Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций лимфоидной ткани, биологических жидкостей и капиллярно-венозной проницаемости

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Роль капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций лимфоидной ткани, биологических жидкостей и капиллярно-венозной проницаемости"

ц

На правах рукописи

□03064087'

ЖУКОВА Елена Михайловна

РОЛЬ КАПСАИЦИН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НЕЙРОНОВ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНЫХ РЕАКЦИЙ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ, БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЕЙ И КАПИЛЛЯРНО-ВЕНОЗНОЙ ПРОНИЦАЕМОСТИ

03 00 13 - физиология 03 00 25- гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

ТОМСК 2007

003064087

Работа выполнена в ГУ НИИ физиологии Сибирского отделения Российской Академии медицинских наук, г Новосибирск

Научный консультант доктор медицинских наук, профессор

Логвинов Сергей Валентинович, профессор, зав кафедры анатомии, гистологии,

эмбриологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор

Правоторов Георгий Васильевич, профессор кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии Новосибирского государственного Медицинского университета МЗ РФ доктор биологических наук, профессор

Большаков Михаил Алексеевич, профессор кафедры физиологии Томского государственного университета доктор биологических наук, профессор

Замощина Татьяна Алексеевна, профессор, зав кафедры фармакологии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава

Ведущая организация Институт физиологии им ИП Павлова РАН, 199034, Санкт-Петербург, набережная Макарова, 6

Защита состоится «г/ - 2007 г в / О ч на заседании

диссертационного совета Д 208 096 01 при ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (634050, г Томск, Московский тракт, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава по адресу г Томск, проспект Ленина, 107

Автореферат разослан " " 2007 г

Ученый секретарь

диссертационного совета

Суханова Г А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Роль нервной системы в регуляции периферических гомеостатических процессов изучается в течение длительного времени Новый аспект этих исследований - выявление физиологической роли первичных сенсорных нейронов, которые составляют афферентное звено центральной нервной системы [Beitran J et al, 2007, Tang L, 2007] Чувствительные нейроны не только передают в головной мозг информацию о действии физических и химических факторов, но и оказывают локальные эффекты на периферии, механизмы которых не определены [Albutaihi I et al, 2004, Demirbilek S et al, 2004, Lo Y et al, 2005] При решении этой актуальной проблемы современной физиологии получены новые доказательства проявления эфферентной функции заднекорешковых нервов на периферии, в частности, в контроле капиллярно-венозной проницаемости, регуляции структурного гомеостаза и клеточных реакций в лимфоидных органах, крови и биологических жидкостях Впервые экспериментально доказано наличие центральной регуляции над реализацией влияний чувствительных нейронов спинальных ганглиев Этому способствовало применение сочетания классических методов невротомии с модифицированной экспериментальной моделью фармакологической деафферентации капсаицином

Хирургическая невротомия (дорзальная ризитомия, иссечение спинномозговых узлов, перерезка седалищного, блуждающего нервов) не позволяет исключать эффекты оперативного вмешательства и проводить чистую деафферентацию, так как все периферические нервные стволы смешанные Анализ результатов острых опытов приводил к нечеткой, а порой, и не правильной трактовке наблюдаемых изменений [George F, Sampol J, 1994, Абдуллаев М С, Маметова Е Г, 2000] Решению проблемы способствовало выявление медиаторов первичных сенсорных нейронов - нейропептидов группы тахикининов - вещества П и кальцитонин-ген-родственного пептида - КГРП [Марр et al, 1990, Nagy I, Rang H, 1999] и доказательство их селективной чувствительности к растительному алкалоиду капсаицину [Geppetti et al, 1988] Действие капсаицина зависит от дозы Инъекции нейротоксических доз (более 200 мг/кг) приводят к значительному повреждению сомы этих нейронов [Arbuckle J , Docherty R, 1995, Румянцева T А, Шилкин В В, 2001] и атрофии тонких немиелизированных волокон С- и А-типа [Vizzard М et al, 1995] Одновременно снижается порог восприимчивости термочувствительных рецепторов [Lu Z et al, 1990, Malberg H et al, 2004], в тканях развивается нейродистрофический процесс с наиболее выраженным повреждением капилляров и вен [Anand Р, 2003, Chen S et al, 2007]

Подкожная инъекция минимальной нейротоксической дозы капсаицина (150 мг/кг) вызывает выделение медиаторов (нейропептидов) из окончаний КЧН одновременно в коже и висцеральных органах Полагают, что эффект реализуется по механизму аксон - рефлекса [Scardina G et al, 2006] и проявляется, прежде всего, в органах, имеющих прямую (без переключения в интрамуральных ганглиях) иннервацию от КЧН Лимфоидная ткань и кожа содержат наибольшее число окончаний первичных нейронов спинальных ганглиев, поступающих сюда без переключения [Elfvin L et al, 1993, Feiten D et al, 1993] Клетки подкожной соединительной и лимфоидной тканей, крови и биологических жидкостей, связанные в единую систему вследствие процессов циркуляции и рециркуляции,

имеют NK- и ваниллоидные рецепторы к нейропептидам и капсаицину [Donnerer J et al, 2004] Тимус по плотности иммунореактивности к нейропептидам уступает только головному мозгу [Jurjus А et al, 1998], в нем иммунореактивные к веществу П волокна связаны с сосудами капсулы и перегородок [Atoji J et al, 1997], а в медуллярной зоне лежат свободно между ОХ-8+-тимоцитами и тканевыми базофилами [Lorton D et al, 1990] Интенсивное рецепторное связывание вещества П в тимусе снижается после неонатальной обработки капсаицином [Santoni G et al, 2000] Сенсорную иннервацию селезенки обеспечивают волокна спинномозговых ганглиев уровня Д6-Д10, которые не переключаются в интрамуральных ганглиях Прямую чувствительную иннервацию получают синовий и подколенные лимфатические узлы [Бородин ЮИ и др, 1990] Получены данные о влиянии медиаторов КЧН на функциональную активность клеток иммунной защиты, в частности, на выработку цитокинов [Savmo W, Dardenne N, 2000, Santoni G et al, 2003] Капсаицин-чувствительные нейроны (КЧН) генерируют импульсные и градуальные сигналы, что принципиально позволяет им выполнять двойную афферентно-эфферентную функцию передавать сигнальную информацию в ЦНС и оказывать влияние на периферии [Holzer Р, 1998, Permkumar L, 2001] Попадая в кровь, капсаицин действует на клетки -эффекторы воспаления через активацию тахикининовых и ваниллоидных рецепторов [Esquisatto L et al, 2001] Роль нейропептидов КЧН в организации нейрогенного воспаления интенсивно исследовалась в эксперименте и в клинике [Hever G et al, 1998, Xue Q, et al, 2007] На основании полученных данных предположили, что нейропептиды реализуют свое влияние через макрофаги, тканевые базофилы и с помощью изменения проницаемости сосудов [Lötz М et al, 1990, Evan С et al, 1998, Barbara G et al, 2007]

