Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека"

На правах рукописи

Левицкий Сергей Алексеевич

Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека.

молекулярная биология - 03.00.03

АВТОРЕФЕРАТ • диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории Молекулярной биологии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» («ГосНИИгенетика»).

Научный руководитель:

Доктор биологических наук В.П. Вейко

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Честухина Г.Г.

Кандидат биологических наук, Захарова Е.С.

Медико-генетический научный центр РАМН

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится

М» ¿ребраМ

2005 г. в «

<ч

часов

на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов»

Автореферат разослан « 13 » 2005 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

В.И. Щербакова

Актуальность темы диссертации. Прочная взаимосвязь, существующая между функциональной активностью отдельных белков и их внутриклеточной локализацией, позволяет проводить изучение значимости отдельных элементов молекулы для функционирования белка в целом in vivo, основываясь, прежде всего, на изменениях в локализации в клетке мутантных полипептидов, детектируемых с помощью методов иммуноцитохимии или флуоресценции слитых с исследуемым продуктом белков-маркеров.

Исследование структурно-функциональных отношений в белке ядрышка эукариот - фибрилларине, позволяет выявить участки белковой молекулы, определяющие его РНК-связывающую и метилтрансферазную активности, а также установить структурные элементы, направляющие транспорт этого белка в ядрышко. Такие данные, помимо фундаментальных знаний о принципах функционирования фибрилларина и механизмах процессинга пре-рРНК, позволяют выяснить закономерности распределения фибрилларина в клетке на разных стадиях клеточного цикла, онто- и эмбриогенеза. Последнее особенно важно в связи с образованием у ряда больных аутоиммунными заболеваниями, в частности, системной склеродермией, антител к фибрилларину и его комплексам с нуклеиновыми кислотами и другими белками. Т.о. понимание закономерностей структурно-функциональной организации фибрилларина ведет к расширению знаний о возникновении и течении аутоиммунных заболеваний.

Сказанное выше и определяет актуальность темы исследования.

Цель работы. Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных структурных элементов в молекуле фибрилларина человека - белка ядрышка эукариот, участвующего в процессинге прерибосомальной РНК.

Научная новизна работы. При проведении работы создана серия рекомбинантных векторов, несущих гены различных мутантных форм фибрилларина человека, слитых с маркерным зеленым флуоресцирующим

белком (GFP) под контролем истинно раннего промотора цитомегаловируса, для экспрессии рекомбинантных химерных белков в клетках высших эукариот. Изучена локализация мутантных форм фибрилларина человека в клетках HeLa.

Впервые показано, что специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК в ядрышке обусловлена не какими-либо сигнальными последовательностями, а функциональной активностью белка. Установлено, что мутантный белок, лишенный N-концевого глицин- и аргинин-богатого участка, сохраняет специфическую локализацию и, следовательно, функциональную активность, аналогично ортологам фибрилларина у Archae.

Впервые установлено, что наличие или отсутствие дисульфидной связи между двумя высококонсервативными остатками цистеина в молекуле фибрилларина человека не влияет на локализацию и функциональную активность белка.

Впервые получен рекомбинантный экспрессионный вектор, в составе которого клонирован ген слитого белка «стрептавидин — С-концевой фрагмент фибрилларина человека». Показано, что полученная конструкция обеспечивает достаточный уровень экспрессии химерного гена в Е. coli. Разработана система выделения, очистки и ренатурации такого рекомбинантного белка из штамма-продуцента Е. coli.

Получена антисыворотка мыши, высокоспецифично взаимодействующая с С-концевым фрагментом фибрилларина и полноразмерным фибрилларином в системах in vivo и in vitro.

Практическая ценность работы. Исследована роль отдельных элементов в структурно-функциональной организации молекулы фибрилларина человека, что позволит расширить понимание процессов созревания прерибосомальной РНК и механизмов транспорта белков в клетке.

Впервые получен штамм-продуцент слитого белка «стрептавидин - С-концевой фрагмент фибрилларина» и разработана методика выделения и очистки рекомбинантного белка. Выделение такого химерного белка позволило

получить высокоспецифичную антисыворотку, потенциально применимую как в научной практике для иммуноцитохимических исследований, так и в медицинской диагностике.

Апробация результатов и публикации. Результаты работы были доложены на трех международных научных конференциях (Италия, 2003; Украина, 2003; Россия, 2004), на межлабораторных семинарах ГосНИИгенетика. Апробация диссертации проведена на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика». По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на № страницах, иллюстрирована рисунками и таблицами. Список литературы содержит источников.

Результаты и обсуждение.

I. Введение.

Фибрилларин человека состоит из 321 аминокислотного остатка и условно разбивается на три структурных участка ^-концевой глицин- и аргинин-богатый домен, центральный РНК-связывающий домен, С-конецвойа-спиральный каталитический домен), разделенных двумя спейсерными областями (рис. 1). При этом третичная структура фибрилларина человека (как и всех фибрилларинов эукариот) остается невыясненной. Не ясна и роль как отдельных структурных элементов этого белка в его природной локализации, так и в осуществлении его предполагаемой основной функций внутри ядрышка - специфическом 2'-О-метилировании остатков рибозы в пре-рРНК и, возможно, некоторых других.

GAR ISp RB 2Sp a

8 80 133 222 274 306

Рисунок 1. Схема структурной организации фибрилларина человека GAR - глицин-и аргинин-богатый участок; 1Sp — первый спейсерный участок; RB - РНК-связывающий домен; 2Sp - второй спейсерный участок; а - альфа-спиральный домен.

В литературе высказывались различные точки зрения о природе структурных участков молекулы фибрилларина, которые обеспечивают его способность мигрировать в ядрышки и накапливаться в них в районах синтеза пре-рРНК. Среди потенциальных сигнальных ядрышковых последовательностей фибрилларина рассматриваются практически все его участки, за исключением 1-го спейсерного участка. Однако, имеющиеся литературные данные в значительной степени являются противоречивыми. Так, в недавних работах разные авторы указывали на необходимость и достаточность глицин- и аргинин-богатого N-концевого участка для миграции в ядрышко аналога фибрилларина у Arabidopsis. В то же время, согласно результатам других авторов, специфическое расположение фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК в ядрышках клеток человека ответственен второй спейсерный участок, тогда как GAR-домен не играет значительной роли в накоплении белка в ядрышке.

При этом не вызывает сомнений то, что осуществление функций фибрилларина напрямую взаимосвязано с его специфической локализацией в ядрышке в фокусах транскрипции рДНК. Соответственно, любые изменения в первичной структуре белка, вызывающие нарушения его функциональной активности, должны приводить к заметным изменениям специфической локализации такого мутантного фибрилларина в клетке.

Одним из наиболее используемых в последнее время подходов к исследованию роли отдельных структурных участков тех или иных белков в

функционировании молекулы в целом является изучение локализации делеционных мутантов in vivo с помощью флуоресценции белка-маркера. В роли последнего достаточно часто используется зеленый флуоресцирующий белок (GFP) из Aequorea victoria. Такой подход позволяет исследовать интересующие участки молекулы в условиях, максимально приближенных к природным и, следовательно, получать достоверные и наиболее близкие к существующим в клетке результаты.

В связи с этим, в настоящей работе мы создали ряд экспрессионных векторов, несущих гены мутантных форм фибрилларина человека, слитых с маркерным зеленым флуоресцирующим белком (GFP), и изучили локализацию химерных белков в интерфазных и телофазных клетках HeLa.

П. Локализация химерного белка фибрилларин-GFP аналогична распределению эндогенного фибрилларина.

Для того, чтобы установить, насколько велико влияние GFP на локализацию слитого белка «фибрилларин-GFP», мы провели исследование распределения эндогенного фибрилларина и химерного рекомбинантного белка фибрилларин-GFP в клетках человека линии HeLa.

