Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка экомониторинга сложных водно-органических систем методом количественной спектроскопии ЯМР на различных ядрах

ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Разработка экомониторинга сложных водно-органических систем методом количественной спектроскопии ЯМР на различных ядрах"

На правах рукописи

ПОДГОРСКИЙ ВИКТОР ВИКТОРОВИЧ

РАЗРАБОТКА ЭКОМОНИТОРИНГА СЛОЖНЫХ ВОДНО-ОРГАНИЧЕСКИХ СИСТЕМ МЕТОДОМ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ СПЕКТРОСКОПИИ ЯМР НА РАЗЛИЧНЫХ ЯДРАХ.

03.02.08 - экология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

1 7 МАЙ 2012

МОСКВА-2012

005042847

005042847

Работа выполнена на кафедре системной экологии экологического факультета и в ЦКП (НОЦ) федерального государственного бюджетного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов».

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор Калабин Геннадий Александрович

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Зволинский Валентин Петрович

доктор химических наук, профессор Бодоев Николай Васильевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Московский педагогический

государственный университет, г. Москва

Защита состоится «

2012 г. в

_ на заседании Диссертационного

совета Д 212.155.13 при Московском государственном областном университете по адресу: 141014, г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, 24; http://www.mgou.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного областного университета по адресу: 105005, г. Москва, ул. Радио, д. 10 а.

Автореферат разослан «_»

2012 г

Ученый секретарь Диссертационного совета: доктор биологических наук, профессор

Снисаренко Т. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В обширном современном арсенале физико-химических методов выявления экотоксикантов в объектах окружающей среды центральное место занимает хромато-масс-спектрометрия, обладающая уникальной чувствительностью и высокой разрешающей способностью. Не менее информативным, но пока менее востребованным методом является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Она не требует использования стандартов, длительных процедур пробоподготовки, является абсолютным количественным методом, не разрушает исследуемый образец, позволяя установить строение интересующих загрязнителей в объекте исследования, количественно определить их содержание, выявить сырьевую, географическую и технологическую предысторию. Занимая ведущие позиции в химии и биологии, особенно в органической химии, спектроскопия ЯМР все шире используется для решения проблем экологической химии и прикладных медико-фармацевтических задач. Спектроскопия ЯМР не менее широко используется и для анализа продукции химических производств за рубежом (в т. ч. масел, алкогольной продукции, продуктов нефтепереработки). Методики анализа различных видов продукции методом спектроскопии ЯМР входят в национальные стандарты США и стран Евросоюза.

Являясь экологически безопасным и недеструктивным методом анализа водно-органических систем, удовлетворяющим самым жестким требованиям «зеленой химии», обладая высокой эффективностью, спектроскопия ЯМР, несомненно, займет важное место в экоанализе и экомониторинге. Для этого необходима с одной стороны адаптация известных и разработка принципиально новых методологий и технологий получения надежных результатов измерений, и, с другой стороны, оптимальных схем и методов статистического анализа данных.

Появление компактных проточных спектрометров ЯМР и современных алгоритмов автоматической обработки массивов спектральных данных делает метод применимым для экологического мониторинга объектов, связанных с переработкой природного органического сырья химической и легкой промышленности, производства пищевой продукции и лекарственных средств. Поскольку природное органическое сырье - как правило, сложные водно-органические системы, наиболее эффективно использование методик спектроскопии ЯМР с подавлением сигнала протонов воды, что позволяет анализировать такие объекты без её удаления, существенно упрощая пробоподготовку и снижая время анализа.

Цель работы - создание новых подходов и методик спектроскопии ЯМР для экологического мониторинга продукции химических производств. Для её достижения решались следующие задачи:

- Идентификация загрязнений в различных видах потребительской продукции;

- Разработка подходов к анализу происхождения сырья;

- Оценка эффективности применения спектроскопии ЯМР для анализа важнейших объектов экологии человека: фармацевтической продукции и биологических жидкостей человека;

Научная новизна. Предложена методика выявления загрязнителей (рост-стимулирующих добавок, инсектицидов и т.п.), сырьевого происхождения, безопасности и свойств гуминовых веществ в с/х препаратах на их основе методом количественной спектроскопии ЯМР 13С.

Показана эффективность спектроскопии ЯМР на ядрах 'Н, 2Н, 13С, 19Р как одного из наиболее быстрых методов выявления загрязнителей в широко востребованных фармацевтических препаратах и БАДах (арбидола, ибупрофена, дигидрокверцетина, рисперидона), в некоторых видах пищевой продукции и парфюмерно-косметических средств.

Разработана оригинальная методика определения качественного и количественного состава низкомолекулярных метаболитов амниотической жидкости методом ЯМР *Н с подавлением воды и последующего статистического анализа полученных данных для мониторинга изменения состояния рожениц и оценки риска осложнений в родах.

Предложен и реализован алгоритм автоматизации предварительной обработки и анализа данных одномерной спектроскопии ЯМР на различных ядрах проекционными методами.

Практическая значимость. Практическая применимость предлагаемых подходов для выявления загрязнений и анализа сырьевого происхождения гуминовых препаратов, парфюмерно-косметической продукции, биофлюидов, ряда фармацевтических препаратов и БАДов (арбидола, дигидрокверцетина, ибупрофена, рисперидона) по данным спектроскопии ЯМР на различных ядрах состоит в возможности их использования для экологического мониторинга продукции химических производств по сырьевому и технологическому происхождению, выявления загрязнений, мониторинга динамических изменений водно-органических систем. В сочетании с предложенными алгоритмами предварительной обработки и статистического анализа данных одномерной спектроскопии ЯМР на различных

ядрах, результаты настоящей работы создают научно-методические предпосылки для дальнейших экологических прикладных исследований продукции химических производств с целью разработки методик экологического мониторинга для более широкого круга объектов по данным спектроскопии ЯМР.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Классификация и ряд алгоритмов анализа сложных водно-органических систем методом количественной спектроскопии ЯМР на различных ядрах.

2. Обоснование эффективности использования спектроскопии ЯМР для экомониторинга и прогнозирования свойств (технологических, функциональных) и выявления поллютантов в реальном масштабе времени.

3. Адаптация ряда алгоритмов статистической обработки экспериментальных данных для автоматического анализа больших объемов спектральной информации.

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав, отражающих собственные экспериментальные исследования, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 74 рисунками. Библиографический список включает 10 отечественных и 115 зарубежных источников.

Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены на XIII международной молодежной научной школе "Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применений" (Казань 2010), 5-м конгрессе всемирной ассоциации репродуктивной медицины (Москва 2010), 7-й международной конференции «ЯМР в гетерогенных системах» (С-Пб 2010), всероссийской конференции «Актуальные проблемы экологии и природопользования» (Москва 2007, 2008 и 2009), всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар 2009), всероссийской молодежной школе с международным участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике» (Новосибирск 2010).

