ВНО-ГАР.* Препарат ДНК данного вируса был наработан в 1985 году в Национальном центре инфекционных заболеваний (Атланта, США) и любезно предоставлен нам д-ром Дж.'Эспозито в 1991 году.

При гидролизе ДНК данного вируса рестриктазой XhoI образуется 19 фрагментов ДНК размером от 0,5 т.п н (XhoI-R- и -R'-фрагменты) до 42 т.п.н. (XhoI-А-фрагмент) (рис. 4).

Рис. 4. Шп&Ш- и Хйо1-рестриктные карты генома ВНО штамма Гарсия-1966 Серыми блоками обозначены Хйо1-фрагменты, клонированные в составе векторных плазмид.

ДНК ВНО-ГАР, гидролизованную рестриктазой Хко\, лигировали с линеаризованной той же рестриктазой ДНК вектора риВ820. Лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.еоИ 1М109 и на среде с ампициллином, X-gal и ИПТГ отбирали белые и светло-голубые колонии. Из колоний с таким фенотипом - выделяли плазмидную ДНК и анализировали ее на наличие встроек клонированных Хйо1-фрагментов ДНК ВНО. Анализ около 200 независимых клонов позволил сформировать плазмидную клонотеку ХМ-фрагментов ДНК ВНО штамма Гарсия-1966. Последующий рестрикционный и гибридизационный анализ позволил выявить в составе этой клонотеки все -фрагменты генома ВНО за исключением крупных Хко\-А- и -В и концевых Хко1-К и -Я', которые принципиально не могли быть клонированы с использованием данной векторной системы (табл. 3).

Таблица 3. Коллекция гибридных плазмид серии pVGX, содержащих клонированные ЖоЬфрагменты генома ВНО-ГАР

, № Фрагмент Длина (п.н.) Положение в геноме (ан.) Номера клопов

Начало Конец

3 С 23058 138241 161298 4,

4 D 14601 112681 127281 204

5 Е 13949 12974 26922 За. 243

6 F 11298 161299 172596 183

7 G 10959 127282 138240 52

8 Н 8116 104565 112680 9з

9 I 7520 175668 183187 16з.25з.28з.36з

10 I 7186 5788 12973 35з.20з.10,.27э

11 К 5752 36 5787 102.313

12 L 5263 68549 73811 333

13 М 4203 100362 104564 15г. З23

14 N 3451 73812 77262 14]

15 О 3071 172597 175667 12,

16 Р 2794 183188 185981 19[

17 Q 966 185982 186947 193

Используя имеющиеся в нашем распоряжении коллекции гибридных плазмид, были секвенированы протяженные районы генома ВНО-ГАР, в сумме имеющие размер 141 т.п.н. Оставшаяся часть генома ВНО-ГАР была секвенирована Дж. Эспозито с соавторами (CDC, Атланта, США). В совокупности размер генома ВНО-ГАР составил 186 986 п.н..

3. Создание международного репозитория гибридных плазмид, содержащих

фрагменты ДНК ВНО

Учитывая планируемое Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) уничтожение коллекций штаммов вируса натуральной оспы особенное значение приобретает вопрос о сохранении клонированных фрагментов генома разных штаммов этого вируса. Такое хранение генетической информации ВНО является биологически безопасным. В связи с этим ВОЗ решил создать международные репозитарии фрагментов ДНК ВНО на базе лабораторий в Кольцове (ГНЦ ВБ "Вектор") и Атланте (CDC, США). Заключительным этапом работы по получению представительных клонотек фрагментов генома ВНО-ИНД и ВНО-ГАР стало проведение надежной консервации полученного банка клонов двух изученных штаммов вируса натуральной оспы. С этой целью была проведена наработка препаративных количеств ДНК рекомбинантных клонов, их паспортизация и закладка на длительное хранение.

4. Изучение организации генома вируса variola major ВНО-ИНД

Состав G+C секвенированной последовательности 185578 ILH. ДНК ВНО-ИНД равен 32,7%, что сравнимо с 33,4% для ДНК вируса осповакцины штамма Копенгаген (ВОВ-КОП). В процессе компьютерного анализа данных сехвенирования прежде всего рассчитали потенциальные открытые рамки трансляции (ОРТ), кодирующие полипептиды размером от 60 аминокислотных остатков (ак) и более. Для ВНО-ИНД было идентифицировано 200 потенциальных ОРТ, из них 108 левонаправленных и 92 - правонаправленных.

Для детального выяснения особенностей структурной организации генома ВНО-ИНД было проведено сравнение последовательностей генома изучаемого вируса и близкородственного высоковирулентного ВНО штамма Бангладеш (ВНО-БАН), секвенированного учеными США спустя год после завершения наших работ с ВНО-ИНД. ВНО-БАН был выделен во время последней естественной вспышки variola major в октябре 1975 г. в Бангладеш. Уровень летальности данной вспышки оспы в Бангладеш составил 18,5%. Таким образом, для сравнительного анализа были взяты последовательности геномов двух азиатских штаммов вируса variola major. Следует отметить, что азиатские изоляты ВНО являются наиболее вирулентными среди изученных в ХХ-м столетии.

Последовательность генома ВНО-БАН составляет 186103 п.н. Геном ВНО-БАН содержит по сравнению с геномом ВНО-ИНД две относительно протяженные делении. Одна деления размером 210 п.н. расположена в некодирующей области, прилегающей х правому концу генома, а вторая деления размером 569 п.н. находится в HindIII-J фрагменте генома и не затрагивает жизненно важных для размножепия вируса генов. Другие отличия ВНО-ИНД и ВНО-БАН состоят в делениях или вставках размером менее 50 п.н. и в точечных заменах в геноме одного вируса относительно другого. При сравнении нуклеотидных последовательностей ДНК ВНО-ИНД и ВНО-БАН обнаружили высокую степень гомологии (99,3%). Если в этих расчетах исключить районы делений 210 п.н. и 569 п.к., то гомология сравниваемых последовательностей достигает 99,7%.

Суммарные результаты анализа показывают, что из 200 белков, кодируемых потенциальными ОРТ ВНО-ИНД и ВНО-БАН, 122 идентичны, 42 имеют единичные, all двойные аминокислотные замены. В оставшихся белках выявлено большее число аминокислотных различий, хотя чаще всего они вызваны заменой одних аминокислот на другие изофункциональные (например, Leu—>11е н т.п.). Кроме того, имеются примеры укорачивания ОРТ в геноме одного вируса относительно другого.

Наблюдаемые отличия в организации ОРТ в геномах ВНО-ИНД и ВНО-БАН концентрируются в правом и левом концевых районах, в то время как центральная часть, охватывающая 148 ОРТ, за несколькими исключениями, высококонсервативна. Размер этой области составляет около 135 т.п.н. Если же предположить, что короткие ОРТ, по которым различаются вирусы, не функциональны, то генетические карты ВНО-ИНД и ВНО-БАН практически совпадут.

Таким образом, сравнение последовательностей ДНК ВНО-ИНД и ВНО-БАН позволило выявить высокий консерватизм вируса натуральной оспы как на уровне нуклеохидной последовательности ДНК, так и аминокислотной последовательности потенциально кодируемых ею белков. Проведенное сравнение организации геномов ВНО-ИНД и ВНО-БАН может указывать на относительно медленную эволюцию вируса variola major. Возможно, данный вирус эволюционно так глубоко

адаптировался к организму человека, что существенные изменения в организации генома могут приводить лишь к снижению его жизнеспособности и/или значительно уменьшать показатель вирулентности.

5. Сравнительный анализ геномов вирусов ВНО major и ВОВ

Вирус натуральной оспы является возбудителем одного из наиболее опасных заболеваний человека - оспы, а вирус осповакцины, относящийся к тому же роду Orthopoxvirus семейства Poxvindae, - эффективной живой вакциной против данного заболевания. Поэтому стояла задача изучить, чем генетическая организация данных вирусов различается и в чем их сходство. Такое сравнение открывает возможность выявления молекулярных факторов вирулентности и познания механизмов преодоления ортопоксвирусами многочисленных защитных барьеров организма-хозяина.

Полученные нами данные секвенирования ВНО-ИНД сравнивали с опубликованными данными для ВНО-БАН, ВОВ-КОП и BOB-WR. Сравнение трансляционных (генетических) карт геномов этих вирусов показывает, что центральная консервативная область генома, характеризующаяся высокой гомологией последовательностей ДНК и совпадением генетических карт ВНО и ВОВ, имеет размер около 100 т.п.н. Именно эта область генома содержит большинство генов, детерминирующих родоспецифичные свойства ортопоксвирусов. Видоспецифичные свойства данных вирусов, по-видимому, определяются в основном генами, расположенными во фланкирующих центральную область концевых последовательностях ДНК

Генетические карты левого и правого концевых районов генома ВНО по сравнению с ВОВ характеризуются "мозаичностью". Относительно короткие сегменты практически полного соответствия этих карт перемежаются с областями мутационных нарушений ОРТ или их делецией/вставкой. Необходимо отметить, что при сравнении разных штаммов одного и того же вида ортопоксвирусов центральная консервативная область генома имеет значительно большие размеры. Так, по нашим оценкам для пары ВОВ-КОП/ВОВ-WR она составляет 163 т.п.н. При сравнении ВНО-ИНД и ВНО-БАН консервативная часть генома составляет около 135 т.п н.

Наибольшие отличия между вирусами натуральной оспы и осповакцины обнаружены в зоне обращенных (инвертированных) концевых повторов (ITR) Размер ITR ВОВ-КОП - 12,1 т П.Н., а у BOB-WR он составляет 10,2 т.п.н. Протяженные ITR были выявлены и у других видов ортопоксвирусов. Исключение составляет вирус натуральной оспы, ITR которого в зависимости от штамма варьирует в размере от 518 п.н. до 1051 п.н. Такие короткие повторы не содержат каких-либо генов и, возможно, представляют собой минимальный теломерный элемент, необходимый для репликации поксвирусной ДНК. По-видимому, столь малый размер ITR существенно ограничивает возможность генетической рекомбинационной изменчивости ВНО по сравнению с другими видами ортопоксвирусов, характеризующимися относительно высоким уровнем перестроек генома.

6. Изучение органюации генома штамма Гарсия-1966 ВНО minor alastrim

Определенная полная последовательность ДНК ВНО-ГАР, заключенная между крайними XhoI сайтами (рис. 4), отсекающими концевые шпильки (примерно по 530

пн.), составила 186986 п.н.. Состав G+C данной последовательности равен 32,7%, гомология по соответствующим последовательностям ДНК ВНО-ИНД и ВНО-БАН составляет 98,24 и 98,02%, соответственно. В процессе анализа идентифицировано 206 потенциальных открытых рамок трансляции (ОРТ) с размером от 60 ак и более. Было проведено сравнение выявленных ОРТ с соответствующими генами ВНО-ИНД, ВНО-БАН и вирусов осповакцины ВОВ-КОП и BOB-WR. В центральном районе генома ВНО-ГАР наблюдается полное совпадение трансляционных карт ВНО-ГАР и ВНО-ИНД В длинных концевых областях генома сегменты практически полного соответствия трансляционных карт ВНО-ГАР и ВНО-ИНД перемежаются участками с выраженными различиями. Рассмотрим подробнее 'принципиальные различия ВНО-ГАР и ВНО-ИНД по организации индивидуальных ОРТ.

Семейство белков с анкириновыми повторами. ОРТ D6L ВНО-ИНД в случае ВНО-ГАР распадается на две более короткие ОРТ B7L и B8L. Данная область соответствует гену круга хозяев CHOhr вируса оспы коров (ВОК). У ВОВ-КОП этот ген делегирован, а в случае BOB-WR - фрагментирован на четыре потенциальные короткие ОРТ. Необходимо отметить, что данный белок содержит так называемые анкириновые повторы, которые встречаются в целом ряде ортоцоксвирусных белков и, по-видимому, играют важную роль в регуляции такой сложной функции вирусов как детерминирование круга чувствительных хозяев и тканевого тропизма.

Соседние с рассмотренным выше районом потенциальные ОРТ ВНО-ГАР B9L, B10L, B11R и B12L образовались, скорее всего, в результате мутационных изменений в структуре соответствующего гена вируса-предшественника. Такое заключение позволяет сделать г наблюдение о том, что ВОВ-КОП в данном районе имеет полноразмерную ОРТ C9L. ВОК также кодирует такую протяженную ОРТ. Нуклеотидяая последовательность ВНО-ГАР в рассматриваемом районе идентична ДНК ВОК, штамм GRI-90 (BOK-GRI), на 89%, в то время как по отношению к ВОВ-КОП и BOB-WR этот показатель равен лишь 73%. Следует отметить, что другие районы генома ВНО-ГАР, за исключением вставки 627 п.н. в правом концевом районе (см. далее), имеют идентичность по последовательности ДНК с BOB-КОД не менее 90%. Таким образом, в составе генома ВНО-ГАР район B9L-B12L, по-видимому, происходит от общего с ВОК предшественника, а в геноме вирусов осповакцины данная область, возможно, рекомбинационно заменена на фрагмент ДНК другого, пока не изученного ортопоксвируса. Вирусы variola major по отношению к ВНО-ГАР в рассматриваемом районе имеют делецию размером 898 п н. Следует отметить, что C9L ВОВ-КОП содержит в своем составе анкириновые повторы, как и выше рассмотренный ген круга хозяев ВОК. Однако функции гена C9L пока не изучены.

Другие ОРТ с анкириновыми повторами (Q1L, H6L, D8R, D10R и G1R для ВНО-ГАР) у всех сравниваемых вирусов ВНО имеют высококонсервативные последовательности. При этом у ВОВ-КОП лишь ОРТ, соответствующие H6R и D8R ВНО-ГАР, имеют такой же размер и высокогомологичны белкам вирусов ВНО. ОРТ MIL ВОВ-КОП характеризуется несколько большим размером по сравнению с- Q1L ВНО-ГАР, а изологи ВОВ-КОП по отношению к D10R и G1R ВНО-ГАР имеют значительно меньший размер и, по-видимому, являют собой результат мутационного изменения (инактивации) соответствующих генов вируса-предшественника. Противоположный пример представляет ген круга хозяев K1L ВОВ-КОП, который как в случае variola major, так и variola minor распадается на две короткие потенциальные ОРТ (Q3L и P1L для ВНО-ГАР).