В ядрышках интерфазных клеток HeLa эндогенный фибрилларин, выявляемый с помощью антисыворотки, проявляется в дискретных участках, общее число которых могло достигать нескольких десятков на ядро (рис. 2а). Как и ожидалось, дискретные участки связывания фибрилларина в ядрышках совпадали с местами синтеза рРНК, выявляемыми по включению в клетки BrUTP (рис. 26). Ни при каких условиях фиксации клеток гомогенная локализация фибрилларина в ядрах и цитоплазме не наблюдалась. Эти наблюдения полностью соответствуют литературным данным о локализации фибрилларина в клетках разных объектов, полученным нами и другими авторами ранее. Такая характерная для фибрилларина локализация в фокусах транскрипции рДНК объясняется большинством исследователей взаимосвязью расположения белка в клетке с его основной функцией, которая, судя по всему,

заключается в специфическом 2'-О-метилировании рибозы в 45S пре-рРНК транскриптах.

На рисунке 2в представлено характерное ядро клетки HeLa, нарабатывающей фибрилларин дикого типа, слитый с зеленым флуоресцирующим белком (плазмида pfibr/GFP). Хорошо видно, что локализация химерного белка fibr/GFP полностью совпадает с эндогенным фибрилларином, выявляемым с помощью специфической антисыворотки (рис. 2а).

а

6

Хо

Рисунок 2. Ко-локализация эндогенного фибрилларина, выявляемого с помощью специфической сыворотки (а), участков включения BrUTP (б) в ядрышках клеток HeLa; рекомбинантного фибрилларина дикого типа, слитого с GFP (в), в ядрышках клеток HeLa; (г) - окраска хроматина ядра красителем ДАПИ; N - ядрышко.

Фибрилларин выявляется в составе дискретных ядрышковых участков (а, стрелка), которые совпадают с местами включения BrUTP в ядрышки (б, стрелка). Локализация рекомбинантного фибрилларина, слитого с GFP совпадает с местоположением эндогенного фибрилларина.

При этом сам GFP в клетках HeLa, трансфицированных соответствующей плазмидой, располагается преимущественно гомогенно в нуклеоплазме, не окрашивая ядрышки (не представлено). Исходя из представленных данных, а также результатов, опубликованных другими авторами, можно заключить, что маркерный зеленый флуоресцирующий белок не влияет на локализацию слитого с ним фибрилларина и его мутантных форм. Исходя из этого, мы заключили, что использование GFP в качестве маркера локализации мутантных форм фибрилларина вполне корректно.

III. Остатки цистеина Cys99 и Cys268 и наличие дисульфидной связи между ними не влияют на специфическую локализацию фибрилларина.

Важной задачей в исследовании структурно-функциональной организации фибрилларина человека являлось изучение роли остатков цистеина и возможной дисульфидной связи между ними в локализации и, следовательно, в функциональной активности белка. Известно, что цистеиновые остатки могут выполнять важную функцию по стабилизации третичной и четвертичной структуры белков, образуя внутри- и межмолекулярные дисульфидные связи, и, тем самым, придавая конформационную стабильность молекуле или молекулярному комплексу в целом. Помимо этого, остатки цистеина часто располагаются в каталитическом центре ферментов, во многом предопределяя их свойства.

В молекуле фибрилларина человека содержатся два остатка цистеина (Cys99 и Cys268). Эти аминокислотные остатки, по всей видимости, являются структурно важными элементами белка и консервативны для фибрилларинов многих эукариотических организмов. Однако, подобной консервативности двух остатков цистеина в N- и С-концевых частях молекулы не наблюдается в случае ортологов фибрилларина у архебактерий, отличающихся от эукариотического отсутствием GAR-домена. Последнее позволяет предположить важность

образования дисульфидной связи в фибрилларине эукариот для его транспорта в ядрышко.

Для того, чтобы выяснить, влияет ли наличие Cys99 и Cys268, а также потенциально возможное замыкание дисульфидной связи между 99-м и 268-м остатками цистеина в фибрилларине человека на специфическую локализацию (и, исходя из сказанного выше, функциональность) этого белка в фокусах транскрипции рДНК, мы получили три экспрессионных вектора, несущих гены фибрилларина с точечными заменами Cys99Seг, Cys268Seг и Cys99Ser+Cys268Ser, слитых с репортерным зеленым флуоресцентным белком (GFP), и изучили локализацию химерных белков в интерфазных клетках HeLa.

При трансфекциях клеток HeLa полученными конструкциями локализация химерных белков фибрилларин (Cys99Seг) - GFP, фибрилларин (Cys268Seг) - GFP и фибрилларин (Cys99Ser, Cys268Seг) - GFP, детектируемая по флуоресценции GFP, не отличалась от таковой для фибрилларина дикого типа и совпадала с местами образования пре-рРНК.

Таким образом, описанные мутантные формы фибрилларина, лишенные 99-го, 268-го или двух сразу остатков цистеина и не способные к образованию дисульфидной связи между Cys99 и Cys268 аминокислотными остатками, сохраняли способность мигрировать в ядрышко. При этом все мутантные белки располагались внутри ядрышка аналогично рекомбинантному фибрилларину дикого типа и эндогенному фибрилларину, то есть дискретно в фокусах транскрипции рДНК.

Приведенные данные указывают на то, что в случае фибрилларина человека аминокислотные остатки Cys99 и Cys268, а также потенциально возможная дисульфидная связь между ними, не играют существенной роли в структурно-функциональной организации белка. В связи с этим можно сделать предположение о том, что формы фибрилларина с замкнутой и незамкнутой дисульфидной связью обладают сходными функциями в клетке.

Полученные данные позволили нам при дальнейших экспериментах по изучению внутриклеточной локализации делеционных мутантов фибрилларина

человека не учитывать возможное влияние остатков цистеина и дисульфидной связи между ними на распределение исследуемых белков в клетках HeLa.

IV. GAR-домен фибрилларина содержит сигналы ядрышковой локализации.

Далее нами были получены экспрессионные векторы, несущие гены мутантных форм фибрилларина человека, соответствовавших GAR-домену (pFGAR); GAR-домену и первому спейсерному участку (pFGARl); фибрилларину с делегированным РНК-связывающим доменом (pARB); фибрилларину с удаленным 2-м спейсерным участком и а-спиральным доменом (pA2Spa); фибрилларину с частично измененной аминокислотной последовательностью РНК-связывающего участка (pSRB), слитых с GFP. Полученными плазмидами были трансфицированы клетки человека линии HeLa, а затем проведено исследование локализации рекомбинантных химерных белков.

Из шести плазмид, несущих гены фибрилларина дикого типа или его мутанты, «слитых» с GFP, практически все химерные белки - fibг/GFP, A2Spct/GFP, GAR1/GFP, GAR/GFP и, частично, ДRB/GFP - не теряли способности мигрировать в ядрышко. Однако во всех случаях, за исключением фибрилларина «дикого типа» локализация в ядрышках мутантных форм фибрилларина (плазмиды рД28раЛЗРР, pGARl/GFP, pGAR/G FpД]/JG F P) резко отличалась от таковой эндогенного фибрилларина. Во всех случаях мутантные «слитые» белки распределялись по ядрышкам диффузно, а не дискретно, как эндогенный фибрилларин (рис. 2а) или fibг/GFP (рис. 2в).

Приведенные результаты позволяют предположить, что все участки фибрилларина являются необходимыми для его специфической локализации в фокусах транскрипции рДНК. Однако только некоторые районы достаточны для накопления фибрилларина в ядрышках.

а

No

6

У

\

г

*

No

Рисунок 3. Распределение рекомбинантных слитых белков GAR/GFP (a), GAR1/GFP (в) и окраска хроматина ядер красителем ДАПИ (б,г); No-ядрышко.

