Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физико-химической природы элементарных процессов молекулярного распознавания методами ЯМР, колебательной спектроскопии и компьютерного моделирования

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химической природы элементарных процессов молекулярного распознавания методами ЯМР, колебательной спектроскопии и компьютерного моделирования"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГіГТА ГЕНЕТИКИ

РГЗ од ,

На правах рукопису

1 1 НОН 13їг0 УДК 577(322+323):543.424

Кондратюк: Ігор Васильович

ДОСЛІДЖЕННЯ Ф13ИКО-Х1МІЧНОЇ ПРИРОДИ ЕЛЕМЕНТАРНИХ ПРОЦЕСІВ МОЛЕКУЛЯРНОГО РОЗПІЗНАВАННЯ МЕТОДАМИ ЯМР, КОЛИВАЛЬНОЇ СПЕКТРОСКОПІЇ ТА КОМП'ЮТЕРНОГО МОДЕЛЮВАННЯ

03.00.03 - МОЛЕКУЛЯРНА БІОЛОПЯ

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ - 1996

Дисертація є рукописом

Роботу виконано у відділі молекулярної біофізики Інституту молекулярні біології та генетики НАН України

НАУКОВІ КЕРІВНИКИ:

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ:

ПРОВІДНА УСТАНОВА:

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, доцент

1М. В.Желтовськии

кандидат фізико-математичних наук,

старший науковий співробітник

Д.М.Говорун

доктор біологічних наук,

професор : .

В.Л.Зима,

кандидат хімічних наук, старший науковий співробітник А.С.Шаламай

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України

Захист дисертації відбудеться 22 жовтня 1996 року о 10 годині засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 01.86.01 із захисту докторськ дисертацій в Інституті молекулярної біології та генетики НАН України (2521^ м.Київ-143, вул.Академіка Заболотного, 150).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.

Автореферат розіслано 21 вересня 1996 року.

Вчений секретар Спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник

Л.ЛЛукаш

- з -

Актуальність проблеми. З’ясування найбільш загальних фізико-хімічних акономірностей, які визначають перебіг молекулярного ішізнаїшння в живій літині, є однією і центральних проблем сучасної молекулярної та структурної ііології. Встановлено, що одним з найбільш важливих структурних чинників іисокої специфічності, як атрибуту молекулярного розпізнавання, е точкові ¡ілково-нуоеїнові контакти, що стабілізуються міжмолекулярними водневими в'язками. Однак детальніше розуміння фізико-хімічніх засад впізнавання е надто :кладним завданням навіть у найпростіших випадках. Такий стан речей з іеобхідністю актуалізує всебічне дослідження досить простих і водночас >епрезентатинних молекулярних систем, що моделюють різноманітні точкові Н-сонтакти компонентів біополімерів, із залученням найінформативніших і юдночас неруйнуючих біофізичних методів, в першу чергу ЯМР та коливальної ¡пектроскопії у поєднанні з комп'ютерним моделюванням на рівні сучасних шііпемпіричних квантооохімічних методів. Окрім того, однією з нагальних задач ) цьому напрямку є створення кількісних молекулярно-кінетичних моделей, то ідекватно описують елементарні акти молекулярного розпізнавання.

Мета роботи - розвіпчж уявлень про фізико-хімічну природу перебігу уісментарних актів білково-нуклеїнового та нуклеїново-нуклеїнового шізнавання в рамках моделі точкових контактів.

Для виконання роботи вирішувалися такі завдання:

1.Створити базу даних спектрів ЯМР нуклеотидних основ, нуклеозмдів та хніх метилпохідних, а також їхніх Н-зн’язаних комплексів з одним з найбільш нстивних бічних радикалів амінокислот - карбоксильною групою та її іепротонопаною формою - карбоксилат-іоном у безводному ДМСО та коливальних спектрів ' (Раманівських та 14) твердофазних комплексів типу нуклеотидна оснопа:похідпа амінокислоти.

2.0тримати геометричну та електронну структуру повного сімейства -ібетки точкових контактів обох форм карбоксильної групи з нуклеотидними зсновами, описати енергетику взаємодії та структурні збурення, що її :упроводжують. Встановити, як метилювання основ та нуклеозидів впливає на хнє комплексоугіюрення з обома формами карбоксильної групи.

З.Дослідити структурно-динамічні властиіюсті нуклеотидних основ та їхніх Уотсон-Криківських пар, то детермінують перебіг елементарних актів молекулярного розпізнавання.

4.Розробити кількісні молекулярно-кінетичні моделі спонтаннії; напіврозкритих станів ДНК та Н-»Т-обміну групи С8Н азотистих осної пуринового ряду з водою.'

5.Проаналізувати білогічну значущість отриманих результаті».

Наукова новизна. Вперше за допомогою поєднання реального біофізичноп експерименту (ЯМР, 14 та Раманіпська спектроскопія) з комп’ютерним виконаним в рамках сучасних квантовохімічних напіиемпіричних методів досліджено фізико-хімічну природу перебігу елементарних актів молекулярной впізнавання. Вперше встановлено, що точкові Н-контакти карбоксильної групі та карбоксилат-аніону з нуклеотидними основами мають множинний характер причому карбоксилат-аніон є. більш селективним структурним елементок розпізнавання, аніж карбоксильна група. Зафіксовано конкуренцію обох фор\ карбоксильної групи за Н-зв’зування основ у Уотсон-Криківські пари. Впсріт показано, що відповідальною за залежність відстані між сусідніми парами ДНК від послідовності пар та за наявність квазівироджених конформаційних станії ДНК є динамічна стереоізомерія Уотсон-Криківських пар. Створено оригінальн молекулярно-кінетичні моделі спонтанних напіврозкритих стані» ДНК та Н->Т-обміну групи С8Н азотистих основ пуринового ряду з подою. Отриман результати значно розширюють існуючі уявлення про фізико-хімічну природі елементарних актів молекулярного впізнавання і переводять їхнє описання і площину кількісних молекулярно-кінетичних моделей.