Основное содержание работы изложено в 13 научных публикациях, в том числе в 3 статьях в центральных рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена при поддержке грантов № 2.1.1/3151, № 2.1.2/4658 министерства образования РФ, государственного контракта министерства образования РФ № 16.552.12.7002.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Обоснована актуальность темы диссертации и сформулированы основные цели и задачи исследования. Приведена классификация задач анализа водно-органических систем, методы их решения и объекты, на которых продемонстрировано решение каждого из типов задач в диссертации.

Водно-органические системы (ВОС) и используемые для их анализа методы принципиально различаются для ВОС постоянного и переменного (нестехиометрического) химического состава. С точки зрения анализа ВОС важны также количество входящих в систему компонент и их химическая близость (принадлежность к одному классу соединений или к группе производных одного соединения).

Задачи анализа ВОС можно разделить на несколько типов:

- классификация группы объектов по сырьевой природе, составу и свойствам;

- классификация группы объектов по видовому и географическому происхождению;

- соответствие отдельных образцов эталону;

- идентификация соединений и определение примесей;

- установление взаимосвязи «состав-свойство» без идентификации отдельных компонентов смеси.

Одним из примеров первой задачи является идентификация сырьевого происхождения гуминовых веществ. Гуминовые вещества являются ВОС переменного состава, поэтому для их классификации удобно использовать данные о фрагментом составе, полученные с помощью спектроскопии ЯМР 13С, по которым целесообразно строить статистические модели методами кластерного анализа и методом главных компонент.

Пример второй задачи - классификация растительных масел по видовому и гемрафическому происхождению. Масла являются смесью жирных кислот и их производных, близких по химическому строению, поэтому хорошо классифицируются по фрагментному составу. Для классификации объектов по географическому происхождению удобно использовать также данные изотопного состава, поэтому для анализа растительных масел использовалась спектроскопия ЯМР на трех ядрах, 'Н, 13С и 2Н.

Установление соответствия эталону водно-спиртовых экстрактов природных соединений является примером третьей задачи. Для анализа этого типа ВОС использовалась спектроскопия ЯМР 'Н и 13С. Для автоматизации анализа данных спектроскопии ЯМР водно-спиртовых экстрактов на соответствие эталону целесообразно использовать факторный анализ, в качестве исходных данных для этого типа задач удобно использовать

весь спектр ЯМР целиком или совокупность нескольких спектров ЯМР на различных ядрах, как «отпечаток пальца» сравниваемых объектов без идентификации всех компонентов ВОС.

Для решения четвертого типа задач для простых синтетических ВОС, таких как фармпрепараты и биодобавки, целесообразно использование данньЕх спектроскопии .ЯМР на различных ядрах, обычно 'Н и 13С.

Самым сложным типом задач является установление взаимосвязи «состав-свойство» для ВОС, содержащих сотни компонентов, концентрации которых различаются на порядки. В этом случае идентифицировать все компоненты смеси невозможно и в качестве данных для анализа используют спектры ЯМР целиком, как «отпечаток пальца» объекта. Для построения моделей по таким данным используют методы факторного анализа и распознавания образов.

Одной из задач такого типа является анализ биологических жидкостей человека с целью установления взаимосвязи между изменениями в их составе и отклонениями в состоянии человека в реальном масштабе времени.

Глава 1. Особенности регистрации и анализа количественных спектров ЯМР сложных водно-органических систем. Литературный обзор по теме диссертации, содержит рассмотрение наиболее важных технических аспектов спектроскопии ЯМР водно-органических систем, такие как подготовка проб, регистрация количественных спектров ЯМР 'Н в условиях подавления сигнала растворителя, методы статистического анализа получаемых спектральных данных. Отдельный подраздел этой главы посвящен спектроскопии ЯМР биологических жидкостей человека.

Глава 2. Идентификация методом спектроскопии ЯМР ,3С сырьевого и природного происхождения водных растворов гумиповых препаратов. Определение сырьевой природы гуминовых препаратов это частный случай задачи классификации группы объектов по составу и свойствам. Гуминовые вещества представляют собой высокомолекулярные органические системы. Они являются продуктом совокупности случайных химических реакций, поэтому имеют нестехиометричный, не определяющийся однозначно состав и не имеют конкретной общей формулы. По этой причине наилучшим образом гу миновые препараты характеризует фрагментный, а не компонентный состав.

-а 4 .3 .2 -1 0 1 2 3 РС1

Рис. 1. Результаты статистического анализа данных спектроскопии ЯМР !3С гуминовых препаратов. Слева - образцы в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом главных компонент. Справа - распределение образцов в 3-х кластерах, полученных кластерным анализом.

Для анализа фрагментного состава гуминовых препаратов различного сырьевого происхождения были получены их количественные спектры ЯМР 13С в режиме развязки от ядер II без ядерного эффекта Оверхаузера (время накопления - 12 часов). Д ля регистрации спектров использовались растворы гуминовых препаратов в дейтероводе, твердые препараты растворялись до перенасыщения (выпадения осадка), жидкие перед растворением выпаривались до выпадения осадка. Статистический анализ полученных данных проводился с помощью кластерного анализа и методом главных компонент.

Из рис. 1 видно, что полученные кластеры приблизительно соответствуют гуминовым препаратам, полученным из видов сырья, соответствующих трем стадиям превращения растительных остатков при образовании углей. Гуминовые препараты, полученные из углей и торфов, попали и во второй и в третий кластеры, поскольку угли являются продуктом превращения торфов и гуминовые препараты, полученные из молодых углей и наиболее старых торфов очень близки по составу и свойствам.

На основании полученных результатов можно заключить, что для более надежной дифференциации препаратов целесообразно использовать наравне с данными спектроскопии ЯМР |3С данные спектроскопии ЯМР *Н и проводить эксперименты с переосажденными образцами гуминовых веществ.

Полученная модель позволяет надежно определять источник природного сырья, из которого изготовлены гуминовые препараты, а также отличать их от аналогов, содержащих рост-стимулирующие и иные добавки.

Глава 3. Выявление географического и сырьевого происхождения пищевой продукции методом спектроскопии ЯМР 'н, 2Н и 13С на примере растительных масел и твердых жиров. Задача выявления видового и географического происхождения пищевой продукции близка к описанной в предыдущей главе задаче анализа сырьевого происхождения. Для ее решения также достаточно описания фрагментного состава объекта. При анализе растительных масел, являющихся смесью жирных кислот и их производных, для этого достаточно спектров ЯМР *Н и 13С. Однако для более надежной идентификации по географическому происхождению целесообразно использовать также спектры ЯМР 2Н, поскольку изотопный состав масел зависит от места происхождения сырья для них вследствие различного фракционирования изотопов в воде и минералах в разных точках Земли. Поэтому по полученным и литературным данным была разработана методика статистической обработки данных спектроскопии ЯМР *Н, 2Н и 13С масел (оливковые, подсолнечные, кедровое и какао масла, произведенные в Испании, России, Тунисе и Греции). Для спектров ЯМР 13С статистический анализ проводился по 5 областям спектра, представленным в табл. 4. Для спектров ЯМР 2Н и 'Н - по 4 областям, представленным в табл. 2 и по 9 областям, представленным в табл. 3 соответственно.