Химерные белки выявляются в нуклеоплазме (а,в, стрелки) и в ядрышках (а,в, стрелки). При этом окраска ядрышек гомогенна, а не дискретна, как в случае фибрилларина дикого типа и эндогенного фибрилларина. Аналогичным образом в клетках распределялись белки ARB и A2Spa.

К таким участкам относится, в первую очередь, глицин- и аргинин-богатый (GAR) домен, поскольку химерные белки GAR/GFP и GAR1/GFP мигрируют в ядрышки, начиная с ранних сроков трансфекции плазм иды (рис.

В пользу этого предположения говорит также тот факт, что делеция 2-го спейсера и а-спирального участка (pA2a/GFP) также не препятствуют миграции фибрилларина в ядрышки.

Достаточность GAR-домена для миграции фибрилларина в ядрышки можно объяснить наличием в этом участке сигнальных последовательностей ядрышковой локализации. Ранее наличие сигнальных последовательностей, определяющих миграцию белков в ядрышки, было показано в глицин и аргинин-богатых участках нуклеолина и РНК-хеликазы. Нельзя также исключить возможность того, что фибрилларин транспортируется в ядрышки другими ядрышковыми белками или нуклеиновыми кислотами (в частности, мякРНК), которые способны связываться с его GAR-доменом.

Таким образом, суммируя результаты этой части работы, мы предположили, что основная роль в обеспечении локализации фибрилларина в ядрышке принадлежит GAR- или GAR1-участкам его молекулы. При этом глицин- и аргинин-богатый участок фибрилларина способен самостоятельно мигрировать в ядрышки. Однако, по всей видимости, способность фибрилларина накапливаться в фокусах транскрипции рДНК и раннего процессинга пре-рРНК внутри ядрышка зависит от интактности его молекулы в целом.

V. Другие структурные участки фибрилларина по отдельности не содержат сигналов локализации в ядрышке.

На следующем этапе работы нами было изучено распределение рекомбинантных слитых белков 1Sp/GFP, 2Sp/GFP, 2Spa/GFP, 1Sp-RB/GFP, RB-2Sp/GFP и lSp-RB-2Sp/GFP (см. рис. 1).

Ни один из перечисленных шести рекомбинантных белков, представлявших собой отдельные структурные участки фибрилларина или их комбинации и не содержавших глицин- и аргинин богатый участок, не обладал способностью мигрировать в ядрышко. Все эти белки распределялись

гомогенно по нуклеоплазме и, иногда, по цитоплазме, аналогично белкам 1Sp/GFP и 2Sp/GFP (рис. 4).

Во всех случаях флуоресценция маркерного белка GFP наблюдалась в нуклеоплазме (что, по всей видимости, связано со свойством самого GFP мигрировать в ядро), но никогда — в ядрышке.

Рисунок 4. Распределение рекомбинантных слитых белков 1Sp/GFP (а), 2Sp/GFP (в) и окраска хроматина ядер красителем ДАПИ (б,г); ^-ядрышко.

Химерный белок ISp/GFP накапливается гомогенно в нуклеоплазме и цитоплазме, но не обнаруживается в ядрышках (а, стрелки), аналогично маркерному GFP. Рекомбинантный слитой белок 2Sp/GFP сходным образом локализовался в нуклеоплазме и не накапливался в ядрышках (в, стрелки). Аналогично распределялись в клетках белки 28раЛЗРР, lSp-RB/GFP, RB-2Sp/GFP и lSp-RB-2Sp/GFP.

На основании этого нами было сделано заключение, что ни один из исследованных в этой части работы структурных участков фибрилларина (1-й

спейсерный участок, РНК-связывающий домен, 2-й спейсерный участок и а-спиральный метилтрансферазный домен) по отдельности не содержат сигналов ядрышковой локализации.

Таким образом, в заключении этой части работы мы установили, что ни один из четырех структурных участков фибрилларина (1Sp, RB, 2Sp, а) и их комбинации не содержат сигналов ядрышковой локализации и, следовательно, не способны мигрировать в ядрышко и фокусы транскрипции рибосомных генов. Эти данные подтвердили высказанное нами ранее предположение о необходимости N-концевого глицин- и аргинин-богатого участка для специфической локализации фибрилларина человека в ядрышке.

VI. Лишенный GAR-домена фибрилларин локализуется аналогично фибрилларину «дикого типа».

Однако, высказанные выше предположения о центральной роли глицин-и аргинин-богатого участка в миграции фибрилларина в ядрышко не подтвердились в ходе дальнейшего исследования локализации мутантных форм фибрилларина человека, слитых с GFP, в клетках линии HeLa.

В частности, при трансфекции клеток плазмидой pAGAR, несущей ген фибрилларина с делегированным GAR-доменом, флуоресценция химерного белка наблюдалась в дискретных участках ядрышка, совпадающих с фокусами транскрипции рДНК, и не детектировалась в нуклеоплазме и цитоплазме (рис. 5 а,6). При этом ни один из структурных участков, составляющих этот рекомбинантный белок, не содержат сигналов локализации в ядрышке, как это было показано нами ранее. По всей видимости, в данном случае специфическая локализация рекомбинантного белка определяется не наличием каких-либо сигнальных последовательностей, а третичной структурой и функциональностью белка в целом. Исходя из этого утверждения, можно предположить, что в ядрышко, а далее и в фокусы транскрипции рДНК попадает уже собранный мякРНП, содержащий в своем составе мякРНК C/D-класса, фибрилларин и ряд других белков.

а б

Рисунок 5. Распределение рекомбинантного слитого белка ДОАКЛЗРР (а) и окраска хроматина ядер красителем ДАПИ (б); ^-ядрышко. Химерный белок AGAR/GFP накапливается в ядрышках дискретно в фокусах транскрипции рибосомных генов и не обнаруживается в нуклеоплазме и цитоплазме (а, стрелка). Такая локализация аналогична распределению эндогенного фибрилларина и фибрилларина дикого типа, слитого с GFP.

Таким образом, фибрилларин, лишенный ^концевого GAR-домена, по всей видимости, сохраняет способность входить в состав мякРНП, взаимодействуя с мякРНК и другими белками. Более того, учитывая интактность каталитического С-концевого участка, можно предположить, что такой делегированный мутантый белок сохраняет способность

осуществлять свою ферментативную активность как специфической 2'-О-метилазы рибозы в пре-рРНК.

Эти предположения вполне могут быть соотнесены с данными по сравнению аминокислотных последовательностей фибрилларин-подобных белков эукариот и архейных ортологов фибрилларина, третичная структура многих из которых разрешена. Первичные структуры этих белков сходны в участках, соответствующих РНК-связывающему домену и, особенно, С-концевому каталитическому домену. Это наблюдение позволяет предположить чрезвычайную консервативность функций всех известных фибрилларин-

подобных белков в осуществлении метилирования по 2'-0 положению рибозы в пре-рРНК. При этом полученные нами данные о факультативности глицин- и аргинин-богатого участка для специфической локализации фибрилларина в местах транскрипции рДНК (т.е. в местах его непосредственного функционирования) могут свидетельствовать о консервативности не только функции фибрилларина, но и всего механизма модификаций пре-рРНК посредством мякРНП С/О-класса.

Ранее большинство исследователей в своих работах полагали, что наличие глицин- и аргинин-богатого участка в фибрилларинах эукариот является следствием необходимости транспорта белка в ядро и ядрышко, однако полученные нами результаты, описанные выше, однозначно опровергают эту гипотезу.