Исследование структурного гомеостаза и клеточных реакций в лимфоидных органах, крови и биологических жидкостях в условиях изменения активности КЧН важно для определения роли нервной системы в механизмах неспецифической и иммунной защиты [Beinth А et al, 2003, Johaek L, 2004] Нарушение этих взаимодействий может способствовать развитию гиперчувствительности при хронических воспалительных и психосоматических патологиях Таким образом, роль первичных афферентных нейронов в регуляции структурного гомеостаза в лимфоидных органах не исследована Не изучались клеточные реакции в дренирующих лимфоидную ткань биологических жидкостях и венозной крови после введения капсаицина Не определена реакция на капсаициновую блокаду капиллярно-венозных сосудов и системы свертывания крови Не установлено, контролируется ли функциональная активность капсаицин-чувствительных нейронов центральной нервной системой Эти данные важны для понимания физиологических функций первичных афферентных нейронов, которые обеспечивают реализацию адаптационных механизмов в норме и при развитии патологических процессов

Цель исследования: изучить капиллярно-венозную проницаемость в коже, клеточные реакции и структурный гомеостаз в лимфоидных органах, крови, биологических жидкостях в условиях изменения функциональной активности капсаицин - чувствительных нейронов и вьивить роль центральной нервной системы в контроле их эфферентной функции

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи

1 Исследовать регуляцию капсаицин-чувствительными нейронами капиллярно-венозной проницаемости кожи у животных разного возраста и пола,

2 Установить роль центральной нервной системы в контроле эфферентной функции капсаицин-чувствительных нейронов,

3 Определить изменения структурного гомеостаза лимфоидных органов в условиях блокады капсаицин-чувствительных нейронов,

4 Выявить зависимость между состоянием капсаицин-чувствительных нейронов и функциональной активностью эпителиоцитов и макрофагов тимуса,

5 Оценить динамические изменения клеточного состава крови и биологических жидкостей после фармакологической деафферентации капсаицином,

6 Выявить изменения в системе свертывания крови и реологии в условиях изменения функциональной активности первичных афферентных нейронов

Научная новизна. Впервые показано, что вызванное введением калсаицина усиление экстравазии витального красителя в области локализации сенсорных окончаний в коже устраняется после перерезки проводящих путей дорзальных рогов спинного мозга, что доказывает наличие рефлекторного тормозного контроля над эффектами капсаицин-чувствительных нейронов со стороны центральной нервной системы Контроль капиллярно-венозной проницаемости капсаицин-чувствительными нейронами различается у молодых животных разного пола и ослабевает в результате снижения активности сенсорных нейропептидов в онтогенезе

Получены экспериментальные доказательства участия капсицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций и структурного гомеостаза лимфоидных органов Блокада капсаицин-чувствительных нейронов приводит к сокращению объема лимфоидной паренхимы тимуса, активации популяций макрофагов и тканевых базофилов, снижению гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов В селезенке в условиях дисбаланса медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов активировались герминативные центры, усиливалась фагоцитарная активность макрофагов и плазматизация красной пульпы, нарушалась трансформация мегакариобластов В подколенном лимфатическом узле при блокаде медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов расширялся объем микроциркуляторного русла, увеличивалась популяция тканевых базофилов и число макрофагов в мозговых синусах, усиливалась плазматизация мякотных тяжей Эти результаты обсуждаются и сравниваются с патологическими и возрастными перестройками структуры лимфоидных органов В работе обосновывается концепция, позволяющая считать первичные сенсорные нейроны анатомическим субстратом нейроиммунных взаимодействий

Выявлены общие закономерности и особенности изменения клеточного состава венозной крови и биологических жидкостей в условиях нарушения нормального функционирования КЧН Установлено, что блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов приводит к перестройкам клеточного состава перитонеальной жидкости и бронхоальвеолярного жидкостного смыва, увеличению вязкости крови, ускорению свертываемости, снижению способности

нейтрофилов к продукции биоокислителей и общей антиокислительной активности крови Показано, что капсаицин-чувствительные нейроны регулируют способность тромбоцитов к наработке тромбина, ключевого фермента внутрисосудистого свертывания Этот эффект ослабевает после электрокоагуляции проводящих путей дорзальных рогов спинного мозга, то есть эфферентная функция капсаицин-чувствительных нейронов по регуляции системы свертывания крови контролируется центральной нервной системой

Теоретическая и практическая значимость. Настоящая работа вносит важный вклад в понимание роли первичных афферентных нейронов обосновывается гипотеза об их двойной афферентно-эфферентной функции Получены новые доказательства участия капсаицин-чувствительных нейронов в контроле капиллярно-венозной проницаемости, структурного гомеосгаза лимфоидных органов, функциональной активности клеток крови и биологических жидкостей, системы свертывания крови Раскрытие механизмов трофического действия нейропептидов в иммунных органах позволяет предполагать их включение в регуляцию нейроиммунных взаимодействий в качестве анатомического субстрата, в обеспечение реакций гиперчувствительности, хронизации воспалительных патологий В этой связи выполненная работа имеет и практическую ценность для клиницистов Впервые получены данные, подтверждающие наличие рефлекторных тормозных влияний на физиологическую активность афферентных нейронов спинальных ганглиев в норме со стороны центральной нервной системы Патологические воздействия на эти нейроны могут приводить к развитию заболеваний психосоматической природы

Результаты исследования расширяют современные представления о роли чувствительных к капсаицину нейронов в регуляции клеточных реакций при развитии нейрогенного воспаления Обоснована перспективность исследования механизмов периферического действия медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов в клинике для коррекции хронических воспалений и нейропатических болей в НИИ курортологии Материалы используются при чтении лекции по курсу «Клиническая психология» (тема «Психосоматические и соматотрофные патологии») на кафедре психологии Новосибирского высшего военного командного училища (военного института) Модификация метода капсаициновой деафферентации применяется для научно-исследовательской работы лаборатории функциональной нейроморфологии ГУ НИИ физиологии СО РАМН

Положения, выносимые на защиту:

1 Блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов усиливает капиллярно-венозную проницаемость и лейкоцитоз крови, снижает функциональную активность элителиоцитов тимуса, способность нейтрофилов к продукции биологических окислителей и общую антиокислительную активность крови, стимулирует активность фагоцитов, активирует внутрисосудистые механизмы свертывания крови, увеличивая ее вязкость

2 Фармакологическая деафферентация капсаицином вызывает истощение структурных резервов тимуса, усиливает иммунную и нарушает кроветворную функции селезенки, увеличивает популяцию макрофагов и тканевых базофилов подколенного лимфатического узла

3 Реализация периферических эффектов капсаицин-чувствительных нейронов находится под контролем центральной нервной системы

Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных систем и органов» (Томск, 1989), научной конференции (с международным участием) «Патогенез хронического воспаления» (Новосибирск, 1991), Всесоюзном симпозиуме «Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии» (Томск, 1992), II и III Съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995, 1997), I Съезде патофизиологов Росии «Патофизиология органов и систем» (Москва, 1996), III Международной конференции «Колосовские чтения-97» (Санкт-Петербург, 1997), XVIII Съезде физиологов России (Ростов-на-Дону, 1998), Международном симпозиуме «Проблемы лимфологии и эндокринологии» (Новосибирск, 1998), Всероссийской научно-практической конференции «Морфологические науки -практике здравоохранения и ветеринарии (Омск, 1999), Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения ИП Павлова (Санкт-Петербург, 1999), I и II Всероссийских конференциях с международным участием по нейроиммунопатологии (Москва, 1999, 2002), Международной конференции «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2000), IV Международном симпозиуме "Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма" (Бишкек, 1999), Международной научной конференции к юбилею Казахского института физиологии (Алма-Аты, 2001), Международном конгрессе нейроморфологов (Санкт-Петербург, 2002), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 50-летию ЧГМА (Чита, 2003), Международном симпозиуме «Механизмы регуляции висцеральных функций» (Санкт- Петербург, 2003, 2005), IX Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003), V Сибирском физиологическом съезде, (Томск, 2005), I Сибирском съезде лимфологов с международным участием «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии», (Новосибирск, 2006), Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации», (Томск, 2006), XVIII (Казань, 2001) и XIX (Москва, 2007) Съездах Всероссийского физиологического общества

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 научных работ В ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, опубликовано 13 статей

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 269 стр машинописного текста Состоит из введения и пяти глав, включающих обзор литературы, описание материалов и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов и выводов Список литературы включает 827 публикаций, из них 184 - отечественных авторов Работа иллюстрирована сорока тремя рисунками, четырьмя таблицами и тремя схемами

Автор глубоко признателен научному консультанту работы д м н, профессору С В Логвинову и выражает большую благодарность за помощь в выполнении диссертации вне НЦКЭМ СО РАМН д б н О П Макаровой, зав лабораторией ультраструктурных исследований ГУ НИИ КиЭЛ СО РАМН, д б н Н П Бгатовой, в н с ГУ НИИ КиЭЛ СО РАМН, д м н Л А Обуховой

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. Эксперименты выполнены на крысах породы Вистар, характеризующихся низкой вариабельностью структурно-функциональных параметров организма Всего использовано 60 самок и 1250 самцов разного возраста и массы, (питомник РАМН "Столбовая"), содержавшихся в стандартных условиях вивария при естественном освещении и обычной диете ¡Работа выполнена в соответствии с гуманными нормами, предусмотренными международной ассоциацией исследований на экспериментальных животных и одобрена Этическим комитетом ГУ НИИ физиологии СО РАМН Для морфологических исследований формировали группы половозрелых крыс массой 180-210 г, для исключения суточных колебаний структурно-функциональных свойств органов экспериментальный материал забирали между 9-10 часами утра

Модели капсаициновой обработки. Неонатальное введение капсаицина осуществляли на второй день жизни крысятам в дозе 50 мг/кг подкожно в верхнелопаточную область Исследования на этих животных проводили через 2-3 месяца Половозрелым крысам препарат вводили подкожно под легким эфирным наркозом Капсаицин (Sigma, США, 1%-ный раствор в растворителе 10% этиловый спирт, 10% Твин-80, 80% физиологический раствор) вводили в течение двух дней с интервалом в 12 часов, чтобы предотвратить сенситизацию Суммарная доза -150 мг/кг, однократные дозы - 25, 25, 50 и 50 мг Нейрогенное воспаление на коже у крыс вызывали аппликацией ксилола 0,2 мл на освобожденный от волос участок кожи бедра (проба по Менкину)

Биохимические исследования Для исследования капиллярно-венозной проницаемости за 15 минут до забоя животным под нембуталовым наркозом (40 мг/кг) внутривенно вводили 50 мг/кг витального красителя Эванса голубого После декалитации забирали участок кожи с задних конечностей, взвешивали Экстракцию красителя проводили в пробирке с 3 мл формамида в течение суток в термостате (60°С) Оптическую плотность экстракта, соответствующую концентрации красителя в растворе, измеряли на отечественном спектрофотометре СФ-46 (ЛОМО), при длине волны 620 нм С помощью калибровочных кривых высчитывали концентрацию в мкг на 1 мг ткани Контролем служили интактные крысы, которым до забоя вводили краситель Способность нейтрофилов к продукции биоокислителей оценивали по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ-тест) в двух вариантах - спонтанном (с-НСТ) и индуцированном (и-НСТ) по методу Park в модификации Д Н Маянского [1996] Активированные нейтрофилы усиливают восстановление растворимой краски нитросинего тетразолия в темно-фиолетовый формазан Забор крови проводили на 7, 14 и 21 сутки В спонтанном варианте к 50 мкл с предварительно введенным гепарином (10 Ед/мл) крови добавляли 25 мкл раствора Хенкса и 25 мкл 0,2% раствора нитросинего тетразолия (HCT, Renal, Венгрия) В индуцированном варианте в инкубационную среду вместо раствора Хенкса вносили 25 мл раствора стимулятора Инкубировали 30 минут при температуре 37°С, готовили мазки, сушили, фиксировали в метаноле и окрашивали метиловым зеленым (по Романовскому-Гимзе) В качестве индукторов использовали раствор продигиозана - липополисахарида Serratia marcescens и убитую вакцину Staphylococci aureus Под микроскопом при увеличении X 1000 с масляной иммерсией подсчитывали 100 нейтрофилов Нейтрофилы с фиолетово-черными блок-депозитами расценивали как НСТ-позитивные Считали % формазанпозитивных клеток (%ФПК) В целом НСТ-тест отражает степень

