Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение специфического взаимодействия карбоксильной группы аминокислот с нуклеотидными основаниями, нуклеозидами и их метилпроизводными методами оптической спектроскопии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение специфического взаимодействия карбоксильной группы аминокислот с нуклеотидными основаниями, нуклеозидами и их метилпроизводными методами оптической спектроскопии"

# о

¿О НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ

,_ 1НСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНО! Б10Л0Г1! ТА ГЕНЕТИКИ

На правах рукопису УДК 577(322+323):543.424

Колом!ець 1рина Микола1вна

ВИВЧЕННЯ СПЕЦИФ1ЧНО! ВЗАСМ0Д1Х КАРБОКСИЛЬНО! ГРУПП ЛШНОКНСЛОТ 3 НУКОЛЕОТНДНИМИ ОСНОВАМИ. НУКЛЕОЗНДАМИ ТА 1ХШМИ МЕТИЛПОХ1ДНИМИ МЕТОДАМИ оптично! СПЕКТРОСКОП II

03.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНА Б10Л0ПЯ

.Автореферат

дисертацП на здобуття иаукового ступеня кандидата б!олог1чних наук

Ки1в - 1996

Роботу виконано у в1дд1л1 молекулярно! б1оф!зики 1нститут молекулярно! б1олог11 та генетики HAH Укра1ни

НАУК0В1 КЕР1ВНИКИ: кандидат б!олог1чних наук.

старший науковий сп1вроб1тник,

доцент__

|М. В. Желтовський,

кандидат ф1зико-ыатематичних наук, старший науковий сп1вроб1тник Д. М.Говорун

0Ф1Ц1ЙН1 ОПОНЕНТИ: доктор б1олог1чних наук.

професор В. I. Зима

кандидат х1м1чних наук, старший науковий сп1вроб1тник А. С. Шаламай

Г1ров1дна установа: 1нститут б1ох1м1! 1м. 0. В. Палпад1на HAH Укра!к

Захист дисертацП в1дбудеться " ЪО " dimn9i 1996 року JL годин! на зас1данн1 Спец1ал1зовано! вчено! ради Д 01.86,01 1 захисту докторських дисертац1й в 1нститут1 молекулярно! б1олог! та генетики HAH Укра!ни (252143, м.Кихв-143, вул. Академ1ка За болотного. 150).

3 дисертац1Ею можна ознайомитись в б1бл1отец1 1нституту ыс лекулярно! б1олог11 та генетики HAH Укра!ни.

Автореферат роз1слано _ 1996 року,

Вчений секретар Спец1ап1зовано! вчено! ради, кандидат б1олог1чних наук, старший науковий сп1вроб1тник

Актуапьн1сть проблем. Висв1тлення ф1зико-х1м1чних основ специф1чносг! б1лково-нукле!нового вп1энавання е одним 1з центральних завдань сучасно! молекулярно! та структурно! б!о-логП. Одним з найб!льш важливих чинник1в структурно! специф1-ки цих взаемод!й е точков1 б1лково-нукле!нов1 контактн та мно-жинн1сть утворюваних Н-зв'язк1в, котр1 забезпечують як точ-н!сть, так 1 функц!онально необх1дну м!нлив1сть таких контакта. 0ск1льки детальне розум1ння ф1зико-х1м1чних иехан1зм1в б1лково-нукле!нового вп!знавання е дуле складним завданням на-в1ть у найпрост1ших випадках. актуальн1сть досл1дження простих модельних систем на мономерному р1вн! не викликае сумн1ву. Об'ектом досл1дження вибрано одну з найб1льш активних груп б!чних рад1кал1в ам1нокислот - карбоксильну групу аспарагино-во! та глутам1ново! кислот. нуклеотидн1 основи, нуклеозиди та 1хн1 метилпох1дн1. Використання велико! к!лькост1 ыетиллох1д-них основ та нуклеозид!в не т1льки дозволило оц1нити внесок в специф!чн1сть взаемодП окремих атомних груп, апе й мае самос-т!йний 1нтерес з точки зору вивчення комплексотв1рно! здатнос-т1 досл!джених молекул та розум!ння 1хньо1 б1олог1чно! рол1.

Мета роботи - висв1тлити ф1зико-х1ы1чн! механ1зми водне-вого зв'язування карбоксильно! групи ам1нокислот з нуклеотид-ними основами, нуклеозидами та !хн1ми метилпох!дними в безводному ДМСО 1 його внесок в специф!чн1сть реальних б!лково-нук-ле!нових взаемод1й.