Практична цінність роботи. Встановлені структурно-динамічні шіастивоет точкових білково-нуклеїнових та нуклеїново-нуклеїнових контактів можуть буті! використані для детальної інтерпретації рентгеноструктурних і ЯМР*даних шодс тонких деталей просторової організації комплексів ДНК з регуляторними білками, тРНК з АРСазами і т.п. Розроблені молекулярно-кінетичні модел знайдуть застосування для аналізу експериментальних даних по Н—>Т-обміму і складних нуклеопротеїдних комплексах. Результатами дисертації можна та ко# скористатися при виробленні стратегії синтезу нових біологічно-активни> речовин, зокрема лікарських препаратів.

Особистий внесок автора полягас у виконанні всього обсяг) експериментальної частини дисертації, підборі та обробці літературних даних, аналізі та інтерпретації отриманих результатів.

Автор захищає:

1. Стіїорену на основі пласких експериментальних досліджень базу даних спектріп ЯМР близько 100 молекулярних структур - нуклеотидних основ, нуклеозндіи та їхніх мстилпохідних, а також їхніх Н-зв’язанмх комплексів з карбоксильною групою і карбоксилат-іоном у безводному ДМСО та коливальних спектріп (Раманіиських та 14) тиердофазних комплексів типу нуклеотидна осноіш:похідна амінокислоти. Серед досліджених сполук - канонічні основи і нуклеозиди (Ade, Gua, Cyt, Ura, Thy), мінорні компоненти ДНК (m6A, m'G, tn7G, m3C) і РНК (n^A, m6A, ш6.6А, ni'G, m2G, m7G, isoGua, Hyp, m'Hyp, rPCyt, m5Cyt, isoCyt, m^Ura), продукти генотоксичної модифікації ДНК і РНК 'ггИА, m3Ade, m3Gua, nvG, m3Cyt, Hyp, Хап), метаболіти UK (Hyp, Xan), :кладові частини антибіотики! (Pur, m6>6Ade, Hyp) та in., а також спіикрнсталізат "yt:(-Gly.

2. Осношіі фізико-хімічні пласти пості точкових контактів карбоксильної -рупи та карбоксилат-іону з нуклеотидішми основами, нуклеозидами та їхніми нетилпохідними, що стабілізуються Н-зв’язками, та їхні зміни при переході від іільного стану до конденсованого (розчин безводного ДМСО, тверда фаза).

3. Структурно-динамічні властивості нуклеотидних основ (лужні і кислотні їластивості, включаючи CH-кислотність; стереохімічна нежорсткість; ефекти, юв'изані з нерівноцінністю амінних зв'язків, анізотропією внутрішнього )бертання аміногрупи та взаємозалежність внутрішньомолекулярних Н-зв’язків), цо детермінують перебіг елементарних актів молекулярного розпізнавання.

4. Кількісні молекулярно-кінетичні моделі спонтанних напіврозкритих :танін ДНК та Н-»Т обміну групи С8Н азотистих основ пуринового ряду з водою

Алробанія роботи. Основні результати дисертації доповідалися на Міжнародному симпозиум! "Фізико-хімія ДНК і молекулярні механізми функціонування геному" (Тбілісі, 1987), V та ¡X Міжнародних нарадах по ііомодекулярній стереодннаміці (Олбані, 1987 та 1995), II та III Європейських юиференціях із спектроскопії біологічних молекул (Фрайбург, 1987 та Болонья, 989), XIV Міжнародному конгресі по біохімії (Прага, 1988), VI та VII ісесоюзних конференціях із спектроскопії біополімерів (Харків, 1988, 1991), XX всесоюзному з'їзді із спектроскопії (Київ, 1988), Міжнародному симпозиумі Молекулярне впізнавання та його роль в хімії та біохімії" (Сопрон, 1988), XVI

Міжнародному колокиіумі з спектроскопії (Софія, 1989), II Всесвітньом; конгресі з теоретичної хімії (Торонто, 1990), НІ Міжнародній конференції і: спектроскопії лазерного розсіюііашш та діагностиці біооб'єктів (Москиа, 1990) Міжнародному симпозиумі з нових досягнень н хімії та молекулярній біологі раку (Пекін, 1991), І та (І Українсько-польських симпозиумах з подненого зв'язк (Чернівці, 1989 та Одеса, 1992), XII Міжнародному семінарі з міжмолекулярно взаємодіїта конформації молекул (Харкін, 1994), XXIII Європейському конгресі молекулярної спектроскопії (Балатоиф'юрсд, 1996) та багатьох інших вітчизнянії: та міжнародних наукових форумах.