Вероятно, назначение GAR-домена в фибрилларин-подобных белках эукариот может заключаться в осуществлении вспомогательных функций. Так, известно, что глицин- и аргинин-богатый домен нуклеолина неспецифично взаимодействует с РНК, вызывая плавление вторичных структур нуклеиновой кислоты. В то же время установлено, что некоторых клеточные белки, включая РНК-хеликазу и моторный белок нейронов БМ^ взаимодействуют с фибрилларином именно через его GAR-домен. Суммируя вышесказанное, можно предположить, что GAR-домен фибрилларина способствует «расплетанию» вторичных структур пре-рРНК и увеличению доступности сайтов связывания для каталитической части белка, а также играет определенную роль в осуществлении фибрилларином отличных от метилирования пре-рРНК и биогенеза рибосом в ядрышке функций, например, участие в процессинге мРНК или протеолизе ядерных белков.

VII. Первый спейсерный участок играет важную роль в структурно-функциональной организации фибрилларина человека.

В связи с вышесказанным чрезвычайно интересными выглядят результаты, полученные при исследовании клеток, трансфицированных

плазмидами pAGARl, pCGAR и pCGARAl, несущих гены фибрилларина с делегированным GAR-доменом и 1-м спейсерным участком; с перенесенным в С-концевую часть молекулы GAR-доменом; и с перенесенным в С-концевую часть молекулы GAR-доменом и удаленным 1-м спейсерным участком, слитых с GFP соответственно.

При трансфекциях клеток HeLa плазмидой pAGARl в ходе нескольких независимых экспериментов нам не удалось обнаружить ни одной экспрессирующей клетки. Белок 1 Sp-RB-2Sp-a-GAR/GFP распределялся в трансфицированных плазмидой pCGAR клетках аналогично эндогенному фибрилларину и фибрилларину дикого типа (рис. 6 а,б). В случае белка RB-отличающегося от предыдущего отсутствием первого спейсерного участка, флуоресценция наблюдалась в ядрышках и нуклеоплазме, однако окраска ядрышек была гомогенной, а не дискретной, как в случае фибрилларина дикого типа (рис. 6 в, г).

Эти данные позволяют говорить о чрезвычайной важности первого спейсерного участка для специфической локализации фибрилларина и, следовательно, для его функциональности. Во всех случаях делеция этого участка приводила либо к отсутствию накопления соответствующего мутантного белка (плазмида pAGARl), либо к существенному изменению его локализации (белок

В последнем случае локализация рекомбинантного белка полностью совпадает с распределением белков GAR и GAR1, что дополнительно свидетельствует о наличии в GAR-домене, имеющемся в составе RB-2Sp-a-GAR, содержатся сигналы ядрышковой локализации.

Таким образом, из описанных выше результатов можно заключить, что первый спейсерный участок играет чрезвычайно важную роль в структурно-функциональной организации фибрилларина человека.

а

\

Рисунок 6. Распределение рекомбинантных слитых белков 15р-КВ-28р-а-ОАКЛЗРР (а), RB-2Sp-a-GAR/GFP (в) и окраска хроматина ядер красителем ДАПИ (б,г); No -ядрышко.

Рекомбинантный белок 15р-1Ш-25р-<х-ОАК/ОРР накапливается в ядрышках дискретно в фокусах транскрипции рибосомных генов и не обнаруживается в нуклеоплазме и цитоплазме (а, стрелка). Такая локализация аналогична распределению эндогенного фибрилларина и фибрилларина дикого типа, слитого с GFP (см. рис. 2). Химерный белок RB-2Sp-a-GAR/GFP распределяется по нуклеоплазме и ядрышку гомогенно и не обнаруживается в ядрышке (в, стрелки) аналогично белкам GAR/GFP и GAR1/GFP (см. рис.

3).

VIII. Предполагаемый механизм специфического фибрилларин-

зависимого 2'-0-метилирования остатков рибозы в пре-рРНК.

На основании изложенных выше наших результатов и предположений, а также литературных данных нами была предложена модель механизма

осуществления специфического фибрилларин-зависимого метилирования остатков рибозы в пре-рРНК по 2'-О-положению.

На первом этапе происходит сборка мякРНП, в который входят мякРНК С/О-класса, связанный с ней посредством РНК-связывающего домена фибрилларин и другие белки (рис. Та).

Рисунок 7. Модель механизма осуществления специфического фибрилларин-зависимого метилирования остатков рибозы в пре-рРНК по 2'-О-положению. Пояснения см.

в тексте.

8- аденозилметионин Другие белки мякРНП

Затем собранный мякРНП попадает в ядрышко, где входящая в состав комплекса мякРНК комплементарно взаимодействует с участком пре-рРНК, таким образом мякРНК оказывается связанным с пре-рРНК-транскриптом (рис. 7б).

"^ПГ

фибрилларин мякРНК

Это взаимодействие может быть усилено за счет неспецифического взаимодействия вЛЯ-домена фибрилларина с пре-рРНК (рис. 16, стрелка). При этом участок связывания мякРНП с пре-рРНК определяется анти-сенс последовательностью С/О-мякРНК, входящей в состав мякРНП. После образования комплекса метилтрансферазный домен фибрилларина оказывается физически сближен с пре-рРНК и катализирует перенос метальной группы с Б-аденозилметионина на 2'-ОН остаток рибозы (рис. 1в). По всей видимости, подобная модель специфической модификации остатков рибозы в пре-рРНК характерна и для архебактерий, однако в последнем случае модифицирующий комплекс взаимодействует с пре-рРНК без дополнительного увеличения сродства к РНК за счет вЛЯ-домена.

Безусловно, представленная модель является лишь схематичным описанием одного из процессов модификации пре-рРНК, однако, с нашей точки зрения, в рамках проведенного исследования является вполне достоверной и подтвержденной.

IX. Получение рекомбинантного белка «стрептавидин — 2-й спейсерный участок - а-спиральный домен».

До настоящего времени практически отсутствует достоверные данные о получении активного рекомбинантного фибрилларина эукариот. По всей видимости, неудачи в получении эффективных систем экспрессии фибрилларина как у зарубежных исследователей, так и у нас, связаны с тем, что активная форма этого белка даже в незначительных количествах является чрезвычайно токсичной для большинства используемых в качестве продуцентов организмов.

В ходе настоящей работы нами была проведена серия экспериментов, направленных на получение рекомбинантного полноразмерного фибрилларина человека или его фрагментов для исследования их активности и получения поликлональных сывороток. К сожалению, большинство предпринятых попыток окончились неудачно. Единственным удачным вариантом оказалась

19

система экспрессии гена слитого белка «стрептавидин - 2-й спейсерный участок - а-спиральный домен фибрилларина человека» (Sav2a) в Е. coli под контролем искусственной промоторно-регуляторной области, содержавшей промотор фага Т5 и два участка /ас-оператора в составе коммерчески доступного вектора pQE30 (Qiagen, США).

Для получения экспрессионного вектора полученный PCR-амплификацией фрагмент, соответствующий 2-му спейсерному участку и а-спиральному домену фибрилларина человека, был клонирован в составе плазмиды pQSav, полученной ранее в лаборатории Молекулярной биологии ГосНИИгенетика (не опубликовано).

Выделенный белок представлял собой достаточно чистый (-90% от общего числа белков в пробе) препарат, находящийся в растворе в неденатурирующих условиях. Полученный рекомбинантный слитой белок был использован для получения поликлональной сыворотки мыши к С-концевому фрагменту фибрилларина человека.

X. Получение и исследование поликлональной сыворотки мыши к С-концевому фрагменту фибрилларина человека.

Чрезвычайно важным аспектом изучения фибрилларина человека и его структурно-функциональной организации является его медицинское значение, а именно связь образования антител к этому белку с развитием аутоиммунных заболеваний. К настоящему времени чрезвычайно остро стоит вопрос ранней диагностики таких патологий для наиболее эффективного их лечения. Основные надежды в возможности ранней диагностики аутоиммунных заболеваний типа системной склеродермии и полиартрозов возлагаются на создание основанных на иммуноферментном анализе тест-систем, определяющих уровень накопления фибрилларина в тканях организма.