Для виконання роботи вир1шувалися так1 завдання:

1. Створення банку УФ та 14 спектр!в поглинання основ. нуклеозид1в 1 1хн1х метилпох1дних, а також 1хн1х Н-зв'язаних комплекс1в з карбоксильное групою та карбоксилат-1оном у безводному диметилсульфоксид! (ДМСО).

2. Визначення структури Н-зв'язаних комплексов обох форм карбоксильно! групи ai.ilнокислот з основами та нуклеозидами.,

3. Вивчення впливу метилювання основ та нуклеозид!в на специф!чн!сть !хньо! взаемодП з карбоксильною групою та кар-боксилат-1оном.

4. Досл1дження провесу перенесения протону по м!жмолеку-лярному Н-зв'язку в1д карбоксильно! групи на основу та ецд ос-нови на карбоксилат-1он.

5. 0ц1нка впливу розчинника на комллексоутворення, зокре-ма на перенесения протону вздовж м1жмолекулярного Н-зв'язку.

6. Анал1з б!олог1чно! значущост! отриманих результат!в.

Наукова новизна. Вперше методами УФ та 14 спектроскоп1!

досл1дкено специф1чну взаемод1ю карбоксильно! групи та карбок-силат-1ону з низкою основ, нуклеозид!в та 1хн1х метиллох1дних у безводному ДМСО в рамках единого експериментального набли-ження. Визначено схеми Н-зв'язування при комплексоутворенн1: з одним, з двома цикл1чними Н-зв'язкаш, 1з втягненням СН-груп, зареестровано випадки перенесения протону вздовж м!жмолекуляр-них Н-зв'язк1в, заф1ксооано взаемозалежн1сть ы1сць зв'язування карбоксильно! групи та карбоксилат-1ону з пуриновиы 1 п1рим1-диновим к1льцем та р1бозою (дезоксир1бозою) при лереход1 в!д основи до нуклеозиду. оц!нено вплив розчинника на процес комллексоутворення, зокрема на перенесения протону.

0триман1 результати дозволили поглибити розум1ння струк-турних аспект1в високоспециф1чних б1лково-нукле!нових взаемо-д1й при вп1знаванн1 деякими метилазами п1рим1динових субстра-т1в. АРСазами - в1дпов1дних тРНК, ферментами репарац11 - пош-коджених основ ДНК та 1н.

Практична ц!нн!сть роботи. Отриыан! результати розширюють

!снуюч1 уявлення про ф!зико-х!м!чну природу специф!чност! молекулярного вп!знавання. Досл!джен! структуры! характеристики точкових б!лково-йуклежових контакт!в ыожуть бути використан1 для !нтерпретацп рентгеноструктурних 1 ЯМР даних щодо тонких ' деталей просторовох органi3aqlï комплекс!в ДНК з регуляторними б!лкаыи. тРНК з АРСазами 1 т.п. Результатами дисертацП можна скористатися при побудов! теоретичних моделей; при синтез! 61-олог1чно активних речовин, в тому числ! л!карських препарат!в з адресной д1ею.

Особистий внесок автора полягае у виконанн1 всього обсягу експериментально! частини дисертацП, п!дбор! та обробц! л!те-ратурних даних, анал1з1 та !нтерпретац11 отриманих результате.

На захист виносяться так! основн! положения :

1. Розширений банк УФ та 14 спектр1в поглинання нуклео-тидних основ, нуклеозид!в та ïxhIx метилпох1дних, а також ïx-н1х Н-зв'язаних комплекс1в з карбоксильною групою ам!нокислот у безводному ДМСО; серед 52 досл!джених сполук - канон!чн1 ос-нови i нукпеозиди (Ade, Gua, Cyt, Ura, Thy), м!норн1 компонента ДНК (msA, m1 G, m7G, m5C) i РНК (m1 A, m6A, m®/6Ade, m1 G. m2G, m7G. isoGua. Hyp, m1 Hyp, M3Cyt, m5Cyt. IsoCyt. m3Ura). продукти генотоксично! ыодиф!кац1Г ДНК 1 РНК (m'A, m3Ade, m3Gua, m7G, m3Cyt, Hyp, Xan). метабол!ти HK (Hyp, Xan), складов! частини антиб!отик1в (Pur, и®16Ade, Hyp) та !н.

2. Ф1зико-х!м1чн! законом1рност1 Н-зв'язування обох форм карбоксильно! групи ам1нокислот з основами, нукпеозидами та 1хн1ми метилпох1днями, що стосуються структур» утворюваних комплекс1в, рол1 перенесения протону при ïx формуванн!, а також впливу розчинника на Гхню стаб1льн!сть.