Публікації. Матеріали дисертації викладені у 72 наукових працях, серед ни

- 37 статей у вітчизняних та закордонних журналах, що реферуються.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, трьо; оригінальних розділім, кожен з яких закінчується висновками, підсумковії: висновків та переліку використаної літератури. Роботу викладено на 17' сторінках друкованого тексту, вона містить 20 рисунків та 37 таблиць.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ

Взаємодія основ, нуклеозидів та їхніх метилпохідних з карбоксильної групою вивчалась и сумішах з ac-Asp, ac-Glu, ac-Gly, ac-Asp-OMe, a карбоксшіат-аніоном - в сумішах з NaAc, f-Gly(ONa), f-Asp(ONa) ra f-Glu(ONa у безводному ДМ CO.

Спектри ЯMP реєструвались на спектрометрах Varían Gemini-200 та Varia VXR-300. Розчинник - ДМСО^, внутрішній стандарт - TMS, Спектри Iі поглинання реєструвались на спектрофотометрі Specord М80 (Carl Zeiss Раманівські спектри записувалися на створеному дисертантом на базі подвійног монохроматора ДФС-24 (JIOMO) автоматичного трьохпроменевого спектрометрі Віднесення спектрів зроблено на основі насамперед власної бази даних,* а тако; із залученням літературних джерел.

В роботі використовувалися реактиви фірм Fluka, Serva, Sigma, Aldrich Calbiochem та Реахім. Комп'ютерний експеримент проведено в рамка напівемпірнчних квантовохімічних методів AMI, MNDO та MNDO/H у режиь онтимізації всіх структурних параметрів з нормою градієнта <0,01.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

У першому розділі наиедеио результати дослідження методом ЯМР на ядрах і та ІЗС п безводному ДМСО взаємодії карбоксильної групи амінокислот з лслеотидннми основами, нуклеозидами та їхніми численними похідними дебільшого метильованими), шо моделюють точкові білково-нуклеїнові )МГсікти (табл. 1,2). Встановлено'специфічність взаємодії основ, нуклеозидів та ніх похідних з нейтральною та депротонованою карбоксильною групою, ізначено атомні групи, шо беруть участь у формуванні таких водневозв’язаних >мплексів, та запропоновано їхню структуру. Спостережено значну поширеність іища перенесення протону як від амінокислоти до основи, так і в зворотньому іпрямі. Отримано експериментальне свідчення конкуренції карбоксильної іупи з гуаніном за зв'язування з цитозином в потрійному комплексі Gua:Cyt:ac-¡р.

Показано, шо точкові контакти карбоксильної групи та карбоксилат-іону з гклеотидпимн основами у вільному стані мають множинний характер, причому ірбоксилат-аніон є більш селективним точковим сайтом розпізнавання, аніж ірбоксильна група, оскільки забезпечує значно ширший енергетичний діапазон аємодій в залежності піл основи та місця зв’язування, а також характер і личину відповідних структурних збурень. Отримано геометричну та електронну руктуру всього сімейства контактів - "абетки впізнавання" (табл. 3), описані іергетичні параметри взаємодії та структурні збурення, що її супроводжують. В :реважній більшості випадків утворюються квазіпланарні комплекси, найбільше охилення від площинності - "ортогональне зв'язування" - спостерігається в тому іпадку, коли карбоксилат-іон взаємодіє одним Н-зв'язком з NH чи СН групою,

о знаходиться в оточенні двох електронегативних атомів (С2Н Ade, N3H Ura і іу та ін.). Зафіксовано конкуренцію обох форм карбоксильної групи за Н-'язування основ у Уотсон-Криківські пари: карбоксилат-аніон, розриваючи іидві пари, зв'язується з Gua (N1H...O* + N2H\..0_) та з Thy ("ортогональне ’язування" N3H...O") відповідно; карбоксильна група розриває пару Ade:Thy і аємодіє з Ade (OH...N1 + N6H’...OC). З парою Gua:Cyt карбоксильна група деашиної кислоти утпорює потрійний комплекс, зв'язуючись із спареним Gua І2Н"...ОС + OH...N3) і послаблюючи тим самим внутрішні опарні Н-взаємодії.

Таблиця 1. Взаємодія иуклеотидних осію», нуклсчнидт та їхніх метилпохідни: карбоксилат-іоном у безподному ДМСО (стрілкою «означене перенесення протону), зафіксована методом ЯМР-спектроског

Осяоіа, нуклсоїид Схема шасмодії

Асіе ^Нм...О~С~О...Н71Ч

гп6А(іс - МН”...0~ С~О...Н7К

•• т£>6Асіе тн...о~с~о

т5Риг N94 -*0~С~О

т'АсІе ^Н...О--С—0

т^виа МН...О—С—О...Н’2К

т7Сиа МІН...О- С~О...Н’2М

ш^Оиа ЖН...О~С~О...Ь^

т^иа И7Н -> 0--С—0

■ воСиа №ІН...О--С—О...Н’6М

’ МН...О~С~.О...Н’2К

ас мн...о-с-о...над

т2С жн...о~с~о...н^

т7С И1Н -»О—С—О...Н’2М

Нур N94...О—С--0 або МН...О—С—О

1 мн...о-с-о

<11 МН...О-С— о

т7І С8Н...О--С..О

Хап N9H...O..C..O або ЮН...0.-С~0

т3Хап МН-О—С-О

т9Хап ЮН -> 0-.С—0

’ X N34 -»0--С--0

т7Х С8Н...О--С..О

Суі N14—0—С--О...Н6С

т3Суі мн-»о..с-о

ш5С>г МН...О- С--О...Н6С

іхоСуг N2H...O—С—O...HЗN

С МН”...0~С—0...Н5С

<ІС ЖН”...0- _С—О...Н5С

т5с1С N411"...О—С—О...Н5С

ига МН...О~С~О...Н6С

т'ига ЮН...О-Л —Ота С6Н...О~С~О...Н5С

т3ига МН -+0-.-С--0...Н6С

и ЮН...0~С~О га С6Н...0-С--0

ііи МН-О—С-О та С6Н...О—С—О

ТИу ЖН...О--С—О...Н6С

п^ТЬу юн...о~с~о

Т N311...О—С—О та С6Н...О—С- 4)