Кроме того, большое значение антитела к фибрилларину имеют и в исследовательской деятельности. В частности, помимо изучения непосредственно фибрилларина, такие антитела могли бы быть использованы в

20

качестве маркеров фокусов транскрипции рибосомных генов при цитологических и иммуноцитохимических исследованиях.

Сейчас коммерчески доступны несколько препаратов антител к фибрилларину человека. Все они получены с использованием в качестве антигенов синтетических пептидов, по своей структуре соответствующих отдельным участкам фибрилларина человека и обладают весьма широким спектром специфичности, т.е. способны взаимодействовать с фибрилларинами большого числа эукариот. К недостаткам таких препаратов относится в первую очередь чрезвычайно высокая стоимость и ограниченная доступность.

В ходе данной работы нам удалось получить и протестировать поликлональную антисыворотку мыши, способную эффективно узнавать фибрилларины человека и мыши как в условиях денатурирующего иммуноблота, так и при клеточных исследованиях.

Полученную антисыворотку использовали в 1000-кратном разведении для окраски иммуноблота, куда были нанесены лизаты различных клеточных линий человека (рис. 8).

Как видно из представленного рисунка, полученная антисыворотка специфично окрашивала белок размером ~34 кДа, практически не взаимодействуя с другими белками. Кроме этого, по интенсивности окраски соответствующих полос вполне можно судить об относительном количестве фибрилларина в пробе (рис. 8).

Судя по представленному распределению интенсивности окрашивания полос на иммуноблоте, повышенная экспрессия фибрилларина может свидетельствовать о высокой пролиферирующей активности клеток. Исходя из этого можно предположить, что полученная нами антисыворотка может найти применение в создании тест-систем, определяющих пролиферативный статус той или иной ткани человека и, возможно, направленных на раннюю диагностику онкозаболеваний.

12 3 4

Рисунок 8. Иммуноблот некоторых линий клеток человека с антифибриллариновой сывороткой 1- 1мкг стрептавидина, 2- лизат культуры клеток асцитной аденокарциномы, 3-лизат культуры эмбриональных фибробластов человека, 4- лизат культуры фибробластов взрослого донора.

Естественно, что помимо фибрилларина полученная нами антисыворотка взаимодействовала и со стрептавидином, входившим в состав слитого белка-антигена Sav2a (рис 8, 1). Однако, поскольку стрептавидин является весьма слабым антигеном, пул антител к стрептавидину в сыворотке был значительно меньше пула антифибриллариновых антител.

Той же антисывороткой обрабатывали фиксированные клетки человека и мыши (рис. 9). Согласно полученным данным и в клетках человека, и в клетках мыши с помощью антисыворотки окрашивались дискретные участки в ядрышке, соответствующие фокусам транскрипции рибосомных генов и локализации эндогенного фибрилларина. Таким образом, полученная нами

антисыворотка может быть использована для исследований как in vitro (иммуноблот), так и in vivo (окраска клеток).

Рисунок 9. Ко-локализация иммуноферментного анализа клеток мыши (а) и человека (б) с помощью полученной антисыворотки и окрашивания хроматина ядер красителем ДАПИ. Полученная антисыворотка специфически взаимодействует с дискретными участками в ядрышках клеток мыши (а, стрелка, яркие области) и человека (б, стрелка, яркие области), не окрашиваемыми хроматиновым красителем ДАПИ (а, б, затененные области).

Способность как полученной нами антисыворотки, так и коммерчески доступных препаратов взаимодействовать с фибрилларинами из разных организмов, по-видимому, объясняется чрезвычайной консервативностью этих белков и формированием ими общих для всей группы эпитопов.

Таким образом, в ходе исследования нами была получена антисыворотка мыши, специфично и эффективно узнающая фибрилларины человека и мыши как in vitro, так и in vivo.

IV. Выводы.

1. GAR-домен фибрилларина человека содержит сигналы ядрышковой локализации. Другие структурные участки фибрилларина по отдельности таких сигналов не содержат.

2. Специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК не зависит от наличия дисульфидной связи в белке.

3. Локализация фибрилларина обусловлена его взаимодействием с мякРНК в составе мякРНП участком 1Sp-RB-2Sp-a.

4. Предложена модель осуществления специфического фибрилларин-зависимого 2'-О-метилирования остатков рибозы в пре-рРНК.

5. Получен штамм-продуцент слитого белка «стрептавидин — 2-й спейсерный участок - a-спиральный домен фибрилларина» и разработана схема выделения, очистки и ренатурации рекомбинантного белка.

6. Получена антисыворотка мыши, специфично взаимодействующая с фибрилларинами человека и мыши в условиях in vivo и in vitro.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Левицкий С.А., Мухарьямова К.Ш., Вейко В.П., Зацепина О.В. Выявление сигнальных последовательностей в молекуле фибрилларина, определяющих его специфическую локализацию в ядрышках клеток HeLa. Молекулярная Биология. - 2004. - Т. 38. - С. 483-492.

2. Левицкий С.А., Мухарьямова К.Ш., Зацепина О.В., Вейко В.П. Выяснение роли остатков цистеина в структурно-функциональной организации фибрилларина человека. Биотехнология. — 2004 - №6 — С. 1926

3. Mukharyamova K.Sh., Levitsky S.A., Veiko V.P., and Zatsepina O.V. Signal sequences in the molecule of the nucleolar protein fibrillarin directing its specific localization within the nucleolus. 18th Wilhelm Bernard workshop on the cell nucleus. September 4-8, 2003, Pavia, Italy, Abstarct book, P. 32

4. Levitsky S.A., Mukharyamova K.Sh., Veiko V.P., and Zatsepina O.V., Structural domains of the nucleolar protein fibrillarin contain signal sequences of nucleolus localization. Conference for students, PhD students and youbg scientists on molecular biology and genetics, September 25-27, 2003, Kyiv, Ukraine, Abstract book, P. 95

5. Левицкий С.А., Мухарьямова К.Ш., Вейко В.П., Зацепина О.В., Выявление сигнальных последовательностей в молекуле фибрилларина, определяющих его специфическую локализацию в ядрышках клеток HeLa. Ш Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», 20-24 января, 2004, Москва, Сборник тезисов, С. 174

Заказ N8 49 Подписано в печать 17.01.05 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. 741-18-71,505-28-72 . >

www.cfr.ru 1 ■ Т '

4 ^ " 1_ ' ^

ч - - .; >

2 2 Ш 2335 " - -

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Левицкий, Сергей Алексеевич

Введение

Оглавление

I. Роль фибрилларипа в биогенезе рибосом и жизнедеятельности клетки.Обзор литературы.

1.1 Введение!

1.2 Структура и функции ядрышка в клетке. Созревание рРНК.

1.3 Модификации рибонуклеотидов в пре-рРНК. Малые ядрышковые РНК.

1.4 Фибрилларин. Общие сведения.

1.5 Структурная организация фибрилларина человека и его отдельных участков.

1.6. Ортологи фибрилларина у архебактерий. Консервативность структуры и функций.

1.7. Роль структурных доменов фибрилларина в его специфической локализации в ядрышке.

1.8. Функции фибрилларина в эмбриогенезе.

1.9. Фибрилларин как антиген при аутоиммунных заболеваниях.

1.10. Рекомбинантные фибрилларины. Роль остатков цистеина в иммуногенности фибрилларина.

1.11. Выводы. 39 II. Материалы и методы. 40 II.1. Материалы. 41 II. 1.1. Реактивы. 41 II. 1.2. Ферменты 41 II. 1.3. Бактериальные штаммы и плазмиды. 42 II. 1.4. Микробиологические среды. 42 II. 1.5. Линии клеток человека и среды для эукариотических клеток.

II.2. Методы.

11.2.1. Выделение плазмидной ДНК методом щелочного лизиса.