Белки семейства kelch. Полагают, что вирусные белки данного семейства могут связываться с цитоскелетом и играть важную роль во взаимодействии вирус-хозяин. Следует отметить, что вирус осповакцины в составе своего генома содержит три полноразмерных гена данного семейства (ВОВ-КОП C2L, F3L, A55R), в то время как у ВНО-ИНД и ВНО-БАН они мутационно фрагментированы. Кроме того, ВНО-ИНД и ВНО-БАН содержат короткие рамки (B22R-B24R для ВНО-ИНД), которые можно объединить в полноценную протяженную ОРТ, предположительно предсуществующую в вирусе-прародителе. В случае ВНО-ГАР все рассмотренные ОРТ семейства kelch также мутационно фрагментированы относительно соответствующих генов ВОВ-КОП, но необходимо обратить внимание на то, что во всех случаях (за исключением ВНО-ГАР E3L) ВНО-ГАР имеет другой по сравнению с ВНО-ИНД и ВНО-БАН спектр фрагментов в нарушенных генах. Это может указывать на независимые пути эволюции рассматриваемых вирусов variola major и variola minor alastrim из вируса-предшественника.

Алястрим-специфичный дополнительный сегмент ДНК размером 627 п.н. обнаружен в районе ОРТ ВНО-ГАР H10R-H12R, соответствующем области ОРТ B10R и B11R ВНО-ИНД. Эти короткие потенциальные ОРТ являются «обломками» обнаруженной в геноме некоторых изолятов ВОК протяженной ОРТ размером 1891 ак, которая по всей видимости содержалась в геноме возможного общего предшественника ВНО.

Район коротких ОРТ H2L, H3R, H4L и H5R ВНО-ГАР скорее всего также является районом множественных мутационных изменений, которые привели к разрушению протяженых ОРТ, существовавших в геноме вируса-предшественника. Различия в размерах ОРТ между ВНО-ГАР и ВНО-ИНД в этом районе указывают на независимый путь эволюции данных вирусов.

Таким образом, проведенное исследование позволило выявить ряд отличий ВНО-ГАР от азиатских вариантов variola major. Одно из самых ярких различий ВНО-ГАР от ВНО-ИНД и ВНО-БАН состоит в том, что ряд генов, являющихся скорее всего "обломками" генов вируса-предшественника у variola minor alastrim и variola major мутационно нарушены разным образом. Данные примеры указывают на независимые пути эволюции вирусов variola major и variola minor alastrim из единого вируса-предшественника. Что касается известных молекулярных факторов вирулентности ортопоксвирусов, значительных отличий по их структуре между ВНО-ГАР и ВНО-ИНД/ВНО-БАН в результате компьютерного анализа выявить не удалось. Эти отличия, как правило, состоят лишь в точечных заменах некоторых аминокислот. Как такие замены влияют на свойства того или иного белка могут дать ответ лишь эксперименты по экспрессии индивидуальных вирусных генов в какой-либо генно-инженерной системе. Получив индивидуальные белки разных штаммов вируса, можно провести подробное сравнительное изучение их свойств.

7. Сравнение геномов вирусов ВНО п вируса оспы верблюдов

Недавно английскими исследователями была определена полная последовательность генома вируса оспы верблюдов (ВОВБ). В качестве объекта исследований ими был выбран штамм CMS вируса оспы верблюдов. Данный вирус был выделен д-ром Баксби в 1970 году в Иране. Определенная полная

последовательность ДНК ВОВБ-CMS составила 202182 п.н.. Состав G+C данной последовательности равен 33,1%. ITR ВОВБ имеет размер 6045 п.н., а расстояние от конца генома до первой ОРТ составляет 650 п.н. Такой тип организации ITR характерен также и для генома ВНО в отличие от геномов ВОВ и ВОК.

Сравните геномов ВОВБ и ВНО показало, что их геномы коллинеарны, за исключением различающихся по длине ITR и четырех вставок ДНК размером от 1,5 до 2,9 ТП.Н. в геноме ВОВБ относительно ВНО. В отличие от достаточно высокого сходства последовательностей геномов ВОВБ и ВНО, гораздо больше различий было обнаружено при попарном сравнении последовательностей ВОВБ и ВОВ, а также ВОВБ и ВОК. Проведенный анализ позволил сделать вывод, что ВОВБ и ВНО являются более близкородственными вирусами.

Сравнение трансляционных карт терминальных областей ВОВБ, ВНО, ВОК и ВОВ позволило выявить 26 потенциальных ОРТ, имеющихся в полноразмерном виде у всех трех вирусов. Анализ степени гомологии аминокислотных последовательностей показал, что в большинстве случаев (20/26) белки ВОВБ были более близки к белкам ВНО, чем к аналогичным белкам остальных вирусов. В 3 из 26 случаев белки ВОВБ и соответствующие белки ВОВ и/или ВОК обладали одинаковой степенью гомологии с белками ВНО, и только в трех из 26 случаев белки ВОВ или ВОК, а не ВОВБ были более гомологичны белкам ВНО.

Таким образом, полученные данные по анализу последовательности генома ВОВБ, организации ОРТ и сравнению гомологии аминокислотных последовательностей показали, что ВОВБ является эволюционно более близким к вирусу натуральной оспы, чем к какому-либо другому виду ортопоксвирусов.

8. Сравнение организации молекулярных факторов преодоления защитных систем организма ВНО, ВОВ и ВОВБ

ВНО major обусловливает генерализованную инфекцию, которая в высоком проценте случаев завершается летальным исходом, а ВОВ размножается в организме человека, как правило, локально в месте его введения без существенного патогенного воздействия на хозяина. ВОВБ не патогенен для человека. Поэтому было проведено сравнение организации молекулярных факторов этих ортопоксвирусов, обеспечивающих преодоление защитных реакций организма чувствительного хозяина. В таблице 4 приведена суммарная информация о составе и индивидуальных характеристиках белков данной группы. Прежде всего следует отметить, что у ВНО разрушены гены рецептора интерлейкина-1Р и ЗР-гидроксистероид дегидрогеназы (Зр-HSD). Ранее опубликованные исследования показали, что продукция вирусом осповакцины растворимого рецептора интерлейкина- lp (EL- lpR) предотвращает развитие системных реакций (лихорадка, повышение температуры тела) в организме инфицированных мышей. Оказалось, что нарушение соответствующего гена ВОВ-WR приводит к увеличению вирулентных свойств ВОВ при интраназальном введении мышам. Также было показано, что штаммы ВОВ, дающие более высокую частоту поствакцинальных осложнений у человека, не обладают IL- ф-связывающей активностью. Полученные результаты хорошо согласуются с тем фактом, что соответствующие ОРТ вируса натуральной оспы разрушены.

Таблица 4. Орюпоксвнрусные иим^ночодуляторпые белки

ИНО-ШЩ ВИО-БЛН ВНО-ГАР ВОВБ-СМБ ВОВ-КОП П011-\\'И

ОРТ Размер, ак ОРТ Размер, ак ОРГ Размер, ак ОРТ Размер, ак ОРГ Размер, ак орт; Размер, ак

Фактор роста П2Я 140 04 К 140 113 Я " 140 11Я 139 СИЯ 142 9Я . 140

]Ь-18-связывающий белок 126 ть 126 В61, 126 , - - - 13Ь 126

Ком племен г-спязы вающи й белок 012Ь 263 Ш5Ь 263 В18Ь 263 23Ь 265 сзь 263 25 Ь 263

Гомолог е!Р-2а, фактор у стойчивости к интерферону СЗЬ 88 сзг. 87 РЗЬ 88 32Ь 88 кзь 88 34Ь 88

дцРНК-связывающнй белок, фактор устойчивости к интерферону ЕЗЬ 190 сзь 192 СЗЬ 192 55Ь 190 ЕЗЬ 190 59Ь 1 190

З-р-гидроксистеронд дегидрогеназа А50Ь' 61 у- - 'Л34Ь, 61 161Ь 346 А441 346 170Ь ; 346

у-1ГЫ-связывающий белок В9Я 266 В 811 266 И9Я 266 181Я 266 В8Я 272 190Я 272

Ингибитор сериновой протеазы, 8Р1-2 В13Я 344 В12Я 344 02Я 344 188Я 344 В13Я 116 195Я 345

Н--1 Р-связывакпций белок В15Я 63 ; • - Э4Я 63 190Я 99 Ц16Я 290 197Я 326

а/р-1РК-связывшощий белок В20Я 354 В17Я 354 09Я 355 196Я 355 В19Я 35* - 200Я 351

ТОТ-связывающий белок, СгшВ вгя 349 0211 348 в2Я 349 21* 205Я* 349 349 С22Ь* В!28Я» 122 122 41,* 215Я* 122 122

Хемокин-связывающиЙ белок 03 я 253 ОЗЯ 253 ОЗЯ 253 11.* 206Я* 255 255 С23Ь* В29Я* 244 244 218Я* 244 244

Звездочкой обозначены открьмые рамки трансляции (ОРТ), которые дуилициропаны в левом и правом концевых инвертированных повторах. Укороченные нарушенные ОРТ заполнены серым.

Ранее было показано, что вирусный ген А44Ь ВОВ-КОП кодирует белок с ферментативной активностью ЗР-гидроксистероид дегидрогеназы. 3(3-ШБ является ключевым ферментом биосинтеза стероидных гормонов и участвует на разных его этапах. Стероидные гормоны, в свою очередь, проявляют влияние на многие функции хозяина, например, обусловливают иммуносупрессию и противовоспалительное действие. На модели интраназально инокулированных мышей было показано, что делеционный мутант ВОВ по гену 3(3-ШБ имеет сниженную вирулентность. ОРТ, кодирующая Зр-ЖБ, у ВНО-ИНД и ВНО-БАН мутационно фрагментирована (см. табл. 4). Нарушение данного гена у ВНО позволяет предположить, что вследствие различий в гормональном регулировании у грызунов и человека рассматриваемый ген утратил свое значение в случае строгого антропоноза, каким является ВНО.

Существенным отличием ВНО от ВОВ является то, что у последнего отсутствуют гены, кодирующие аналоги рецептора фактора некроза опухолей (ПЧРг). Фактор некроза опухолей является наряду с 1Ь- 1р ключевым цитокином, индуцирующим воспалительные реакции в организме инфицированного хозяина. ВНО-ИНД и ВНО-БАН содержат ОРТ 02И, кодирующую белок, гомологичный белку Т2 вируса миксомы и клеточному рецептору типа II фактора некроза опухолей (ТЫРгИ). Показано, что белок Т2 является важным секретируемым фактором вирулентности вируса миксомы (род Ьвропроху1гш). Аналогичными свойствами, по-видимому, обладает и его аналог О2Я вируса натуральной оспы. В геноме ВОВ выявили лишь две потенциальные короткие ОРТ (ВОВ-КОП А53Я и В28Я), имеющие гомологию с ТЫРг (см. табл. 4). Выполненный нами анализ позволяет заключить, что в данных районах предсуществовали в геноме вируса-прародителя полноразмерные ОРТ гомологов ТЫРг, однако в результате мутационных изменений произошло нарушение этих кодирующих последовательностей, приведшее к преждевременной терминации трансляции. В результате ВОВ утратил способность синтезировать эти белки Таким образом, ВНО в отличие от ВОВ, по-видимому, способен за счет связывания вирусспецифичного белка с ТОТ ингибировать его активности, в том числе как активатора воспалительных и имунных реакций.

Для остальных проанализированных факторов вирулентности ВНО и ВОВ (табл. 4) нами было выявлено наличие значительного количества точечных отличий по аминокислотной последовательности Вероятно, это во многих случаях может стать решающим фактором, определяющим высокий уровень патогенности ВНО для человека. В частности, недавно было показано, что наличие 11 аминокислотных замен между комплемент-связывающим белком ВНО и ВОВ приводит к тому, что данный белок ВНО в 100 раз более эффективно инактивирует СЗЬ компонент комплемента человека. Это обусловливает более эффективное ингибированис развития каскада комплемента и высокую вирулентность ВНО.

На эффективность распространения вируса в организме хозяина, по-видимому, могут также влиять такие белки как вирусный фактор роста, белки оболочки внеклеточных вирионов (прежде всего, гемагглютинин) и анкиринподобные белки (белки, определяющие круг хозяев вируса). Так, ВНО заметно отличается от ВОВ по структуре УОБ, гемагглютинина и ряда анкиринподобных белков.

При анализе геномов ВНО и ВОВ показано, что значительное число ОРТ у ВНО за счет мутационных изменений имеет меньшие размеры (разрушены) по сравнению с ВОВ. Можно предполагать, что по крайней мере некоторые из этих генов являются "буферными", т.е. нейтрализующими негативные эффекты, развивающиеся в организме в процессе вирусной инфекции. Для одного из генов возможность такого

регулирования взаимодействия вирус-хозяин показана экспериментально. Нарушение гена BOB-WR, кодирующего 1Ь- 1р-связывающий белок, приводит к более раннему появлению симптомов заболевания и гибели подопытных мышей по сравнению с исходным вирусом. В случае ВНО данный ген нарушен.

Суммируя имеющиеся данные, можно заключить, что вирус натуральной оспы и другие ортопоксвирусы обладают беспрецедентным по сравнению с вирусами других семейств набором генов, белковые продукты которых эффективно модулируют многочисленные защитные функции организма хозяина. При этом особо следует отметить, что ВНО кодирует строго специфичный для своего вида набор иммуномодуляторных белков (см. табл. 4)

9. Исследование внутривидовых и межвидовых перестроек в геномах ортопоксвирусов

Для выяснения закономерностей перестроек вирусного генома нами был выполнен сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей ДНК трех штаммов вируса натуральной оспы ВНО-ИНД, ВНО-БАН, ВНО-ГАР и штаммов вируса осповакцины ВОВ-КОП и BOB-WR.

В процессе проведенного анализа были выявлены различные делеции/вставки и области множественных мутаций в геномах вирусов натуральной оспы относительно вируса осповакцины. Было выявлено 16 протяженных делеций (размером от 621 до 17654 п.н.) и множество коротких делеций (длиной менее 100 п.н ). Для коротких делеций характерно то, что в вирусных ДНК, где эти делении не произошли, делегируемые последовательности, как правило, ограничены короткими прямыми повторами, а вариант вируса с делецией содержит лишь одну копию такого повтора. В геномах ВНО-ИНД и ВНО-БАН содержится по 93 короткие делеций относительно остальных сравниваемых вирусов, а в геномах ВНО-ГАР и ВОВ-КОП - 96 и 87 делеций, соответственно. Распределение коротких делеций по областям генома отражено в следующей таблице:

Левая кондевая область генома Центральная консервативная область геноыа Правая концевая область геноыа Всего

ВНО-ИНД 27 21 45 93

ВНО-БАН 27 21 45 93

ВНО-ГАР 33 24 39 96

ВОВ-КОП 28 13 46 87

Из таблицы видно, что анализируемые вирусы содержат сравнимое количество делеций в расчете на весь геном, что, по-видимому, отражает близкую частоту рекомбинационных процессов для этих вирусов, хотя распределение делеций по областям генома может в какой-то степени варьировать.