тТ ЮН...О~С—О та С6Н...О—С-О

Н’ • амінопротон, котрий бере участь у Уотсон-Криківському слирюианні

іблаця 2, Взаємодій иуклеотияних основ, нуклеозидш та їхніх метнлпохідпих з карбоксильною групою амінокислот у безводному ДМСО (стрілкою позначено перенесення протону), зафіксована методом ЯМР-спсктроскопії.

Основа, иуклсоїид Схема яіасмоді!

щіАііс М6Н”...0=С-0Н -» N7

т3Ас1е N6П”...0=-C-0H -> N7

т'А • ^Н”...0=С-0Н -> N7

т^виа Ы2Н’...0=С-0Н...Ы1

іяоСиа Ы6Н”...0=С-0Н...М7

Н2Н'...0=С-0Н -* N1

т?І С2Н...О=С-ОН -> N1

Суі МН’...0=С-0Н -» N3

шіСуі ЖН’...0=С-0Н...Ю

ш5Суі !Ч4Н’...0=С-0Н -> N3

т].5Суі ЖН’...0=С-0Н...Ю

ічоСуг №Н’...0=С-0Н...М1

С ЖН’...0=С-0Н...Ю

сіС N4H’...0=C-0H...NЗ

ш5с1С ЖН’...0=С-0Н...Ю

Встановлено, що найбільша залежність комплексотвірної здатності основ з іома формами карбоксильної групи під їхнього мстилювання спостерігається и іму випадку, коли ноно спричиняє зміну місця взаємодії. Зафіксовано декілька руктурних переходів в нуоеотидних основах та їхніх «етильованих аналогах, дукованих взаємодією з карбоксилат-іоном: Асіе(І'І9И) -» Аде(Ы7Н),

2Оиа(цис) -> ш2Оиа(транс), Хап(\7Н) -> Хап(Ы9Н) та ін.

Показано, що перехід воднево-зв’язаних комплексів з вільного стану у індексований (розчин безводного ДМСО, тверда фаза) істотно збурює їхню інформацію; у переважній більшості випадків Н-зв’кзуваїшя карбоксильної упи з основою унеможливлюється сольватацією молекул-партнерів; порівняно вакуумом конденсована фаза підсилює перенесення протону з основи та ірбоксилат-аніон. Так, наприклад, перехід комплексу Суі:Г-Сіу з вільного стану кристалічний супроводжується перенесенням протону з амінокислоти на :нову. Окрім того, суттєво змінюється його конформація - найбільші зміни [остерігаються для "найм'якіших" структурних ступенів свободи - двогранних ггів. Комплекс стабілізується трьома суттєво взаємозалежними Н>зв'язкамк -юма міжіонними та одним внутрішньоіонним ІЧН...О*(Г-СІу) з ентальпією ~ 7,5 сал/моль.

Таблиця 3. Взаємодія канонічних нуклеотилних осію» з мурашиною кислоток та її депротоноїшюю формою у вакуумі (розрахунок методо* ММБО/Н). Схеми взаємодії подано її порядку пріоритетності енергі взаємодії. Енергія взаємодії - її ккал/моль.

Комплекс Схема сзасмодіі Енергія •іасмодії

GuarHCOO- NIH...O—С- O...H’2N N2H'...0-C_-0...H"2N N9H...O--C--O...H8C C8H...O—C--0 44,63 35.40 34.41 23,61

Gua:HCOOH N1H...0—C--0H...06 N9H...O--C--OH...N3 N2H”...0—C--0H...N3 18,84 18,45 12,88

Ade:HCOO- N6H”...0—C- -O...H7N N9H...O--C--O...H8C C8H...0--C--0 N6H'...0 C--0 N6H”...0—C-O C2H...O—C--0 50.18 35,07 25,58 23.18 21,67 13,73

Ade:HCOOH N9H...O—C--OH...N3 N6H\..0—С—OH...N7 N6H'...0.-C—OH...NI 19,71 18,01 16,84

Cyl:HCOO- NIH...O—С—O...H6C N4H"...0--C--0...H5C N4H’...0—C--O...H"4N C5H...O—C--O...H6C 36,88 35,30 28,08 21,42

Cyt:HCOOH N IH...O—С—0H...02 N4H'...0—С —OH...N3 18,80 17,11

Ura:HCOO- NIH...O—C--O...H6C C5H...O--C—O...H6C N3H...0--C--0 40,33 28,48 20,31

Thy:HCOOH N1H...O--C --0H...02 N3H...0—С--OH...04 N3H...0.-C-0H...02 СНЗ.О--С--ОН ...04 18,98 16,50 16,05 10,12

У другому розділі напівсмпіричинмн кішнтопохімічними методами AM MNDO і MNDO/H детально досліджено структурно-динамічні шіастинос нуклеотидних основ та їхніх воднепози'язаних пар, які, на думку аитора, даю вагомий внесок в елементарні процеси молекулярного розпізнавання.