11.2.2. Проведение полимеразной цепной реакции (PCR). 44 И.2.3. Олигонуклеотиды.

11.2.4. Сайт-направленный мутагенез.

11.2.5. Получение компетентных клеток Е. coli.

11.2.6. Трансформация компетентных клеток Е. coli. 46 И.2.7. Скрининг рекомбинантных клонов. 47 И.2.8. Выделение рекомбинантного белка. 47 И.2.9. Ренатурация очищенного рекомбинантного белка. 48 II.2.10. Инъекция мышей препаратом белка и отбор крови. 48 И.2.11. Иммунодот. 49 И.2.12. Иммуноблот.

11.2.13. Трансфекция клеток HeLa и иммуноцитохимические методы.

11.2.14. Выявление мест синтеза рРНК.

III. Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека. Обсуждение результатов. 54 III. 1. Структурная организация фибрилларина человека и связь его функциональной активности с локализацией в ядрышках.

111.2. Локализация химерного белка фибрилларин-GFP аналогична распределению эндогенного фибрилларина.

111.3. Остатки цистеина Cys99 и Cys268 и наличие дисульфидной связи между ними не влияют на специфическую локализацию фибрилларина.

111.4. Конструирование плазмидных векторов для изучения локализации мутантных вариантов фибрилларина, слитых с

GFP в клетках человека.

111.5. GAR-домен фибрилларина содержит сигналы ядрышковой локализации.

III.6. Другие структурные участки фибрилларина по отдельности не содержат сигналов локализации в ядрышке.

111.7. Лишенный GAR-домена фибрилларин локализуется ; аналогично фибрилларину «дикого типа».

111.8. Первый спейсерный участок играет важную роль в структурно-функциональной организации фибрилларина человека.

111.9. Предполагаемый механизм специфического фибрилларин-зависимого 2'-0-метилирования остатков рибозы в пре-рРНК.

III. 10. Получение рекомбинантного белка «стрептавидин - 2-й спейсерный участок - а-спиральный домен».

III. 11. Получение и исследование поликлональной сыворотки мыши к С-концевому фрагменту фибрилларина человека.

IV. Выводы. 100 Благодарности 101 Список цитированной литературы.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

EDTA - этилендиаминтетраацетат натрия. EtBr -бромистый этидий.

GFP - зеленый флуоресцирующий белок, green flourescent protein.

IPTG - изопропил-Р,Б-тиогалактопиранозид.

SDS - додецилсульфат натрия. а.о. - аминокислотный остаток. мякРНК - малая ядрышковая РНК. мякРНП - малый ядрышковый рибонуклеопротеид. пре-рРНК - прерибосомальная РНК рДНК - гены рибосомной РНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структурно-функциональной организации фибрилларина человека"

В последнее время в биологии весьма остро стоит вопрос системного познания фундаментальных принципов функционирования клетки. Одним из важнейших процессов в развитии клетки является формирование основного аппарата обеспечения жизнедеятельности клетки - биогенез рибосом, без которых развитие, дифференциация и другие процессы жизнедеятельности клеток нереализуемы. Изучение природных механизмов образования аппарата синтеза белка и систематизация знаний об этом процессе может внести существенный вклад в понимание основных принципов функционирования клеток.

Актуальность темы диссертации. Прочная взаимосвязь, существующая между функциональной активностью отдельных белков и их внутриклеточной локализацией, позволяет проводить изучение значимости отдельных элементов молекулы для функционирования in vivo белка в целом, основываясь, прежде всего, на изменениях в локализации в клетке мутантных полипептидов, детектируемых с помощью методов иммуноцитохимии или флуоресценции слитых с исследуемым продуктом белков-маркеров.

Исследование структурно-функциональных отношений в белке ядрышка эукариот - фибрилларине, позволяет выявить участки белковой молекулы, определяющие его РНК-связывающую и метилтрансферазную активности, а также установить структурные элементы, направляющие транспорт этого белка в ядрышко. Такие данные, помимо фундаментальных знаний о принципах функционирования фибрилларина и механизмах процессинга пре-рРНК, позволяют выяснить закономерности распределения фибрилларина в клетке на разных стадиях клеточного цикла, онто- и эмбриогенеза. Последнее особенно важно в связи с образованием у ряда больных аутоиммунными заболеваниями (например, системной склеродермией) антител к фибрилларину и его комплексам с нуклеиновыми кислотами и другими белками. Т.о., понимание закономерностей структурно-функциональной организации фибрилларина ведет к расширению знаний о возникновении и течении аутоиммунных заболеваний.

Сказанное выше и определяет актуальность темы исследования.

Цель работы. Целью работы являлось выяснение функциональной роли отдельных структурных элементов в молекуле фибрилларина человека - белка ядрышка эукариот, участвующего в процессинге прерибосомальной РНК.

Научная новизна работы. При проведении работы получена серия рекомбинантных векторов, несущих гены различных мутантных форм фибрилларина человека, слитых с маркерным зеленым флуоресцирующим белком (GFP) под контролем истинно раннего промотора цитомегаловируса. Исследована экспрессия генов рекомбинантных химерных белков и изучена локализация мутантных форм фибрилларина человека в клетках HeLa.

Впервые показано, что специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК в ядрышке обусловлена не какими-либо сигнальными последовательностями, а функциональной активностью белка. Установлено, что мутантный белок, лишенный N-концевого глицин- и

• • ! ' ' ' Н аргинин-богатого участка, сохраняет функциональную активность и специфическую локализацию аналогично ортологам фибрилларина у представителей Archae. ■ t

Впервые установлено, что наличие или отсутствие дисульфидной связи между двумя высококонсервативными остатками цистеина в молекуле фибрилларина человека не влияет на локализацию и функциональную активность белка.

Впервые получен рекомбинантный экспрессионный вектор, в составе которого клонирован ген слитого белка «стрептавидин - С-концевой фрагмент фибрилларина человека». Показано, что полученная конструкция обеспечивает достаточный уровень экспрессии химерного гена в Е. coli. Разработана система выделения, очистки и ренатурации такого рекомбинантного белка из штамма-продуцента Е. coli.

Получена антисыворотка мыши, высокоспецифично взаимодействующая с С-концевым фрагментом фибрилларина и полноразмерным фибрилларином в системах in vivo и in vitro.

Практическая ценность работы. Исследованы структурно-функциональные отношения отдельных элементов молекулы фибрилларина человека, что позволит расширить понимание фундаментальных процессов созревания прерибосомальной РНК и механизмов транспорта белков в клетке.

Впервые получен штамм-продуцент слитого белка «стрептавидин - С-концевой фрагмент фибрилларина» и разработана методика выделения и очистки рекомбинантного белка. Выделение такого химерного белка позволило получить высокоспецифичную антисыворотку, потенциально применимую как в научной практике для иммуноцитохимических исследований, так и в медицинской диагностике.

I. Роль фибрилларина в биогенезе рибосом жизнедеятельности клетки. Обзор литературы.

1.1 Введение.

Одним из важнейших процессов в жизнедеятельности клетки является синтез полипептидных молекул на матрице мРНК - процесс трансляций.

Основными участниками процесса считывания информации, закодированной в последовательности мРНК, являются аминоацил-тРНК-синтетазы, тРНК, рибосомы, белки, связанные с рибосомами, и некоторые другие белки.

Рибосомы - молекулярные машины, играющие ключевую роль в синтезе белка, имеются во всех клетках; их число колеблется от 20000 до

50000 в зависимости от белок-синтезирующей активности клеток [1].

Рибосомы эукариот, находящиеся в цитозоле, состоят из малых (40S) и больших (60S) субчастиц. Малые субчастицы содержат одну молекулу i ) рибосомальной РНК (18S) размером около 1900 нуклеотидов и 30 - 35 белков; большие - три цепи рРНК длиной 120 (5S), 160 (5,8S) и 4800 (28S) нуклеотидов и 45 - 50 белков [1].