ВНО-ИНД и ВНО-БАН имеют 85 идентичных делеций из 93, а ВНО-ИНД и ВНО-ГАР - 80 (из 93 для ВНО-ИНД и 96 для ВНО-ГАР), в то время как ВОВ-КОП при сравнении с ВНО-ИНД, ВНО-БАН и ВНО-ГАР имеет лишь по 5, 6 и 8 идентичных делеций, соответственно Штаммы ВНО-ИНД и ВНО-БАН вируса натуральной оспы variola major содержат по четыре уникальных, специфических для

каждого штамма делеции, variola minor ВНО-ГАР - 8, и ВОВ-КОП - 74. Более трети всех коротких делеции находятся в межгенных районах и, по-видимому, могут влиять на уровень экспрессии соответствующих генов. Полученные данные позволяют заключить, что практически все короткие делеции являются видоспецифичными. Более того, обилие таких делеций, различающих вирусы натуральной оспы и осповакцины, указывают на то, что эти два вида ортопоксвирусов эволюционировали независимыми путями от единого вируса предшественника.

Следует отметить, что в центральной консервативной области ортопоксвирусного генома обнаружены лишь немногочисленные короткие делеции, как правило, кратные трем, т.е. не приводящие к сбою рамок трансляции соответствующих ОРТ. Пять делеций не кратных трем располагаются в межгенных районах и только одна делеция 5 п.н. приводит к сбою рамки трансляции ОРТ A9L в ВНО-ИНД и потере трех С-концевых аминокислотных остатков по сравнению с аналогичным белковым продуктом ВОВ-КОП A9L, функция которого к настоящему времени не установлена.

Наибольшее количество коротких делеций было обнаружено в концевых видо-специфичных районах генома анализируемых вирусов. В ряде случаев для более полного выявления спектра вариабельности и консервативности вирусных штаммов с различной степенью вирулентности провели сравнение с определенными х настоящему времени концевыми последовательностями ДНК ВНО штаммов variola major Congo-1970 (ВНО-КНГ) и variola minor Somalia-1977 (BHO-COM). Африканские штаммы ВНО-КНГ и ВНО-СОМ характеризуются уровнем летальности вспышек заболевания, во время которых они были выделены, 9,6% и 0,4%, соответственно.

Как отмечалось выше, для коротких делеций характерно то, что они часто фланкированы короткими прямыми повторами-. Области тандемного расположения прямых повторов, являющиеся обычно горячими точками рекомбинационных процессов, оказываются таким образом сайтами потенциального возникновения коротких делеций. Прямой анализ областей расположения тандемных прямых повторов подтвердил наличие в данных районах большого числа делеций. К примеру, среди рассматриваемых последовательностей были обнаружены прямые повторы, у которых число повторяющихся элементов варьировало у различных штаммов. Начиная с позиции 21722 левого конца ДНК ВНО-ИНД нонамер ТАТАТСАТС повторяется двенадцать раз, в ДНК ВНО-КНГ, ВНО-СОМ, ВНО-БАН, и ВНО-ГАР содержится 5, 9, 7 и 31 копия данного нонамера, соответственно. Нонамер содержится внутри ОРТ C5L, для каждого штамма ВНО число повторяющихся единиц определяет число повторов Пе-Asp-Asp в кодируемом C5L белке. В результате белковый продукт C5L варьирует по длине, поскольку число аминокислотных остатков различно: ВНО-КНГ - 231; ВНО-БАН - 237, ВНО-СОМ -241, ВНО-ИНД - 251 и ВНО-ГАР - 312. Белок, кодируемый геном C5L ВНО-ИНД имеет 88% идентичности по аминокислотной последовательности с белком длиной 226 ак, кодируемым геном F1L ВОВ-КОП, однако анализ последовательности ДНК ВОВ-КОП выявил только единственный нонамер в положении 34047-35055. Как данные повторы влияют на свойства белка и какова его функция пока не выяснено, однако следует отметить, что как следствие наличия повторяющихся остатков De-Asp-Asp данный белок имеет очень высокий отрицательный заряд.

У ВНО-ГАР в районе, соответствующем N-концу ОРТ A35R находятся 6 копий повтора АТААСААТТ. ВНО-ИНД и ВНО-БАН в данном районе содержат делению

18 п н, а ВОВ-КОП и ВОВ-т - делецию 66 п.н. В результате у ВНО-ИНД и ВНО-БАН остается по 4 копии нонамера, а у ВОВ-КОП и BOB-WR происходит почти полное делегирование всех повторяющихся элементов Поскольку размеры делеций в данном случае кратны трем, то сбоя рамок не происходит, но ОРТ A34R ВНО-ИНД и ВНО-БАН короче аналога A35R ВНО-ГАР на 6 аминокислот, а А3Ш ВОВ-КОП и A35R BOB-WR - на 22 ак. Функция данных белков неизвестна.

Мы обнаружили несколько различных типов прямых повторов в областях генома, которые не кодируют каких-либо белков. Например, в ДНК ВНО-БАН и ВНО-СОМ между B8R и B9R находятся 16 прямых повторов ТААТАС, но ВНО-ИНД

в аналогичном районе содержит 8 копий гексамера, а ВНО-ГАР - 2 копии повтора ----->----->----->----->----->----->----->----->----->

ВНО-БАН АОАСТТТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАС 160890

БНО-КНД АСАСТТТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТАА'ГАСТААТАСТААТАС------ 160852

ВНО-ГАР АСАСТТТААТАСТААТАС------------------------------------------ 161880

ВНО-БАН ТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТААТАСТАСТАСТТСТААСААТСА 160950

ВНО-ИНД ------------------------------------------ТАСТАСТТСТААС5ААТСА 160870

ВНО-ГАР ------------------------------------------ТАСТАСТТОТАЛСААТСА 161898

На основании проведенного анализа можно заключить, что делеции (дупликации) играют важную роль в эволюции ортопоксвирусов По-видимому, реализуется два типа делеций в поксвирусной ДНК. Наиболее часто происходят (или сохраняются) короткие делеции, которые обычно ограничены прямыми повторами и, по-видимому, являются результатом соскальзывающего ошибочного спаривания при репликации вирусной ДНК Делеции второго типа обычно имеют большой размер, не ограничены прямыми повторами, и механизм их возникновения требует дальнейшего изучения. Важным результатом выполненной работы является также то, что впервые удалось обнаружить видовую специфичность ортопоксвирусов по спектру коротких делеций/вставок в вирусных ДНК относительно друг друга.

Проведенный нами сравнительный анализ организации геномов ВНО и ВОВ выявил большое число протяженных и коротких делеций в нуклеотидных последовательностях этих вирусов относительно друг друга, что в совокупности с рядом других признаков позволяет сделать вывод о том, что ВНО и ВОВ эволюционировали независимо от общего предшественника, и что вирус осповакцины не мог быть прямым потомком существующих в настоящее время вирусов натуральной оспы.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы клоиотеки гибридных плазмид и космид, содержащих ЯшЛИ- и Хйо1-фрагменты ДНК вируса натуральной оспы штамма Индия-1967 (ВНО-ИНД) и покрывающих в совокупности весь вирусный геном. Создана и охарактеризована коллекция гибридных плазмид, содержащих Хко\-фрагменты ДНК вируса натуральной оспы штамма Гарсия-1966 (ВНО-ГАР). Клонотеки гибридных ДНК ВНО паспортизованы и сданы на хранение в Международный репозиторий штаммов и ДНК ВНО (ГНЦ ВБ «Вектор»)

2. Впервые - секвенированы геномы высоковирулентного ВНО-ИНД и низковирулентного ВНО-ГАР. Нуклеотидные последовательности ВНО-ИНД (185578 п.н.) и ВНО-ГАР (186 986 п.н.) аннотированы и зарегистрированы в Международном банке данных EMBL Data Library под номерами Х69198 и Y16780.

3. Построены полные генетические (трансляционные) карты геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР, содержащие соответственно 200 и 206 потенциальных открытых рамок трансляции. Осуществлен сравнительный анализ Структурно-функциональной организации геномов вирусов натуральной оспы, осповакцины (ВОВ) и оспы верблюдов (ВОВБ). Впервые выявлены видоспецифичные различия генетических стратегий ВНО, ВОВ и ВОВБ.

4. Выполнен детальный сравнительный анализ внутривидовых и межвидовых структурных перестроек ДНК на примере двух штаммов ВНО и двух штаммов ВОВ, на основании которого сделано заключение, что ВНО и ВОВ эволюционировали от общего вируса-прародителя независимыми путями

Результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Щелкунов С.Н., Маренникова С.С., Тотменин А.В., Блинов В.М., Чижиков В.Е., Гуторов В.В., Сафронов П.Ф., Поздняков С.Г., Шелухина Э.М., Гашников П.В., Анджапаридзе О.Г., Сандахчиев Л.С. (1991) Создание клонотек фрагментов генома вируса натуральной оспы и изучение структурно-функциональной организации вирусных генов круга хозяев. Докл. АН СССР, Т. 321, С. 402- 406.

2. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Тотменин А В., Маренникова С.С., Колыхалов А.А., Фролов И.В., Чижиков В.Е., Гуторов В.В., Гашников П.В., Беланов Е.Ф., Белавин П.А., Ресенчук СМ., Шелухина Э.М., Нетесов СВ., Анджапаридзе О Г., Сандахчиев Л С. (1992) Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы. I. Клонирование HindIII- и XM-фрагментов вирусной ДНК и секвенирование HindIII-M, -L, -I-фрагментов. Молекуляр. биология, Т. 26, С. 1099-1115.

3. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Ресенчук СМ., Гуторов В.В.,Сафронов П.Ф., Курманов Р.К., Тотменин А.В., Чижиков В.Е.,Маренникова С.С., Сандахчиев Л.С. (1993) Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы. П. Анализ последовательности нуклеотидов района HindIII-C,E,R,Q,K и Н фрагментов ДНК штамма Индия-1967. Молекуляр. биология, Т. 27,С. 1287-1303.

4 Щелкунов С.Н, Блинов В.М., Ресенчук С.М., Денисов С.И., Тотменин А.В., Сандахчиев Л.С. (1993) Семейство анкиринподобных белков ортопоксвирусов. Докл РАН, Т. 328, С. 256-258.

5. Щелкунов С.Н., Маренникова С.С., Блинов В.М., Ресенчук СМ., Тотменин А.В , Чижиков В.Е., Гуторов В.В., Сафронов П.Ф., Курманов Р.К, Сандахчиев Л.С. (1993) Полная кодирующая последовательность генома вируса натуральной оспы. Докл. Академии наук, Т. 328, С. 629- 632.

6. Щелкунов С.Н, Ресенчук СМ., Тотменин А.В., Колыхалов А.А., Фролов И.В., Дрыга СМ., Волчков В.В., Чижиков В.Е., Гуторов В.В., Блинов В.М., Сандахчиев Л.С. (1994) Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы. III. Секвенирование и анализ последовательности нуклеотидов консервативного района HindIII- F-, -N-, и -А-фрагментов генома штамма Индия-1967. Молекуляр. биология, Т. 28, С. 392-406.

7. Блинов В.М., Тотменин А.В., Ресенчук С.М., Оленина Л.В. Чижиков В.Е., Колыхалов А.А., Фролов И.В., Гугоров В.В., Поздняков С.Г., Красных В.Н., Серпинский О.И., Сандахчиев Л.С, Щелкунов СЛ. (1995) Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы. IV. Секвенирование и анализ последовательности нуклеотидов правого конца генома штамма Индия-1967. Молекуляр. биология, Т. 29, С. 772-789.

8. Щелкунов С.Н., Тотменин А.В., Бабкин И.В., Сафронов П.Ф., Гуторов В.В., Поздняков СТ., Блинов В.М., Ресенчук С.М., Сандахчиев Л.С. (1996) Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы. V. Секвенирование и анализ последовательности нуклеотидов левого конца генома штамма Индия-1967. Молекуляр. биология. Т. 30. С. 595-612.

9. Shchelkunov, S.N., Blinov, V.M., Resenchuk, S.M., Totmenin, A.V. and Sandakhchiev, L.S. (1993) Analysis of the nucleotide sequence of 43 kbp segment of the genome ofvariola virus India-1967 strain. Virus Res., V. 30, P. 239-258.

10. Shchelkunov, S.N., Blinov, V.M., Totmenin, A.V., Marennikova, S.S., Kolykhalov, A.A., Frolov, I.V., Chizhikov, V.E., Gytorov, V.V., Gashnikov, P.V., Belanov, E.F., Belavin, PA., Resenchuk, S.M., Andzhaparidze, O.G. and Sandakhchiev, L.S. (1993) Nucleotide sequence analysis ofvariola virus HindIII M, L, I genome fragments. Virus Res., V. 27, P. 25-35.

11. Shchelkunov, S.N., Resenchuk, S.M., Totmenin, A.V., Blinov, V.M., Marennikova, S.S. and Sandakhchiev, L.S. (1993) Comparison of the genetic maps of variola and vaccinia viruses. FEBS Lett, V. 327, P. 321-324.

12. Shchelkunov, S.N. Blinov, V.M., Resenchuk, S.M., Totmenin, A.V., Olenina, L.V., Chirikova, G.B. and Sandakhchiev, L.S. (1994) Analysis ofthe nucleotide sequence of 53 kbp from the right terminus ofthe genome of variola major virus strain India-1967. Virus Res., V. 34, P. 207-236.

13. Shchelkunov, S.N., Resenchuk, S.M., Totmenin, A.V., Blinov, V.M. and Sandakhchiev, L.S. (1994) Analysis ofthe nucleotide sequence of48 kbp ofthe variola major virus strain India-1967 located on the right terminus ofthe conservative genome region. Virus Res., V. 32, P. 1-19.

14. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V. (1995) Two types of deletions in orthopoxvirus genomes. Virus Genes, V. 9, № 3, P. 231-245.

15. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Sandakhchiev L.S. (1996) Analysis of the nucleotide sequence of 23.8 kbp from the left terminus of the genome of variola major virus strain India-1967. Virus Res., V. 40, № 2, P. 169-183.

16. Massung R.F., Loparev V.N., Knight J.C., Totmenin A.V., Chizhikov V.E., Parsons J.M., Safronov P.F., Gutorov V.V., Shchelkunov S.N., Esposito J.J. (1996) Terminal region sequence variations in variola virus DNA. Virology, V. 221, № 2, P. 291-300.