Побудовано ради кислотних і лужних нластиіюстсй для вс протонодонорних і протоноакцепторних груп Im, Pyr, Pur, Нур, Хап, Ade, Gu Cyt, Tliy i Ura, що визначають їхню специфічну комплексотиірну одатніст Показано, шо зафіксоване експериментально (Greco et ai, 1994) обернення рю

- Il •

лужних властииостей Gua і Cyt зумовлене виключно їхньою прототропною таутомерією. Зііернуто особлииу уіигу на газофазну CH-кислотність азотистих основ - встановлено, що'на ізілміну під "нормальних” органічних CH-кислот, для них не вдається зафіксувати простих кореляційних співвідношень між СН-кислотністю і рядом фізико-хімічних параметрів, зокрема зарядом на атомі Н при атомі вуглецю.

На прикладі Im, Рут та Pur простежено, як зміна зарядового стану молекул шляхом протонупання чи депротонувания відбивається на їхніх кислотно-лужних властивостях.

Досліджено квантопохімічну природу стереохімічної нежорсткості нуклеотидних основ з екзоииклічною аміногрупою. Встановлено, що основним її електронним чинником с ря-спряження ВЕП (цільної електронної пари) амінного атома азоту з л-електроиною системою кільця.

Детально проаналізовано ефект нерівноцінності амінних зв’язків у Cyt, Gua і Ade. Показано, що він визначається, в основному, двома причинами -стеричним фактором і внутрішньомолекулярпою донорно-акценторною взаємодією амінного атома водню з сусіднім ендоциклічним атомом азоту.

Зафіксовано явище анізотропії внутрішнього обертання аміногрупи в Cyt, Gua і Ade. Встановлено, що воно тісно пов'язане з нееквівалентністю аміннних зв'язків і додатково детермінується електростатичною взаємодією ВЕП амінного і сусіднього ендоциклічного атомів азоту.

Показано, що кожна канонічна иуклеотидна основа охоплена просторовою сіткою внутрішньомолекулярних Н-зіі’язків типу NH...O і NH...N з ентальпією

0,7 - 3 ккал/моль, які мають взаємозалежний характер. При спарюванні нуклеотидних основ внугрішньомолекулярні Н-зв’язки об’єднуються з міжмолекулярними u єдину кооперативну систему.

Доведено, що Уотсон-Криківські пари нуклеотидних основ, як і самі основи, є стереохімічно-нежорсткими, дипольно-нестійкими, суттєво иепланарними структурами. Взаємоперетворення їхніх "еііантіомерів” відбувається шляхом дипольно-активної площинної інверсії асиметричних амінних атомів азоту, прм цьому перехідному станові відповідають класичні копланарні структури. Основними біологічними наслідками динамічної стереоізомерії Уотсон-Крикіїїських пар є наявність низькоенергетичних кішівироджених станін Ді ї К (що ннключають існування глобального

енергетичного мінімуму и загальноприйнятому розумінні), пропелерової конфігурації комплементарних пар ДНК, а також залежність підстані між сусідніми парами ДНК під послідовності пар. Остання ііластииість, як иідомо, значною мірою відповідальна за зв'язування ДНК з РНК-полімеразою, регуляторними білками та гістонами при формуванні нуклеосом; окрім того, нона детермінує розшеиления ДНК неспецифічною ДНК-азою I (Dickerson, 1981).

Розроблено кількісну молекулярно-кінетичну модель спонтанних напінрозкрнтих станін дноланцюгоної ДНК, які відіграють неабияку роль у шісокоспецифічних процесах білково-нуклеїнового впізнавання. В рамках цієї моделі напіирозкриті метастабільні стани ділянок ДНК, збагачених парами Ade:Thy, пов’язуються із спонтанним ішніврозкритим метастабільним станом Уотсон-Кри кінської пари Ade:Thy, котрий стабілізується днома шіутрішиьопарними Н-зв’язками N3H...N1 і С2Н...02, з иииільненою від водневого зв'язування аміногрупою Ade. При цьому віртуальним напіврозкритим станам пари Gua:Cyt, що утворюються внаслідок повертання екзоииклічної аміногрупи Gua та Cyv її цис- та транс-положення, відповідно, відносно сусіднього подвійного зв'язку C2=N3, відводиться роль попередника метастабільних напіврозкритих станів ДНК, іцо реалізуються на Gua:Cyt-збатених її ділянках при значно вищих температурах. Віртуальні напіирозкриті стани сприяють також, на думку автора, утворенню наведених (наприклад взаємодією :з лігандами самої різноманітної природи) напіврозкритих станів. Запропонована модель вигідно відрізняється від існуючих високим ступенем адекватності та прогностичною силою.

Третій розділ присвячено вивченню особливостей прототропної таутомерії низки азотистих основ та їхніх складових - Im, Руг, Pur, Hyp, Xan, Ade, Gua, Cyt, Thy і Ura - у вільному стані. За допомогою напівемпіричного квантовохімічного методу AM І побудовано повні, замкнуті сімейства прототропііих таутомерів, чисельність яких визначається загальною кількістю кислотних та лужних центрів молекули; визначено основні їхні фізико-хімічні характеристики - геометричну та електронну структуру, теплоту утворення, дипольний момент і перший адіабатичний потенціал іонізації.

Вперше встаноилено, шо прототропна таутомерія цих молекул мас молекулирно-цштеріоііний характер і и ній беруть участь протони при атомах вуглецю - так знані карбопротони.