Статистический анализ данных показал, что информации, содержащейся в спектрах ЯМР 2Н не достаточно для определения географического происхождения и типа масел. Спектры ЯМР 'Н и 1?С, напротив, позволяют эффективно определять тип и географическое происхождение масла.

Таблица 2. Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР 2Н *

Сырье и страна-изготовитель СНз- -СН2- -СН2СО- =сно-,-сн-, -сн2о-

Подсолнечник, Россия 0,14 0,53 0,22 0,12

0,12 0,52 0,25 0,11

0,11 0,48 0,29 0,13

0,13 0,57 0,19 0,10

Кедр, Россия 0,11 0,48 0,29 0,13

Олива, Тунис 0,16 0,55 0,18 0,11

Олива, Испания 0,15 0,57 0,18 0,10

0,10 0,54 0,24 0,09

0,14 0,56 0,18 0,04

Какао, Кот Д' Ивуар 0,08 0,62 0,10 0,20

Олива, Греция 0,13 0,62 0,20 0,05

- интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

Таблица 3, Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР *Н *

Сырье и страна-изготовитель I II III IV V VI VII VIII IX

5,2 м.д. 4,1 м.д. 4,0 м.д. 2,1 м.д. 1,9 м.д. 1,8 м.д. 1,4м.д. 1,1 м.д. 0,7 м.д.

Подсолнечник, Россия 0,09 0,54 0,15 0,29 0,24 0,21 0,13 0,14 0,85

0,09 0,55 0,15 0,30 0,25 0,20 0,12 0,14 0,85

0,09 0,48 0,14 0,32 0,24 0,21 0,12 0,13 0,87

Кедр, Россия 0,09 0,55 0,10 0,35 0,23 0,19 0,11 0,13 0,87

Олива, Тунис 0,09 0,50 0,13 0,21 0,12 0,06 0,04 0,04 0,19

Олива, Испания 0,09 0,60 0,18 0,33 0,30 0,11 0,16 0,18 0,80

0,09 0,62 0,20 0,35 0,34 0,06 0,17 0,21 0,76

Какао, 0,09 0,63 0,19 0,36 0,33 0,06 0,16 0,19 0,76

Кот Д' Ивуар 0,08 0,65 0,16 0,29 0,22 0,01 0,09 0,10 0,32

Олива, Греция 0,08 0,72 0,16 0,11 0,22 0,01 0,08 0,09 0,41

0,09 0,65 0,18 0,28 0,21 0,03 0,08 0,09 0,31

интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

Таблица 4. Фрагментный состав масел по данным спектроскопии ЯМР 13С *

Сырье и страна-изготовитель -с=о -СН= -сн2о-, =СНО- -сн2- -СНз

Подсолнечник, Россия 0,05 0,20 0,07 0,93 0,80

0,05 0,19 0,07 0,93 0,79

0,05 0,21 0,07 0,93 0,80

0,05 0,22 0,07 0,95 0,70

Кедр, Россия 0,05 0,21 0,06 0,90 0,85

Олива, Тунис 0,05 0,14 0,06 0,93 0,80

Олива, Испания 0,05 0,12 0,06 0,93 0,81

0,05 0,13 0,06 0,93 0,81

0,04 0,12 0,06 0,96 0,74

Какао, Кот Д' Ивуар 0,02 0,15 0,03 0,96 0,91

Олива, Греция 0,03 0,18 0,10 0,96 0,71

интегральные интенсивности пиков в спектрах, нормированные на полный интеграл спектра.

* подгалнечное

Ь Кедооеге

О Одавюеое

А кжю

Рис. 2. Образцы масел в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом главных компонент по данным спектроскопии ЯМР 13С.

1.0 о.в о,в

[),4 0,2 [),(>

-0,4

-П,Я •0,8 -1,11 И.?

-1,4 -1.R

Rimia

: ' С*

» Russia

Ru^a »

о Ь

Spain' О

Tunis о

Spain О

Cole 0 Voir й „

Для решения этой задачи наиболее эффективен статистический анализ данных спектров ЯМР 13С, результаты которого представлены на рис. 2. Однако стоит отметить, что регистрация спектров ЯМР 13С намного более длительна, нежели регистрация спектров ЯМР Н, которые также позволяют решить поставленную задачу (около 10 минут для спектров ЯМР 13С, около 1 минуты для спектров ЯМР !Н). Поэтому для анализа большинства обргяцов по данным спектроскопии ЯМР статистическими методами целесообразно использовать данные спектров ЯМР 'Н.

В факторном пространстве координаты образцов по каждой из осей коррелируют с такими свойствами масел, как степень ненасыщенности, соотношение цис- и транс- изомеров в смеси и длинна и степень разветвленное™ «хвостов» триглицеридов. Полученная модель может быть использована для выявления загрязнений в маслах, в том числе добавок для повышения окислительной стабильности и трансизомеров жирных кислот, возникающих при гидрогенизации масла. Наряду с растительными маслами, подобная схема анализа может быть использована и для твердых жиров. Кроме того, спектроскопия ЯМР 'Н позволяет значительно быстрее, нежели стандартными методами, определять такие характеристики смесей жиров, как число омыления, йодное и гидроксильное числа, что показано на примере двух твердых жировых основ, используемых в пищевой промышленности. Глава 4. Идентификация водно-спиртовых экстрактов природного и синтетического происхождения на примере парфюмерно-косметических средств. Описан подход к анализу парфюмерно-косметической продукции на примере идентификации туалетной воды. Многие пар фюмерно-косметические средства, как и

il

-...............—i.JT .1. |( ...... ili 1j< Jliflikllili !

-u--itiiliiÉ liii li. IL J . i Inl ™ ®| [ ЩГ i™ e У lililí

- • T 1 -L "

- "lo ~ "■• — - -»• »• - ™n ¡и ~ ■nf'M JJ i 'ж-;«!

Рис. 3. Спектры ЯМР 13С (JEOL JNM ЕСА-600, 600 МГц) 3 фальсифицированных и 1 подлинного (третий сверху) образцов парфюмерно-косметического средства «Amor Amor». Наиболее интенсивные сигналы (в т. ч. углеродных атомов этанола) обрезаны.

некоторые продукты пищевой и фармацевтической промышленности представляют собой водные экстракты с высоким содержанием низкомолекулярных спиртов. Для идентификации таких систем и выявления в них загрязнителей (в т. ч. токсичных и канцерогенных органических красителей, как правило, гетероциклических) достаточно регистрации спектров ЯМР *Н, с подавлением сигнала воды, если ее содержание превышает 90%, и 13С.

JUW¡LulL

JUULJL

parts per million

Рис. 5 Спектры ЯМР 1H (JEOL JNM ECA-600, 600 МГц, область 0-8 м. д.) 3 фальсифицированных и 1 подлинного (третий сверху) образцов парфюмерно-косметического средства «Amor Amor». Сигналы этанола и воды обрезаны, гидроксильных протонов спирта и протонов воды в спектре подлинника - уширены и имеют более низкую интенсивность в связи с наличием обмена протонами между водой, гидроксильной группой спирта и другими компонентами образца.

Рис. 4. Образцы в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом главных компонент по данным спектроскопии ЯМР 13С (А - образцы подлинников, В - образцы подлинников с различной экспозицией хранения, С - образцы поддельной продукции).

Исследованная серия образцов одного и того же парфюмерного препарата ("Amor Amor", Chacharel Ltd., Франция) состояла из продукции, полученного у фирмы-производителя и от сторонних производителей (была куплена в торговых организациях Москвы разного уровня доверительности), представляет собой водно-этанольный раствор смеси эфиров и небольшого числа ароматических соединений. Идентификацию парфюмерных препаратов целесообразно осуществлять по спектрам ЯМР на ядрах 13С, а не 'Н. Это обусловлено тем, что парфюмерные средства содержат значительное количество родственных эфирных соединений, сигналы которых сильно перекрываются между собой и частично закрыты сигналами воды и спирта, доля которых в образце значительно больше (см. рис. 5).

В спектрах ЯМР 13С наиболее информативными являются области 40 - 80 м. д., 110160 м. д., 170-180 м. д. и 210 - 220 м. д. (рис. 3). Затраты времени на получение количественных спектров ЯМР 13С в данном случае не велики и составляют около 10 минут, результаты статистического анализа спектров ЯМР ,3С парфюмерного препарата «Amor Amor» представлены на рис. 4.

Полученная модель позволяет определять наличие загрязнителей в исследованном парфюмерном средстве, таких как не соответствующие требованиям экологической безопасности органические красители.

Глава 5. Оценка эффективности спектроскопии ЯМР 'Н и ,3С как метода идентификации примесей в фармацевтических препаратах и оценки их соответствия требованиям экологической безопасности. Для идентификации соединений и определения примесей в смесях небольшого числа нескольких компонент в большинстве случаев достаточно регистрации спектров ЯМР *Н и 13С, в случае присутствия в смеси большого числа родственных соединений для их идентификации необходима дополнительно регистрация двумерных спектров ЯМР. Эффективность такого подхода к анализу фармацевтических препаратов показана на примерах определения загрязнителей в препаратах на основе дигидрокверцетина в сравнении со стандартным хроматографическим методом, определения содержания действующего вещества и скорости его высвобождения в препаратах пролонгированного действия на основе рисперидона, определения содержания действующих веществ в препаратах арбидола и ко-тримоксазола. В качестве загрязнителей в данном случае могут выступать остаточные количества веществ, использующихся в процессе изготовления препаратов, токсичные и обладающие нежелательными побочными эффектами родственные основным компонентам препаратов соединения.

5.1 Анализ качества фармацевтических препаратов (на примере дигидрокверцетина) На рис.6 представлена структурная формула дигидрокверцетина (ДГК). Сырье производства ДГК всегда содержит большое количество

Рис. 6. Структурная формула родственных ДГК флавоноидов (кемпферол, дигидрокверцетина. дигидрокемпферол, нарингенин, лютеолин и т.п.),

максимальные содержания которых регламентированы нормативными документами (ТУ 9325-001-70692152-07, международная фармакопея).

Проведена серия экспериментов по контролю качества образцов дигидрокверцетина различных производителей. В качестве спектров сравнения в серию были включены спектры дигидрокверцетина-сырца и эталонного чистого дигидрокверцетина. Все образцы серии

были охарактеризованы с помощью ВЭЖХ (по приведенной выше методике, на хроматографе ЬС Ргс^аг 325) и с помощью спектроскопии ЯМР на ядрах !Н и 13С. Для анализа методом спектроскопии ЯМР образцы были;: предварительно растворены в ОМБО-Эб, регистрация спектров проводилась при постоянной температуре, общее время накопления протонных спектров — менее минуты, углеродных — около 12 минут. Регистрация спектров производилась на 600 МГц ЯМР - спектрометре ЖОЬ ЖМ-ЕСА 600, троекратно для каждого спектра с целью оценки воспроизводимости результата. Краткое сравнение анализа ДГК методами ВЭЖХ и спектроскопии ЯМР представлено в табл. 5.

Таблица 5. Сравнение спектроскопии ЯМР и ВЭЖХ как методов идентификации

лекарственных и парафармацевтических препаратов

ВЭЖХ с фотометрическим детектированием ЯМР 'Н

Высокочувствительный метод, предел обнаружения 10"4 - 10"6 г/л. Низкочувствительный метод, предел обнаружения 10"2 - 10° г/л.

Необходимы стандартные образцы на каждое вещество. Не требует стандартных образцов.

Для определения всех примесей требуется несколько экспериментов. Для определения всех примесей достаточно одного эксперимента.

Подготовка образца требует времени. Нет необходимости в предварительной подготовке образца.

Один эксперимент занимает не менее 10 минут. Один эксперимент занимает не более минуты.

Полное время анализа не менее 50 мин. Полное время анализа менее 5 мин.

Родственные соединения трудно различимы. Возможна однозначная идентификация родственных примесных соединений (нарингенин, лютеолин, дигидрокемпферол и т.д.).

На основе проведенного сравнительного анализа можно рекомендовать применять методики идентификации фармпрепаратов с помощью протонной спектроскопии ЯМР в тех случаях, когда компоненты фармпрепарата имеют близкие времена удерживания, важно содержание определенного оптического изомера в смеси, необходимо качественно идентифицировать все возможные примеси. Протонная спектроскопия ЯМР может также использоваться как дополнительный метод идентификации фармпрепарата для подтверждения результатов ВЭЖХ и получения информации, которую сложно или невозможно получить с помощью хроматографии. Анализ образцов методом спектроскопии ЯМР выявил наличие в образцах следовых количеств растворителей, используемых при экстракции дигидрокверцетина из растительного сырья (ацетон, этилацётат). Кроме того, в образцах были обнаружены дигидрокемпферол, нарингенин, лютеолин, апигенин, кверцетин в различных количествах. Эти флавоноиды не токсичны, но обладают значительно меньшей антиоксидантной активностью, чем дигидрокверцетин.

и

сн,

Арбндол

'ХХКГГ

/Ч

<ч

Тримстопрям

5.2 Анализ качества

фармацевтических препаратов на основе арбидола и ко-тримоксазола.

Спектроскопия ЯМР в ряде случаев является практически безальтернативным методом контроля качества лекарственных

качества

Рис. 7. Структурные формулы арбидола и препаратов. Один из наглядных примеров -

Исследована серия образцов ректальных свечей, содержащих два действующих начала -арбидол и ко-тримоксазол (рис. 7) (состоит из двух компонент - сульфометоксазола и триметоприма). Применяемые для подобных анализов хроматографические методы не позволяют работать с твердой фазой, а перевод в жидкую фазу для хроматографии требует отделения жиров от действующих веществ. Это усложняет анализ и увеличивает его длительность. Получение количественных спектров ЯМР 'н данных образцов занимает около 10 минут. Было определено соотношение количеств действующих начал в суппозиториях и их объемное распределение (для чего регистрировались спектры нескольких проб из разных частей суппозитория). В ряде образцов исследованной серии соотношение количеств действующих начал не соответствовало паспортному. Созданы основы соответствующей методики.

5.3 Анализ состава фармацевтических препаратов на основе рисперидона. Рисперидон (рис. 8) - атипичное антипсихотическое средство, производное бензизоксазола, нейролептик. Применяется для лечения психозов в терапии некоторых форм биполярного расстройства, психотической депрессии, при шизофрении. В настоящем исследовании была

Рис. 8. Структурная пролонгированного действия для внутримышечного введения, формула рисперидона. все образцы были предоставлены Институтом проблем лазерных и информационных технологий РАН. В ходе исследования решались следующие задачи -идентификация действующего начала препарата по спектрам ЯМР 'Н, ,3С и количественное определение примесей, определение содержания препарата в композиции с биодеградируемым полимером (поли-В.Ь-лактид-когликолид). Регистрация спектров ЯМР "р была необходима для подтверждения пространственного строения действующего начала препарата и более точного его количественного определения.

компонентов ко-тримоксазола.

анализ качества ректальных суппозиториев.

изучена серия образцов препарата и его дженериков различного производства в форме порошка для приготовления суспензии

Спектры ЯМР всех образцов регистрировались на спектрометре ЛОГ, ЖМ ЕСА-600 с рабочей частотой для ядер 'Н 600 МГц в ампулах 5 мм в идентичных условиях. В качестве растворителя использовались физиологический раствор (в спектре ЯМР 'Н содержит интенсивный сигнал протонов воды в области 5 м.д.), и дейтерированный хлороформ.

Предложен и использован простой метод определения в растворе (СОСЬ) соотношения «рисперидон : полилактид : полигликолид», основанный на сопоставлении интегральных интенсивностей сигналов в выделенных областях спектра ЯМР !Н. Метод может бьггь успешно использован для исследования процесса высвобождения препарата из полимерной матрицы в физиологическом растворе в реальном времени и выявления загрязнителей, образующихся при ее разрушении. Единичное измерение может занимать менее 10 минут. В исследованной серии образцов, полученных по различной технологии микронизации, произошло полное разрушение матрицы без образования примесей, но скорость высвобождения препарата в некоторых из них не соответствовала заявленной изготовителем.

Глава 6. Методология анализа биологических жидкостей человека, как наиболее сложных водно-органических систем, методом спектроскопии ЯМР *Н с подавлением воды на примере амниотической жидкости беременных. Биологические жидкости человека - сложные многокомпонентные водно-органические системы с высоким содержанием воды. Задача идентификации индивидуальных веществ в них очень сложна и трудоемка, поэтому для задач экомониторинга и медицинской диагностики целесообразно сравнивать химический состав таких смесей, используя спектры ЯМР 'Н с подавлением воды целиком в качестве «отпечатка пальца», характеризующего мгновенное состояние образца.

В главе 6 показана применимость такого подхода в задаче анализа амниотической жидкости для ранней оценки риска родовых осложнений и мониторинга состояния рожениц. Исследованы образцы амниотической жидкости 115 пациенток, большинство из которых страдали экстрагенитальными заболеваниями. Отбор всех образцов производился непосредственно при родовом акте, на его заключительной стадии. Образцы хранились и транспортировались в замороженном состоянии, при температуре -25оС. От объема образца отбирали 0,8 мл жидкости, которую подвергали центрифугированию с силой 14000g в течение 10 минут, 0,5 мл полученного супернатанта переносили в 5мм ампулу дня спектроскопии ЯМР. Образцы были очищены от белковой части с помощью молекулярных фильтров.

Для каждого образца амниотической жидкости были зарегистрированы спектры по двум методикам - ШЕ-Ш (поевургШ) и СРМв (стр§рг), в которых подавление сигнала

растворителя (воды) осуществлялось его преднасыщением. Регистрация всех спектров проводилась на спектрометре ЯМР Вгикег Ауапсе-600 с разрешением 600 МГц для протонов, на инверсном датчике, поскольку чувствительность прямого датчика не достаточна для получения качественных спектров амниотической жидкости.

Для построения модели был осуществлен факторный анализ данных методом главных компонент (рис. 9) и методом проекции на латентные переменные с ортогональной коррекцией сигнала (О-РЬБ), для повышения точности классификации. Полученная модель позволяет разделить образцы по различиям в химическом составе на 5 групп, соответствующих образцам беременных с осложненным каждой из четырех патологий и с нормальным течением родов. В наибольшей степени риски осложнений в родах коррелируют с содержанием в амниотической жидкости гистидина, уксусной и ацетоуксусной кислот, молочной кислоты, лейцина, изолейцина, лимонной кислоты, креатина и креатинина.

А •if: 1

-rdM

<ff ,Л ■ ■ it

й ш Ш

я* Г - ш 'о : = с

¡.У

О Анемия

Д Артериальная гяпертензия

О Гестационный пиелонефрит

О Контроль

Рис. 9. А - Образцы в факторном пространстве главных компонент 1-3, полученном методом проекции на скрытые переменные с ортогональной коррекцией сигнала (О-РЬБ). В - типичный спектр ЯМР 1Н 600 МГц амниотической жидкости.

ВЫВОДЫ

1. Расширены возможности современной спектроскопии ЯМР на различных ядрах с последующим статистическим анализом проекционными методами (РСА, PLS) в сочетании с дискриминантным анализом (LDA) на ядрах 'Н, 2Н и 13С для экомониторинга, идентификации и установления генетического и географического происхождения сложных водно-органических систем, представляющих значительный интерес с позиции экологии человека.

2. Выявлена возможность надежного определения загрязненности и сырьевого происхождения экологически-безопасных стимуляторов роста гуминового типа на основе дескрипторов фрагментного состава (содержание фрагментов -COO, (^„„О, Саро„С,Н, С^О, Саж), полученных при анализе спектров ЯМР 13С.

3. Выявлена возможность надежного определения загрязненности, сырьевого и географического происхождения растительных масел на основе дескрипторов фрагментного

состава триглицеридов полученных при анализе спектров ЯМР на ядрах 'Н, 2Н и 13С, надежного определения стандартных показателей жирных смесей (йодного и гидроксильного чисел, числа омыления) по данным спектроскопии ЯМР 'Н.

4. Выявлена возможность надежной оценки безопасности, качества и идентификации подлинности парфюмерно-косметической продукции методами спектроскопии ЯМР *Н и ,3С.

5. Выявлена возможность определять содержание основных действующих веществ и примесей в лекарственных и парафармацевтических препаратах методами спектроскопии ЯМР на ядрах 13С, 'Н значительно быстрее, нежели другими методами, без применения стандартов и эталонов.

6. Выявлены особенности химического состава амниотической жидкости, позволяющие характеризовать риск родовых осложнений при наличии одного или нескольких из четырех самых распространенных заболеваний при беременности по данным спектроскопии ЯМР 'Н. В наибольшей степени риски осложнений в родах коррелируют с содержанием в амниотической жидкости гистидина, уксусной и ацетоуксусной кислот, молочной кислоты, лейцина, изолейцина, лимонной кислоты, креатина и креатинина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах из перечня ВАК

1. В.В. Подгорский, Б.Р. Садыков, A.B. Чертков, Л. А. Воронина, Н.Г. Баканова, Л.И. Куркиева, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР сложных водно-органических объектов: новые направления исследования в РУДН // Вестник РУДН сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2010. 1. - С. 5-13.

2. В.В. Подгорский, A.C. Михалев, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР в контроле качества лекарственных и парафармацевтических препаратов // Химико-фармацевтический журнал. - 2011. - №3. - С. 52-55.

3. Н.Г. Баканова, Г.А. Калабин, В.В. Подгорский Взаимосвязь молекулярного строения и рост-стимулирующей активности гуминовых веществ из лигнина // Вестник РУДН сер. Экология и безопасность жизнедеятельности. - 2012. - № 2. - С. 16-23.

Материалы конференций

1. Н.Г. Баканова, Б.Р. Садыков, В.В. Подгорский Новый алгоритм идентификации сырьевой и технологической природы промышленных гуминовых препаратов для с/х методом спектроскопии ЯМР // материалы XIV всеросс. конф. «Докучаевские молодежные чтения», Санкт-Петербург, 2011, С. 193-195.

2. A. Poltanova, A. Chertkov, Е. Simonenko, V. Podgorsky, E. Yutkin, N. Sergeyev, S. Yakovenko Leading innovation: metabolomic profiling of embryo culture media using *H NMR for selection embryos with higher pregnancy rate // Reproductive BioMedicine Online. Abstracts of 5th WARM congress. - 2010. - Vol. 20(3). - P. S4.

3. A.V.Chertkov, V.V.Podgorsky, K.F.Sheberstov, A.V.Poltanova, N.M.Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media // материалы XIII Международ, конф. "Актуальные проблемы магнитного резонанса и его применений", Казань, 2010, С. 72-75.

4. В.В. Подгорский, Г.А. Калабин О применении приборного комплекса Delta V Advantage Plus изотопной масс-спектрометрии // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». - 2009. - Вып. 11. - С. 230-233.

5. В.В. Подгорский, Г.А. Калабин Идентификация триглицеридов методом спектроскопии ЯМР *Н // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». - 2008. - вып. 10 (часть 1). - С. 34-36.

6. В.В. Подгорский, Т.Н. Колоколова, Г.А. Калабин Количественная спектроскопия ЯМР !Н биофлюидов человека // Сб. науч. трудов «Актуальные проблемы экологии и природопользования». - 2007. - Вып. 9 (часть 1). - С. 5-8.

7. A.V. Chertkov, V.V. Podgorsky, К. Sheberstov, A. Poltanova, N.M. Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media // Материалы Всеросс. конф. с международ, участием «Магнитный резонанс в химической и биологической физике», Новосибирск, 2010, С. 41.

8. A.Chertkov, S.Trashin, V.Podgorsky, A.Poltanova, K.Sheberstov, N.M.Sergeyev, G.A.Kalabin High resolution NMR spectroscopy as a new method in medicine diagnostics and biochemical research. Metabonomics study of human amniotic fluid and embryo culture media// материалы 7-й международ, конф. «ЯМР в гетерогенных системах», Санкт-Петербург, 2010, С. 67.

9. Калабин Г.А., Чертков А.В., Подгорский В.В. Компонентный и фрагментный анализ биофлюидов человека совокупностью методов спектроскопии ЯМР 'Н, 13С и хромато-масс-спектрометрии высокого разрешения // материалы III Всеросс. конф. с международ, участием «Аналитика России-2009», Краснодар, 2009.

10. Подгорский В.В., Колоколова Т.Н., Сергеев Н.М. Определение уровня дейтерирования дейтерированных растворителей с высокой точностью // Тез. докл. Международ, конф. «Ломоносов - 2007». - 2007. - CD-ROM, ISBN 5-7776-0079-4.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Подгорский, Виктор Викторович, Москва

61 12-2/429

Федеральное государственное бюджетное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов»

На правах рукописи

Подгорский Виктор Викторович

Разработка экомониторинга сложных водно-органических систем методом количественной

спектроскопии ЯМР на различных ядрах.

03.02.08 - Экология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель д.х.н., проф. Калабин Г.А.