17. Shchelkunov S.N., Totmenin A.V., Loparev V.N., Safronov P.F., Gutorov V.V., Chizhikov V.E., Knight J.C., Parsons J.M., Massung R.F., Esposito JJ. (2000) Alastrim smallpox variola minor virus genome DNA sequences. Virology, V. 266, № 2, P. 361-386.

Подписано в печать 16.01.2004 Формат 60x84 1/16 Печ.л. 1 Заказ № 12 Бумага офсетная, 80 гр/м2 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

i-2325

РНБ Русский фонд

2004-4 27623

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тотменин, Алексей Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Молекулярно-биологическая организация ортопоксвирусов.

1.2. Организация генома ортопоксвирусов.

1.3. Гены круга хозяев.

Ц 1.4. Молекулярные факторы вирулентности ортопоксвирусов.

1.5. Структурные перестройки в геномах ортопоксвирусов.

1.6. Модели возникновения дупликаций, транспозиций и делеций концевых последовательностей.

1.7. Гомологичная рекомбинация.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Выделение и анализ плазмидной ДНК.

2.3. Получение компетентных клеток Е.соИ.

2.4. Трансформация компетентных клеток Е.соИ.

2.5. Получение геномных библиотек в космидном векторе.

2.6. Компьютерный анализ данных секвенирования.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание плазмидных и космидных клонотек фрагментов ДНК ВНО

Щ штамма Индия-1967.

3.1.1. Получение и характеризация коллекций гибридных плазмид, содержащих НтбIII- и А7ю1-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967.

3.1.2. Получение и характеризация библиотеки космид, содержащих ///жШ1-фрагменты ДНК ВНО штамма Индия-1967.

3.1.3. Использование полученных клонотек фрагментов ДНК ВНО-ИНД для секвенирования полной кодирующей последовательности генома данного вируса.

3.2. Получение и характеризация коллекции гибридных плазмид, содержащих Л7/о1-фрагменты генома ВНО штамма Гарсия-1966.

3.3. Создание международного репозитория гибридных плазмид, содержащих фрагменты ДНК ВНО.

3.4. Организация генома вируса variola major ВНО-ИНД.

3.5. Сравнение геномов вирусов ВНО major и ВОВ.

3.6. Организация генома штамма Гарсия-1966 ВНО minor alastrim.

3.7. Сравнение геномов вирусов ВНО и вируса оспы верблюдов.

3.8. Сравнение организации молекулярных факторов вирулентности ВНО, ВОВиВОВБ.

3.9. Интегральная схема преодоления вирусом натуральной оспы защитных барьеров организма.

3.10. Молекулярная эволюция ортопоксвирусов.

3.10.1. Различия в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной оспы и осповакцины.

3.10.2. Механизмы рекомбинационных перестроек ортопоксвирусных ДНК.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы"

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования было создание и характеризация клонсггек фрагментов ДНК высоко- и низковирулентного штаммов вируса натуральной оспы и выполнение работы по секвенированию и компьютерному анализу организации вирусных генов и их белковых продуктов.

В процессе работы решались следующие задачи:

1. Получение представительных клонотек фрагментов генома вируса натуральной оспы штаммов Индия-1967 (ВНО-ИНД) и Гарсия-1966 (ВНО-ГАР) в плазмидных и ко см ид пых векторах. Надежная консервация полученного банка клонов фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО.

2. Проведение секвенирования полных последовательностей нуклеотидов геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР.

3. Построение полных генетических карт геномов двух изученных штаммов ВНО.

4. Осуществление подробного сравнительного анализа структурно-функцио-нальной организации изучаемых геномов вируса натуральной оспы и вируса осповакцины штаммов Копенгаген (ВОВ-КОП) и Вестерн Резерв (ВОВ-\У11).

Научная новизна и практическая значимость работы. Получена представительная библиотека гибридных плазмид и космид, несущих фрагменты генома ВНО-ИНД и ВНО-ГАР. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома высоковирулентного (ВНО-ИНД) и низковирулентного (ВНО-ГАР) штаммов вируса натуральной оспы. Осуществлен подробный анализ организации геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР и сравнение их с геномами вирусов осповакцины и оспы верблюдов. Выявлены потенциальные гены вирулентности ВНО. Выполнен детальный ф сравнительный анализ внутривидовых и межвидовых структурных перестроек ДНК ортопоксвирусов и сформулирована модель их возникновения. Впервые на основании анализа спектра коротких делеций в геноме ВНО относительно ВОВ сделан вывод об их видоспецифичности и независимом эволюционном происхождении ВНО и ВОВ от общего прародителя. Проведена надежная консервация полученных клонотек фрагментов ДНК двух изученных штаммов вируса натуральной оспы в составе Международного репозитория ДНК ВНО, что дает возможность использовать их в последующих научных исследованиях.

Публикации и апробация работы. По материалы диссертации опубликованы 17 статей в реферируемых изданиях. Результаты работы были представлены на международных конференциях: 9-th International Conference on Poxviruses and Iridoviruses (Les Diablerets, Switzerland, 1992), 9th International Congress of Virology (Glasgow, Scotland, 1993), 10th International Conference on Poxviruses and Iridoviruses (Banff, Alberta, Canada, 1994), 11th International Meeting on Poxviruses and Iridoviruses (Toledo, Spain, 1996), 12th International Poxvirus Simposium (St. Thomas, USA, 1998), International Conference on Bacterial and Viral Virulence Factors (Smolenice, Slovakia, 2000), 13th International Poxvirus and Iridovirus Symposium (Montpellier, France, 2000).

Вклад автора. Создание и характеризация клонотек фрагментов геномной ДНК штаммов Индия-1967 и Гарсия-1966 ВНО, компьютерный анализ организации генома штамма Гарсия-1966 ВНО, анализ структурных перестроек в нуклеотидных последовательностях ДНК вирусов натуральной ^ оспы и осповакцины выполнены лично автором; анализ организации генома штамма Индия-1967 ВНО выполнен автором совместно с В.М. Блиновым и сотрудниками лаборатории теоретической биологии и вирусологии ГНЦ ВБ «Вектор»; секвенирование ДНК вирусов натуральной оспы выполнено сотрудниками отдела молекулярной биологии геномов и отдела молекулярной вирусологии ГНЦ ВБ «Вектор» при участии автора.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Тотменин, Алексей Владимирович

4. ВЫВОДЫ

Щ 1. Получены и охарактеризованы клонотеки гибридных плазмид и космид, содержащих Hindlll- и Л7?о1-фрагменты ДНК вируса натуральной оспы штамма Индия-1967 (ВНО-ИНД) и покрывающих в совокупности весь вирусный геном. Создана и охарактеризована коллекция гибридных плазмид, содержащих Л7?о1-фрагменты ДНК вируса натуральной оспы штамма Гарсия-1966 (ВНО-ГАР). id Клонотеки гибридных ДНК ВНО паспортизованы и сданы на хранение в Международный репозиторий штаммов и ДНК ВНО (ГНЦ ВБ «Вектор»).

2. Впервые секвенированы геномы высоковирулентного ВНО-ИНД и низковирулентного ВНО-ГАР. Нуклеотидные последовательности ВНО-ИНД (185578 п.н.) и ВНО-ГАР (186 986 п.н.) аннотированы и зарегистрированы в Международном банке данных EMBL Data

Library под номерами Х69198 и Y16780.

3. Построены полные генетические (трансляционные) карты геномов ВНО-ИНД и ВНО-ГАР, содержащие соответственно 200 и 206 потенциальных открытых рамок трансляции. Осуществлен сравнительный анализ структурно-функциональной организации геномов вирусов натуральной оспы, осповакцины (ВОВ) и оспы верблюдов (ВОВБ). Впервые выявлены видоспецифичные различия генетических стратегий ВНО, ВОВ и ВОВБ.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тотменин, Алексей Владимирович, Кольцово

1. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Д. Гловера. М: Мир, 1988.-538 с.

2. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир, 1984.- 480 с.

3. Маренникова С.С., Шелухина Э.М., Ефремова Е.В. Новый аспект в биологии вируса оспы коров. // Acta Virol. 1984. - Т 28. - С. 437-444.

4. Пенмен Ш. Метаболизм вирусов и клеточная архитектура. // Вирусология / Под ред. Б. Филдса, Д. Найпа. М.: Мир, 1989. Т.1. -С.307-328.

5. Приходько Г.Г., Дегтярев С.Х., Речкунова Н.И., Сосновцев С.В., Чижиков В.Е. Общий метод определения участков расщепления ДНК эндонуютеазами рестрикции. // Биотехнология. 1990. - № 1. - С. 12-16.

6. Сафронов П.Ф., Петров H.A., Рязанкина О.И., Тотменин A.B., Щелкунов С.Н., Сандахчиев JI.C. Гены круга хозяев вируса оспы коров. // Докл. Академии наук. 1996. - Т. 249. - С. 829-833.

7. Сенкевич Т.Г., Арасланов P.P., Вовк Т.С., Лопарев В.Н., Черное В.И. Рекомбинанты вирусов осповакцины и эктромелии, вызывающиехарактерные для вируса эктромелии поражения у мышей. // Молекул, генет., микробиол. и вирусол. 1989. - Т. 8, С. 20-23.

8. Щелкунов С.Н., Блинов В.М., Ресенчук С.М., Денисов С.И., Тотменин А.В., Сандахчиев JT.C. Семейство анкиринподобных белков ортопоксвирусов. // Докл. РАН. 1993. - Т. 328. - С. 256-258.

9. Aguado В., Selmes I.P., Smith G.L. Nucleotide sequence of 21.8 kbp of variola major virus strain Harvey and comparison with vaccinia virus. // J.Gen.Virol. 1992. - V. 73 ( Pt 11). - P. 2887-2902.

10. Ahn B.Y., Gershon P.D., Jones E.V., Moss B. Identification of гроЗО, a vaccinia virus RNA polymerase gene with structural similarity to a eucaiyotic transcription elongation factor. // Mol. Cell. Biol. 1990a. - V. 10.-№ 10.-P. 5433-5441.

11. Ahn B.Y., Jones E.V., Moss B. Identification of the vaccinia virus gene encoding an 18-kilodalton subunit of RNA polymerase and demonstration of a 5' Poly(A) leader on its early transcript. // J. Virol. 1990b. - V. 64. - № 6. -P. 3019-3024.

12. Ahn B.Y., Moss B. Glutaredoxin homolog encoded by vaccinia virus is a virion-associated enzyme with thioltransferase and dehydroascorbate reductase activities. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992a. - V. 89. - № 15 -P. 7060-7064.

13. Ahn B.Y., Moss B. RNA polymerase-associated transcription specificity factor encoded by vaccinia virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992b. -V. 89.-№8.-P. 3536-3540.

14. Ahn B.Y., Rosel J., Cole, N.B., Moss B. Identification and expression of rpol9, a vaccinia virus gene encoding a 19-kilodalton DNA-dependent RNA polymerasee subunit. // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 2. - P. 971-982.

15. Ahuja S.K., Gao J.L., Murphy P.M. Chemokine receptors and molecular mimicry. // Immunol.Today. 1994. - V. 15. -№ 6. - P. 281-287.

16. Albertini A.M., Hofer M., Calos M.P., Miller J.H. On the formation of spontaneous deletions: the importance of short sequence homologies in the generation of large deletions. // Cell. 1982. - V. 29. - № 2. - P. 319-328.

17. Alcami A., Smith G.L. A soluble receptor for interleukin-1 beta encoded by vaccinia virus: a novel mechanism of virus modulation of the host response to infection. // Cell. 1992. - V. 71. - № l.-P. 153-167.

18. Alcami A., Smith G.L. Cytokine receptors encoded by poxviruses: a lesson in cytokine biology. // Immunol.Today. 1995a. - V. 16. - № 10. - P. 474478.

19. Alcami A., Smith G.L. Vaccinia, cowpox, and camelpox viruses encode soluble gamma interferon receptors with novel broad species specificity. // J. Virol. 1995b. - V. 69. - № 8. - P. 4633-4639.

20. Alcami A., Smith G.L. A mechanism for the inhibition of fever, by a virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - V. 93. - № 20. - P. 11029-11034.

21. Almazan F., Tscharke D.C., Smith G.L. The vaccinia virus superoxide dismutase-like protein (A45R) is a virion component that is nonessential for virus replication.//J. Virol. 2001. - V. 75.-№ 15.-P. 7018-7029.

22. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. // Nucleic Acids Res. 1997. - V. 25. - № 17. - P. 3389-3402.

23. Amegadzie B.Y., Ahn B.-Y., Moss B. Identification, sequence, and expression of the gene encoding a Mr 35,000 subunit of the vaccinia virus

24. DNA-dependent RNA polymerase. // J. Biol. Chem. 1991a. - V. 266. - № 21.-P. 13712-13718.

25. Appleyard G., Hapel A.J., Boulter E.A. An antigenic difference between intracellular and extracellular rabbitpox virus. // J.Gen.Virol. 1971. - V. 13. - № 1. - P. 9-17.

26. Archard L.C., Mackett M. Restriction endonuclease analysis of red cowpox virus and its white pock variant. // J.Gen.Virol. 1979. - V. 45. - № 1. - P. 51-63.

27. Archard L.C., Mackett M., Barnes D.E., Dumbell K.R. The genome structure of cowpox virus white pock variants. // J.Gen. Virol. 1984. - V. 65 ( Pt 5). - P. 875-886.

28. Ayares D., Chekuri L., Song K.Y., Kucherlapati R. Sequence homology requirements for intermolecular recombination in mammalian cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - № 14. - P. 5199-5203.

29. Baek S.H., Kwak J.Y., Lee S.H., Lee T., Ryu S.H., Uhlinger D.J., Lambeth J.D. Lipase activities of p37, the major envelope protein of vaccinia virus. // J. Biol. Chem. -1997. V. 272. - № 51. - P. 32042-32049.

30. Ball L.A. High-frequency homologous recombination in vaccinia virus DNA.//J. Virol. 1987.-V. 61.-№6.-P. 1788-1795.

31. BanhamA.H., Smith G.L. Vaccinia virus gene B1R encodes a 34-kDa serine/threonine protein kinase that localizes in cytoplasmic factories and is packaged into virions. // Virology. 1992. - V. 191. - № 2. - P. 803-812.

32. BanhamA.H., Smith G.L. Characterization of vaccinia virus gene B12R. // J. Gen. Virol. 1993. - V. 74. -№ 12. - P. 2807-2812.

33. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Incompletely base-paired flip-flop terminal loops link the two DNA strands of the vaccinia virus genome into one uninterrupted polynucleotide chain. // Cell. 1982. - V. 28. - № 2. - P. 315-324.

34. Baroudy B.M., Venkatesan S., Moss B. Structure and replication of vaccinia virus telomeres. // Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol. 1983. - V. 47 Pt 2. - P. 723-729.