активации кислородозависимого метаболизма, и, прежде всего, функцию гексозомонофосфатного шунта на указанное воздействие Антиокислительную активность (АОА) крови, индуцированной перекисью водорода, регистрировали следующим образом 0,1 мл свёжей плазмы крови, взятой из хвостовой вены, и 0,8 мл бесцветного раствора Хенкса вносили в кюветы для хемилюминесцентного анализа, содержали в термостате в течение 5 минут при 37°С, добавляли 0,1 мл Н202 (конечная концентрация 3%) и измеряли вспышку свечения, которая наступала через 20 сек АОА плазмы крови определяли как величину, обратную интенсивности вспышки свечения, и выражали в относительных единицах [Журавлев АИ, Журавлева АИ, 1975] Биологическая хемилюминесценция, индуцированная Н202, имеет высокую интенсивность и регистрируется в микроварианте с использованием менее 0,1 мл крови Измерение вспышки свечения, отражающей антиоксидантную активность исследуемой биологической жидкости [Серкиз Я И и др, 1984], проводили на хемилюминометре «СКИФ-0306» производства СКТБ «Наука» (г Красноярск)

Операции на животных. Перерезку спинного мозга проводили специальными микрохирургическими инструментами под наркозом (нембутал, в/б, 40 мг/кг) на уровне Th9-Thl0, повреждая участки верхних боковых рогов спинного мозга Схема повреждения сделана на основе данных о распределении иммунореактивности к веществу П в дорзальных рогах спинного мозга [Lean J et al, 1988] У оперированных крыс через 2 часа исследовали капиллярно-венозную проницаемость в коже задних конечностей При ложной операции вскрывали спинномозговой канал соответствующей зоны без повреждения мозга Электрокоагуляцию области дорзальных рогов спинного мозга на уровне Th4-Th5 проводили за 2 и 24 часа до забоя животных с помощью униполярного стального электрода диаметром 0,2 мм, через который пропускали электроток в течение 45 секунд до достижения полной мощности при силе тока 8 мА под нембуталовым наркозом (40 мг/кг) Операцию проводили интактным и капсаицинобработанным крысам, для контроля проводили имплантацию электрода без подачи тока (ложная операция) Эффективность перерезки и электрокоагуляции оценивали по фотоснимкам нефиксированных срезов спинного мозга в области воздействия, сделанных на замораживающем микротоме По полученным снимкам рабочего качества отбирали животных с хорошей эффективностью воздействия и формировали опытные группы

Морфологические исследования Для исследования методом световой микроскопии, кусочки тканей тимуса, селезенки и подколенный лимфатический узел (целиком) фиксировали в первые минуты после декапитации животных под эфирным наркозом в 10% нейтральном формалине или жидкости Буена, Карнуа, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и ксилоле, заливали в парафин Для фиксации тимуса применяли кислый фиксатор Телесницкого Для обзорного просмотра срезы окрашивали гематоксилином-эозином, для цитологических исследований и съемки - азуром В-эозином Y по Нохт-Максимову Кроме того, срезы окрашивали по Kramer'y на тканевые базофилы помещая в 0,1% раствор толлуцдинового синего на 30% спирте [Авакимян СБ и др, 2002] Окраску фиксировали в двух сменах абсолютного спирта Срезы обезвоживали в ксилоле (20 мин) и заключали в канадский бальзам Срезы селезенки, толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином-эозином, метилгрюн-пиронином по Браше [Пирс Э , 1962] Для составления спленограмм селезенки делали отпечатки свежих

ее срезов, которые фиксировали метиловым спиртом и слегка подкрашивали В красной пульпе селезенки на 10 серийных срезах в 30 полях зрения подсчитывали среднее число мегакариоцитов и мегакариобластов (диаметр поля - 0,43 мм, общая площадь-0,0625 мм2) Подсчет количества клеток делали с помощью морфометрической сетки и гематологического счетчика [Автандилов Г Г, 1990] В субкапсулярной зоне тимуса подсчитывали количество ретикулярных клеток, разных форм лимфоцитов, плазматических клеток, фагоцитов, клеток с фигурами митозов и деструктивно измененных Измеряли толщину коркового и диаметр мозгового вещества с помощью винтового окулярного микрометра МОВ-1 (объектив Х8, окуляр XI5), делая в каждом препарате по 20 измерений Для определения морфофизиологических индексов тимуса и селезенки измеряли массу животных, их почки и соответствующих органов Для определения абсолютного объема тимуса и его структурно-функциональных зон использовали морфометрический метод [Бородин ЮИ, 1991] Серийные срезы готовили из целиком зафиксированного органа, забирая для исследования каждый 15 срез толщиной 5 мкм Для более подробного анализа найденных методами световой микроскопии цитологических и цитохимических феноменов, тимус, селезенку и подколенный лимфатический узел исследовали на электронном микроскопе Материал фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида (дофиксация в 2% растворе осмиевой кислоты по Конфилду) и заливали в араддит и эпон Ультратонкие срезы готовили на ультрамикротоме ЬКВ, контрастировали насыщенным водным раствором уранил ацетата и цитратом свинца, изучали и фотографировали на электронном микроскопе ШМ-5-У Полутонкие срезы окрашивали полихромным толуидиновым синим по Унна и исследовали на световом микроскопе Для гистохимического анализа функциональной активности эпителиоцитов и макрофагов тимуса проводили окраску его срезов альдегид-фуксином со смесью Гельми по методу Гыба-Дыбана Нуклеиновые кислоты изучались в реакции Браше на РНК (при этой реакции изучалась также морфология и топография тканевых базофилов и плазматических клеток)

Физиологические методы. Температурную чувствительность у экспериментальных животных оценивали с помощью модифицированного стандартного теста «горячей пластинки» Применение этого теста основано на данных о том, что тепловая стимуляция в диапазоне температур 41-53С° приводит к стимуляции преимущественно безмиелиновых нервных окончаний С-типа [КтсЫет Т ег а1, 1997] Площадка диаметром 20 см располагалась на высоте 15 см от пола На ней с помощью подсоединенного термостата поддерживалась постоянная температура площадки (55С°) Этот широко используемый в экспериментальной физиологии тест заключается в измерении времени схождения животного с горячей поверхности В хроническом опыте при многократном тестировании одних и тех же животных вырабатывается ситуационный рефлекс и указанный параметр становится необъективным, поэтому фиксировали момент первого отрыва лапы от нагретой площадки - латентный период термочувствительной реакции В поведенческих опытах животные, покидавшие нагретую площадку быстрее, чем за три минуты, зачислялись в группу с высокой термочувствительностью Крысы, имеющие латентный период схождения с горячей площадки от трех до пяти минут, считали низко термочувствительными В эксперименте не участвовали крысы со значительно пониженной температурной чувствительностью, которые находились на горячей площадке более пяти минут

На основе этой выборки формировали группы по 40 животных Внутри каждой группы на основе случайной выборки образовывали подгруппы для стимуляции и блокады сенсорного звена (по 20 крыс) Изучение двигательной, исследовательской активности и эмоциональной реактивности проводили в тесте «открытого поля» через два часа после введения стимулирующей дозы капсаицина (5 мг/кг, подкожно, под легким эфирным наркозом) и через 2 недели после инъекций нейротоксической дозы этого препарата (150 мг/кг) В каждой подгруппе 10 животных использовали для опыта, 10 - для контроля Контрольным крысам в эти же сроки под наркозом вводили растворитель для капсаицина Экспериментальная установка состояла из круглой арены диаметром 120 см со стенками высотой 30 см Ярко и равномерно освещенный пол площадки делили на квадраты Экспериментальных животных высаживали в центр поля и в течение пяти минут наблюдали [Буреш Я и др, 1991] Регистрировали параметры двигательной активности число пересеченных квадратов, время перемещения из центра на периферию (латентный период начала двигательной реакции), число вертикальных стоек и выходов в центр поля Определяли показатели эмоционального состояния (ЭС) число актов груминга и их длительность, количество болюсов дефекации

Методы исследования крови Общее количество лейкоцитов и лейкоформулу крови подсчитывали с использованием стандартных гематологических методов на мазках, окрашенных по методу Романовского-Гимзе [Каркищенко АИ, 1999] Клетки бронхоальвеолярной лаважной жидкости и перитонеального жидкостного смыва выделяли по методу Myrvik, модифицированному в лаборатории патофизиологии НЦКЭМ СО РАМН [Маянский ДН, 1991] Мазки крови, бронхоальвеолярной лаважной жидкости и перитонеального жидкостного смыва фиксировали метиловым спиртом, окрашивали по Май-Грюнвальду Измерение абсолютного количества клеток в крови и биологических сред проводили в камере Горяева На мазках процентное соотношение лейкоцитов определяли по лейкоцитарной формуле при подсчете 200 клеток Цитофотометрически исследовали клетки селезенки на отпечатках, фиксированных метиловым спиртом и окрашенных по методу Фельгена (гидролиз в 1 н соляной кислоте при 60°С в течение 5 минут) Вязкость крови определяли безгепариновым методом на вискозиметре ВК-4 Для оценки отдельных параметров системы свертывания крови определяли содержание тромбоцитов, протромбиновое время, тромбиновое время при стимулировании а-тромбином со стандартной активностью 32-35 секунд, концентрацию фибриногена (Балуда В П и др , 1980) Величину гематокрита крови определяли после центрифугирования в течение 45 минут (3000 об / мин) в гемометре Сали (метод Винтроба), гемоглобин после смешивания крови с раствором Драпкина, на спектрофотометре при длине волны 540 нМ (компенсаторная жидкость - дистиллят)

Статистическая обработка материала. Обработку данных осуществляли при помощи набора стандартных программ Statgraphics и Microsoft Exel Для построения графиков использовали средние величины (М), ошибку средней величины (т) и доверительный интервал Достоверность различий устанавливали по t - критерию Стьюдента В части экспериментов применялся однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим множественным парным сравнением по t-критерию Стьюдента

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Участие капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции капиллярно-венозной проницаемости 1.1. Изменение капиллярно-венозной проницаемости в коже бедра у крыс - самцов Вистар в онтогенезе Чтобы установить, как изменяется эфферентная функция первичных сенсорных нейронов в онтогенезе, исследовали капиллярно-венозную проницаемость в коже бедра у крыс разных возрастных групп (3, 6, 9 и 12 и 18 месяцев) В качестве маркера проницаемости использовали витальный краситель голубой Эванса, который в комплексе с альбумином проходит тканевой барьер трансэндотелиально, а не через поры или межэндотелиальные пространства, что доказано на модели задней камеры глаза, где отсутствуют межклеточные промежутки [Andrews Р, Helme R, 1987] Фактически по данным спектрофотометрического анализа оценивали интенсивность накопления красителя голубого Эванса в коже бедра

Масса исследуемых животных закономерно увеличивалась с возрастом, составляя 141,32±0,44 г (3 месяца), 203,22+13,87 г (6 месяцев), 289,31±28,72 г (9 месяцев), 419,12+50,14 г и 432,22+33,07 г, соответственно, в год и в полтора года Количество витального красителя, выделенного из образцов кожи бедра опытных крыс, взятой в области нанесения ирританта, с возрастом уменьшалось, составляя в три месяца 155,03+41,82 мкг/мг, в шесть - 121,03+24,01, в девять - 97,04±30,21, в год и полтора, соответственно, - 48,04+13,66 и 31,11+11,72 мкг/мг (рис 1)

Есть основания полагать, что учащение с возрастом трофических нарушений

в периферических тканях может быть связано со снижением в онтогенезе количества сенсорных нейронов [Ferrante F et al, 1991, Khalil Z, Helme R, 1997] Известно, что в ходе индивидуального развития

нарастает денервация сосудов внутренних органов за счет гибели афферентных и эфферентных нейронов

[Стовичек ГВ, 1991] Все это и стало причиной выявленных изменений проницаемости

микрососудов в онтогенезе

Для контроля исследовали изменение афферентной функции в онтогенезе с помощью метода «горячей площадки» В ходе индивидуального развития чувствительность тепловых рецепторов у крыс достоверно снижалась, что выражалось в увеличении времени схождения с горячей площадки - латентного периода (ЛП) термочувствительной реакции Если у трехмесячных крыс ЛП в тесте «горячая площадка» составлял 81,12±12,33 с, то у шестимесячных животных показатель достоверно возрастал до 150,21±21,54 с (Р <0,01) В последующие сроки наблюдения (девять месяцев и год) ЛП в тесте «горячей площадки» так же возрастал, соответственно, до 367,35±98,82 с (Р <0,05), 626,24+121,21 с (Р <0,05) Величина исследуемого показателя у крыс в возрасте 18 месяцев (644,44+111,71 с)