Москва - 2012

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................4

Глава 1 Литературный обзор...........................................................................7

1.1 Особенности регистрации и анализа количественных спектров ЯМР сложных водно-органических систем...............................................................7

1.1.1 Подготовка образцов.............................................................................7

1.1.2 Методы подавления воды в спектроскопии ЯМР ]Н сложных водно-органических систем.......................................................................................9

1.1.3 Особенности спектроскопии ЯМР биологических жидкостей.........18

1.2 Статистический анализ данных спектроскопии ЯМР водно-органических систем................................................................................................................22

1 ^

Глава 2 Идентификация методом спектроскопии ЯМР С сырьевого и природного происхождения водных растворов гуминовых препаратов .. 34

Глава 3 Выявление географического и сырьевого происхождения пищевой продукции методом спектроскопии ЯМР *Н и 2Н на примере растительных масел и твердых жиров.........................................................43

Глава 4 Идентификация водно-спиртовых экстрактов природного и синтетического происхождения на примере парфюмерно-косметических средств..............................................................................................................51

1 1 -1

Глава 5 Оценка эффективности спектроскопии ЯМР Н и С как метода идентификации примесей в фармацевтических препаратах и оценки их соответствия требованиям экологической безопасности...........................57

5.1 Анализ качества фармацевтических препаратов (на примере дигидрокверцетина)..........................................................................................57

5.2 Анализ качества фармацевтических препаратов на основе арбидола и ко-тримоксазола.....................................................................................................69

5.3 Анализ состава фармацевтических препаратов на основе рисперидона. 72

Глава 6 Методология анализа биологических жидкостей человека, как наиболее сложных водно-органических систем, методом спектроскопии

ЯМР с подавлением воды на примере амниотической жидкости беременных......................................................................................................80

6.1 Подбор условий пробоподготовки, хранения и регистрации спектров амниотической жидкости.................................................................................84

6.2 Изучение статистических свойств данных спектроскопии ЯМР амниотической жидкости и построение их статистической модели.............93

ВЫВОДЫ........................................................................................................119

Список использованной литературы...........................................................121

ВВЕДЕНИЕ

В обширном современном арсенале физико-химических методов выявления примесей и/или токсикантов в объектах окружающей среды центральное место занимает хромато-масс-спектрометрия как метод, обладающий уникальной чувствительностью (пределом обнаружения) и высокой разрешающей способностью. Не менее информативным, но пока менее востребованным методом является спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) высокого разрешения. Она не требует использования стандартов, поскольку является абсолютным методом, не разрушает исследуемый образец и не требует длительных процедур пробоподготовки, позволяя установить строение интересующих соединений в объекте исследования или примесей в нем, количественно определить их содержание, выявить сырьевую, географическую и технологическую предысторию. Занимая ведущие позиции в химии и биологии, особенно в биоорганической химии, спектроскопия ЯМР все шире используется для решения проблем экологической химии и связанных с ней прикладных медико-фармацевтических задач. Спектроскопия ЯМР широко используется для анализа продукции химических производств за рубежом (в т. ч. масел, алкогольной продукции, продуктов нефтепереработки), входит в национальные стандарты США и стран Евросоюза.

Являясь экологически безопасным и недеструктивным методом анализа водно-органических систем, удовлетворяющим самым жестким требованиям «зеленой химии», обладая высокой эффективностью, спектроскопия ЯМР, несомненно, займет одно из ведущих мест в экоанализе и экомониторинге. Для этого необходима с одной стороны адаптация известных и разработка принципиально новых методологий и технологий получения надежных результатов измерений, и, с другой стороны, оптимальных схем и методов статистического анализа данных.

Появление компактных проточных спектрометров ЯМР и современных алгоритмов автоматической обработки массивов спектральных данных делает

4

метод применимым для производств, связанных с переработкой природного органического сырья химической и легкой промышленности, производстве пищевой продукции и лекарственных средств. Поскольку природное органическое сырье, как правило, сложные водно-органические системы (ВОС), наиболее эффективно использование методик спектроскопии ЯМР с подавлением сигнала протонов воды, что позволяет анализировать такие объекты без её удаления, существенно упрощая пробоподготовку и снижая время анализа.

ВОС и используемые для их анализа методы принципиально различаются для ВОС постоянного и переменного (нестехиометрического) химического состава. С точки зрения анализа ВОС важны также количество входящих в систему компонент и их химическая близость (принадлежность к одному классу соединений или к группе производных одного соединения).

Задачи анализа ВОС можно разделить на несколько типов: классификация группы объектов по сырьевой природе, составу и свойствам;

классификация группы объектов по видовому и географическому происхождению;

соответствие отдельных образцов эталону; идентификация соединений и определение примесей; установление взаимосвязи «состав-свойство» без идентификации отдельных компонентов смеси.

Одним из примеров первой задачи является идентификация сырьевого происхождения гуминовых веществ, рассмотренная в главе 2 диссертации. Гуминовые вещества являются ВОС переменного состава, поэтому для их классификации удобно использовать данные о фрагментном составе, полученные с помощью спектроскопии ЯМР 13С, по которым целесообразно строить статистические модели методами кластерного анализа и методом главных компонент.

Пример второй задачи - классификация растительных масел по видовому и географическому происхождению. Масла являются смесью жирных кислот и их производных, близких по химическому строению, поэтому хорошо классифицируются по фрагментному составу. Для классификации объектов по географическому происхождению удобно использовать также данные изотопного состава, поэтому для анализа растительных масел использовалась

1 13 2

спектроскопия ЯМР на трех ядрах, Н, С и Н.

Установление соответствия эталону водно-спиртовых экстрактов природных соединений является примером третьей задачи. Для анализа этого типа ВОС использовалась спектроскопия ЯМР 'Н и 13С. Для автоматизации анализа данных спектроскопии ЯМР водно-спиртовых экстрактов на соответствие эталону целесообразно использовать факторный анализ, в качестве исходных данных для этого типа задач удобно использовать весь спектр ЯМР целиком или совокупность нескольких спектров ЯМР на различных ядрах, как «отпечаток пальца» сравниваемых объектов без идентификации всех компонентов ВОС.

Для решения четвертого типа задач для простых синтетических ВОС, таких как фармпрепараты и биодобавки, целесообразно использование данных

1 п

спектроскопии ЯМР на различных ядрах, обычно Ни С.

Самым сложным типом задач является установление взаимосвязи «состав-свойство» для ВОС, содержащих сотни компонентов, концентрации которых различаются на порядки. В этом случае идентифицировать все компоненты смеси невозможно и в качестве данных для анализа используют спектры ЯМР целиком, как «отпечаток пальца» объекта. Для построения моделей по таким данным используют методы факторного анализа и распознавания образов.

Одной из задач такого типа является анализ биологических жидкостей человека с целью установления взаимосвязи между изменениями в их составе и отклонениями в состоянии человека в реальном масштабе времени.

Глава 1 Литературный обзор

1.1 Особенности регистрации и анализа количественных спектров ЯМР сложных водно-органических систем

1.1.1 Подготовка образцов

Рутинная пробоиодготовка для анализа методом спектроскопии ЯМР проста и состоит из двух стадий - перевода образца в жидкую фазу и добавления дейтерорастворителя. При подготовке проб водно-органических систем, содержащих компоненты с большим временем релаксации, например гуминовых препаратов, дополнительно добавляют вещества, снижающие время релаксации (релаксанты). При подготовке вязких проб, например некоторых масел, добавляют вещества, понижающие вязкость.

Выбор растворителя зависит от состава исследуемого образца. При подготовке образцов фармацевтических препаратов и водно-спиртовых экстрактов обычно используется дейтерохлороформ, при подготовке масел -диметилсульфоксид (ДМСО).