35. Baxby D. Smallpox-like viruses from camels in Iran. // Lancet. 1972. - V. 2. -№7786. -P. 1063-1065.

36. Bayliss C.D., Smith G.L. Vaccinia virion protein I8R has both DNA and RNA helicase activities: implications for vaccinia virus transcription. // J. Virol. 1996. - V. 70. - № 2. - P. 794-800.

37. Beattie E., Tartaglia J., Paoletti E. Vaccinia virus-encoded eIF-2 alpha homolog abrogates the antiviral effect of interferon. // Virology. 1991. - V. 183.-№ 1. - P. 419-422.

38. Beattie E., Paoletti E., Tartaglia J. Distinct patterns of IFN sensitivity observed in cells infected with vaccinia K3L- and E3L- mutant viruses. //. Virology. 1995. - V. 210. - № 2. - P. 254-263.

39. Bedson H.S., Dumbell K.R. Hybrids derived from the viruses of variola major and cowpox. // J.Hyg.(Lond). 1964. - V. 62. - P. 147-158.

40. Bedson H.S., Dumbell K.R. Hybrids derived from the viruses of alastrim and rabbit pox. // J.Hyg.(Lond). 1964. - V. 62. - P. 141-146.

41. Benzer S. On the topography of the genetic fine structure. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961. - V. 47. - P. 403-415.

42. Blasco R., Cole N.B., Moss B. Sequence analysis, expression, and deletion of a vaccinia virus gene encoding a homolog of profilin, a eukaryotic actin-binding protein. // J. Virol. 1991. - V. 65. - № 9. - P. 4598-4608.

43. Blasco R., Moss B. Role of cell-associated enveloped vaccinia virus in cell-to-cell spread. //J. Virol. 1992. - V. 66. - № 7. - P. 4170-4179.

44. Blomquist M.C., Hunt L.T., Barker W.C. Vaccinia virus 19-kilodalton protein: relationship to several mammalian proteins, including two growth factors. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - № 23. - P. 73637367.

45. Born T.L., Morrison L.A., Esteban D.J., VandenBos T., Thebeau L.G., Chen N., Spriggs M.K., Sims J.E., Buller R.M. A poxvirus protein that binds to and inactivates IL-18, and inhibits NK cell response. // J.Immunol. 2000. -V. 164.-№6.-P. 3246-3254.

46. Brick D.J., Burke R.D., Minkley A.A., Upton C. Ectromelia virus virulence factor p28 acts upstream of caspase-3 in response to UV light-induced apoptosis. //J. Gen. Virol. 2000. - V. 81. -№ 4. - P. 1087-1097.

47. Brown C.K., Turner P.C., Moyer R.W. Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // J. Virol. 1991. - V. 65. - № 7. - P. 3598-3606.

48. Brown G.D., Moyer R.W. The white pock mutants of rabbit poxvirus: V. In vitro translation of early host range mutant mRNA. // Virology. 1983. - V. 126.-№ 1.-P. 381-390.

49. Brown G.D., Peluso R.W., Moyer S.A., Moyer R.W. A simple method for the preparation of extracts from animal cells which catalyze efficient in vitro protein synthesis. // J.Biol.Chem. 1983. - V. 258. - № 23. - P. 1430914314.

50. Brown J.P., Twardzik D.R., Marquardt H., Todaro G.J. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transforming growth factor. // Nature. 1985. - V. 313. - № 6002. - P. 491492.

51. Brown S.D., Piechaczyk M. Insertion sequences and tandem repetitions as sources of variation in a dispersed repeat family. // J.Mol.Biol. 1983. - V. 165.-№2.-P. 249-256.

52. Broyles S.S., Fesler B.S. Vaccinia virus gene encoding a component of the viral early transcription factor. // J. Virol. 1990. - V.64. - № 4. - P.1523-1529.

53. Broyles S.S., Moss B. Identification of the vaccinia virus gene encoding nucleoside triphosphate phosphohydrolase I, a DNA-dependent ATPase. // J. Virol. 1987.-V. 61. -№ 5.-P. 1738-1742.

54. Buller R.M., Smith G.L., Cremer K., Notkins A.L., Moss B. Decreased virulence of recombinant vaccinia virus expression vectors is associatedwith a thymidine kinase-negative phenotype. // Nature. 1985. - V. 317. - № 6040.-P. 813-815.

55. Buller R.M., Chakrabarti S., Cooper J. A., Twardzik D.R., Moss B. Deletion of the vaccinia virus growth factor gene reduces virus virulence. // J. Virol. -1988. V. 62. - № 3. - P. 866-874.

56. Buller R.M., Palumbo G.J. Poxvirus pathogenesis. // Microbiol.Rev. 1991. -V. 55. - № 1. - P. 80-122.

57. Cairns J. The initiation of vaccinia infection. // Virology. 1960. - V. 11.-P. 603-623.

58. Calderara S., Xiang Y., Moss B. Orthopoxvirus IL-18 binding proteins: affinities and antagonist activities. // Virology. 2001. - V. 279. - № 1. - P. 22-26.

59. Calos M.P., Galas D., Miller J.H. Genetic studies of the lac repressor. VIII. DNA sequence change resulting from an intragenic duplication. // J.Mol.Biol. 1978. - V. 126. - № 4. - P. 865-869.

60. Chambers S.P., Prior S.E., Barstow D.A., Minton N.P. The pMTL nic-cloning vectors. I. Improved pUC polylinker regions to facilitate the use of sonicated DNA for nucleotide sequencing. // Gene. 1988. - V. 68. - № 1. -P. 139-149.

61. Chang H.W., Watson J.C., Jacobs B.L. The E3L gene of vaccinia virus encodes an inhibitor of the interferon-induced, double-stranded RNA-dependent protein kinase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. - V. 89. - № 11.-P. 4825-4829.

62. Chang W., Lim J.G., Hellstrom I., Gentry L.E. Characterization of vaccinia virus growth factor biosynthetic pathway with an antipeptide antiserum. // J. Virol. 1988. - V. 62. - № 3. - P. 1080-1083.

63. Chapin C.V. Variation in type of infectious disease as shown by the history of smallpox in the United States 1895-1912. // J. Infect. Dis. 1913. - V. 13. -P. 171-196.

64. Chapin C.V. and Smith J. Permanency of the mild type of smallpox. // J. Prevent. Med. 1932. - V. 6. - P. 273-320.

65. Chen W., Drillien R., Spehner D., Buller R.M. Restricted replication of ectromelia virus in cell culture correlates with mutations in virus-encoded host range gene. // Virology. 1992. - V.187. - № 2. - P. 433-442.

66. Chernos V.I., Antonova T.P., Senkevich T.G. Recombinants between vaccinia and ectromelia viruses bearing the specific pathogenicity markers of both parents. // J.Gen.Virol. 1985. - V. 66 ( Pt 3). - P. 621-626.

67. Christen L.M., Sanders M., Wiler C., Niles E.G. Vaccinia virus nucleoside triphosphate phosphohydrolase I is an essential viral early gene transcription termination factor. // Virology. 1998. - V. 245. - № 2. - P.360-371.

68. Chung C.S., Hsiao J.C., Chang Y.S., Chang W. A27L protein mediates vaccinia virus interaction with cell surface heparan sulfate. // J. Virol. -1998. V. 72. - № 2. - P. 1577-1585.

69. Clark A.G. Invasion and maintenance of a gene duplication. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. -№ 8. - P. 2950-2954.

70. Colby C., Duesberg P.H. Double-stranded RNA in vaccinia virus infected cells. // Nature. 1969. - V. 222. - № 197. - P. 940-944.

71. Collins J., Hohn B. Cosmids: a type of plasmid gene-cloning vector that is packageable in vitro in bacteriophage lambda heads. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - № 9. - P. 4242-4246.

72. Dales S., Siminovitch L. The development of vaccinia virus in Earle's L strain cells as examined by electron microscopy. // J. Biophys. Biochem. Cytol. 1961. - V. 10. - P. 475-503.

73. Dallo S., Esteban M. Isolation and characterization of attenuated mutants of vaccinia virus. // Virology. 1987. - V. 159. - № 2. - P. 408-422.

74. Davis R.E., Mathews C.K. Acidic C terminus of vaccinia virus DNA-binding protein interacts with ribonucleotide reductase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - № 2. - P. 745-749.

75. De Korte W.E. Amaas, or kaffir milk-pox. // Lancet. 1904. - V. 1. - P. 1273-1276.

76. DeLange A.M., Macaulay C., Block W., Mueller T., McFadden G. Tumorigenic poxviruses: construction of the composite physical map of the Shope fibroma virus genome. // J. Virol. 1984. - V. 50. - № 2. - P. 408416.

77. DeLange A.M., Reddy M., Scraba D., Upton C., McFadden G. Replication and resolution of cloned poxvirus telomeres in vivo generates linear minichromosomes with intact viral hairpin termini. // J. Virol. 1986. - V. 59.-№2.-P. 249-259.

78. Douglass N.J., Richardson M., Dumbell K.R. Evidence for recent genetic variation in monkeypox viruses. // J.Gen.Virol. 1994. - V. 75 ( Pt 6). - P. 1303-1309.

79. Drillien R., Koehren F., Kirn A. Host range deletion mutant of vaccinia virus defective in human cells. // Virology. 1981. - V. 111. - № 2. - P. 488499.

80. Dumbell K.R., Huq F. Epidemiological implications of the typing of variola isolates. // Trans.R.Soc.Trop.Med.Hyg. 1975. - V. 69. -№ 3. - P. 303-306.

81. Dumbell K.R., Archard L.C. Comparison of white pock (h) mutants of monkeypox virus with parental monkeypox and with variola-like viruses isolated from animals. // Nature. 1980. - V. 286. - № 5768. - P. 29-32.

82. Dumbell K.R., Huq F. The virology of variola minor. Correlation of laboratory tests with the geographic distribution and human virulence of variola isolates. //Am .J.Epidemiol. 1986. - V. 123. -№ 3. - P. 403-415.

83. Duncan S.A., Smith G.L. Identification and characterization of an extracellular envelope glycoprotein affecting vaccinia virus egress. // J. Virol. 1992a.-V. 66.-№3.-P. 1610-1621.

84. Duncan S.A., Smith G.L. Vaccinia virus gene SalF5R is non-essential for virus replication in vitro and in vivo. II J. Gen. Virol. 1992b. - V. 73. - № 5. -P. 1235-1242.

85. Dyster L.M., Niles E.G. Genetic and biochemical characterization of vaccinia virus genes D2L and D3R which encode virion structural proteins. // Virology. 1991. - V. 182. - № 2. - P. 455-467.

86. Earl P.L., Jones E.V., Moss B. Homology between DNA polymerase of poxviruses, herpesviruses, and adenoviruses: Nucleotide sequence of the vaccinia virus DNA polymerase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. -№11.-P. 3659-3663.

87. Engelstad M., Howard S.T., Smith G.L. A constitutively expressed vaccinia gene encodes a 42-kDa glycoprotein related to complement control factors that forms part of the extracellular virus envelope. // Virology. 1992. - V. 188.-№2.-P. 801-810.

88. Engelstad M., Smith G.L. The vaccinia virus 42-kDa envelope protein is required for the envelopment and egress of extracellular virus and for virus virulence. // Virology. 1993. - V. 194. - № 2. - P. 627-637.

89. Esposito J.J., Cabradilla C.D., Nakano J.H., Obijeski J.F. Intragenomic sequence transposition in monkeypox virus. // Virology. 1981. - V. 109. -№2.-P. 231-243.

90. Esposito J.J., Knight J.C. Orthopoxvirus DNA: a comparison of restriction profiles and maps. // Virology. 1985. - V. 143. - № 1. - P. 230-251.

91. Evans D.H., Stuart D., McFadden G. High levels of genetic recombination among cotransfected plasmid DNAs in poxvirus-infected mammalian cells. // J. Virol. 1988. - V. 62. - № 2. - P. 367-375.

92. Evans E., Klemperer N., Ghosh R., Traktman P. The vaccinia virus D5 protein, which is requered for DNA replication, is a nucleic acidindependent nucleoside triphosphatase. // J. Virol. 1995. - V.69. - № 9. - P. 5353-5361.

93. Farabaugh P.J., Schmeissner U., Hofer M., Miller J.H. Genetic studies of the lac repressor. VII. On the molecular nature of spontaneous hotspots in the lacl gene of Escherichia coli. II J.Mol.Biol. 1978. - V. 126. - № 4. - P. 847857.

94. Fathi Z., Dyster L.M., Seto J., Condit R.C., Niles E.G. Intragenic and intergenic recombination between temperature-sensitive mutants of vaccinia virus. // J.Gen.Virol. 1991. - V. 72 ( Pt 11). - P. 2733-2737.

95. Fenner F. The biological characters of several strains of vaccinia, cowpox and rabbitpox viruses. // Virology. 1958. - V. 5. - № 3. - P. 502-529.

96. Fenner F., Comben B.M. Genetic studies with mammalian poxviruses. I. Demonstration of recombination between two strains of vaccina virus. // Virology. 1958. - V. 5. - № 3. - P. 530-548.

97. Fenner, F., Henderson, D.A., Arita, I., Jezek, Z., and Ladnyi I.D. "Smallpox and Its Eradication". 1988. - World Health Organization, Geneva, Switzerland.

98. Fenner F., Sambrook J.F. Conditional lethal mutants of rabbitpox virus. II. Mutants (p) that fail to multiply in PK-2a cells. // Virology. 1966. - V. 28. -№ 4. - P. 600-609.

99. Fenner, F., Wittek, R., and Dumbell, K.R. "The Orthopoxviruses". 1989. -Academic Press, Inc., San Diego.

100. Frischknecht F., Moreau V., Rottger S., Gonfloni S., Reckmann I., Superti-Furga G., Way M. Actin-based motility of vaccinia virus mimics receptor tyrosine kinase signalling. // Nature. 1999. - V.401. - № 6756. - P. 926929.

101. Funahashi, S., Sato, T., Shida, H. Cloning and characterization of the gene encoding the major protein of the A-type inclusion body of cowpox virus. // J. Gen. Virol. 1988. - V. 69. - P. 35-47.

102. Gagliardini V., Fernandez P.A., Lee R.K., Drexler H.C., Rotello R.J., Fishman M.C., Yuan J. Prevention of vertebrate neuronal death by the crmA gene. // Science. 1994. - V. 263. -№ 5148. - P. 826-828.

103. Garon C.F., Barbosa E., Moss B. Visualization of an inverted terminal repetition in vaccinia virus DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75.-№ 10.-P. 4863-4867.