3 мес 6 мес 9 мес 12 мес 18 мес

Рис 1 Изменение содержания красителя голубого Эванса в коже бедра крыс-самцов Вистар в норме и после агтикаций ксилола **-Р <0,01, * - Р <0,05 к уровню показателя в предыдущий срок наблюдения

достоверно не отличалась от уровня годовалых животных, однако была выше (Р <0,05), чем у молодых (3-6 месяцев) особей Полученные результаты свидетельствуют о наличии возрастного снижения функциональной активности сенсорных нейронов, причем как их классической «чувствительной» функции, так и эфферентной

1.2. Динамика изменений капиллярно - венозной проницаемости кожи у половозрелых крыс-самцов Вистар в разные сроки после введения капсаицина

Капиллярно-венозную проницаемость исследовали у половозрелых крыс-самцов Вистар на 7, 14, 21 и 28 сутки после введения капсаицина (150 мг/кг) Для контроля использовали животных, которым вводили растворитель для препарата На седьмые сутки наблюдения накопление красителя в образце ткани увеличивалось в три раза (контроль 8,21+1,71 мкг/кг, опыт 27,31±2,93, Р <0,01, рис 2)

Эффект, наблюдаемый в первую неделю действия капсаицина, связан с выбросом нейропептидов Сходные изменения отмечены при исследовании антигензависимой проницаемости после неона-тальной обработки

капсаицином [Szepes Z et al, 1997]

Через две недели величина показателя в два раза снизилась по отношению к предыдущему сроку наблюдения (15,12+2,13, Р <0,05), однако она, так же как и величина показателя на 21 и 28 сутки наблюдения (10,17+1,72 и 9,33+2,11), достоверно не отличалась от уровня контроля (рис 2) Это связано с дефицитом нейропептидов в периферических отростках КЧН вследствие блокады нейрокининовых или ваниллоидных рецепторов [Tominaga К et al, 2004, Valeriani М et al, 2004] Чтобы убедиться, что под влиянием капсаицина меняется афферентная функция чувствительных к нему нейронов, использовали классическую модель «hot-plate test» и ее модификацию, в которой измеряли время первого отдергивания лап от горячей поверхности [Hunskaar S et al, 2000] Анализ полученных результатов выявил фазные изменения латентного периода термочувствительной реакции В первую неделю действия капсаицина латентный период схождения с горячей площадки был на 28% (Р <0,05) ниже уровня контроля (рис 3) Через две недели действия препарата латентный период термочувствительной реакции (ЛП) был в 2,3 раза больше, чем у контроля (Р <0,01, рис 3) Эти перестройки вызваны фазными изменениями уровня нейропептидов в области локализации окончаний капсаицин-чувствительных нейронов интенсивному выбросу в ранние сроки и истощению содержания на второй неделе действия препарата Тот факт, что опытные животные в первую неделю действия препарата покидают горячую площадку быстрее, чем контрольные, связан, возможно, с избытком нейропептидов Действие его может

40

g Контроль 7сутКс 14сутКс 21 сутКс 28сутКс

И

Рис 2 Накопление красителя голубого Эванса в коже бедра крыс в разные сроки действия капсаицина (150 мг/кг) **- Р <0,01 к контролю, * -Р <0,05 к предыдущему сроку наблюдения

сохраняться в течение педели, что подтверждают данные литературы [Liderman М. etai, 1998].

Известно, что чувствительность к болевым температурным воздействиям усиливается при введении эндогенной субстанции П LAIlcn 8. et al„ 1997]. Таким эффектом

сопровождается введение N концевых фрагментов вещества П [Kreeger J. et al, ) 994], функциональных антагонистов нейрокинино-вых рецепторов, приводящее к накоплению нейро-целтидой в периферических сенсорных окончаний* [Mansikka Н. el al, 1999]. Развитие болевой гипер-чувстачтеяькоотч наблюдается и мри блокаде »знилдаидкых рецепторов к кацеаишшу на периферии, что так же связывают с накоплением н ей р о пептид о is [С ale г in а М. et al., 2000; Баринов АН., Яхио Н.Н., 2003] Снижение болевой температурной чувствительности у крыс через две недели действия капсаицина может быть связано с истощением периферических депо нейропетшов. Показано, что после введения его в больших дозах (более 200 мг/кг) температурная чувствительность у крыс резко снижается [Drummond Р., 2004], На третьей неделе действия капсаицина беленая температурная чувствительность у опытных и контрольных.животных была практически одинаковой,

1.3. Влияние нолевых различий в уровне нейропептидов на капиллярно-венозную проницаемость кожи у крыс Вистар разного возраста. йммуногисто химическими и ради о иммунным и методами выявлено более высокое содержание нейропептидов у самок по сравнению с самцами в головном мозге [Weld М. et al., 1994], в цереброспинальной жидкости [Naqamitsu S. et al,, 1998] и n висцеральных органах [Pushkala К,, Gupta Р. 2001]. Имму но гистохимические исследования свидетельствуют о различиях в распределении КГРП в чувствительных окончаниях у самок и самцов крыс [Carrier N., Connat ]., ¡996]. В связи с этим был проведем эксперимент по выявлению особенностей проницаемости сосудов для витального красителя у животных разпиго пола. В экспериментальные группы отбирали трехмесячных крыс одного помета, с одинаковой массой тела, Формировали группы крыс разного пола и ишраста (по 10 животных и группе), у которых после забоя определяли количество экстрагированного из кожи бедра красителя голубого Эванса. У части животных кожная реакция усиливалась аппликациями ксилола. У самцов усиленная ксилолом экетравазия красителя в кожу снижалась в онтогенезе, составляя п три месяца 92,11 ±35.43 мкг/мг, в шесть месяцев - 67.11±23,52 мкг/мг. ft девять месяцев -46.25±1 127 мкг/мг, в год -36,,12±9.38 мкг/мг и в полтора года - 32,12±5.68 мкг/мг (рис. 4).

. , липы с горячен шшщадкл

Рис. 3. ДЦнамика изменения латентного

периода болевой те%щочубСмвимедъно&

реакции у крыс в тесте "горячая площадки" в

разные сроки действия капсаицина (150 мг/кг).