З'ясовано, що для кожної азотистої осноии пуринового ряду та Іт основним таутомером-цвітеріоном з-поміж тих, шо формуються шляхом міграції карбопротонів Н8(Н2) на атоми-акцептори протона є таутомер-цвітеріон, шо утворюється в результаті переходу карбопротоиа Н8 (Н2 у Іт) на сусідній в імідазольному кільці атом азоту, з’єднаний з атомом С8 (С2 в Іт) подвійним валентним зв'язком. Ця ілідна форма є перехідним станом реакції Н-»Т-обміну групи С8Н8 азотистих основ пуринового ряду та Іт з водою при сприятливих pH; молекулярно-кінетичний механізм її формунання - естафетне протонування (атома N7 пуринів і атома N3 Іт) - депротонування (зв’язків С8Н8 пуринів і С2Н2 Іт).

Встановлено, що навіть на низькомолекулярному рівні процес обміну є конформаційно-чутливим. Наголошується, що швидкість обміну по групі С8Н8 Аае і Оиа визначається власне не конформацією НК, як це традиційно вважалося раніше, а її збуренням при переході Асіе і (або) Она з основної молекулярної форми в ілідну.

ВИСНОВКИ

1. На основі власних експериментальних досліджень створено базу даних спектрів ЯМР близько 100 молекулярних структур - нуклеотидних основ, нуклеозидіи та їхніх метилпохідних, а також їхніх Н-зв'язаних комплексів з карбоксильною групою і карбоксилат-іоном у безводному ДМ СО та коливальних спектрів (Раманівських та 14) твердофазних комплексів типу нуклеотидна основа:похідна амінокислоти.

2. Встановлено, що точкові Н-контакти карбоксильної групи та карбоксилат-іоиу з нуклеотидними основами у вільному стані мають множинний характер, причому карбоксилат-аніон с більш селективним точковим сайтом розпізнавання, аніж карбоксильна група. Отримано геометричну та електронну структуру всього сімейства контактів, описано енергетичні параметри взаємодії та структурні збурення, що її супроводжують. Зафіксовано конкуренцію обох форм карбоксильної групи за Н-зп'язування основ у Уотсон-Крикіпські нари.

- м-

3. Показано, що перехід Н-комплексів а цільного стану у конденсований (розчин безводного ДМСО, тиерда фаза) істотно збурює їхню конформацію; у переважній більшості випадків Н-зи'нзувашія карбоксильної групи з основою унеможливлюється сольватацією молекул-партнерів; поріиняно з иакуумом конденсоиана фаза підсилює перенесеним протону з основи на карбоксилат-іон.

4. Розроблена кількісна молекулярно-кінетична модель спонтанних

напінрозкритих стані» ДН К.

5. Детально досліджено структурно-динамічні шіастішості нуклеотидних

основ (лужні і кислотні властивості, включаючи СН-кислопіість; стереохімічну нежорсткість та її фізико-хімічну природу; ефекти, пов'язані з нерівноцінністю амінних зв'язків, анізотропією внутрішнього обертаний аміногрупи та наявністю взаємозалежних шіутрішньомолекулирнйх Н-зо'язкін) та їхніх Уотсон-Криківських пар (динамічна стереоізомерія),що відіграють важливу роль у перебігу елементарних актів молекулярного розпізнавання. Встановлено,

зокрема, що динамічна стереоізомерія Уотсон-Криківських пар визначає

залежність відстані між сусідніми парами ДНК від послідовності пар і спричиняє ннзькоенергетичні кііазіїшроджсні стани ДНК.

6. Показано, що прототропна таутомерія азотистих основ має

молекулярно-цвітеріонний характер, - в ній беруть також участь протони при атомах вуглецю. Запропоновано молекулярно-кінетичну модель Н-»Т-обміну групи С8Н азотистих основ пуринового ряду з водою.

7. Отримані фізико-хімічні закономірності перебігу елементарних процесів молекулярного розпізнавання на низькомолекулярному рівні використано для уточнення структурно-динамічних моделей високоспецифічпого зв'язування НЬаІ метилтрансферази (КІітаяаиБкая еі аі, 1994), Оп-АРС-ази (Біеііг, 1990) та Іас рспресора (Карісіп сі аі, 1994) з НК; висловлено припущення про роль ш^С та т^О у підтриманні просторою! структури тРНК (міцніші за класичні Уотсон-Криківські модифіковані пари т^С'.О та Сіт^О відіграють роль "кріплення" перед неспареними ділянками).

ПЕРЕЛ1К ОСНОВ НИХ ПРЛЦЬ, ОП УБЛ1 КОВАН ИХ НА ТЕМУ ДИСЕРТАЩК

1. Zheltovsky N.V., Samoilenko S.A., Kondratyuk I.V. et al. Spectroscopic investigation of the structure of complexes between nucleotide bases and amino acid carboxylic groups: nucleic acid-protein recognition aspect// Proc.of the И Eur. Conf.on Spectroscopy of Biological Molecules (Freiburg, 1987), in: Spectroscopy of Biological Molecules. New Advances. (E.D.Schmid, F.W.Schneider, F.Siebert, Eds.), John Wiley and Sons.-1988.-P.403-406.

2.Zheltovsky N.V., Samoilenko S.A., Kondratyuk l.V. et al. Some structural

aspects of protein-nucleic acid recognition point mechanisms involving amino acid carboxylic groups // J.Mol.Struct.-1989.-v.214 .-P.15-26.