104. Gemmell A., Fenner F. Genetic studies with mammalian poxviruses. III. White (u) mutants of rabbitpox virus. // Virology. 1960. - V. 11. - P. 219235.

105. Gershon P.D., Ahn B.-Y., Garfield M., Moss B. Poly(A) polymerase and a dissociable polyadenylation stimulatory factor encoded by vaccinia virus. // Cell. 1991.-V.66.-№6.-P. 1269-1278.

106. Gershon P.D., Moss B. Early transcription factor subunits are encoded by vaccinia virus late genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V.87. - № 11.-P. 4401-4405.

107. Geshelin P., Berns K.I. Characterization and localization of the naturally occurring cross-links in vaccinia virus DNA. // J.Mol.Biol. 1974. - V. 88. -№4.-P. 785-796.

108. Gillard S., Spehner D., Drillien R., Kirn A. Localization and sequence of a vaccinia virus gene required for multiplication in human cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83. - № 15. - P. 5573-5577.

109. Goebel S.J., Johnson G.P., Perkus M.E., Davis S.W., Winslow J.P., Paoletti E. The complete DNA sequence of vaccinia virus. // Virology. 1990. - V. 179. -№ l.-P. 247-263.

110. Golini F., Kates J.R. Transcriptional and translational analysis of a strongly expressed early region of the vaccinia virus genome. // J. Virol. 1984. -V.49. - № 2. - P. 459-470.

111. Grady L.J., Paoletti E. Molecular complexity of vaccinia DNA and the presence of reiterated sequences in the genome. // Virology. 1977. - V. 79. -№ 2.-P. 337-341.

112. Gross C.H., Shuman S. The nucleoside triphosphatase and helicase activities of vaccinia virus NPH-II are essential for virus replication. // J. Virol. -1998. V.72. - № 6. - P. 4729-4736.

113. Guan K., Broyles S.S., Dixon J.E. A Tyr/Ser protein phosphatase encoded by vaccinia virus. //Nature. 1991. - V.350. - № 6316. - P. 359-362.

114. Gubser C., Smith G.L. The sequence of camelpox virus shows it is most closely related to variola virus, the cause of smallpox. // J.Gen.Virol. 2002. - V. 83. - № Pt 4.-P. 855-872.

115. Gvakharia B.O., Koonin E.K., Mathews C.K. Vaccinia virus G4L gene encodes a second glutaredoxin. // Virology. 1996. - V.226. - № 2. - P. 408411.

116. Haenlin M., Steller H., Pirrotta V., Mohier E. A 43 kilobase cosmid P transposon rescues the fs(l)K10 morphogenetic locus and three adjacent Drosophila developmental mutants. // Cell. 1985. - V. 40. - № 4. - P. 827837.

117. Harford C.G., Hamlin A., Rieders E. Electron microscopic autoradiography of DNA synthesis in cells infected with vaccinia virus. // Exp.Cell Res. -1966.-V. 42. № 1. - P. 50-57.

118. Hirt P., Hiller G., Wittek R. Localization and fine structure of a vaccinia virus gene encoding an envelope antigen. // J. Virol. 1986. - V. 58. - № 3. -P. 757-764.

119. Hsiao J.C., Chung C.S., Chang W. Vaccinia virus envelope D8L protein binds to cell surface chondroitin sulfate and mediates the adsorption of intracellular mature virions to cells. // J. Virol. 1999. - V. 73. - № 10. - P. 8750-8761.

120. Hsu D.H., de Waal M.R., Fiorentino D.F., Dang M.N., Vieira P., de Vries J., Spits H., Mosmann T.R., Moore K.W. Expression of interleukin-10 activity by Epstein-Barr virus protein BCRF1. // Science. 1990. - V. 250. - № 4982. - P. 830-832.

121. Hu F.Q., Smith C.A., Pickup D.J. Cowpox virus contains two copies of an early gene encoding a soluble secreted form of the type II TNF receptor. // Virology. 1994. - V. 204. - № 1. - P.343-356.

122. Hu X., Wolffe E.J., Weisberg A.S., Carroll L.J., Moss B. Repression of the A8L gene, encoding the early transcription factor 82-kilodalton subunit, inhibits morphogenesis of vaccinia virions. // J. Virol. 1998. - V. 72. - № 1. -P. 104-112.

123. Hughes S.J., Johnston L.H., De Carlos A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes an active thymidylate kinase that complements a cdc8 mutant of Saccharomyces cerevisiae. II J. Biol. Chem. 1991. - V. 266. - № 30. - P. 20103-20109.

124. Ichihashi Y., Takahashi T., Oie M. Identification of a vaccinia virus penetration protein. // Virology. 1994. - V.202. - № 2. - P. 834-843.

125. Isaacs S.N., Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus complement-control protein prevents antibody-dependent complement-enhanced neutralization of infectivity and contributes to virulence. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992a. V. 89. - № 2. - P. 628-632.

126. Isaacs S.N., WolfFe E.J., Payne L.G., Moss B. Characterization of a vaccinia virus-encoded 42-kilodalton class I membrane glycoprotein component of the extracellular virus envelope. // J. Virol. 1992b. - V. 66. - № 12. - P. 7217-7224.

127. Ishii K., Moss B. Role of vaccinia virus A20R protein in DNA replication: construction and characterization of temperature-sensitive mutants. // J. Virol. 2001. - V. 75. - № 4. - P.1656-1663.

128. Jin D.Y., Li Z.L., Jin Q., Hao Y.W., Hou Y.D. Vaccinia virus hemagglutinin. A novel member of the immunoglobulin superfamily. // J.Exp.Med. 1989. - V. 170. - № 2. - P. 571-576.

129. Joklik W.K., Becker Y. The replication and coating of vaccinia DNA. // J.Mol.Biol. 1964. - V. 10. - P. 452-474.

130. Kane E.M., Shuman S. Temperature-sensitive mutations in the vaccinia virus H4 gene encoding a component of the virion RNA polymerase. // J. Virol. 1992. - V.66. - № 10. - P.5752-5762.

131. Kane E.M., Shuman S. Vaccinia virus morphogenesis is blocked by a temperature-sensitive mutation in the 17 gene that encodes a virion component. // J. Virol. 1993. - V. 67. - № 5. - P. 2689-2698.

132. Kaverin N.V., Varich N.L., Surgay V.V., Chernos V.I. A quantitative estimation of poxvirus genome fraction transcribed as "early" and "late" mRNA.//Virology. 1975.-V. 65.-№ 1. - P. 112-119.

133. Kao S.-Y., Bauer W.R. Biosynthesis and phosphorylation of vaccinia virus structural protein VP11. // Virology. 1987. - V. 159. - № 2. - P.339-407.

134. Keck J.G., Baldick C.J., Moss B. Role of DNA replication in vaccinia virus gene expression: A naked template is required for transcription of three late trans-activator genes. // Cell. 1990. - V. 61. - № 5. - P. 801-809.

135. Keck J.G., Feigenbaum F., Moss B. Mutational analysis of a predicted zinc-binding motif in the 26-kilodalton protein encoded by the vaccinia virus

136. A2L gene: correlation of zinc binding with late transcriptional transactivation activity. U J. Virol. 1993a. - V. 67. - № 10. - P. 5749-5753.

137. Keck J.G., Kovacs G.R., Moss B. Overexpression, purification, and late transcription factor activity of the 17-kilodalton protein encoded by the vaccinia virus AIL gene. // J. Virol. 1993b. - V. 67. - № 10. - P. 57405748.

138. Kerr S.M., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a polypeptide with DNA Iigase activity. //Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - № 22. - P. 9039-9050.

139. Klemperer N., McDonald W., Boyle K., Unger B., Traktman P. The A20R protein is a stoichiometric component of the processive form of vaccinia virus DNA polymerase. // J. Virol. 2001. - V. 75. - № 24. - P. 1229812307.

140. Koonin E.V. A highly conserved sequence motif defining the family of MutT-related proteins from eubacteria, eukaryotes and viruses. // Nucleic Acids Res. 1993. - V. 21. - № 20. - P. 4847-4849.

141. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes a secretory polypeptide structurally related to complement control proteins. // Nature. 1988a. - V. 335.-№6186.-P. 176-178.

142. Kotwal G.J., Moss B. Analysis of a large cluster of nonessential genes deleted from a vaccinia virus terminal transposition mutant. // Virology. -1988b. V. 167. - № 2. - P. 524-537.

143. Kotwal G.J., Moss B. Vaccinia virus encodes two proteins that are structurally related to members of the plasma serine protease inhibitor superfamily. //J. Virol. 1989. - V. 63. - P. 600-606.

144. Kovacs G.R., Moss B. The vaccinia virus H5R gene encodes late gene transcription factor 4: purification, cloning and overexpression. // J. Virol.1996.-V. 70.-№ 10.-P. 6796-6802.f

145. Kovacs G.R., Vasilakis N., Moss B. Regulation of viral intermediate gene expression by the vaccinia virus B1 protein kinase. // J. Virol. 2001. - V. 75.-№9.-P. 4048-4055.

146. Kumar S., Tamura K., Jakobsen I.B., Nei M. MEGA2: molecular evolutionary genetics analysis software. // Bioinformatics. 2001. - V. 17. -№12.-P. 1244-1245.

147. Lake J.R., Cooper P.D. Deletions of the terminal sequences in the genomes of the white pock (u) and host-restricted (p) mutants of rabbitpox virus. // J.Gen.Virol. 1980. - V. 48. - № 1. - P. 135-147.

148. Lambert S., Yu H., Prchal J.T., Lawler J., Ruff P., Speicher D., Cheung M.C., Kan Y.W., Palek J. cDNA sequence for human erythrocyte ankyrin. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - V. 87. -№ 5. - P. 1730-1734.

149. Law K.M., Smith G.L. A vaccinia serine protease inhibitor which prevents B virus-induced cell fusion. // J. Gen. Virol. 1992. - V. 73. - № 3. - P. 549557.

150. Lee-Chen G.-J., Bourgeois N., Davidson K., Condit R.C., Niles E.G. Structure of the transcription and termination sequence of seven early genes in the vaccinia virus Hindlll D fragment. // Virology. 1988. - V. 163. - № l.-P. 64-79.

151. Lin S., Chen W., Broyles S.S. The vaccinia virus B1R gene product is a serine/threonine protein kinase. // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 5. - P. 27172723.

152. Loh P.C., Riggs J.L. Demonstration of the sequential development of vaccinial antigens and virus in infected cells: observations with cytochemical and differential fluorescent procedures. // J. Exp. Med. 1961. -V. 114.-P. 149-160.

153. Lopez P., Espinosa M., Greenberg B., Lacks S.A. Generation of deletions in pneumococcal mal genes cloned in Bacillus subtilis. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. -№ 16. - P. 5189-5193.

154. Lux S.E., John K.M., Bennett V. Analysis of cDNA for human erythrocyte ankyrin indicates a repeated structure with homology to tissue-differentiation and cell-cycle control proteins. // Nature. 1990. - V. 344. -№6261.-P. 36-42.

155. Maa J.-S., Esteban M. Structural and functional characterization of cell surface binding protein of vaccinia virus. // J. Virol. 1987. - V. 61. - № 12. -P. 3910-3919.

156. Maa J.-S., Rodriguez J.F., Esteban M. Structural and functional characterization of a cell surface binding protein of vaccinia virus. // J. Biol. Chem.- 1990.-V. 265.-№3.-P. 1569-1577.

157. Mackett M., Archard L.C. Conservation and variation in Orthopoxvirus genome structure. // J.Gen.Virol. 1979. - V. 45. - № 3. - P. 683-701.

158. Marotta C.A., Wilson J.T., Forget B.G., Weissman S.M. Human beta-globin messenger RNA. III. Nucleotide sequences derived from complementary DNA. // J. Biol. Chem. 1977. - V. 252. - № 14. - P. 5040-5053.

159. Martin K.H., Grosenbach D.W., Franke C.A., Hruby D.E. Identification and analysis of three myristylated vaccinia virus late proteins. // J. Virol. 1997. - V.71.-№7.-P. 5218-5226.

160. Martinez-Pomares L., Thompson J.P., Moyer R.W. Mapping and investigation of the role in pathogenesis of the major unique secreted 35-kDa protein of rabbitpox virus. // Virology. 1995. - V. 206. - № 1. - P. 591600.

161. Massague J., Pandiella A. Membrane-anchored growth factors. // Annu.Rev.Biochem. 1993. - V. 62. - P. 515-541.

162. Massung R.F., Liu L.I., Qi J., Knight J.C., Yuran T.E., Kerlavage A.R., Parsons J.M., Venter J.C., Esposito J.J. Analysis of the complete genome of smallpox variola major virus strain Bangladesh-1975. // Virology. 1994. -V. 201.-№2.-P. 215-240.

163. Massung R.F., Knight J.C., Esposito J.J. Topography of variola smallpox virus inverted terminal repeats. // Virology. 1995. - V. 211. - № 1. - P. 350355.

164. Maxam A.M., Gilbert W. Sequencing end-labeled DNA with base-specific chemical cleavages. // Methods Enzymol. 1980. - V. 65. - № 1. - P. 499560.

165. McClain M.E., Greenland R.M. Recombination between rabbitpox virus mutants in permissive and nonpermissive cells. // Virology. 1965. - V. 25. -P. 516-522.

166. McClain M.E. The host range and plaque morphology of rabbitpox virus (Rpu+) and its u mutants on chick fibroblast, PK-2A, and L929 cells. // Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci. 1965. - V. 43. - P. 31-44.

167. McFadden G., Dales S. Biogenesis of poxviruses: mirror-image deletions in vaccinia virus DNA. // Cell. 1979. - V. 18. - № 1. - P. 101-108.

168. McGeoch D.J. Protein sequence comparisons show that 'pseudoproteases' encoded by the poxviruses and certain retroviruses belong to the deoxyuridine triphosphatase family. // Nucl. Acids Res. 1990. - V. 18. - P. 4105-4110.

169. Mcintosh A.A., Smith G.L. Vaccinia virus glycoprotein A34R is required for infectivity of extracellular enveloped virus. // J. Virol. 1996. - V. 70. -№ 1. - P. 272-281.

170. Meis R.J., Condit R.C. Genetic and molecular biological characterization of vaccinia virus gene which renders the virus dependent on isatin-P-thiasemicarbazone (IBT). // Virology. 1991. - V. 182. - № 2. - P. 442-454.

171. Merchlinsky M., Moss B. Resolution of linear minichromosomes with hairpin ends from circular plasmids containing vaccinia virus concatemer junctions. // Cell. 1986. - V. 45. - № 6. - P. 879-884.

172. Merchlinsky M., Moss B. Nucleotide sequence required for resolution of the concatemer junction of vaccinia virus DNA. // J. Virol. 1989. - V. 63. - № 10.-P. 4354-4361.