3. Б1олог1чну значущ!сть отриманих результат!в, а саме -

внесок в специф1чн!сть реальних б1лково-нукле!нових взаемод!й точкових Н-контант1в карбоксильно! групи ам!нокислот з основами (взаемод!я метилаз 3i сво!ми субстратами, вп!знавання ферментами репарацП пошкоджених нуклеозид1в, специф1чне зв'язу-вання тРНК з в!дпов!дними АРСазами, роль м!норних компонент^ тРНК в стабШзацП Гхньо! просторово! структури i т.п.).

Апробац1я роботи. Основн! результата дисертацП допов!да-лися на I Всесоюзному б!оф!зичному з'!зд! (Москва. 1982), М!ж-народному симпозиум! "Ф!зико-х!м1я ДНК ! молекулярн! механ!зми функц!онування геному" (Тб1л1с!, 1987), V М!жнародн!й нарад! по б1оыолекулярн!й стереодинам!ц! (Олбан!, 1987), II та III Европейських конференц1ях !з спектроскопП б1олог1чних молекул (Фрайбург, 1987 та Болонья, 1989), XIV М!жнародному KOHrpeci по б!ох!м!1 (Прага, 1988), VI та VII Всесоюзних конференц1ях 1з спектроскоп!! б!опол!мер1в (Харк!в, 1988; 1991), XX Всесоюзному з'!зд1 i3 спектроскоп!! (Ки!в, 1988), М!жнародному симпозиум! "Молекулярне вп!знавання та його роль в х1м!1 та б1о-xiMii" (Сопрон, 1988), XVI М!жнародному колокв1ум! з спектроскоп!! (Соф!я, 1939). II Всесв!тньому конгрес! з теоретично! xiMil (Торонто, 1990), III М1жнародн!й конференц!! !з спект-pocKonl'i лазерного розс!ювання та д!агностиц1 б!ооб'ект1в (Москва, 1990), М!жнародному симпозиум! з нових досягнень в х1м!1 та молекулярн1й б1олог!! раку (Пек!н, 1991), I та II Ук-раГнсько-польських симпозиумах з водневого зв'язку (Черн!вц1, 1989; Одеса, 1992), XII КИжнародному сем!нар! з м!жмолекуляр-но! взасмодП та конформацП молекул (Харк1в, 1994) та !н.

Публ1кац1!. Матер!али дисертацП викладен1 у 31 науков!й прац!» серед них - 11 статей у в!тчизняних та закордонних журналах, що реферуються.

Структура та обсяг дисертацН. Дисергац1я складаеться 1з вступу, трьох ориг1нальних частин, кояна з.яких зак1нчуеться висновками, п1дсумкових висновк!в та перел!ку використано! л1-тератури 1з 150 найменувань. Роботу викладено на 163 стор1нках друкованого тексту, вона м!стить 35 рисунк1в та 24 таблиц!; структури заф!ксованих комплекс!в представлен1 на 27 граф!чних схемах.

ОБ'еКТИ ТА МЕТОДИ ДОШДЖЕНЬ Взаемод1я основ, нуклеозид1в та Ixhíx метилпох!дних з карбоксильной групою вивчалась в сумiшах з ас-Asp, ac-Glu, ac-Gly. ac-Asp-OMe, а з карбоксилат-1оном - в сум!шах з NaAc, f-Gly(ONa), f-Asp(0Na)¡, та í-Glu(ONa)., у безводному ДМСО.

Спектри УФ поглинання рееструвались на спектрофотометр! MPS-2000 (Shlmadzu). Спектри 14 поглинання рееструвались на спектрофотометр! Specord М80 (Carl Zeiss). В1днесення смуг 14 поглинання зроблено на баз! в1домих з л!тератури розрахункових та експериментальних даних, а також на п1дстав1 власного банку 14 спектр!в. В робот! використовувалися реактиви Ф1рм Fluka. Serva. Sigma, Aldrlch, Calblocheia.

РЕЗУЛЬТАТА Д0СЛ1ДЙЕНБ TA IXHG ОБГОВОРЕННЯ Отриман! результати представлен! в таблицах 1 та 2, а також частково на рисунках 1-7.

1. Досл1дхення взаемодН пуринових основ, нуклеозид1в та ixhíx мвтилпох!дних з карбоксильного грулои аи1нокислот. Характер зм1н, що спостер!гаються в УФ спектр1 поглинання Ade при додаванн! в його розчин у безводному ДМСО NaAc (рис.1), под!бний до аналог1чних зм!н, що мають м1сце у водному розчин! Ade при лужних pH: це св!дчить про сильну взаемод1ю з карбок-силат-Юном. В 14 спектр! Ade в присутност! NaAc смуга йШН2) =

Таблиця 1. Взаемод1я нуклеотидних основ, нуклеозид!в та 1хн1х метиллох!дних з карбоксилат-1оном у безводному ДМСО (строкою позначено перенесения протону).