Установлено, что почти половина общей транскрипционной активности в большинстве эукариотических клеток приходится на долю генов класса I, транскрибируемых с участием РНК-полимеразы I [2, 4]. Единственным продуктом этого процесса является предшественник рибосомной РНК (пре-рРНК). В клетках человека первичные транскрипты генов рРНК, известные как 45S-PHK, имеют в длину около 13000 нуклеотидов. Прежде чем покинуть ядро в составе собранной субчастицы рибосомы, 45S-PHK подвергается специфическому расщеплению, в результате чего образуется по одной копии 28S-PHK, 18S-PHK и 5,8S-PHK, которые и являются компонентами рибосомы. Общее происхождение всех трех типов рРНК из одного первичного транскрипта является гарантией того, что они будут образованы в равных количествах. Остальная часть пре-рРНК транскрипта (около 6000 нуклеотидов) деградирует в ядре (рис. 1). Возможно, эти «излишние» участки первичного 455-транскрипта играют определенную роль на ранних стадиях процессинга пре-рРНК, происходящих непосредственно по завершении синтеза 45S-PHK.

1фру Деградкруянцне участки нуклеотндной последов атачыюсти

ISS-pPHK

3"

Включение в малую субчастицу рибосомы

2SS-pPHK

Включеюш и большую субчастнцу рибосомы

Молекулы SS-pPHK снкгеэируются в футом месте

Рисунок 1. Общая схема процессинга 45S-npe-pPHK эукариот с образованием молекул рРНК трех типов. Почти половина первичного транскрипта деградирует в ядре.

Число генов, кодирующих рРНК, колеблется от сотен до нескольких тысяч в зависимости от вида эукариот (у человека - около 200 копий гена пре-рРНК на гаплоидный геном [3]). Множественные копии высококонсервативных генов рРНК расположены в виде серии тандемных повторов, отделенных друг от друга межгенным спейсером ДНК. У человека эти копии распределены небольшими кластерами по пяти различным хромосомам [3].

Другие тандемно повторяющиеся гены, также разделенные спейсерами, - это гены 5S-PHK большой субчастицы рибосомы (это единственная рРНК, транскрибируемая отдельно от других). Гены этой рРНК насчитывают в длину всего 120 пар нуклеотидов и, как и большинство других генов, кодирующих небольшие стабильные РНК, транскрибируются РНК-полимеразой III. У человека насчитывается около 2000 генов 5S-pPHK, которые тандемно расположены внутри единственного кластера, локализованного в отличной от других генов рРНК области. Остается неизвестным, почему этот тип рРНК транскрибируется отдельно [3].

Непрерывная транскрипция дуплицированных генов обеспечивает клетку достаточным количеством рРНК. Новосинтезированные транскрипты незамедлительно связываются с рибосомными белками с образованием рибосом. Сборка рибосом происходит в ядре, а именно в той его специфической области с диффузной структурой, которая называется ядрышком.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Левицкий, Сергей Алексеевич

IV. Выводы.

1. GAR-домен фибрилларина человека содержит сигналы ядрышковой локализации. Другие структурные участки фибрилларина по отдельности таких сигналов не содержат.

2. Специфическая локализация фибрилларина в фокусах транскрипции рДНК не зависит от наличия дисульфидной связи в белке.

3. Локализация фибрилларина обусловлена его взаимодействием с мякРНК в составе мякРНП участком 1 Sp-RB-2Sp-a.

4. Предложена модель осуществления специфического фибрилларин-зависимого 2'-0-метилирования остатков рибозы в пре-рРНК.

5. Получен штамм-продуцент слитого белка «стрептавидин - 2-й спейсерный участок - a-спиральный домен фибрилларина» и разработана схема выделения, очистки и ренатурации рекомбинантного белка.

6. Получена антисыворотка мыши, специфично взаимодействующая с фибрилларинами человека и мыши в условиях in vivo и in vitro.

101

Благодарности.

Автор выражает признательность и благодарность всем сотрудникам лаборатории Молекулярной биологии ФГУП ГосНИИгенетика, а также д.б.н. О.В. Зацепиной, К.Ш. Мухарьямовой и всем сотрудникам лаборатории Структурной биохимии Института Биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Левицкий, Сергей Алексеевич, Москва

1. М. Сингер, П. Берг. Гены и геномы./ -М.: «Мир»., 1998, т. 1. С. 142.

2. М. Сингер, П. Берг. Гены и геномы./ -М.: «Мир», 1998, т. 2, С. 25-27.

3. Б. Албертс и др. Молекулярная биология клетки./ -М.: «Мир», 1994, т.2, С. 162-166.

4. Miller O.L.I I J. Cell Biol. 1981. - V. 91. - P. 15 - 27.

5. Hadjiolov A.A. The Nucleolus and Ribosome Biogenesis./ New York, Springer-Verlag, 1985.

6. ArnettF.C., Reveille J.D., Goldstein R.,et al. //Arthritis Reum. 1996. -V.39. P. 1151- 1160.

7. Tormey V.J., Bunn C.C., Denton C.P., et al. II Rheumatology. 2001. - V.40.-P. 1157-1162.

8. Hultman P., Enestrom S., Turley S.J., et al. II Clin. Exp. Immunol. 1994. -V. 96.-P. 285-291.

9. Yang J.M., Baserga S.J., Turley S.J., et al. II Clin. Immunol. 2001. - V. 101.-P. 38-50.

10. URL http://npd.hgu.mrc.ac.uk/images/fullnucleolusfigl.jpg

11. Miller, O. L., Jr., Beatty B. RJ/ Science. 1969. - V. 164. - P. 955.

12. Brown J. W.S., Shaw P.J. II The Plant Cell. 1998. - V. 10. - P. 649-657.

13. Dennis P.P., OmerA., Lowe T.U Mol. Microbiol. 2001. - V. 40.-P. 509515.

14. Madden B.E.HJI Prog. Nucleic Acid Res. 1990. - V. 39. - P. 241-303.

15. Madden B.E.H. /The modified nucleotides in ribosomal RNA of man and other eukariotes. In Chromatography and Modification of Nucleosides, C.W. Gehrke and K.C.T. Kuo./ eds (Amsterdam: Elsevier), B265-B301.