173. Merchlinsky M. Intramolecular homologous recombination in cells infected with temperature-sensitive mutants of vaccinia virus. // J. Virol. 1989. - V. 63.-№5.-P. 2030-2035.

174. Meyer H., Neubauer H., Pfeffer M. Amplification of'variola virus-specific' sequences in German cowpox virus isolates. // J.Vet.Med.B Infect.Dis.Vet.Public Health. 2002. - V. 49. - № 1. - P. 17-19.

175. Miller C.G., Justus D.E., Jayaraman S., Kotwal G.J. Severe and prolonged inflammatory response to localized cowpox virus infection in footpads of

176. C5-deficient mice: investigation of the role of host complement in poxvirus pathogenesis. // Cell Immunol. 1995. - V. 162. - № 2. - P. 326-332.

177. Moore J.B., Smith G.L. Steroid hormone synthesis by a vaccinia enzyme: a new type of virus virulence factor. // EMBO J. 1992. - V. 11. - № 5. - P. 1973-1980.

178. Morgan J.R., Cohen L.K., Roberts B.E. Identification of the DNA sequence encoding the large subunit of the mRNA-capping enzyme of vaccinia virus. //J. Virol. 1984. - V. 52.-№ l.-P. 206-214.

179. Morgan J.R., Roberts B.E. Organization of RNA transcripts from a vaccinia virus early gene cluster. // J. Virol. 1984. - V. 51. - № 2. - P. 283-297.

180. Moss B. Poxviridae: The viruses and their replication. In "Virology" (B.N. Fields, D.M. Knipe, R.M. Chanock, T.P. Monath, P.M. Howley, J.L. Melnick, B. Roizman, and S.E. Straus, Eds.), Vol. 2. 1996. - LippincottRaven. Philadelphia, pp. 2637-2671.

181. Moss B., Winters E., Cooper N. Instability and reiteration of DNA sequences within the vaccinia virus genome. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1981.-V.78.-№3.-P. 1614-1618.

182. Moss B., Winters E., Cooper J.A. Deletion of a 9,000-base-pair segment of the vaccinia virus genome that encodes nonessential polypeptides. // J. Virol. 1981. - V. 40. -№ 2. - P. 387-395.

183. Mossman K., Upton C., Buller R.M., McFadden G. Species specificity of ectromelia virus and vaccinia virus interferon-gamma binding proteins. //

184. Virology. 1995. - V. 208. - № 2. - P. 762-769.

185. Moyer R.W., Graves R.L., Rothe C.T. The white pock (mu) mutants of rabbit poxvirus. III. Terminal DNA sequence duplication and transposition in rabbit poxvirus. // Cell. 1980. - V. 22. - № 2 Pt 2. - P. 545-553.

186. Moyer R.W., Rothe C.T. The white pock mutants of rabbit poxvirus. I. Spontaneous host range mutants contain deletions. // Virology. 1980. - V. 102.-№ l.-P. 119-132.

187. Moyer R.W., Graves R.L. The mechanism of cytoplasmic orthopoxvirus DNA replication. // Cell. 1981. - V. 27. - № 2 Pt 1. - P. 391-401.

188. Moyer R.W., Graves R.L. The white pock mutants of rabbit poxvirus. IV. The late white pock (mu) host range (hr) mutants of rabbit poxvirus are blocked in morphogenesis. // Virology. 1982. - V. 119. - № 2. - P. 332346.

189. Najarro P., Traktman P., Lewis J.A. Vaccinia virus blocks gamma interferon signal transduction: viral VH1 phosphatase reverses Statl activation. // J. Virol. 2001. - V. 75. - № 7. - P. 3185-3196.

190. Nakano E., Panicali D., Paoletti E. Molecular genetics of vaccinia virus: demonstration of marker rescue. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79.-№5.-P. 1593-1596.

191. Ng A., Tscharke D.C., Reading P.C., Smith G.L. The vaccinia virus A41L protein is a soluble 30 kDa glycoprotein that affects virus virulence. // J. Gen. Virol. 2001. - V. 82. -№ 9. - P. 2095-2105.

192. Niles E.G., Lee-Chen G.-J., Shuman S., Moss B., Broyles S.S. Vaccinia virus gene D12L encodes the small subunit of the viral mRNA capping enzyme. // Virology. 1989. - V. 172. - № 2. - P. 513-522.

193. Niles E.G., Seto J. Vaccinia virus gene D8 encodes a virion transmembrane protein. // J. Virol. 1988. - V. 62. - № 10. - P. 3772-3778.

194. Novick D., Kim S.H., Fantuzzi G., Reznikov L.L., Dinarello C.A., Rubinstein M. Interleukin-18 binding protein: a novel modulator of the Thl cytokine response. // Immunity. 1999. - V. 10. - № 1. - P. 127-136.

195. Oguiura N., Spehner D., Drillien R. Detection of a protein encoded by the vaccinia virus C7L open reading frame and study of its effect on virus multiplication in different cell lines. // J.Gen.Virol. 1993. - V. 74 ( Pt 7). -P. 1409-1413.

196. Oie M., Shida H., Ichihashi Y. The function of the vaccinia hemagglutinin in the proteolytic activation of infectivity. // Virology. 1990. - V. 176. - № 2.-P. 494-504.

197. Okamura H., Tsutsui H., Kashiwamura S., Yoshimoto T., Nakanishi K. Interleukin-18: a novel cytokine that augments both innate and acquired immunity. // Adv.Immunol. 1998. - V. 70. - P. 281-312.

198. Ortiz M.A., Paez E. Identification of viral membrane proteins required for cell fusion and viral dissemination that are modified during vaccinia virus persistence. // Virology. 1994. - V. 198. - № 1. - P. 155-168.

199. Owen J.E., Schultz D.W., Taylor A., Smith G.R. Nucleotide sequence of the lysozyme gene of bacteriophage T4. Analysis of mutations involving repeated sequences. // J.Mol.Biol. 1983. - V. 165. - № 2. - P. 229-248.

200. Paez E., Esteban M. Nature and mode of action of vaccinia virus products that block activation of the interferon-mediated ppp(A2'p)nA-synthetase. // Virology. 1984. - V. 134. - № 1. - P. 29-39.

201. Paez E., Esteban M. Interferon prevents the generation of spontaneous deletions at the left terminus of vaccinia virus DNA. // J. Virol. 1985. - V. 56.-№ l.-P. 75-84.

202. Paez E., Dallo S., Esteban M. Generation of a dominant 8-MDa deletion at the left terminus of vaccinia virus DNA. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1985. V. 82. - № 10. - P. 3365-3369.

203. Palumbo G.J., Pickup D.J., Fredrickson T.N., Mclntyre L.J., Buller R.M. Inhibition of an inflammatory response is mediated by a 38-kDa protein of cowpox virus. // Virology. 1989. - V. 172. - № 1. - P. 262-273.

204. Palumbo G.J., Glasgow W.C., Buller R.M. Poxvirus-induced alteration of arachidonate metabolism. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - № 5. - P. 2020-2024.

205. Palumbo G.J., Buller R.M., Glasgow W.C. Multigenic evasion of inflammation by poxviruses. // J. Virol. 1994. - V. 68. - № 3. - P. 17371749.

206. Panicali D., Davis S.W., Mercer S.R., Paoletti E. Two major DNA variants present in serially propagated stocks of the WR strain of vaccinia virus. // J. Virol. 1981.-V. 37.-№3.-P. 1000-1010.

207. Panicali D., Paoletti E. Construction of poxviruses as cloning vectors: Insertion of the thymidine kinase gene from herpes simplex into the DNA of infectious vaccinia virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - № 16.-P.4927-4931.

208. Parkinson J.E., Sanderson C.M., Smith G.L. The vaccinia virus A38L gene product is a 33-kDa integral membrane glycoprotein. // Virology. 1995. -V. 214. - № l.-P. 177-188.

209. Parkinson J.E., Smith G.L. Vaccinia virus gene A36R encodes a Mr43-50K protein on the surface of extracellular enveloped virus. // Virology. 1994. -V. 204.-№ l.-P. 376-390.

210. Parks R.J., Evans D.H. Enhanced recombination associated with the presence of insertion and deletion mutations in poxvirus-infected cells. // Virology. 1991. - V. 184. - № 1. - P. 299-309.

211. Parsons B.L., Pickup D.J. Tandemly repeated sequences are present at the ends of the DNA of raccoonpox virus. // Virology. 1987. - V. 161. - № 1. -P. 45-53.

212. Patel A.H., Gaffney D.F., Subak-Sharpe J.H., Stow N.D. DNA sequence of the gene encoding a major secreted protein of vaccinia virus, strain Lister. // J.Gen.Virol. 1990. - V. 71 ( Pt 9). - P. 2013-2021.

213. Payne L. Polypeptide composition of extracellular enveloped vaccinia virus. //J. Virol. 1978.-V. 27.-№ 1,-P. 28-37.

214. Payne L.G. Identification of the vaccinia hemagglutinin polypeptide from a cell system yielding large amounts of extracellular enveloped virus. // J. Virol. 1979. - V. 31. -№ 1. - P. 147-155.

215. Payne L.G. Significance of extracellular enveloped virus in the in vitro and in vivo dissemination of vaccinia. // J.Gen. Virol. 1980. - V. 50. - № 1. - P. 89-100.

216. Payne L.G. Characterization of vaccinia virus glycoproteins by monoclonal antibody precipitation. // Virology. 1992. - V. 187. - № 1. - P. 251-260.

217. Perkus M.E., Panicali D., Mercer S., Paoletti E. Insertion and deletion mutants of vaccinia virus. // Virology. 1986. - V. 152. - № 2. - P. 285-297.

218. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Limbach K., Norton E.K., Paoletti E. Vaccinia virus host range genes. // Virology. 1990. - V. 179.-№ l.-P.276-286.

219. Perkus M.E., Goebel S.J., Davis S.W., Johnson G.P., Norton E.K., Paoletti E. Deletion of 55 open reading frames from the termini of vaccinia virus. // Virology.- 1991.-V. 180. l.-P. 406-410.

220. Pickup D.J., Bastia D., Stone H.O., Joklik W.K. Sequence of terminal regions of cowpox virus DNA: arrangement of repeated and unique sequence elements. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1982. - V. 79. - № 23. -P. 7112-7116.

221. Pickup D.J., Bastia D., Joklik W.K. Cloning of the terminal loop of vaccinia virus DNA. // Virology. 1983. - V. 124. - № 1. - P. 215-217.

222. Pickup D.J., Ink B.S., Parsons B.L., Hu W., Joklik W.K. Spontaneous deletions and duplications of sequences in the genome of covvpox virus. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. -№ 21. - P. 6817-6821.

223. Porter A.G. The prospects for therapy with tumour necrosis factors and their antagonists. // Trends Biotechnol. -1991. V. 9. - № 5. - P. 158-162.

224. Post L.E., Arfsten A.E., Davis G.R., Nomura M. DNA sequence of the promoter region for the alpha ribosomal protein operon in Escherichia coli. // J.Biol.Chem. 1980. - V. 255. - № 10. - P. 4653-4659.

225. Prescott D.M., Kates J., Kirkpatrick J.B. Replication of vaccinia virus DNA in enucleated L-cells. //J.Mol.Biol. 1971. - V. 59. -№ 3. - P. 505-508.

226. Rajagopal I., Ahn B.-Y., Moss B., Mathews C.K. Roles of vaccinia virus ribonucleotide reductase and glutaredoxin in DNA precursor biosynthesis. // J. Biol Chem. 1995. - V. 270. -№46. - P. 27415-27418.

227. Ramsey-Ewing A., Moss B. Restriction of vaccinia virus replication in CHO cells occurs at the stage of viral intermediate protein synthesis. // Virology.1995. V. 206. -№ 2. - P. 984-993.

228. Ramsey-Ewing A.L., Moss B. Complementation of a vaccinia virus hostrange K1L gene deletion by the nonhomologous CP77 gene. // Virology.1996.-V. 222.-№ l.-P. 75-86.

229. Ravanello M.P., Hruby D.E. Conditional lethal expression of the vaccinia virus L1R myristylated protein reveals a role in virion assembly. // J. Virol. -1994. V. 68. -№ 10. - P. 6401-6410.

230. Ray C.A., Black R.A., Kronheim S.R., Greenstreet T.A., Sleath P.R., Salvesen G.S., Pickup D.J. Viral inhibition of inflammation: cowpox virus encodes an inhibitor of the interleukin-1 beta converting enzyme. // Cell. -1992. V. 69. -№ 4. - P. 597-604.

231. Rempel R.E., Traktman P. Vaccinia virus B1 kinase: phenotypic analysis of temperature-sensitive mutants and enzymatic characterization of recombinant proteins. // J. Virol. 1992. - V. 66. - № 7. - P. 4413-4426.

232. Resenchuk S.M., Blinov V.M. ALIGNMENT SERVICE: creation and processing of alignments of sequences of unlimited length. // Comput.Appl.Biosci. 1995. - V. 11. - № 1. - P. 7-11.

233. Ribas E. Alastrim, amaas or milk-pox. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. -1910.-V. 4.-P. 224-232.

234. Rivas C., Gil J., Melkova Z., Esteban M., Diaz-Guerra M. Vaccinia virus E3L protein is an inhibitor of the interferon (i.f.n.)-induced 2-5A synthetase enzyme. // Virology. 1998. - V. 243. - № 2. - P. 406-414.

235. Rochester S.C., Traktman P. Characterization of the single-stranded DNA binding protein encoded by the vaccinia virus 13 gene. // J. Virol. 1998. -V. 72.-№4.-P. 2917-2926.

236. Rodriguez D., Esteban M., Rodriguez J.R. Vaccinia virus A17L gene product is essential for an early step in virion morphogenesis. // J. Virol. -1995. V. 69. - № 8. - P. 4640-4648.

237. Rodriguez J.F., Esteban M. Mapping and nucleotide sequence of the vaccinia virus gene that encodes a 14-kilodalton fusion protein. //J. Virol. -1987.-V.61 .-№ 11.-P. 3550-3554.

238. Rodriguez J.F., Kahn J.S., Esteban M. Molecular cloning, encoding sequence, and expression of vaccinia virus nucleic acid-dependent nucleoside triphosphatase gene. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - V. 83.-P. 9566-9570.

239. Roper R.L., Moss B. Envelope formation is blocked by mutation of a sequence related to the HKD phospholipid metabolism motif in the vaccinia virus F13L protein. // J. Virol. 1999. - V. 73. - № 2. - P. 1108-1117.