3. Zheltovsky N.V., Samoilenko S.A., Kondratyuk l.V.et al. Infrared and Raman spectroscopic studies of some nucleic acid-protein contacts structure // Proc.of 3d Eur. Conf. on the Spectroscopy of Biological Molecules (Bologna, Italy, 1989), in: Spectroscopy of Biological Molecules. State of the Art. (A.Bertoluzza, C.Fagnano, P.Monti, Eds.), Societa Editrice Esculapio.-Bologna.-1989.-P.159-162.

4.Гоиорун Д.Н., Мищук Я.P., Кондратюк И.В. и др. Исключение влияния нестабильности мощности лазера на точность регистрации спектров комбинационного рассеяния света//Биополимеры и клетка,-1990.-6,№4.-С. 105-107.

5.Говорун Д.Н., Мищук Я.Р., Кондратюк И.В и др. Установка для записи спектров комбинационного рассеяния спета биополимеров // Биополимеры и клетка. -1990.-6,№5.-С.48-51.

6. Kolomiets I.N., Kondratyuk l.V., Stepanyugin A.V. et al. Influence of méthylation of nucleic acid purine bases on their interactions with amino acids through the carboxylic group // J.Mol.Struct.-1991 .-v.250.-P. I -11.

7. Zheltovsky N.V., Samoilenko S.A., Kondratyuk I.V. et al. Low frequency Raman, NMR and IR investigation of methylated nucleic acid bases self-association and complex formation with amino acid carboxylic groups // In:Spectroscopy of Biological Molecules (R.E.Hester, R.B.Girling,Eds.),Royal Society of Chemistry, Cambridge.-1991 .-P.363-364.

8.Govorun D.N. , Danchuk V.D., Kondratyuk I.V. et al. AMI calculation of the nucleic acid bases structure and vibrational spectra //J.Mol.Struct.-1992.-237.-P.99-103.

9.Говорун Д.H., Дапчук В.Д., Кондратюк I.В. та ¡м. Діеркально-симетричі конформаційні стани канонічних нуклеогидних ocnoii // Доп. АН України 1992.-№2.-С.66-69.

10.Желтоііский Н.В., Самойленко С.А., Кондратюк И.В. и др. Исследоиани взаимодействия гипоксантина, ксантина и их метил- й гликозилпроизводных карбоксильной группой аминокислот спектроскопическими методами / Биополимеры и клетка.-1993.-9,№3.-С. 17-22.

11.Желтовський М.В., Самійленко С.П., Кондратюк 1.В. та ін. Взаємодія метил та глікозилпохідішх піримідннонич иуклеотидних оснон з карбоксильною групої амінокислот// Биополимеры и клетка.-1994,- 10,№6.-С.45-51.

12.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтоиський М.В. Прототропна молекулярне цвітеріопна таутомерія ксантину: розрахунок методом AMI // Биополимеры клетка,-1994.-10,№6.-С.52-60.

13.Говорун Д.М., Кондратюк 1.В., Желтонський М.В. Кислотно-лужі властивості молекулярного ксантину та його комплексотиірна здатність / Биополимеры и клетка.-1994.-10,М»6.-С.61-64.

14.Говорун Д.М., Кондрахюк 1.В., Желтонський М.В. Прототропна молекулярно цпітеріонна таутомерія гіпоксантину: розрахунок методом AM І у вакуумном наближенні // Биополимеры и клетка.-1995.-11,№1.-С.30-35.

15.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтоиський М.В. Газофазні кислотно-лужі властивості молекулярного гіпоксантину // Биополимеры и клетка.-1995.-1 l,Nfel.

C.36-39.

16. Zheltovsky N.V., Samoilenko S.A., Kondraîyk l.V. et al. Recognition of purin bases and nucleosides by the amino acid carboxylic group // J.Mol.Struct.-1995.-344. P.53-62.

17.Кондратюк І.В., Говорун Д.М., Желтовський M.В. Прототропна таутомері молекулярного ксантину// Доп. НАН України.-1995.-N»4.-C.109-112.

18.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтовський М.В. Про фізико-хімічниі механізм воднево-тритієвого обміну групи С8Н8 нуклеотидних основ пуриновог р«цу з водою // Биополимеры и клетка,-1995.-11 ,№3-4.-С.24-28.

19.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтовський М.В. Вплив протонування т депротонування на кислотно-лужні властивості пурину, піримідину та імідазол // Биополимеры и клетка.-1995.-11,№3-4.-С.29-34.

10. Говорун Д.М., Данчук В.Д., Кондратюк I.B. та ін. Про неплощинність та іипольну нестійкість канонічних нуклеогидних основ, метильованих по лікозидномуазоту// Доп. НАН України.-І995.-№6.-С.117-119.

!1.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтоиський М.В. Нуклеотидні основи як СН кислоти // Биополимеры и клетка.-І995.-І І,№5.-С. 15-20.

!2.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтоиський М.В. Кислотно-лужні итастипості піримідину, імідазолу та пурину у вільному стані: розрахунок іетодом АМ1 // Биополимеры и клетка.-1995.-11,№5.-С.21-23.

ІЗ.Говорун Д.М., Кондратюк І.В., Желтоиський М.В. Прототропна молекулирно-івітеріонна таутомерія гіпоксантину//Дон. НАН України. -!995.-№7.-С. 135-138. !4.Говорун Д.М., Мііцук Я.Р., .Кондратюк І.В. та ін. Нееквіпалентність а мінних ітомі водню в канонічних нуклеогидних основах //Доп. НАН України. -1995,-^8.-0.130-132.