Основа, нуклеозид

Схема взаемодП

Ade т'Айе 31 Айе и® Риг и'Айе

И6Н... О—С—0... Ш №Н... О—С—О... Н7И №9Н... О—С—О

ыэнг^о—с—о

№Н... О—С—О

ш'Сиа т^иа

Шд'9 Сиа

т^иа 1БоСиа й dG т'й о'С

Ы1Н... 0=С=0... Н2И ШН...0—С—О...Н2Л

шн...о—с—о...Н2И

ШНГТТО—С=0 ШН...0—С=0...Н6И

тн...о—с=о. . .нги шн. ..о—с—о. ..ш

МН. ..О—С—0. ..Н2М ШНггМЭ—С—О...Н2И

н

|р

сП тг1

№Н... 0==С==0 або Ы1Н...0==С=«0

шн.. .о=с~=о ШН.. . о=с—о С8К... 0==С=0

Хал й3Хап т3Хап гагХ X

№9Н... О—С—0 або ИЗН. №Н.. .0=С=0 МЗНГГГ0=С—О С8Н.. .0—С—О ШНгТ*)—С—О

. О—С=0

Сук ш5Су1 ш3Сук 1гоСук С

йС т5с!С

МН... О—С"0... Н6С И1Н... 0=С—0... Н6С 1\ПНГ7Г0—С-=0 ' И2Н.. . О—С~0... НЗМ С6Н... о—с=~о С6Н... о—с~о С6Н... О—С—О

ига о' ига т3ига

и

<Ш

ит... о—с—о... нес

М1Н... О—с=0 , ШНггуО—С—0...Н6С ИЗН... О—С—О та С6Н... О—С—О №Н... О—С—О та С6Н... О—С—О

ГЬу т'Тпу Т

гТ

ШН...О—С—0...Н6С

мзн... О—С—О

ИЗН... О—С—0 та СбН... О—С—О 1Ш... О—С—0 та С6Н... О—С—О

Таблица 2. Взаемод1я нуклеотидних основ, нуклеозид!в та Ххн1х метиллох!дних з карбоксильной групою ам1нокислот у безводному ДМСО (стр!лкою позначено перенесения протону).

Основа, нуклеозид ■ ------ ------- —..... Схема взаемод11

и1 Ade N6H... 0=C-0Hr7TN7

m3Ade N6H... 0=C-0H:T?1J7

m Ч И6Н... 0=C-0Hi7MJ7

m3Gua N2H... 0=C-0H... N1

isoGua N6H... 0=C-0H... N7

m7G N2H..,О=С-0НГГМй

ш71 N2H... O=c-OH^W1

Cyt MH.. .0=C-0HrTTN3

m'Cyt N4H...0=C-0H...N3

m5Cyt N4H...0=C-0Hr7TN3

inj,'5 Cyt ' . N4H...O=c-OH...N3

IsoCyt N2H... 0=C-0H... N1

С N4H... 0=C-0H... N3

dC M4H... 0=C-0H...N3

ra5dC N4H... 0=C-0H...N3

/ ч \ У />

V /

' г

I I «с-и

то ,пи то кое tire

Рис.1. Взаемод1я аден1ну з карбоксилат-1оном: а).УФ спектри Ade (0.5 ыМ) та його сум1ш! з NaAc (5 iM б .14 спектри Ade (30 мЮ та його сум1и1 з NaAc (30 мМ в).Структура комплексу Ade з NaAc.

в ДМСО. в ДМСО.

о

ez

С I

1650 см"1 поширюеться та зменшуеться ïï 1нтенсивн1сть, з'явля-ються нов! смуги - деформац1йного коливання Н-зв'язано! ам1-ногрупи при 1670 см"1 та &Ш7НМ611 см"1. Отже, при взаемодП Ade з карбоксилат-loHOM в!дбуваеться таутомерний перех1д N9H •* N7H та утворюеться комплекс з двома водневими зв'язками за участю ам!но- та 1м1ногруп основи . Така ж сама схема взаемодП реал1зуеться у комплекс! m6Ade з NaAc (табл.1), де також спостер!гаеться таутомерний перех!д МЭН -» N7H, а метильна трупа основи обернена до атома N1.

Встановлено, цо у безводному ДМСО in3 Ade !снуе в ам1нофор-м1, a m1 Ade (и1 А) знаходиться у 1м1ноформ1. и1 Ade (m1 А, рис.2) та и3Ade взаемод!ють з карбоксильною трупов через два цикл1ч-них Н-зв'язки, при цьому утворюються комплекси з перенесениям протону на пуринове к!льце основи (табл. 2). Здатн!сть протону-ватися карбоксильною трупом у m1 Ade сильн!ша, н1ж у m3Ade.

0триман1 результати дозволяють припустити, що вп!знавання ферментами репарацП 3-алкил- та 7-ажилпурин!в в!дбуваеться за участю б1чних радикал!в Asp та Glu за встановленою нами схемою взаемодП и1Ade та а3Ade з карбоксильною групою.

Заф!ксована взаемод1я 6 Ade та m5Pur з карбоксилат-1о-ном через 1м1ногрулу, причому в останньому випадку в1дбуваеть-ся перенесения протону по м!кмолекулярному Н-зв'язку з N9H групи основи на карбоксилат-1он (табл.1).

У безводному ДМСО и9Gua утворюе специф!чний комплекс з Карбосилат-iohom за допомогою двох Н-зв'язк!в, причому при переход! в1д основи до нуклеозиду схема водневого зв'язування не порушуеться (табл.1). Показано, що метилювання ам1ногрупи Gua (G) зб1льшуе його здатн1сть специф1чно взаемод1яти з кар-боксилат-1оном. У комплекс!, що при цьому утворюеться, N2-Me-

Рис.3. Взаемод1я 7-метилгуанозину з карбоксилат-1оном:

а).УФ спектри m'G (0.5 мМ) та його сум1ш1 з NaAc (5 мМ з ДМСО,

б). 14 спектри ra7G (10 мШ та його сум1ш! з NaAc (10 мМ) в ДМСО,

в).Структура комплексу m'G э NaAc.

л

Рис.4. Взаемод1я 7-метилгуанозину з карбоксильной групою:

а).УФ спектри m'G (0.5 мМ) та йсго сум!ш1 з ac-Asp (5 мЮ в ДМСО,

б). 14 спектри mrG (10 мЮ та його сум1и1 з ac-Asp (10 мМ) в ДМСО,

в); Структура комплексу mTG з ac-Asp.

тильна трупа m|,gGua (m2G) обернена до атома N3 пуринового к1льця.

Знайдено, що метильований по N3 атому Gua утворюе з кар-боксилат-ioHoii кошлекс з перенесениям протону в!д групи N7H основи (табл.1) 1 слабко взаемод1е з карбоксильной групою за участи атом1в N1 та N2H (табл.2).

Встановлено схеми водневого зв'язування m7G з карбокси-лат-1оном та з карбоксильного групою (рис.3 14). Це дозволило припустити, що механ!зм вп1знавання m7G ферментами penapaijiï при генотоксичн1й модиф!кацП ЛНК та РНК значною м!рою зумов-лений взаемод1ею m7G з б!чними радикалами Asp або Glu. а також з 1ндольним к1льцем Trp (Islilda, 1988).

Встановлено схеми взаемодИ isoGua. м!норного компоненту тРНК, з карбоксилат-1оном (табл.1) та карбоксильною групою (табл.2).

2. Вивчення взаемодН г1поксамтину. ксантину. ïxnix нук-леозид1в та деяких метилпох1дних з карбоксильной групою ам1-ноксилот. Заф1ксовано утворення Н-зв'язк1в Mist 1м1ногрупами N1H та N9H Hyp та карбоксилат-1оном; при переход1 в1д основи до нуклеозиду специф1чна взаемод1я з карбокскпат-1оном в1дбу-ваеться через 1м1но-протон групи N1H (табл.1). Метилювання 1м1ногрупи NlH I унеможливлве комплексоутворення з карбокси-лат-1оном.

Зареестровано наявн1сть м!цних Н-комплекс1в Xan. т3Хап та m9Xan з карбоксилат-loHOM (табл.1) э перенесениям протону в1д групи N3H основи на карбоксилат-1он.

Характер та величина зм1н в УФ спектр1 поглинання X у безводному ДМСО в присутност1 NaAc (рис.5) под1бн1 до анало-г!чних зм!н. цо спостер!гаються у вод! при переход! нейтральна

' IH №

0 II

YV'Y» „-Vi7

А

V

I

СИ,

Рис.5. Взаемод1я ксантозину з карбоксилат-1оном:

а).УФ спектри X (0.5 мМ! та його сум1ш1 з NaAc (5 мМ) в ДМСО,

б).14 спектри X (30 мМ) та його сум!ш1 з НаАс (30 мМ) в ДМСО.

в).Структура комплексу X з NaAc.

h i i Л.-«

о, с* . «ь^ 9у

к

II

с.1

' \ I

Рис.7. Взаемод1я 3-метилурацилу з карбоксилат-1оном:

а).УФ спектри m'Ura (1 мМ) Та його сум!и1 з NaAc (10 мМ) в ДМСО,

б). 14 спектри nifUra (10 мМ) та його cyMiml з NaAc (10 мМ) в ДМСО,

в).Структура комплексу m'Ura з NaAc.

форма -» ан1он у лукних рН. Це однозначно вказуе на депротону-вання основи у склад! комплексу. У 14 спектр! сум!ш! X з ЫаАс значно знижуеться !нтенсивн1сть смуги у(С=0)=1708 см"1, значно зб1льшуеться !нтенсивн1сть смуги у(С=0)=1668 см"1 депротонова-но! основи та з'являеться нова смуга при 1625 см"1, що взноситься до V(С=0) карбоксильно! групи. Це св!дчить про те, що X утворюе з карбоксилат-1оном комплекс з перенесениям протону в!д групи ГШ основи.

Показано, що наявшсть р!бози (дезоксир1бози) п!дсклюе взаемод!ю пуринового к1льця Нур та Хап з карбоксилат-!оном шляхом Н-зв'язування.

Заф1ксовано, що Хап та його пох!дн! !снують у безводному ДМСО частково у депротонован1й форм!, яка в!дновлюеться при додаванн! у розчин карбоксильно! групи.

Встановлено, що метилювання атому N7 !нозину, яке призво-дить до радикально! перебудови електронно! структури молекули. надае, як ! у випадку т7С, здатн1сть утворювати комплекс з карбоксильною групою з перенесениям протону на атом N1 пуринового к!льця и7I (рис.6). Метилювання атому N7 ксантозину, призводить не лише до радикально! зм1ни електронно! структури молекули, але й !н!ц!юе внутр!шньомолекулярний Н-ав'язок м!х атомом N3 пуринового к1льця 1 групою С1'Н' р!бози, що блокуе специф1чну спор1днен1сть пуринового к!льця до карбоксильно! групи (на в1дм1ну в1д ш7С та ш71).

Заф!ксовано утворення специф1чних Н-зв'язк1в м!ж карбок-силат-1оном та групою С8Н т71 та т7Х (табл.1).

3. Досл1дхешш взавиодИ п1рим1динових основ, 1хн1х нук-леозид1в та деяких иетюшох1дних э карбоксильной групою ам1но-кислот. Виявлено специф!чне комплексоутворення цитозину з кар-

боксильною групою за допомогою двох цикл!чних Н-зв'язк1в за участю груп N3 та N4H (табл.2). яке п1дсилюеться при метилю-ванн1 Cyt в положеНн1 С5.

Встановлено, що U та Т утворюють Н-зв'язаний комплекс з карбоксилат-iohom за участю групи N3H (табл.1). Наявн1сть такого специфичного точкового контакту м1ж U та б1чним радикалом Glu (Gin), ймов1рно, е одним з елемент1в вп!знавання тРНК01п Gln-АРСазою.

Ura, m3Ura та Thy утворюють комплекси з карбоксилат-1оном за допомогою двох Н-зв'язк1в з трупами М1Н та С6Н, при цьому в1дбуваеться часткове депротонування основи по rpynl N1H (рис.7).

Cyt, Ura та Thy утворюють комплекси з карбоксилат-1оном за участю груп N1H та С6Н. В1дпов1дн1 нуклеозиди утворюють слабк1 Н-комплекси за ' допомогою двох водневих зв'язк!в за участю груп С6Н та СГН'.

Це, зокрема, дозволяв зробити висновок, що молекулярний механ1зм вп1знаванкя п!рим1диновими метилазами специф!чного субстрату включае утворення Н-зв'язк1в м1ж карбоксильною групою Asp та трупами N3 1 N4H Cyt, а такой м1ж карбон1льною та ам1ногрупами Asn 1 трупами N3H та С40 Ura. Мутац1я Asn -» Asp (Luí, 1992) перетворюе тим1дилат-синтетазу, субстратом яко! е dUMP, в дезоксицитидилат-метилазу, яка працюе на dCMP. Blpo-г1дно, у цьому випадку елементсм вп1знавання ферментом п1рим1-динового субстрату 6 знайдене наш специф!чне зв'язування кар-боксилат-1ону з трупами С6Н та Cl'H' будь-якого п1рим!диновото нуклеозиду.

Знайдено, що частина молекул m3Cyt депротонуеться ДМСО. причому цей процес заложить в1д часу. В присутност! NaAc и3Cyt

- 16 -

noBHlCTio депротонуеться no rpyni N1H (табл.1).

Отримано схеш водневого зв'язування IsoCyt (який мае у сво!й структур! фрагмента, под1бн! до фрагмент1в п1рим!диново-го к1льця Gua та Cyt).3 карбоксильною групою - за участю труп N1 та N2H 1 з карбоксилах-Iohom - за участю груп N2H та N3H.

БИСНОВКИ

1. Отриыано розширений банк УФ та 14 спектр1в поглинання 52-ох нуклеотидних основ, нуклеозид!в та 1хн1х метилпох1дних, а також IxHix Н-зв'язаних комплекс!в з карбоксильною групою i карбоксилат-ioHOM у безводному ДОСО.

2. Заф!ксовано, цо з карбоксилат-iоном взаемод1ють такх незам!п;ен! нуклеотидн! основи та нуклеозиди - Ade, Gua, G, Hyp, I. Xan, X. lira. U. Thy, T; з карбоксильною групою взаемо-д!ють лише Cyt та С.

3. Знайдено, що вс1 досл1джен1 л1рим1динов! нуклеозиди (С, dC, ш5 dC, U, dU, Т та гТ) слабко взаемод1ють з карбокси-лат-1оном через групу С6Н п!рим1динового к!льця. В той же час група С8Н в ycix пуринових нуклеозидах, за винятком m7I та ш7Х, з карбоксилат-!оном у безводному ДМСО практично не взае-мод!е.

4. Показано, цо при метилюванн! ам!ногрупи Gua його комп-лексоутворення з карбоксилат-1оном п!дсилюеться, а метильован1 по iMlHorpyni нуклеозиди - га1 G. га11 та и^' 3Ura втрачають здат-HicTb взаеыод!яти з карбоксилат-1оноы.

Встановлено, цо метильован! по гетероцикл1чному атому азоту пуринов! основи (нуклеозиди) угворшть Н-комплекси з карбоксильною групою: ш1Ade (ш1А) та ш3Ade - з перенесениям протону на основу, mJGua - слабкий комплекс, a m7G утворюе комплекс« з перенесениям протону з обома формами карбоксильно!

групи. Метильован! по атому N7 I та X утворшть слабк1 Н-зв'язки з карбоксилаг-1оном за участо прогону групи СЗН га взаемод1ють з карбоксильно» групою: ш71 утворюе комплекс з перенесениям протону на основу, а т7Х - слабкий Н-комплекс.

Метильований по гетероцикл1чному ато.\,у азоту цитозин -га3Су1 утворюе з карбоксилат-1оном комплекс з перенесениям протону з групи ШН основи.

5. Основними факторами впливу розчинника на процеси перенесения протону по м!жмолекулярному Н-зв'язку е п1дсилення ос-таннього при сольватацП Н-комплексу та теплова рухлив1сть молекул розчинника, Значно б1льша кошлексотв1рна здатн!сть кар-боксилат-1ону пор1вняно з карбоксильно» групою пов'язана, зо-крема, з ефективн1иою сольватац1ею останньо! безводним ДМСО.

6. З'ясован! структурно-динам1чн1 аспекти специф1чних б1лково-нуклешових взаемод1й при вп1знаванн1 деякими метила-заыи п1рим1динових субстрат1в, АРСазами - в1дпов1дних тРНК, ферментами репарацП - модиф1кованих основ ДНК та 1н. Вислов-лено припущення про роль и1 А, ш7С , и3С, и6С та ягй в стаб1л1-зацП просторово! структури тРНК.

- 18 -

ПЕРЕЛ1К ОСНОВНЫХ ПРАЦЬ.ОЛУБЛ1КОВАНИХ НА ТЕМУ ДНСЕРТАЦ1?:

1. Zheltovsky N.V.. Samollenko S.A.. Kolomiets I.N. et al. Spectroscopic Investigation of the structure oi complexes between nucleotide bases and amino acid carboxyllc groups: nucleic acid-protein recognition aspect // Proc.of the II Eur. Conf. on Spectroscopy of Biological Molecules (Freiburg, 1987), in: Spectroscopy of Biological Molecules. New Advances. (E.D.Schmid, F.W.Schneider, F.Slebert, Eds.), John Wiley and Sons.-1988.-P.403-406.

2. Келтовский H.B., Самойленко С.А., Коломиец И.Н. и др. Взаимодействие нуклеотидных оснований с карбоксильной группой аминокислот в ДМСО: модель точечных белково-нуклеиновых контактов // Доклады АН УССР. Сер.Б.-1988.-N8.-С.68-71.

3. Zheltovsky N. V., Samoilenko S. A., Kolomiets I. И. et al. Some structural aspects of protein - nucleic acid recognition point mechanisms Involving amino acid carboxylic groups // J.Mol.Struct.-1989.-v.214 .-P. 15-26.

4. Zheltovsky N. V., Samoi lenko S. A., GovorunD.N., Kolomiets I.N. et al. Infrared and Raman spectroscopic studies of some nucleic acid-protein contacts structure // Proc. of 3d Eur.Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules (Bologna. Italy. 1989), In: Spectroscopy of Biological Molecules. State of the Art. (A.Bertoluzza, C.Fagnano, P. Monti, Eds.), Socleta Editrice Esculaplo. -Bologna. -1989. -P. 159-162.

5. Кондратюк И. В., Коломиец И. H.. Самойленко С. А. и др. Изучение комплексов цитозина с карбоксильной группой аминокислот методом спектроскопии ЯМР // Биополимеры и клетка. -1989.-т. 5, N6.-С. 21-25.

6. Zheltovsky N.V., Samollenko S.A.. Govorun D.N., Kolomiets I.N. et al. IR. Raman, NMR spectra and structure of some nucleic acid protein contacts: molecular recognition aspect // Book oi Abstr. of II World Congr. of Theoretical Chemistry (Toronto,. Canada. 1990), Canada.-1990.-D2-10.

7. Kolooiets I.N., Kondratyuk I.V., Stepanyugin A.V. et al. Influence of methylatlon of nucleic acid purine bases on their interactions with amino acids through the carboxylic group"// J.Mol.Struct.-1991.-v.250.-P. 1-11.

8. Желтовский H.В., Самойленко С. A., Коломиец И. H. и др. Спектроскопическое изучение взаимодействия нуклеотидных оснований и их производных с карбоксильной группой аминокислот в ДМСО // Тез.докл.Укр.школы-семинара "Спектроскопия молекул и кристаллов" в Сб.научных трудов "Оптическая спектроскопия", ч.'Н, (Ин-т физики. АНУ). -1993. -С. 226-229.

9. Желтовский Н.В., Самойленко С,А., Коломиец И.Н. и др. Исследование взаимодействия гипоксантина. ксантина и их метил- и гликозилпроизводных с карбоксильной группой аминокислот спектроскопическими методами // Биополимеры и клетка.-1993.-т. 9. N6.-С. 17-22.

10. ЗКелтовський М.В.. Сам1йленко С.П., Колом1ець I.M. та 1н. Взаемод1я метил- та гл1козилпох!дних п!рим1динових нуклео-тидних основ з карбоксильно» групою ам1нокислот // Биополимеры и клетка. -1994. -т. 10. N6. -С. 45-51.

11. Zheltovsky N.V., Samollenko S.А., Kolomiets I.N. et al. Recognition of purine bases and nucleosides by the amino acid carboxylic group // J.Mol. Struct.-1995.-344.-P. 53-62.

- 20 -А Н 0 Т А Ц I I Коломиец И.Н. Изучение специфического взаимодействия карбоксильной группы аминокислот с нуклеотидными основаниями, нуклеозидами и их метилпроизводными методами оптической спектроскопии. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1996.

Впервые исследованы физико-химические механизмы специфического взаимодействия карбоксильной группы и карбоксилат-иона с 52-мя нуклеотидными основаниями, нуклеозидами и их метилпро-изводными в безводном ДМС0 методами УФ и ИК спектроскопии. Получены схемы водородного связывания, зафиксированы случаи переноса протона в образующихся комплексах, оценено влияние растворителя на комплексообразование. Проанализирован вклад изученных точечных контактов в специфичность реальных белко-во-нуклеинсвых взаимодействий. Высказано предположение о роли некоторых минорных нуклеозидов в стабилизации структуры тРНК.

Kolomiets I.M. Investigation of specific interactions of amino acid carboxylic groups with nucleotide bases, nucleosides and their methyl derivatives by means of optical spectroscopies. Thesis for seeking of scientific degree of candidate of biological sciences on speciality 03.00.03 -molecular biology, Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kylv, 1996.

The studies on physico-chemical mechanisms of specific interaction of carboxylic group and carboxylate-ion with 52 nucleotide bases, nucleosides and their methyl derivatives in anhydrous DMS0 by means of UV and IR spectroscopies have been

carried out for the first tine. The H-bonded schemes of the complexes formed were obtained, proton transfer in these complexes was registered, solvent Influence on the complex formation was estimated. The contribution of "point" contacts -into specificity of protein-nucleic acid interactions was anallzed. Role of some Modified nucleosides in structure of tRNAs was discussed.

Климов! слова: б1лково-нукле!нове вп!знавання. нуклеотид-на основа,' нуклеозид, метилпох1дн1. карбоксильна трупа ам1но-кислот, 14 га УФ спектроскоп1я, Н-зв'язок, перенесения протону.