240. Roper R.L., Payne L.G., Moss B. Extracellular vaccinia virus envelope glycoprotein encoded by the A33R gene. // J. Virol. 1996. - V. 70. - № 6. -P. 3753-3762.

241. Roper R.L., Wolffe E.J., Weisberg A., Moss B. The envelope protein encoded by the A33R gene is required for formation of actin-containing microvilli and efficient cell-to-cell spread of vaccinia virus. // J. Virol. -1998. V. 72. - № 5. - P. 4192-4204.

242. Rosales R., Sutter G., Moss B. A cellular factor is required for transcription of vaccinia viral intermediate-stage genes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1994. V. 91. - № 9. - P. 3794-3798.

243. Rosel J.L. and Moss B. Transcriptional and translational mapping and nucleotide sequence analysis of a vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core polypeptide 4b. //J. Virol. 1985. - V. 56. - P. 830-838.

244. Rutherfiird K.J., Chen S.A., Shively J.E. Isolation and amino acid sequence analysis of bovine adrenal 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/steroid isomerase. // Biochemistry. 1991. - V. 30. - № 33. - P. 8108-8116.

245. Salzman N.P. The rate of formation of vaccinia deoxyribonucleic acid and vaccinia virus. //Virology. 1960. - V. 10.-P. 150-152.

246. Sambrook J.F., McClain M.E., Easterbrook K.B., McAuslan B.R. A mutant of its multiplication in three cell types. // Virology. 1965. - V. 26. - № 4. -P. 738-745.

247. Sanderson C.M., Parkinson J.E., Hollinshead M., Smith G.L. Overexpression of the vaccinia virus A38L integral membrane protein promotes Ca2+ influx into infected cells. // J. Virol. 1996. - V. 70. - № 2. -P. 905-914.

248. Sanz P., Moss B. Identification of a transcription factor, encoded by two vaccinia virus early genes, that regulates the intermediate stage of viral gene expression. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. - V. 96. - № 6. - P. 26922697.

249. Sarov I., Joklik W.K. Studies on the nature and location of the capsid polypeptides of vaccinia virions. // Virology. 1972. - V. 50. - № 2. - P. 579-592.

250. Schmitt J.F.C., Stunnenberg H.G. Sequence and transcriptional analysis of the vaccinia virus Hindlll I fragment. // J. Virol. 1988. - V. 62. - № 6. - P. 1889-1897.

251. Schnierle B.S., Gershon P.D., Moss B. Cap-specific mRNA (nucleotide-O2-)-methyltransferase and poly(A) polymerase stimulatory activities of vaccinia virus are mediated by a single protein. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992.-V. 89.-№7.-P. 2897-2901.

252. Schultz G.S., White M., Mitchell R., Brown G., Lynch J., Twardzik D.R., Todaro G.J. Epithelial wound healing enhanced by transforming growthfactor-alpha and vaccinia growth factor. // Science. 1987. - V. 235. - № 4786.-P. 350-352.

253. Schwarz D.A., Katayama C.D., Hedrick S.M. Schlafen, a new family of growth regulatory genes that affect thymocyte development. // Immunity. -1998. V. 9. - № 5. - P. 657-668.

254. Seki M., Oie M., Ichihashi Y., Shida H. Hemadsorption and fusion inhibition activities of hemagglutinin analyzed by vaccinia virus mutants. // Virology. 1990. - V. 175. -№ 2. - P. 372-384.

255. Senkevich T.G., Koonin E.V., Buller R.M.L. A poxvirus protein with a RING zinc finger motif is of crucial importance for virulence. // Virology. -1994.-V. 198. -№ l.-P. 118-128.

256. Senkevich T.G., White C.L., Koonin E.V., Moss B. A viral member of the ERV1/ALR protein family participates in a cytoplasmic pathway of disulfide bond formation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. - V. 97. - P. 12068-12073.

257. Seregin S.V., Babkina I.N., Nesterov A.E., Sinyakov A.N., Shchelkunov S.N. Comparative studies of gamma-interferon receptor-like proteins of variola major and variola minor viruses // FEBS Lett. 1996. - V.382. - № 1-2. - P. 79-83.

258. Shida H. Nucleotide sequence of the vaccinia virus hemagglutinin gene. // Virology. 1986. - V. 150. - № 2. - P. 451-462.

259. Shida H. Vaccinia virus hemagglutinin. // Subcell.Biochem. 1989. - V. 15. p. 405-440.

260. Shors T., Keck J.G., Moss B. Down regulation of gene expression by the vaccinia virus D10 protein. // J. Virol. 1999. - V. 73. - № 1 - P. 791-796.

261. Shors T., Kibler K.V., Perkins K.B., Seidler-Wulff R., Banaszak M.P., Jacobs B.L. Complementation of vaccinia virus deleted of the E3L gene by mutants of E3L. // Virology. 1997. - V. 239. - № 2. - P. 269-276.

262. Shuman S. Vaccinia virus RNA helicase: An essential enzyme related to the DE-II family of RNA-dependent NTPases. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. V. 89. - № 22. - P. 10935-10939.

263. Shuman S., Morham S.G. Domain structure of vaccinia virus mRNA capping enzyme. // J. Biol. Chem. 1990. - V. 265. - № 20. - P. 1196711972.

264. Shuman S., Moss B. Identification of a vaccinia virus gene encoding a type I DNA topoisomerase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - № 21. P. 7478-7482.

265. Simpson D.A., Condit R.C. The vaccinia virus A18R protein plays a role in viral transcription during both the early and the late phases of infection. // J. Virol. 1994. - V. 68. -№ 6. - P. 3642-3649.

266. Slabaugh M.B., Johnson T.L., Mathews C.K. Vaccinia virus induces ribonucleotide reductase in primate cells. // J. Virol. 1984. - V. 52. - № 2. -P. 507-514.

267. Slabaugh M.B., Mathews C.K. Vaccinia virus-induced ribonucleotide reductase can be distinguished from host cell activity. // J. Virol. 1984. - V. 52.-№2.-P. 501-506.

268. Smith G.L., de Carlos A., Chan Y.S. Vaccinia virus encodes a thymidylate kinase gene: Sequence and transcriptional mapping. // Nucl. Acids Res. -1989a.-V. 17.-№ 19.-P. 7581-7590.

269. Smith G.L., Chan Y.S., Kerr S.M. Transcriptional mapping and nucleotide sequence of a vaccinia virus gene encoding a polypeptide with extensive homology to DNA ligases. // Nucl. Acids Res. 1989b. - V. 17. - № 22. - P. 9051-9062.

270. Smith G.L., Howard S.T., Chan, Y.S. Vaccinia virus encodes a family of genes with homology to serine proteinase inhibitors. // J. Gen. Virol. -1989c. V. 70. - № 9. - P. 2333-2343.

271. Smith G.L., Moss B. Infectious poxvirus vectors have capacity for at least 25 000 base pairs of foreign DNA. // Gene. 1983. - V. 25. - № 1. - P. 21* 28.

272. Smith G.L., Chan Y.S. Two vaccinia virus proteins structurally related to the interleukin-1 receptor and the immunoglobulin superfamily. // J.Gen.Virol. -1991.-V. 72 ( Pt 3). P. 511-518.

273. Smith G.L., Chan Y.S., Howard S.T. Nucleotide sequence of 42 kbp of vaccinia virus strain WR from near the right inverted terminal repeat. // J.Gen.Virol. 1991. - V. 72 ( Pt 6). - P. 1349-1376.ft

274. Smith G.L. Vaccinia virus glycoproteins and immune evasion. The sixteenth Fleming Lecture. //J.Gen. Virol. 1993. - V. 74 ( Pt 9). - P. 1725-1740.

275. Sonnhammer E.L., Durbin R. A dot-matrix program with dynamic threshold control suited for genomic DNA and protein sequence analysis. // Gene. -1995.-V. 167.-№ 1-2.-P. GC1-10.

276. Spehner D., Gillard S., Drillien R., Kirn A. A cowpox virus gene required for multiplication in Chinese hamster ovaiy cells. // J. Virol. 1988. - V. 62.• №4. - P. 1297-1304.

277. Spriggs M.K., Hruby D.E., Maliszewski C.R., Pickup D.J., Sims J.E., Buller R.M., VanSlyke J. Vaccinia and cowpox viruses encode a novel secreted interleukin-1-binding protein. //Cell. 1992. - V. 71. -№ 1. - P. 145-152.

278. Spyropoulos D.D., Roberts B.E., Panicali D.L., Cohen L.K. Delineation of the viral products of recombination in vaccinia virus-infected cells. // J.

279. Virol. 1988.- V. 62. -№3.- P. 1046-1054.

280. Stuart D.T., Upton C., Higman M.A., Niles E.G., McFadden G. A poxvirus-encoded uracil DNA glycosylase is essential for virus viability. // J. Virol. -1993. V. 67. - № 5. - P. 2503-2512.

281. Studier F.W., Rosenberg A.H., Simon M.N., Dunn J.J. Genetic and physical mapping in the early region of bacteriophage T7 DNA. // J.Mol.Biol. 1979. -V. 135.-№4.-P. 917-937.

282. Symons J.A., Alcami A., Smith G.L. Vaccinia virus encodes a soluble type I interferon receptor of novel structure and broad species specificity. // Cell. -1995.-V. 81.-№4.-P. 551-560.

283. Takahashi T., Oie M., Ichihashi Y. N-terminal amino acid sequences of vaccinia virus structural proteins. // Virology. 1994. - V. 202. - № 2. - P. 844-852.

284. Tamin A., Villarreal E.C., Weinrich S.L., Hruby D.E. Nucleotide sequence and molecular genetic analysis of the vaccinia virus ///«dill N/M region encoding the genes responsible for resistance to a-amanitin. // Virology. -1988.-V. 165. № l.-P. 141-150.

285. Tengelsen L.A., Slabaugh M.B., Bibler J.K., Hruby D.E. Nucleotide sequence and molecular genetic analysis of the large subunit of ribonucleotide reductase encoded by vaccinia virus. // Virology. 1988. - V. 164. -№ l.-P. 121-131.

286. Tracey K.J., Cerami A. Tumor necrosis factor: a pleiotropic cytokine and therapeutic target. // Annu.Rev.Med. 1994. - V. 45. - P. 491-503.

287. Upton C., Macen J.L., Schreiber M., McFadden G. Myxoma virus expresses a secreted protein with homology to the tumor necrosis factor receptor gene family that contributes to viral virulence. // Virology. 1991. - V. 184. - № l.-P. 370-382.

288. Upton C., Mossman K., McFadden G. Encoding of a homolog of the IFN-gamma receptor by myxoma virus. // Science. 1992. - V. 258. - № 5086. -P. 1369-1372.

289. Upton C„ Schiff L., Rice S.A., Dowdeswell T., Yang X., McFadden G. A poxvirus protein with a RING finger motif binds zinc and localizes in virus factories. //J. Virol. 1994. - V. 68. - P. 4186-4195.

290. Upton C., Stuart D., McFadden G. Identification of a poxvirus gene encoding a uracil DNA glycosylase. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. -V. 90.-P. 4518-4522.

291. Van Meir E., Wittek R. Fine structure of the vaccinia virus gene encoding the precursor of the major core protein 4a. // Arch. Virol. 1988. - V. 102. -№1-2.-P. 19-27.

292. Van Tongeren H.A. Spontaneous mutation of cowpox-virus by means of egg-passage. // Arch.Gesamte Virusforsch. 1952. - V. 5. - № 1. - P. 35-52.

293. Varich N.L., Sychova I.V., Kaverin N.V., Antonova T.P., Chernos V.I. Transcription of both DNA strands of vaccinia virus genome in vivo. II Virology. 1979. - V. 96. - № 2. - P. 412-430.

294. Venkatesan S. Gershowitz A., Moss B. Complete nucleotide sequences of two agjacent early vaccinia virus genes located within the inverted terminal repetition. //J. Virol. 1982. - V. 44. - № 2. - P. 637-646.

295. Weintraub S., Dales S. Biogenesis of poxviruses: genetically controlled modifications of structural and functional components of the plasma membrane. // Virology. 1974. - V. 60. - № 1. - P. 96-127.

296. Weir J.P., Moss B. Nucleotide sequence of the vaccinia virus thymidine kinase gene and the nature of spontaneous frameshift mutations. // J. Virol.1983.-V. 446. -№2.-P. 530-537.

297. Westwood J.C., Harris W.J., Zwartouw H.T., Titmuss D.H., Appleyard G. Studies on the structure of vaccinia virus. // J.Gen.Microbiol. 1964. - V. 34. - P. 67-78.

298. Whitaker-Dowling P., Youngner J.S. Characterization of a specific kinase inhibitory factor produced by vaccinia virus which inhibits the interferon-induced protein kinase.// Virology. 1984.- V. 137.-№ 1.-P. 171-181.

299. Wittek R., Menna A., Schumperli D., Stoffel S., Muller H.K., Wyler R. ///«dill and Sst I restriction sites mapped on rabbit poxvirus and vaccinia virus DNA. // J. Virol. 1977. - V. 23. - № 3. - P. 669-678.

300. Wittek R., Menna A., Muller H.K., Schumperli D., Boseley P.G., Wyler R. Inverted terminal repeats in rabbit poxvirus and vaccinia virus DNA. // J. Virol. 1978.-V. 28.-№ i.p. 171-181.

301. Wittek R., Moss B. Tandem repeats within the inverted terminal repetitionof vaccinia virus DNA. II Cell. 1980. - V. 21. - № 1. - P. 277-284.

302. Wold W.S., Hermiston T.W., Tollefson A.E. Adenovirus proteins that subvert host defenses. // Trends Microbiol. 1994. - V. 2. - № 11. - P. 437443.

303. Wu A.M., Chapman A.B., Platt T., Guarente L.P., Beckwith J. Deletions of distal sequence after termination of transcription at the end of the tryptophanoperon in E. coli. II Cell. 1980. - V. 19. - № 4. - P. 829-836.

304. Xue F., Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers. // Cell. 1993. - V. 72. - № 5. - P. 681-693.

305. Yanisch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19vectors. // Gene. 1985. - V. 33. - № l.-P. 103-119.

306. Zhang W., Evans D.H. DNA strand exchange catalyzed by proteins from vaccinia virus-infected cells. // J. Virol. 1993. - V. 67. - № 1. - P. 204-212.

307. Zinoviev V.V., Tchikaev N.A., Chertov O.Yu., Malygin E.G. Identification of the gene encoding vaccinia virus immunodominant protein p35. // Gene. -1994. V. 147. -№ 2. - P. 209-214.

Информация о работе

Тотменин, Алексей Владимирович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2004
ВАК 03.00.03

Диссертация

Изучение структурно-функциональной организации генома вируса натуральной оспы - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы