Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) и его фрагментов в регуляции микроциркуляции

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) и его фрагментов в регуляции микроциркуляции"

^ РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ФИЗИОЛОГИИ И БИОХИМИИ

ИМЕНИ И. М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 612.13+557.15/. 17

АКОПЯН Виолетта Андрониковна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ КАЛЬЦИТОНИН ГЕН-РОДСТВЕННОГО ПЕПТИДА (КГРП) И ЕГО ФРАГМЕНТОВ В РЕГУЛЯЦИИ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ.

03.00.13. - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кавдидата биологических наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в группе сравнительной физиологии микроциркуляции Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН (директор - академик ВЛ.Свидерский)

Научный руководитель -кандидат медицинских наук Н.В.Балашов

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, проф. Н.Н.Петрищев Доктор биологических наук, проф. Б.С.Кулаев

Ведущая организация - Институт Кардиологии МЗРФ (Санкт-Петербург)

Защита состоится" июня 1998 г. в а час. на заседании диссертационного совета по присуждению ученой степени доктора биологических наук (Д 002.89.01) в Институте эволюционной физиологии и биохимии имени И.М. Сеченова РАН по адресу: 194223, Санкт-Петербург, пр. М.Тореза, 44

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института эволюционной физиологии и биохимии имени И.М.Сеченова РАН

Автореферат разослан

" МСЗМ 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

М.Н.Маслова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последнее время интерес к вопросам, связанным с существованием и функционированием нейропептидов, значительно возрос. Это связано как с открытием все новых и новых молекул нейропептидов, с возможностью предсказать существование того или иного пептида методами генетического анализа,так и с получением доказательств того, что ней-ропептиды играют ведущую роль в реализации процессов, происходящих в организме на межклеточном и внутриклеточном уровне. Этот интерес усиливается еще и тем, что благодаря разнообразным эффектам, параметры которых зачастую аналогичны характеристикам, свойственным молекулам классических мономолекулярных медиаторов, нейропептидам все чаще отводится роль медиаторов в определенных отделах нервной системы.

Кальцитонин ген-родственный пептид (КГРП) является характерным примером нейропептида, обладающего широким спектром действия и всеми отличительными особенностями, которые дают право причислить его к разряду пептидных регуляторов.

Установлено, что этот нейропептид содержится в нервных волокнах, ин-нервирующих сосуды (Hokfelt et al., 1992), постоянно находится в плазме крови (Samia et al., 1985), а, введенный в кровоток, наряду с другими эффектами вызывает сильное падение артериального давления за счет расширения артериальных сосудов (Brain S. D. et al., 1985; Fergus A. et al., 1991; Fergus A., et al., 1995 ). Однако, анализ литературных данных показывает, что регуляторная функция этого нейропептида на уровне микроциркуляторного русла изучена недостаточно. В микроциркуляторном русле существуют и взаимодействуют три отдела: кровеносный, лимфатический и интерстициальный, которые обеспечивают поддержание гомеостаза в каждом отдельном участке органа или ткани, поэтому микроциркуляторное русло является особым отделом сердечнососудистой системы, в котором реализуются основные функции крови (Куприянов и др., 1975)

Особый интерес представляло выяснение эффекта КГРП на лимфатические сосуды, поскольку в литературе последних лет наряду с обилием информации, посвященной действию КГРП на гладкомышечные клетки кровеносных сосудов (Miyoshi et al., 1995; Mentlein et al., 1996), органов гастроинтестиналь-ного тракта (Holzer et al., 1994; Hong et al., 1996),наблюдается практически полное отсутствие сведений о влиянии КГРП на гладкомышечные клетки лимфатических сосудов.

Несмотря на разнообразие эффектов, приписываемых молекуле КГРП,довольно мало известно о взаимосвязи между структурой и активностью в этой

молекуле. В настоящее время доподлинно известно, что только один фрагмент этого нейропептида - КГРП(8-37) проявляет довольно значительную биологическую активность, являясь антагонистом рецепторов КГРП (Мадд1 е1 а1., 1991; М'|теаи11 а1., 1991). Это довольно странно для такой длинной пептидной молекулы, поскольку в настоящее время общепризнанной является теория »каскадных реакций», когда из довольно длинных молекул нейропептидов в результате энзимного расщепления в организме могут образовываться более короткие биологически активные фрагменты. Причем, характер этой активности может не совпадать с эффектом полномерной молекулы. Отсюда возник наш интерес и к проблеме изучения структуры-активности в этой молекуле, с целью обнаружения более коротких активных фрагментов.

Цель и задачи исследования. Целью нашей работы явилось изучение влияния а-кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) человека и его фрагментов на сосуды микроциркуляторного русла. Исследования проводили на артериальных, венозных и лимфатических микрососудах брыжейки тонкой кишки крысы.

Для достижения этой цели мы поставили перед собой следующие задачи:

- провести анализ структуры-активности в молекуле а-КГРП человека;

- изучить влияние активных фрагментов, выявленных в результате структурного анализа на кровеносные сосуды микроциркуляторного ложа брыжейки;

- изучить влияние а-КГРП и его фрагментов, активных в опытах на кровеносных сосудах, на лимфатическое звено микроциркуляторного русла.