15.Говорун Д.М., Кондратюк 1.В., Желтовський М.В. Прототропна молекулнрно-шітеріонна таутомерія імідазолу та піримідину .// Биополимеры и клетка.-1995.-

1,№6.-С.4І-44. . •

16.Говорун Д.М., Кондратюк !.В., Желтовський М.В. Прототропна молекулнрно-івітеріонна таутомерія пурину // Биополимеры и клетка.-1995.-II,№6.-С.45-50.

17.Говорун Д.М., Мііцук Я.Р., Кондратюк 1.В. та ін. Динамічна стереоізомерія Дотсон-Криківських пар нуклеотидних оснои//Доп. НАН України. -І995.-№ІІ.-:.121-І23.

:8.Говорун Д.М., Кондратюк 1.В. Квантопохімічні розрахунки свідчать: ітрото-ропна таутомерія канонічних нуклеотидних основ має молекулярно-цвітер-онний характер. І. Піримідини // Биополимеры и клетка.-1996.-12,№1.-С.42-48. :9. Говорун Д.М., Кондратюк 1.В. Квантовохімічні розрахунки свідчать: ірототропна гаутомерія канонічних нуклеотидних оснои має молекулярно-івітсріонний характер. І. Пурини//Биополимеры и клетка.-1996.-12,№ 1 .-С.49-52. О.Гонорун Д.М., Міщук Я.Р., Коидратюк І.В., Желтовський М.В. Внутрішньо-юлекулярні кооперативні иоднсиі зв'язки її нуклеотидних осноиах // Доп. НАН fкраїни. -1996.-N28.-C.14I-144.

¡1.Говорун Д.М., Міщук Я.Р., Кондратюк І.В. Про квантовохімічну природу тереохімічної нежорсткості канонічних нуклеотидних основ // Биополимеры и летка.-1996.-12,№5.-С.50-57.

2.Говорун Д.М., Кондратюк І.В. Анізотропія обертальної рухливості аміногрупи

і канонічних нуклеотидних основах//Доп. НАН України. -1996.-№10.-С. 130-133.

• 18-АНОТАЦ11

Кондратюк И.В. -Изучение физико-химической природы элементарны процессов молекулярного распознавания методами ЯМР, колебательно спектроскопии и компьютерного моделирования. Диссертации на соискание учено степени кандидата биологических наук но специальности 03.00.03 молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НА1 Украины, Киев, 1996.

Защищаются результаты, изложенные в 72 научных работах и касающиес глубинных физико-химических механизмов белково-нуклеинового и нуклеиновс нуклеинового узнавания. Отличительной особенностью работы являете сочетание высокоточного биофизического эксперимента (ЯМР, ИК Рамановская спектроскопия) с компьютерным моделированием, выполненным рамках современных полуумлирических квантовохимических методов AM MNDO и MNDO/Н. Такой подход позволил установить, что точечные контакт между двумя формами карбоксильной группы (нейтральной депротонированной) и нуклеотидными основаниями имеют множественны характер, при этом карбоксилат-ион является более селективным точечны сайтом узнавания, нежели карбоксильная группа, и проследить, как изменяютс основные физико-химические свойства точечных контактов при метилировани оснований и при переходе их из свободного состояния в конденсирование (раствор в безводном ДМСО, твердая фаза). Развиты количественнь молекулярно-кинетические модели спонтанных полураскрытых состояний ДН1 а также Н-»Т-обмена группы СЯН азотистых оснований пуринового ряда водой. Обсуждается биологическая значимость полученных результатов

Kondratyuk I.V. Investigation of physico-chcmical nature of elementary process-of molecular recognition by NMR and vibrational spectroscopies and computer simulatio

Thesis for seeking of scientific degree of candidate of biological sciences on speciali

03.00.03 - molccular biology. Institute of Molccular Biology and Genetics of Ukrainu National Academy of Sciences, Kyiv, 1996.

The results, which were published in 72 papers and deal with fine physic« chemical mcchanisms of proiein-nucieic and nucleic-nucleic recognition are discusse The main feature of this work is combination of biophysical experiments (NMR, I

nd Raman spectroscopies) with computer simulation in the frame of modern semi mpirical quantum chemical methods AMI, MNDO and MNDO/H. Such an approach ias given us a possibility to establish that "point" contacts between two forms of amino cid caiboxylic group (neutral and deprotonated) and nucleotide bases has multiple haracter, carboxylate-anion being a more selective point site of recognition than leutral carboxytic group, and trace changes of main physico-chemical properties of the point" contacts on base methylation and under transition from vacuum to condensed tate (anhydrous DMSO, solid state). The quantative molecular-kinetic model? of ponateous semi-opened states of DNAs were developed, as well as the models of H-»T ¡xchange of G8H group of purine nucleotide bases with water. The biological significance of the data obtained is discussed.

Ключові слова: білково-нуклеїнове впізнавання, иуклеотидна основа, нуклеозид, метилпохідні, карбоксильна група амінокислот, ЯМР, 14 та Рамаиівська спектроскопія, Н-зв'язок, комп'ютерний експеримент,

напівемпіричні квантопохімічиі методи, AMI, MNDO, MNDO/H, напіввідкриті стани ДНК, воднево-тритієвий обмін.

Зам. 90 Формат 68 х 84^16

Підписано до друку 18.09,9ь р.

обл. рид. арк. 1,0 Наклад 100

Полі графі чия ді льниця ІГФ їм. М. М. Бого гтюбоел НАН України