* *-Р <0,01; *-Р <0.05 к уровню показателя у

контроля

У самок накопление красителя в коже в ответ на аппликацию ксилола достоверно выше (Р <0,05), чем у самцов и равномерно снижается с возрастом Концентрация красителя в ткани бедра у самок составляла в три месяца 148,12±12,32

мкг/мг, в полгода - 131,17 ±17,79 мкг/мг, в девять месяцев - 89,31+14,42 мкг/мг, в год и полтора года, соответственно, 40,11 ±13,53 мкг/мг и 28,23 ±11,33 мкг/мг (рис 4)

Сравнительный

анализ данных показал, что у молодых и половозрелых самок крыс реакция была более выраженной (Р <0,05), чем у самцов этого же возраста Эффект связан, вероятно, с более высоким содержанием нейропептидов в окончаниях первичных сенсорных нейронов у самок по сравнению с самцами Достоверных различий этого показателя у старых животных (одного и полутора лет) не выявлено

Контролем афферентной функции сенсорных нейронов служили данные по определению температурной чувствительности в тесте «горячей пластинки» У самцов с возрастом время пребывания на горячей площадке (латентный период термочувствительной реакции - ЛП) достоверно увеличивалось (Р <0,05) по сравнению с предыдущим сроком наблюдения ЛП составлял в три месяца 75,23+22,13 с, в шесть месяцев - 166,22±34,52 с, в девять месяцев - 326,32+51,34с, в один и полтора года, соответственно, - 578,22±71,44 с и 641,35±68,24 с Общая закономерность возрастного снижения температурной чувствительности в онтогенезе проявлялась и у самок Однако трехмесячные самки «сидели на горячей площадке» в два раза дольше самцов (165,21+45,52 с) Латентный период термочувствительной реакции у самок составлял в шесть месяцев 278,25+44,13 с, в девять месяцев - 489,24+78,82 с, в один и полтора года, соответственно, - 696,11 +66,72 с и 732,17±81,54 с Статистический анализ показал, что достоверные различия в температурной чувствительности имели место у молодых животных У старых крыс (одного и полутора лет) достоверных различий в чувствительности терморецепторов не вьивлено Более интенсивная нейрогенная воспалительная реакция у самок крыс, вероятно, связана с тем, что их кровеносные сосуды менее устойчивы к проникновению витального красителя, чем сосудистое русло самцов Эти результаты подтверждаются данными о низкой резистентности сосудов периферического венозного русла у женских особей в сравнении с мужскими [Igarashi Н et al, 2001] При исследовании реакции на боль у животных разного пола показано, что самки менее чувствительны к болевой стимуляции [Khalil Z, Helme R, 1996] Выявлены половые различия в электрофизиологической активности участков блуждающего нерва, содержащих волокна первичных афферентных нейронов с NK-1 рецепторами [Oh Е et al, 2000] У молодых

3 мес 6 мес 9 мес 12 мес 18 мес

Рис 4 Изменение капиллярно-венозной проницаемости в коже бедра после аппликаций ксилола у крыс Вистар разного пола е онтогенезе

* -Р <0,05, различия между самцами и самками

животных эти различия наиболее выражены, что может объясняться максимальной активностью половых гормонов у крыс в возрасте от трех до девяти месяцев Вероятно, полученные в работе данные могут иметь значение для объяснения отмеченных в клинической практике различий в клинических проявлениях ревматоидных психосоматических заболеваний у мужчин и женщин [Вейн AM и др, 1993] В период полового созревания отмечены выраженные различия в проявлении эфферентной функции КЧН, что свидетельствует в пользу высказанной в литературе гипотезы о наличии контроля со стороны гормональной системы над процессами синтеза и накопления нейропептидов в первичных сенсорных нейронах [Igarashi Н et al, 2001, Pushkala К, Gupta Р 2001]

1.4. Влияние частичной перерезки спинного мозга на сосудистую проницаемость у интактных и обработанных капсаицином крыс. Согласно гипотезе Р Holzer [1991], эфферентная функция капсаицин-чувствительных нейронов является локальной Она не подвержена контролю со стороны центральной нервной системы Однако позже появились данные, позволяющие предполагать наличие контроля над работой первичных сенсорных нейронов со стороны головного мозга [Kream R et al, 1993] На субпопуляции чувствительных нейронов тройничных ганглиев показано, что микроциркуляторные нарушения в передней камере глаза имеют место не только при стимуляции или блокаде их капсаицином, но так же и при нарушении их связи с вышележащими центрами При этом сами нейроны оставались интактными, и механизм аксон-рефлекса не нарушался На основании этих фактов предположили, что нервная система модулирует эфферентную функцию капсаицин-чувствительных нейронов [Rnyazef GG et al, 1991] В последствии было продемонстрировано, что эта модуляция осуществляется без участия симпатической, парасимпатической и гипоталамо-гипофизарной систем Эти данные позволяют усомниться в традиционных представлениях и делают актуальным исследование эфферентной функции первичных афферентных нейронов спинальных ганглиев по регуляции сосудистой проницаемости в условиях нарушения связи с ЦНС и аналогичных воздействий на фоне истощения депо нейропептидов в сенсорных окончаниях капсаицином Следует отметить, что изучение роли центральной нервной системы в контроле функциональной активности сосудистых центров спинного мозга представляет важный теоретический интерес и может быть актуальным для решения проблем практической медицины

Эксперименты ставили на половозрелых крысах-самцах Вистар, которым за 15 минут до декапитации внутривенно вводили 150 мг/кг красителя Эванса голубого, затем определяли его концентрацию В качестве контроля использовали животных, которым одновременно вводили растворитель для капсаицина и не подвергали оперативным воздействиям (ложная операция) Невротомию спинного мозга проводили специальными микрохирургическими инструментами под наркозом на уровне Th9 спинного мозга, повреждая нервные волокна верхних боковых рогов Ориентиром служили данные литературы о преимущественном распределении иммунореактивности к веществу П в дорзальных рогах спинного мозга [De Leon М, 1994] У контрольных животных концентрация красителя в коже конечностей составляла в среднем 6,03+4,21мкг/мг ткани Приблизительно таким было и содержание экстрагированного из кожи красителя у животных «капсаицинового контроля», которым вводили только растворитель для капсаицина (7,05+3,12 мкг/мг ткани, рис 5) После проведения ложной операции