Научная новизна. Впервые мы показали, что фрагменты а-КГРП человека, расположенные в средней области молекулы между аминокислотами в положениях 20 и 29,обладают вазоактивными свойствами, снижая тонус кровеносных и увеличивая тонус лимфатических сосудов. Установлено, что а-КГРП обладает свойствами местного регулятора лимфатических сосудов микроциркуляторного русла и при этом усиливает лимфомоторику.

Научно-практическая значимость. Полученные данные способствуют расшифровке механизмов регуляции, осуществляемой молекулами регуляторных нейропептидов. Теоретические положения работы могут быть использованы при комплексном подходе к изучению микроциркуляции. Обнаружение более коротких, а следовательно, и более доступных для синтеза, активных фрагментов полномерной молекулы а-КГРП делает возможным их дальнейшее применении в фармакологии.

Апробация работы. Основные результаты, полученные в работе, были представлены на научных семинарах группы сравнительной физиологии микроциркуляции ИЭФБ им. И. М. Сеченова, на конференции »Артериальная ги-пертензия. Экспериментальные и клинические аспекты» (Санкт - Петербург, 1395), I (XI) Международном Совещании и Школе памяти Л.А.Орбели (Санкт -Петербург, 1996), Международной Конференции студентов и молодых исследователей »Актуальные проблемы патологии микроциркуляции» (Санкт -Петербург, 1996), на научном межлабораторном семинаре, посвященном исследованию функций регуляторных пептидов в Эразмском Университете (Роттердам, Голландия, 1997).

Диссертация апробирована на межлабораторном заседании секции экологической физиологии (Саню- -Петербург, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из обзора литературы, описания материала и методики исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 127 страницах машинописного текста, включая 29 рисунков . Указатель литературы содержит 226 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Реализация поставленных задач осуществлялась в условиях острого опыта на крысах - самцах линии Wistar, весом 180-200 г. В экспериментах было использовано 195 крыс. В экспериментах ¡n vivo за 25 мин до начала опытов крысы получали нембуталовый наркоз из расчета 20 мг/кг веса животного внутримышечно.

В опытах по изучению действия фрагментов а-КГРП - а-КГРП(1-9), -(1020), -(15-24), -(20-29) и (30-37) на артериальное давление производилась катетеризация бедренной вены для введения исследуемых препаратов, затем катетеризация бедренной артерии, после чего катетер, заполненный раствором гепарина, соединялся с тензорезисторным датчиком. Благодаря качеству мембраны, высокой чувствительности и линейности датчика было возможно с большой точностью измерять систолическое и диастолическое давление у крыс.

Действие исследуемых препаратов на сосуды микроциркуляторного русла брыжейки тонкой кишки крысы изучалось методом витальной телевизионной микроскопии. Установка была разработана ранее в нашей лаборатории (Балашов и др, 1982) и основана на изучении поведения микрососудов в проходящем свете. Для освещения объекта использовался волоконный осветитель со стабильным источником света и возможностью регулировать освещенность объекта в широком диапазоне. Увеличенное оптическое изображение исследуемого участка микрососуда проецировалось с помощью оптического микроскопа на мишень передающей телевизионной трубки. Оптическое изображение исследуемого объекта воспринималось передающей телевизионной камерой и преобразовывалось в электрический видеосигнал, который поступал на видеоконтрольное устройство (ВКУ) и видеомагнитофон.

Таким образом, мы имели возможность наблюдать за ходом эксперимента на экране ВКУ и записывать его течение на видеокассету. В случае, когда исследуемые параметры оценивались в ходе эксперимента, телевизионная камера подключалась к компьютеру. В этом варианте опыта аналоговый сигнал, поступающий с ТВ камеры, с помощью установленного в компьютере фрэйм-грабера (»frame-graber») переводился в цифровой, а обработанное компьютером изображение выводилось на монитор ВКУ. В дальнейшем все измерения и преобразования параметров производились именно с таким изображением с использованием специальной программы, разработанной в НИИ Телевидения. Аналогичным образом производился анализ резупьтатов после проведения

эксперимента, за исключением того, что аналоговый сигнал поступал в компьютер с видеомагнитофона.

С целью поддержания оптимального температурного режима исследуемого органа при проведении этих экспериментов мы использовали систему тер-мостатирования биологических объектов, разработанную ранее в нашей лаборатории (Балашов и др.1989). Она предназначена для прижизненного изучения параметров крово- и лифотока в микроциркуляторном русле брыжейки в проходящем свете. Система состоит из; 1) столика с подогревом животного и ванночки для изучаемого органа; 2) электронного термостабилизатора.

Фрагменты а-КГРП человека - а-КГРП (20-29), -(22-29), -(23-29), -(24-29), -(21-24) и -(21-31) апплицировались на поверхность брыжейки в концентраци-ии 1 мкмоль со скоростью 1мл/10мин. а-КГРП человека апплицировался на поверхность брыжейки в концентрациях 1 нмоль, 10 нмоль и 100 нмоль с той же скоростью.

Для проведении опытов in vitro нами был выбран метод измерения сокращений фрагмента лимфатического сосуда в изометрических условиях.

Органокомплекс грудной клетки выделялся и отпрепаровывался без нарушения целостности кровеносных и лимфатических магистралей (методика выделения лимфангиона разработана на кафедре нормальной физиологии СПб Санитарно-Гигиенического Медицинского Института). Грудной лимфатический проток выделялся на максимальном протяжении в грудном отделе, перевязывался дистально и проксимально и пресекался.в пределах одного лимфангиона.

Изолированные лимфангионы, наполненные лимфой под естественным давлением и перевязанные с двух концов, в течение 30 мин инкубировались s ванночке, размером 3x3 см2, в стабильных условиях эксперимента: натяжение препарата, проточный термостатируемый при 38° С оксигенерируемый (95 % Ог + 5 % С02) раствор Кребса ( NaCI - 8 r, KCI - 0,2 г, NaHC03 - 1 г, NaH2P04 -0,06 г, 10 % СаС1г - 0,2 мл, 40 % глюкоза - 0,12 мл, MgCI2 - 0,004 мл). После этого приступали к регистрации ритмической активности в контроле и в условиях воздействия исследуемого препарата а-КГРП (100 нмоль и 0,1 мкмоль), которая производилась с помощью механотрона 6МХ1Б, используемого в качестве датчика силы, усилителя и самописца типа Н-327.

Статистическую обработку данных, полученных во всех экспериментах, производили параметрическим методом, используя оценку значимости различия показателей по t-критерию в независимых выборках. При анализе результатов исследования различие показателей считали значимым при р<0,05.

Пространственную ориентацию изучаемых фрагментов оценивали при помощи программы информационного анализа »Алхимия».

Все изучаемые фрагменты были синтезированы в Лаборатории химии биологически активных веществ (зав. лаб., д. х. н. Г. П. Власов) Института Высокомолекулярных Соеденений РАН. а-КГРП человека был произведен фирмой »Sigma».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В соответствии с задачей исследования структуры-активности в молекуле а-КГРП человека в первой серии экспериментов мы исследовали влияние фрагментов а-КГРП(1-9), -(10-20), -(15-24), -(20-29) и -(30-37) на артериальное давление. Показателем активности фрагментов служила регистирируемая величина систолического давления. В контрольных опытах было показано, что физиологический раствор, введенный в объемах аналогичных растворенным препаратам (0,3-0,5 мл), практически не влияет на артериальное давление. Систолическое артериальное давление у разных животных до введения препаратов регистрировалось в пределах от 85 до 110 мм рт.ст.

Фрагменты были выбраны нами на основании существующих в литературе данных о структуре молекулы КГРП (Lynch et al., 1983; Jasbirrr et al., 1991; Boulanger- et al., 1995). Интегрируя выводы разных авторов, можно представить структуру этой молекулы следующим образом. Между Cys в положениях 2 и 7 располагается дисульфидный мостик, область между аминокислотами в положениях 8-18 (а по некоторым данным 8-16) свернута в a-спираль, которая заканчивается неспецифическим витком (которым может быть p-структура) в районе 18-23, причем большим потенциалом для образования этой структуры обладают аминокислоты Ser19-Gly21. Естественно, что a-спираль характеризуется большим колличеством водородных связей. Структура молекулы в промежутке от Giy 21 до Pro 29 гораздо менее охарактеризована. Зато известно, что аминокислоты Asn 31 - Val 32 - Gly 33 вновь образуют (5-виток. Предполагается, что концевой Phe 37 образует связь с Thr 30 с образованием в этой части молекулы конформации типа петли. Возможно, что перечисленные выше изгибы молекулы служат для более компактного расположения КГРП в области рецептора и ,тем самым, способствуют проявлению значительного эффекта.

Из всех исследуемых фрагментов наиболее активными оказались а-КГРП(15-24) и -(20-29). а-КГРП (1-9) и -(30-37) практически не вызывали снижения величины систолического давления, даже при использовании максимальной концентрации 6 мг/кг. а-КГРП(10-20) в концентрации Змг/кг вызывал незначимое снижение систолического давления в 40% случаев. а-КГРП(15-24)

вызывал значимое падение давления на 15-20 мм рт.ст. в дозе 3 мг/кг, Максимум падения давления достигался через 30 - 40 сек, затем давление начинало восстанавливаться и возвращалось к норме через 10-15 мин. а-КГРП(20-29) в концентрации 1 мг/кг снижал уровень систолического давления на 10 мм рт.ст. Введение же дозы 2 мг/кг приводило к снижению давления на 30-40 мм рт.ст., которое было достаточно длительным. Давление возвращалось к норме через 25-40 мин. У одной из крыс давление к норме не вернулось, и она погибла через 25 мин на фоне резкого падения давления. Отсутствие какой-либо активности у коротких N- и С-концевых КГРП(1-9) и КГРП (30-37) вполне согласуется с многочисленными литературными данными, говорящимии либо о полном отсутствии, либо о незначительной агонистической активности различных, небольших по длине, М- и С-концевых фрагментов и аналогов КГРП. Конечно, ни один из вышеперечисленных активных фрагментов не может сравниться с полномерной молекулой, которая способна вызывать вызодилятацию и снижать кровеносное давление в концентрациях 15 фмоль - 15 пмоль при подкожном введении (Brain et al, 1985). Таким образом, в наших экспериментах а-КГРП(20-29) оказался самым активным в опытах по снижению артериального давления, и эффект его носил дозозависимый характер. Так как а-КГРП(20-29) оказался наиболее активным в экспериментах по изменению артериального давления, мы решили исследовать его эффект на сосудах микроциркуляторного русла. Микроциркуляция представляет собой один из важнейших интегрирующих процессов, благодаря которому все части организма находятся в постоянном взаимном коррелировании, обслуживая друг друга и обеспечивая системе организма оптимальные условия жизнедеятельности (Куприянов и др., 1975). Однако, система микроциркуляции не сводится к механической сумме всех компонентов, а выделяется как единство взаимодействующих элементов, воплощенное вместе с их связями в специальной структуре. На этом основании в систему микроциркуляции включаются кроме микрососудов кровеносного русла, тканевые жидкости и лимфоносные пути микроскопического уровня, посредством которых осуществляется транспорт биологических жидкостей. Транспортные феномены на уровне микроциркуляции имеют прямое отношение к поддержанию водного баланса тканей и их локальной температуре; им же принадлежит немаловажная роль и в поддержании специальных видов тканевого гомеостаза.

В этой серии опытов показателем активности а-КГРП(20-29) была степень изменения просвета в опытах на кровенносных и лимфатических сосудов; частота сокращений в минуту, средняя длительность сокращений и пауз - в опытах на лимфатических сосудах; Препарат, растворенный в физиологическом растворе из расчета 1 мкмоль/мл,наносился на наружную поверхность брыжейки

микроинъектором со скоростью 1мл/10мин.

Аппликация а-КГРП(20-29) на поверхность микрососудов брыжейки крысы приводила к расширению артериол (25-35мкм) и венул (35-45 мкм). Артериолы расширялись в 90% случаев на 23,9 + 3,6%. Венулы расширялись в 60% случаев, и это расширение составляло 33,4 + 4,6%. Эффект появлялся в течение первой минуты после начала аппликации и исчезал в течение одной-двух минут по прекращении воздействия.

Большая частота расширения артериол по сравнению с венами, очевидно, связана с большей плотностью КГРЛ-содержащих нервных волокон вокруг артерий по сравнению с КГРЛ-иннервацией вен (исИтап е1 а1, 1985). В частности, мезентериальные артерии, особенно верхняя мезентериальная артерия, получают богатую иннервацию КГРП-содержащими волокнами (Но!гег е{ а1, 1992). Эти же авторы отмечают, что по направлению к артериолам сеть КГРП-содержащих аксонов становится менее плотной, что также справедливо и для иннервации венул.

Возможно, большая степень дилятации венул по сравнению с артериола-ми связана с различиями в строении их сосудистой стенки, обусловленными особенностью функционирования артериол и венул. Известно, что суммарное сопротивление кровотоку в артериях и артериолах составляет около 80% общего периферического сопротивления {Яепкт е1 а1, 1965). Остальные 20% приходятся на венулы, которые конторолируют кровоток в значительно меньшей степени. Основная же функция венул - емкостная. Отсюда возникают и различия в строении гладкомышечного слоя этих микрососудов. Большое колличество миоцитов с высоким содержанием сократительных элементов - миофиламен-тов и определенное спиральное расположение миоцитов придают стенке артериол необходимую упругость, которая не характерна для стенки венуп с меньшим содержанием миоцитов, отличающихся скудным развитием миофи-ламентов, и беспорядочной ориентацией самих миоцитов по отношению к длиннику сосуда (Куприянов и др. 1975).

<х-КГРП(20-29), действуя на спонтанно сокращающиеся лимфатические микрососуды (50 -75 мкм), вызывал сужение просвета сосуда на 21,4 ± 2,7 %, увеличение частоты сокращений за мин в 4-5 раз, снижение средней длительности сокращений на 32,2 ± 5,4 % и снижение общей длительности пауз на 61,6 ±6,6% в 80% экспериментов, Все изменения были значимы. Также, как и в опытах на кровеносных сосудах,эффект появлялся в течение одной минуты от начала воздействия и исчезал в течение одной-двух минут после прекращении аппликации.

Для того, чтобы проверить этот эффект, мы предприняли серию опытов с а-КГРП(20-29), его фрагментами разной длины и а-КГРП(21-31) на лимфатиче-

ских сосудах с диаметром от 150-350 мкм сосудистого ложа брыжейки крысы. Препараты в концентрации 1 мкмоль растворялись в физиологическом растворе из расчета 1мшоль/мя и апплицировались на поверхность брыжейки из микроинъектора также со скоростью 1 мл/10 мин.

Изучаемые сосуды располагались на периферии »прозрачного окна» на границе с жировой тканью брыжейки. Мы проводили свои исследования на этих сосудах, так как они легкодоступны и обладают умеренно выраженной активностью; в них периодически возникают спонтанные сокращения стенки и, реже, клапанная активность.

Существует три основные формы активности лимфатических сосудов: фазные ритмические сокращения, медленные волны и тонические сокращения. Во многих работах, посвященных исследованию лимфомоторики, главным образом рассматриваются фазные и тонические сокращения.

По результам нашего исследования можно сказать, что за исключением а-КГРП(21-31) все фрагменты оказывали влияние, стимулирующее моторику лимфатических сосудов. По степени стимулирующего воздействия, показателем которого может быть длительность пауз между фазными сокращениями, можно выделить две группы препаратов.

Первая включает в себя фрагменты а-КГРП(20-29) и а-КГРП(24-29). Их аппликация на спонтанно сокращающийся сосуд в большинстве случаев приводила к немедленному усилению фазных сокращений, которое заключалось в уменьшение средней длительности пауз на 66,5 ± 4,9%, в увеличении частоты сокращений в минуту на 90, 5 + 11,7% и уменьшении средней длительности сокращений на 11,8 ± 1,0% по сравнению с исходным уровнем в случае а-КГРП(20-29); при действии а-КГРП{24-29) происходило уменьшение средней длительности сокращений на 40,1 ± 2,2%, уменьшение средней длительности пауз на 75,0 ± 4,4 %, увеличение частоты сокращений в минуту более, чем в два раза по сравнению с исходным уровнем. Эффект длился все время аппликации и исчезал при ее прекращении. Такая кратковременность действия согласуется с положением о том, что часть малых пептидов, состоящих из 2-8 аминокислотных остатков, имеет сроки полураспада до 10 мин (Ашмарин и др., 1988). Воздействие приводило к сужению сосудов на 14,1 ± 3,4% в случае с а-КГРП (20-29) и на 13,1 ± 2,0% в случае с а-КГРП (24-29), что являлось косвенным свидетельством усиления тонуса сосудов. Амплитуда сокращений во время воздействия а-КГРП(20-29) и а-КГРП(24-29) уменьшалась на 53,4% и 52,4% соответственно, что также может служить косвенным свидетельством усиления тонуса, так как известно, что при сочетании двух форм моторики повышение тонуса приводит к уменьшению амплитуды фазных сокращений (Орлов и др., 1976). Образно говоря, действие этих наиболее активных фраг-

К)

ментов КГРП приводило к тому, что сокращения сосуда в единицу времени становились более частыми, но менее глубокими как по размаху амплитуды,так и по длительности, и происходили они на фоне незначительно увеличенного тонуса сосуда.

Действие этих фрагментов в тех же концентрациях на спонтанно не сокращающиеся сосуды приводило к появлению фазных сокращений во всех опытах в случае а-КГРП(20-29) и в 70% опытах с а-КГРП(24-29). В этих экспериментах.диаметр сосудов не изменялся, на основании чего можно предположить, что либо тонические сокращения не вызываются аппликацией этих фрагментов,либо концентрация их слишком мала для появления тонических сокращений у изначально молчащего сосуда, так как известно, что тонический пул миоцитов.лимфангиона включается в сократительные ответы лишь при раздражении серией импульсов с параметрами значительно большими, чем для фазного.

Вторая группа препаратов была менее активной при действии на спонтанно активные сосуды, причем, наименьшей активностью среди них обладал а-КГРП(21-24). Эффекты двух оставшихся препаратов по характеру напоминали эффекты, вызванные действием сс-КГРП(20-29) и -(24-29): средняя длительность пауз уменьшалась, частота сокращений в минуту увеличивалась, средняя длительность сокращений либо незначительно увеличивалсь (как в случае а-КГРП(22-29)),либо примерно на 20% уменьшалась (как в случае фрагмента а-КГРП(23-29)). Эти фрагменты вызывали некоторую вазоконстрикцию, лишь в случае с а-КГРП(21-24), это уменьшение диаметра было совсем незначительным. Эффект также наступал сразу от начала аппликации и исчезал в течение одной-двух минут после ее прекращения. Таким образом, и эти фрагменты стимулировали лимфатическую активность спонтанно сокращающихся сосудов. На спонтанно несокращающиеся сосуды эти фрагменты в подавляющем большинстве случаев не действовали.

Необходимо отметить, что в случае обеих выделенных нами групп препаратов возбуждение начиналось в дистальном отделе лимфангиона и распространялось в проксимальном направлении, наиболее интенсивно сосуд сокращался в средней части лимфангиона, как раз в области »мышечной манжетки». И хотя специальных измерений мы не проводили, нодем не менее, по косвенным показателям нами было отмечено усиление лимфотока, которое сопровождало активацию моторики сосуда. Лимфоток усиливался примерно в 2 раза в случае действия фрагментов первой группы и более, чем в 1,5 раза во время действия препаратов второй группы. Усиление моторики лимфатических сосудов также активизировало работу клапанов.

Как упоминалось выше, только один фрагмент - а-КГРП(21-31) - несколько

угнетал моторику спонтанно сокращающихся лимфатических сосудов: увеличивая среднюю длительность сокращений на 12,3 ± 6,2%, он вызывал увеличение средней длительности пауз на 78,9 ± 7,2% и уменьшение частоты сокращений на 30,5 ± 5,5% в минуту. Диаметр сосуда во время воздействия не менялся. Мы считаем, что подобное распределение активности между изученными фрагментами можно объяснить их пространственной организацией. При сопоставлении низкоэнергетических конформаций всех изученных фрагментов нам удалось установить, что наиболее сходным образом ориентированы в пространстве молекулы а-КГРП(20-29) и а-КГРП(24-29) (их относительный коэффициент подобия составил 0,280), наименьшее пространственное сходство наблюдается в случае молекул сс-КГРП(20-29) и а-КГРП(21-31), что полностью согласуется с нашими результатами, полученными при рассмотрении биологической активности. Возможно, что фармакофор изученных фрагментов включает в себя аминокислотны Phe 27, Val 28 и Pro 30, так как при наложение низкоэнергетических конформаций а-КГРП(20-29), -(22-29), -(23-29) и -(24-29) оказалось, что ориентация бензольного кольца Phe, боковая алифатическая цепь Val и пяти-членный цикл Pro совпадают с ориентацией аналогичных структур в сравниваемых фрагментах. Так, например, расстояние в пространстве между углеро-дами в положении 1 бензольного кольца Phe молекул а-КГРП(20-29) и -(24-29) составляет 2,ЗЕ. Торсионный угол вокруг пептидной связи Phe 27 и Val 28 составляет 176,8° для а-КГРП(20-29) и 167,3° для а-КГРП(24-29). Возможно, именно такая пространственная ориентация обеспечивает необходимую для взаимодействия с рецептором комплиментарность. Можно представить себе, что добавление пространственно разветвленных аминокислотных остатков Thr 30 и Asn 31 нарушает эту комплементарность: расстояние в пространстве между С, бензольного кольца Phe молекул а-КГРП(20-29) и -(21-31) составляет 5,5 Е, торсионный угол вокруг аналогичной пептидной связи в молекуле а-КГРП(21-31) равен 17,8°. О важности аминокислотных остатков в положениях 27 - 29 говорит и тот факт, что а-КГРП(21-24) практически лишен биологической активности.

Одной из основных задач нашей работы было исследовать эффект молекулы а-КГРП человека на лимфатические сосуды.

Препарат а-КГРП, предварительно растворенный в физиологическом растворе из расчета 1 нмоль/мл, либо 10 нмоль/мл, либо 100 нмоль/мл, апплици-ровался на поверхность брыжейки микроинъектором со скоростью 1мл/10 мин.

Если сравнивать эффект КГРП с эффектами рассмотренных фрагментов, то по степени своего воздействия на спонтанно сокращающийся сосуд КГРП относится, скорее, к группе умеренно действующих фрагментов. Эффект КГРП был дозозависимым, как и в опытах на кровеносных сосудах, описанных в ли-

тературе. В наших опытах при использовании КГРП в концентрации 1нмоль/мл и 10 нмоль/мл достоверного эффекта не наблюдалось, он появлялся только при использовании концентрации 100 нмоль. Возможно, это связано с разными объектами исследования, а возможно, с тем, что мы использовали метод аппликации фрагмента на поверхность сосуда. Ввиду того, что лимфатические сосуды быстро реагируют на любое воздействие, будь то незначительное растяжение препарата, небольшое повышение температуры, падение капель орошаемого раствора и т.д., изменением характера своего сокращения или полным прекращением ритмической активности, мы избрали мягкий способ аппликации, когда орошаемый раствор по микрофитилю поступал на отдаленные от изучаемого сосуда участки данного поля брыжейки, а затем медленно перетекал по поверхности брыжейки.

Во всех опытах а-КГРП (100 нмоль/мл) стимулировал моторику лимфатического сосуда. Латентный период составлял 1-3 мин, и нарастание эффекта было постепенным, он сохранялся на протяжении всего периода воздействия и после прекращения воздействия еще, как минимум, 10 мин. Такой характер поведения, в общем, характерен для действия довольно длинных молекул нейро-пептидов, отличающихся меньшей скоростью деградации, которая сочетается с низкой скоростью диффузии и рассеиванием части пептидов ( Ашмарин и др., 1988).

И так, в самом начале аппликации полномерной молекулы а-КГРП значимых изменений показателей активности лимфатических сосудов не происходило. Затем, они изменялись следующим образом: средняя длительность сокращений уменьшалась на 19,5 ± 1,5%, средняя длительность пауз уменьшалась на 48,2 ± 4,2%, а частота сокращений в минуту увеличивалась на 50 ± 4,8%. То есть , аппликация а-КГРП приводит к усилению фазных сокращений. Во время воздействия происходит сужение сосуда на 21,5 г 1,2% и на 9,1 + 2,8% через 10 мин после прекращения воздействия. Таким образом, а-КГРП усиливает тонус лимфатических сосудов, хотя колличественно его эффект не сравним с тем, который возникает при снижении тонуса кровеносных сосудов. Во время воздействия-мы наблюдали усиление лимфотока в 1,5 раза, но через некоторое время после прекращения воздействия он возвращался к исходному уровню. Также, мы наблюдали усиление работы клапанов, но оно было не синхронизировано с работой стенок, которые сокращались с частотой от 10 до 22 в мин, что не является максимально большой частотой сокращений. Как и в случае опытов с фрагментами, возбуждение распространялось в направлении от проксимального к дистапьному концу лимфангиона и было наиболее интенсивном в его средней части. Через некоторое время после прекращения воздействия все перечисленные выше показатели возвращались к норме.

Действие а-КГРП на спонтанно неактивные сосуды в более, чем половине случаев вызывало появление фазных сокращений с аналогичными параметрами, эффект его на диаметр сосуда был также вазоконстрикторным. То есть, а-КГРП усиливает моторику лимфатического сосуда, увеличивая его насосную функцию.

Таким образом, и эффект а-КГРП и эффект а-КГРП(20-29) на лимфатических сосудах отличаются от эффектов этих препаратов на кровеносных сосудах. Это различие может быть связано как с морфологическими и функциональными особенностями кровеносных и лимфатических сосудов,так и с множественностью форм комплекса лиганд - рецептор - й- белок.

Для того, чтобы подтвердить прямое влияние КГРП и для того, чтобы выяснить изменяется ли тонус сосуда при его воздействии,нами была предпринята серия опытов на изолированном лимфангионе грудного отдела грудного протока крысы.

Препарат а-КГРП растворялся в физиологическом растворе и в концентрациях 100 нмоль и 1 мкмоль впрыскивался в ванночку с выделенным лим-фангионом грудного отдела грудного протока крысы. Основным показателем активности действия этого препарата была величина амплитуды тонических сокращений.

Термин »лимфангион» уже несколько лет употребляется в литературе, посвященной исследованию лимфатических сосудов, и обозначает клапанный сегмент - т. е. часть лимфатического сосуда между двумя клапанами. Лимфангион явяляется структурно-функциональной единицей лимфатического сосуда, для которой характерны основные закономерности поведения данного лимфатического сосуда (Орлов и др, 1983). Так как нас интересовало влияние КГРП на колебания тонуса, мы выбрали грудной отдел грудного протока крысы, для которого характерна лишь эта одна форма сократительной активности.

Действие а-КГРП в концентрации 100 нмоль на обладающий тонической активностью лимфангион вызывало слабую потенциацию тонического ответа, характеризовавшегося медленным нарастанием сокращения, которое появлялось спустя 3-4 мин после начала воздействия. Амплитуда сокращений изменялась либо незначительно по сравнению с исходной ( 6,2 ± 1,0% ), либо практически не изменялась (1,5 ± 0,5%). Ответ продолжался все время воздействия и исчезал сразу при прекращении последнего.

Действие а-КГРП в концентрации 1 мкмоль на обладающий самостоятельной тонической активностью лимфангион вызывало более заметную потенциацию тонических ответов: латентный период составлял 1-2 мин, кривая регистрации нарастающего сокращения была более крутой (угол составлял 53° ± 1°). Изменения амплитуды сокращений позволяют выделить четыре группы экспе-

1-1

риментов, в которых амплитуда тонических сокращений составляла 11,1 ± 1,3%, 15,4 ± 1,4%, 24,2 ± 2,0% и 32,3 ± 2,8% от исходной соответственно. Ответ продолжался в течение 1-2 мин после прекращения воздействия.

На основании этого можно предположить, что а-КГРП в довольно высокой концентрации влияет на колебания тонуса лимфатического сосуда и тем самым может регулировать емкостную функцию. Однако, аппликация КГРП на спонтанно-несокращающийся лимфангион никак не меняла первоначального тонуса сосуда.

На основании полученных и рассмотренных нами результатов мы можем заключить следующее. Воздействие а-КГРП в биологически активных концентрациях приводит к положительному хронотропному эффекту и к менее заметному инотропному, что, в свою очередь ведет к усилению насосной функции и уменьшению емкостной. Можно предположить, что в эндогенных условиях, когда по тем или иным причинам происходит повышение давления лимфатической жидкости внутри сосуда, под воздействием а-КГРП происходит усиление фазной моторики стенки лимфатического сосуда, что приводит к скорейшему перекачиванию жидкости из данного участка. А некоторая вазоконстрикция ведет к уменьшению емкостной функции данного участка и способствует уменьшению его наполнения, во всяком случае до тех пор, пока отток лимфы из этого участка не приведет к понижению давления до нормального уровня. Таким образом, а-КГРП ведет себя как местный регулятор активности лимфатических сосудов. Говорить о регуляторной активности а-КГРП в данном случае становится возможным на основании морфологических исследований БассЫ с соавторами (ЭассЬ1 е! а1, 1994), которые изучали распределение нервных волокон в стенке брыжеечных лимфатических сосудов. По их данным, нервные волокна иннервируют стенку лимфатических сосудов довольно глубоко - многочисленные волокна проникают не только в медию, но и обнаруживаются на субзндо-телиальном уровне. Авторы обнаружили в субэндотелиальной соединительной ткани КГРП- и вещество Р - иммунно- реактивные волокна. Они предполагают, что эти волокна способны действовать как механоцепторы и реагировать на повышение интрамурального давления высвобождением этих пептидных ней-ромедиаторов.

Таким образом, действуя на лимфатические сосуды при определенных изменившихся условиях,а-КГРП участвует в неком компенсаторном процессе, направленном на сохранение сосудами оптимального состояния для продолжения нормальной деятельности.

Приведенные выше данные и рассуждения дают нам основание считать, что фрагменты молекулы а-КГРП, расположенные между аминокислотами в положениях 20 и 29,обладают некоторой вазоактивностью, которая в опытах на

лимфатических сосудах брыжейки крысы заключается в усилении ими лимфо-стимулирующей активности. Причем, действие а-КГРП(20-29) и -(24-29) более ярко выражено, чем действие самой молекулы КГРП, что является еще одним подтверждением теории »каскадных процессов», свойственных для длинных молекул нейропептидов, Наличие же некоторого вазоконстрикторного эффекта самого а-КГРП на лимфатических сосудах - это еще одно из многих проявление разноплановых возможностей молекулы КГРП, что, очевидно, связано с эволюционном консерватизмом этого нейропептида.

ВЫВОДЫ

1. Исследование влияния фрагментов а-КГРП человека на артериальное давление и на сосуды микроциркуляторного русла брыжейки тонкой кишки крыс показало, что участок молекулы а-КГРП, заключенный в области между аминокислотами Gly 20 и Pro 29, является возможным носителем вазоактивно-сти в этой молекуле.

2. а-КГРП и его фрагмент (20-29) принимают участие в регуляции микроциркуляторного русла, вызывая расширение кровеносных и сужение лимфатических сосудов.

3. а-КГРП человека обладает свойствами местного регулятора активности лимфатических сосудов, стимулируя лимфомоторику посредством ослабления емкостной и усиления насосной функции.

4. Проявление большинством исследованных фрагментов а-КГРП, заключенных в средней части молекулы биологической активности, подтверждает теорию »каскадных реакций», характерных для длинных молекул нейропептидов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 . Акопян В. А., Балашов Н. В., Буров С. В., Власов Г. П. Сосудорасширяющий эффект некоторых фрагментов кальцитонин ген-родственного пептида у крыс,// Тез, докл. конференции »Артериальная гипертензия Экспериментальные и клинические аспекты». Санкт - Петербург. 30 мая-1июня 1995 г. с. 4.

2. Акопян В. А., Балашов Н. В., Буров С. В., Власов Г. П., Корольков В. И.

О роли фрагментов кальцитонин ген-родственного пептида в регуляции микроциркуляции у крыс // Физ. Журнал. 1995. Т. 81. № 6. с. 59-65.

3. Акопян В. А, Роль фрагментов КГРП в регуляции микроциркуляции // Тез. конференции молодых физиологов и биохимиков России »Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций». Санкт - Петербург. 19-21 сентября 1995. с. 7.

4. Balashov N., Akopian V., Burov S., Vlasov G. Biological activity of the calci-tonine some fragments // Abstract of the 25th Annual Meeting of the Society for Neuroscience. San Diego. Nov.11-16 1995. P. 1602.

5. Акопян В. А., Балашов H. В. Роль фрагментов кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) в регуляции микроциркуляции // Тез. I (XI) Международного Совещания и Школы памяти Орбели. 22-26 Апреля 1996, с. 8.

6. Akopian V. Role of some fragments of calcitonin gene-related peptide (CGRP) in regulation of microcirculation // Abstract of the Conference of Students and young scientists »Actual problems of microcirculation pathophysiology». St. Petersburg. July 1-4 1995. P. 23-25

7. Balashov N. V., Akopian V. A., Burov S. V., Vlasov G. P. Effect of rat calcitonin gene-related peptide (20-29) on regulation of microcirculation // Abstract of the 26th Annual Meeting of the Society for Neuroscience. Nov.16-21 1996. P.2001

8. Balashov N. V., Akopian V. A. Effect of CGRP and CGRP(20-29) on regulation of microcirculation // Abstract of the XXXIII Int. Congress of Physiol. Sci., St.Petersburg. June 30 - July 5 1997. P. 061.02

9. Balashov N. V., Akopian V. A. Effect of calcitonin gene-related peptide on the

lymphatic vessels in the experiment in vitro 11 Abstract of the 27th Annual Meeting of the Society for Neuroscience. New Orleans. Oct. 25-30 19Э7. P.56.21.

10. Акопян В. А., Балашов H. В., Ханипов Г. Ф. Влияние кальцитонин ген-родственного пептида (КГРП) на лимфатические сосуды // Жур. Эзол. Био-хим. Физиол.(принято к печати в 1998 году)

11. Акопян В. А , Балашов Н. В., Буров С. В., Власов Г. П. Вазоактивные свойства некоторых фрагментов а-КГРП человека // Физиол. Жур. (принято к печати в 1998 году).

АЭ СКВ "Индикатор". 3ax.ZHi Сир.ЮО Экз. Те,-. 2 52-4 6-66 .