16. Maxwell, E.S., and Fournier, M.J. II Annu. Rev. Biochem. 1995. - V. 35. -P. 897-934.

17. Ofengand, J., andBakin, AM J. Mol. Biol. 1997. V. 266. - P. 246-268.

18. Bachellerie, J.-P., Michot В., Nicoloso M., et al. II Trends Biochem. Sci. -1995. -V. 20.-P. 261-264.

19. SteizJ.A., Tycowski K.T.I I Science. 1995. - V. 270. - P. 1626-1627.

20. Balakin A.G., Smith L., Fournier M.J. //Cell. 1996. - V. 86. - P. 823-834.

21. Caffarelli, E., Fatica, A., Prislei, S., et al./IEUBO J. 1996. - V. 15. - P. 1121-1131.

22. Watkins N.J., Leverette R.D., Xia L., et л/.//RNA. 1996. - V. 2. - P. 118133.

23. Verheggen C., Lafontaine D.L., Samarsky D., et alMEMBO J. 2002. - V. 21.-P. 2736-45.

24. Christensen, M.E.I IBiochem. Biophys. Res. Commun. 1977. - V. 74. - P. 621 - 629.

25. Ochs R.L., Lischwe M.A., Spohn W.H., et al. I I Biol. Cell. 1985. - V. 54. -P. 123-134.

26. Aris J.P., Blobel G. II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V. 88. - P. 931-935.

27. Turley S.J., Tan E.M., PollardK.M. И Biochem. Biophys. Acta. 1993. -V. 1216.-P. 119-122.

28. Lapeyre В., Mariottini P., Mathieu С., et al II Mol. Cell Biol. 1990. - V. 10.-P. 430-434.

29. Christensen M.E., FuxaK.P. II Biochem. Biophys. Res. Com. 1988. - V. 155.-P. 1278-1283.

30. Pierron G., Pedron J., Schelling M, et al И Biol. Cell. 1989. - V. 65. - P. 119-126.

31. Testillano P.S., Sanchez-Pina M.A., Lopez-Iglesias C., et al II Chromosoma. 1992. - V. 102. - P. 41-49.

32. Barneche F., Steinmetz F., Echeverria M. II J. Biol. Chem. 2000. - V. 275.-P. 27212-27220.

33. Pih K.T., Yi M.J., Liang Y.S., et al //Plant Physiol. 2000. - V. 123. - P. 51-58.

34. Tollervey D., Lehtonen H., Jansen R., et al II Cell. 1993. - V.72. - P. 443-457.

35. Narcisi E.M., Glover С. V., Fechheimer M. II J. Eukaryotic Microbiol. -1998.-V. 45.-P. 105-111.

36. Wang H., BoisvertD., Kim K.K., et al IIEMBO J. 2000. - V. 19. - P. 317-323.

37. Туе, K., Steitz, J.A.IIEMBO J. 1989. - V. 8. - P. 3113 - 3119

38. Kiss-Laszlo Z., Henry Y., Bachellerie J.P., et al II Cell. 1996. - V. 85. -P. 1077-1088.

39. Tycowski K.T., Smith C.M., Shu M.D., et. all I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996. V. 93. - P. 14480-14485.

40. Dunbar D.A., Wormsley S., Lowe T.M., et al II J. Biol. Chem. 2000. - V.275.-P. 14767-14776.

41. Pinol-Roma £//Mol. Biol. Cell. 1999. - V. 10. - P. 77-90.

42. Nicol S.M., Causevic M., Prescott A.R.,et a/.//Exp. Cell Res. 2000. - V. 257. - P. 272-280.

43. Ghosh S., Ghosh R., Das P.,et cr/.//Prot. Expr. Purif. 2001. - V. 21. - P. 40-48.

44. Snaar S., Weismeijer K., Jochemsen A.G., et all I J. Cell Biol. 2000. - V. 151 - P. 653-662.

45. Chen M., Rockel Т., Steinweger G., et al. II Mol. Cell Biol. 2002. - V. 13. -P. 3576-3587.

46. Жарская O.O., Медэ/сидова A.A., Федорова H.E., и др. // Доклады Академии Наук. 2002. - Т. 387. - С. 1-4.

47. Newton К., Petfalski Е., Tollervey D.,et alJMol Cell Biol. 2003. - V. 23. -P. 8519-27.

48. Jang Y.K., Kim M., Dai Park SV/Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. -V. 294. - P. 1184-1190.

49. Jones K.W., GorzynskiK., Hales C.M., et al.lI J. Biol. Chem. 2001. - V.276.-P. 38645-38651.

50. Pellizzoni L„ Baccon J., Charroux В., et al.l I Curr. Biol. 2001. - V. 11. -P. 1079-1088.

51. Ghisolfi L., Joseph G., Amalric F„ et all/J. Biol. Chem. 1992. - V. 267. -P. 2955-2959

52. Pellar G.J., DiMario P./V/Chromosoma. 2003. - V. 111. - P. 461-469

53. Jong A., Clark M., Gilbert M, et alJMoX. Cell Biol. 1987. - V. 7. - P. 2947-2955.

54. CobianchiF., SenGupta D., Zmudzka В., et all ft. Biol. Chem. 1995 - V. 261.-P. 3536-3543

55. Girard, J. P., Lehtonen, H., Caizergues-Ferrer, M., et aUFEMBO J. — 1992.-V. 11.-P. 673-682.

56. Gendra E., Moreno A., Mar Alba M.,et alJ!The Plant J. 2004. - V. 38. -P. 875-886.

57. Lin C.H., Huang H.M., Hsieh M., et alllJ. Protein Chem. 2002. - V. 21. -P. 447-453.

58. Bouvet P., Diaz J.-J., Kindbeiter K., Madjar J.-J., et alt'/J. Biol. Chem. -1998. V. 273. - P. 19025-19029.

59. Yanagida M., Hayano Т., Yamauchi Y., et я/V/JBC Papers in Press. -Published on October 28, 2003 as Manuscript M305604200.

60. Lu Deng, N.G. Starostina, Zhi-Jie Liu, et al. II Biochem. Biophys. Res. Com. 2004. -V. 315. - P. 726-732.

61. Jansen R.P., Hurt E.C., Kern H, et all/J. Cell Biol. 1991. - V. 113. - P. 715-729.

62. Speckmann W.A., Li Z.H., Lowe T.M., et alllCun. Biol. 2002. - V. 12. -P. 199-203.

63. CreancierL., Prats H„ Zanibellato С., et al.llMol. Cell Biol. 1993. - V. 4.-P. 1239-1250.

64. Schmidt-Zachmann M.S., Nigg E.A.IIJ. Cell Sci. 1993. - V. 105. - P. 799806.

65. Ou YFritzer M.J., Valdez B.C., et о/.//Exp. Cell Res. 1999. - V. 247. -P. 389-398.

66. Dundr M., Herbert M.D., Karpova T.S., et allll. Cell Biol. 2004. - V. 164.-P. 831-842.

67. Zatsepina О. V., Baly Ch., Chebrout M., et al.ll Dev. Biol. 2003. - V. 253. -P. 66-83.

68. Baran V., VeselaJ., RehakP., et al.llMoX. Reprod. Dev. 1995. - V. 40. -P. 305-310.

69. FerreiraJ., Carmo-Fonseca M.//Development. 1995. - V. 121. - P. 601612.

70. YangJ.-M., Baserga S.J., Turley S.J., et ^/.//Clinical Immunology. 2001. -V. 101.-P. 38-50.

71. Arnett F.C., Reveille J.D., Goldstein R., et al. II Arthritis Reum. 1996. -V. 39.-P. 1151-1160.

72. Van Eenennaam H., Vogelzangs J.H.P., Bisschops L., et al.ll Clin. Exp. Immunol. 2002. - V. 130. - P. 532-540.

73. Chen M, von Mikecz A.IIExp. Cell Res. 2000. - V. 259. - P. 225-238.

74. Zhou X., Tan F.K., Xiong M., et al.Hl. Immunol. 2001. - V. 167. - P. 7126-7133

75. D.L. Pearson, R.D. Reimonenq, KM. Pollard.il Protein Expr. Purif. 1999. -V. 17.-P. 49-56

76. Степанов B.M. Молекулярная Биология. Структура и функции белков./Под ред. А.С. Спирина-М.: Высш. шк., 1996, С. 111-113.

77. Takeuchi К., Turley S. J., Tan Е. М., et al.lП. Immunol. 1995. - V. 154. -P. 961-971.

78. Lubben В., Rottmann N., Kubicka-Muranyi M., et д/.//Мо1. Biol. Rep. -1994.-V. 20.-P. 63-73.

79. Azum-Gelade M.C., Noaillac-Depeyre J., Caizergues-Ferrer M., et al./IJ. Cell Sci. 1994. - V. 107. - P. 463-475.

80. Мухаръямова К.Ш., Дудник O.A., Сперанский A.M., и др. // Биологические мембраны. 1998. - Т. 15. - С. 657-669.

81. Savino Т.М., Gebrane-Younes J., De Mey J., et al.HL Cell Biol. 2001. -V. 153.-P. 1097-1110.

82. Heine M.A., Rankin M.L., DiMario P.JJ/UoX. Cell Biol. 1993. - V. 4. - P. 1189-1204.

83. Ho S.N., HuntH.D., Horton R.M., et al./IGene. 1998. - V. 77. - P. 51-59.