Значительно более сложна подготовка проб биологических жидкостей. Стандартные процедуры их отбора для клинических анализов в медицине хорошо отработаны. Их используют и для отбора проб при анализах методом ЯМР. Собранные образцы центрифугируют для повышения однородности и отделения механических примесей [1-5]. Часто при центрифугировании прибегают к использованию микрофильтров для отделения макромолекул больше определенного размера, поскольку их наличие может искажать базовую линию спектров [2,3]. Биологические жидкости и тканевые экстракты, содержащие много белков или других макромолекул, часто очень вязкие, что усложняет настройку однородности поля [2,5].

Пробоподготовка также часто включает в себя лиофилизацию [5]. Биологические жидкости всегда содержат в себе очень много воды, частичное

удаление которой облегчает получение качественных спектров, но существенно удлиняет суммарное время эксперимента.

Положение сигналов основных метаболитов в спектрах ЯМР !Н биологических жидкостей сильно зависит от рН образца и температуры регистрации спектра. Поэтому, чтобы такие спектры можно было сравнивать друг с другом, оба эти параметра должны быть строго стандартизованы [2,3].

Стандартизация рН особенно важна при исследованиях образцов мочи, где рН может колебаться в большом диапазоне. В связи с этим перед регистрацией спектра к образцу биологической жидкости добавляют стандартное количество фосфатного буферного раствора [2,4].

После такой предварительной подготовки к точно определенному объему биожидкости (обычно 500 мкл) добавляют раствор образца сравнения в Э20 известной концентрации. Чаще всего в качестве такого внутреннего образца используют 3-триметилсилил-[2,2,3,3-2Н4]-пропионат натрия. Это достаточно инертное соединение дает узкий интенсивный синглетный сигнал с химическим сдвигом 0 м. д. [1-5].

По отношению к этому сигналу методом интегрирования определяют интенсивности всех остальных сигналов в спектре. На основе интенсивностей по стандартной методике рассчитывают концентрации всех соединений. Сигнал ЯМР 'Н

тяжелой воды используют в качестве опорного в канале стабилизации спектрометра.

В некоторых случаях прибегают к использованию внешнего стандарта [5-6]. При этом какой-либо дейтерированный растворитель, содержащий известное количество соединения-стандарта, помещают в специальный градуированный запаянный капилляр, который помещают коаксиально в ампулу с исследуемой биологической жидкостью или иным образцом. Такая процедура позволяет избежать разбавления образца.

Большинство рутинных измерений спектров биологических жидкостей проводят на спектрометрах с рабочими частотами ЯМР 500-700 МГц [5].

1.1.2 Методы подавления воды в спектроскопии ЯМР 1Н сложных водно-

органических систем

В большинстве биологических жидкостей, интересных для изучения с точки зрения биохимии и медицины, содержится значительное количество воды, физическое удаление которой из образцов может значительно увеличивать время, трудоемкость и стоимость пробоподготовки, а в ряде случаев и вовсе не представляется возможным без качественного изменения образца.

Поскольку концентрация воды в таких образцах значительно выше, нежели концентрация полезных исследуемых веществ, при регистрации спектра возникают значительные экспериментальные сложности. Поэтому для редактирования спектров с целью удаления сигнала воды используется ряд приемов, которые обычно используют в практике ЯМР для удаления из спектров сигналов недейтерированного растворителя [6-21].

Принципиальной причиной необходимости подавления сильных сигналов растворителя при наличии намного более слабых сигналов растворенного вещества является ограниченный диапазон сигналов, который может быть воспринят приемником и аналого-цифровым преобразователем прибора. Кроме того, интенсивные сигналы искажают базовую линию спектра, приводят к демпфированию облучающего импульса и появлению паразитных сигналов [6].

Демпфирование облучающего импульса вызывает сильное нежелательное уширение сигнала воды, которое маскирует сигналы растворенного вещества. Оно возникает вследствие того, что сильный сигнал ЯМР вызывает появление сильных радиочастотных токов в катушке

9

приемника. Эти токи создают собственное поле, которое смещает намагниченность воды от равновесного положения. Они действуют как дополнительный селективный импульс на частоте протонов воды. Поэтому происходит ускорение потери поперечной намагниченности, уменьшение времени релаксации Т2 и, соответственно, уширение сигнала [6,19].

В ходе нашей работы был проведен тщательный анализ различных методик подавления воды [7-21], основанных на описанных ниже подходах, для околоплодной жидкости. Кроме приведенных здесь классических последовательностей были рассмотрены также различные их вариации и комбинации с другими последовательностями, такими, как RAW, WATR, WEFT.

В общем случае, перед подавлением сигнала воды требуется, чтобы этот сигнал имел правильную форму. Поэтому необходимо прецизионное шиммирование прибора с помощью процедуры градиентного шиммирования. Качество спектра повышается при удалении из образца растворенного газа, например, с помощью ультразвукового перемешивания.

Целью подавления сигнала растворителя является уменьшение амплитуды этого сигнала, перед тем, как сигнал поступит на приемник. Огромное количество работ, посвященных данному вопросу, свидетельствует о том, что задача не является тривиальной. Подходы к ее решению, которые используются наиболее широко, можно разбить на три группы: методы насыщения сигнала воды методы, дающие нулевое возбуждение сигнала воды методы, нарушающие резонансные условия протонов воды,

основанные на импульсных градиентах поля.

Все схемы подавления приводят к уменьшению интенсивности сигналов, расположенных вблизи сигнала растворителя, поэтому, чтобы такие сигналы наблюдались, требуется тщательный подбор условий эксперимента, в

простейшем случае - температуры образца. Таким способом удается избежать потери сигналов вследствие смещения сигнала воды относительно сигналов растворенного вещества.

Простейшим, наиболее надежным и широко применяемым в ЯМР методом подавления сигнала растворителя является преднасыщение [14]. Фрагмент преднасыщения легко вводить в спектры ЯМР, в результате его действия сигнал растворителя удаляется из спектра, а сигналы, частоты которых отличаются от частоты преднасыщения, остаются практически неизменными.

Метод основан на применении постоянного слабого радиочастотного облучения на частоте растворителя до того, как будет произведено возбуждение остальных сигналов, и сбор данных. В результате сигнал растворителя оказывается эффективно насыщенным и в спектре не наблюдается.

Для сигналов, расположенных вблизи сигнала растворителя, также наблюдается некоторая потеря интенсивности. Она может быть уменьшена путем снижения мощности преднасыщения, однако при этом сигнал растворителя может оказаться подавленным не полностью.

Увеличение периода преднасыщения улучшает подавление, но при этом увеличивает время эксперимента. Поэтому для времени преднасыщения подбирают компромиссное значение. Если есть возможность, то и для преднасыщения и для последующих и