по вскрытию спинномозгового канала без перерезки спинного мозга отмечена тенденция к увеличению концентрации красителя в образце ткани (12,52 ±7,24 мкг/мг, рис 5) Через два часа после перерезки спинного мозга на уровне Th9 у интактных крыс был отмечен максимально высокое содержание голубого Эванса в ткани бедра у опытных крыс (59,05+11,57 мкг/мг, Р <0,01 к уровню контроля и ложной операции, рис 5) Отличие этого показателя было достоверным (Р <0,05) как по сравнению с интакт-ными, так и ложнооперированными животными Этот эффект сохранялся в течение суток Важно отметить, что операция нарушает связь первичных сенсорных нейронов с центральной нервной системой, не нарушая их целостность Это позволяет предположить, что в норме имеет место центральная регуляция над сосудистыми центрами спинного мозга, которая ограничивает реализацию эфферентной функции КЧН Через 22 часа после операции концентрация красителя в коже задних конечностей у животных этой группы составляла 40,05±9,33 мкг/мг, что было достоверно выше (Р <0,05), чем у контрольных и ложноперированных крыс Проведение аналогичной операции на фоне предварительно введенного капсаицина (150 мг/кг за 10 дней) приводило к достоверному снижению содержания красителя в образцах тканей у оперированных животных (22,04+8,14 мкг/мг), как по сравнению с оперированными не обработанными капсаицином крысами (Р <0,05), так и контрольными (Р <0,05, рис 5)

Очевидно, что обнаруженное в настоящей работе увеличение сосудистой проницаемости в ранние сроки после частичной перерезки спинного мозга можно объяснить тем, что в норме центральная нервная система рефлекторно тормозит выделение медиаторов из сенсорных окончаний Ослабление эффекта после предварительной обработки животных капсаицином говорит о том, что конечным звеном в этом рефлексе являются капсаицин-чувствительные нейроны Согласно данным литературы, обратный эффект вызывает интратекальное введение вещества П на уровне Th9 спинного мозга крысам, анестезированным пентобарбиталом, при таком воздействии усиливается экстравазия плазменных протеинов в коже задних и передних лап, а так же глаз [Leung К, Lynn К, 1997] Отмеченное в первые часы после

Рис 5 Содержание красителя голубого Эванса в коже бедра у крыс-самцов Вистар при различных воздействиях *-Р <0,05, ** - Р <0,01 в сравнении с величиной показателя у контроля

операции существенное увеличение сосудистой проницаемости является результатом снятия тормозного контроля со стороны центральной нервной системы и доказывает наличие центральной регуляции эфферентной функции чувствительных к капсаицину нейронов Таким образом, усиленное выделение сенсорных нейропептидов можно вызвать, нарушив их связь с центральной нервной системой Этот вывод подтверждают данные, в которых экспериментально доказывается возможность центральной регуляции эффектов болевого и механического раздражения сенсорных нейронов [Ma W, Bisby S , 1998, Pucher G, Henry J, 2002] Есть данные об увеличении нейрогенного отека при повреждении седалищного нерва у крыс, после неонатальной калсаициновой обработки и введения рецепторных антагонистов вещества П [Lin Q et al, 1999, Scott С et al, 2000], однако в этом случае нарушается целостность чувствительного нейрона В собственной экспериментальной схеме чувствительные нейроны, реализующие свое влияние на капиллярно-венозную проницаемость, непосредственно операцией не затрагиваются В эффект не вовлекается симпатоадреналовая система, так как предварительная блокада катехоламинергических механизмов резерпином не устраняла эффект

Через 20 — 22 часа после перерезки спинного мозга, когда пептидные депо в сенсорных окончаниях существенно истощаются, можно наблюдать непосредственное влияние дефицита нейропептидов проницаемость капиллярно-венозных сосудов превышает уровень ложнооперированного контроля Сравнение результатов этого опыта с данными об изменении проницаемости микрососудов после введения крысам нейротоксической дозы капсаицина позволяет выявить значение центральной нервной системы в модуляции сосудистых функций в периферических тканях

Использование капсаициновой блокады для исследования функций нейропептидов - распространенный фармакологический метод Известно, что при неонатальном введении капсаицина и через две недели после инъекций его взрослым животным в дозе 200 мг/кг содержание нейропептидов в периферических тканях значительно снижается [Holford L , Lawson S , 1993] Сходные данные были получены на мышах, у которых исследовали ноцицептивный эффект после интратекального введения вещества П и применения антагониста NK-2 тахикининовых рецепторов дизоцилпина, блокирующего передачу сенсорной информации в центральных окончаниях афферентных нейроцитов [Ione M et al, 2000] Собственные результаты подтверждаются фактами, полученными на культуре срезов спинного мозга или на животных после дорзальной ризотомии [Yang К et al, 2000] При изучении механизмов спинномозгового рефлекса с помощью метода лазерной Доплеровской денситометрии в условиях экспериментального нейрогенного воспаления, вызванного подкожными инъекциями капсаицина анестезированным крысам, так же показано наличие центральной регуляции [Lin Q et al, 1999] Очевидно, что этот механизм лежит в основе модуляции воспалительных процессов, сопровождающихся усиленным выбросом сенсорных нейропептидов и возникающих при интенсивных воздействиях на спинномозговые центры [Ren К, 1994, Helme R, 2000, Ohtori S et al, 2003] С помощью тонких электрофизиологических методов показана активация нейронов, содержащих субстанцию П, в желатинозной субстанции спинного мозга после введения крысам максимальной стимулирующей дозы капсаицина - 50 мг/кг [Yang К et al, 2000] При фармакологической блокаде

энкефалинсодержащих нейронов дорзальных рогов спинного мозга, являющихся проводниками импульсной активности от чувствительных нейронов к центральной нервной системе, отмечено снижение выброса субстанции П в ответ на действие ирритантов [Maldonado R et al, 1994]

2. Структурные и функциональные изменения в лимфоидных органах в условиях дисбаланса нейропептидов первичных афферентных нейронов 2.1 Изменение морфологии тимуса и функциональной активности его эпителиоцитов и макрофагов под действием капсаицина. У половозрелых крыс - Вистар через одну, две и три недели после введения капсаицина и у контроля с введенным растворителем для капсаицина (placebo-контроль) определяли отношение массы тимуса к массе почки (МТимуса / МПочки) На седьмые сутки действия препарата этот показатель возрастал в 1,7 раза (Р <0,05) по сравнению с таковым в контроле (рис 6) Увеличение массового индекса тимуса в первую

неделю наблюдения связано с интенсивным отеком,

увеличением объема междоль-ковых перегородок, расширением посткапиллярных венул в зоне кортико-медуллярного соединения и внутри долек, притоком тканевых базофилов (ТБ) в субкапсулярную зону Наблюдаемые эффекты связаны с выбросом нейропептидов из сенсорных окончаний Есть данные о росте популяции ТБ в тимусе при нарушении нейрогуморальных связей после спленэктомии [Стоменская И С и др, 2001] ТБ стимулируют процессы миграции клеток лимфоидного ряда из тимуса [Вихрук Т И, Берсенева О С, 2000]

Через две недели действия препарата морфофизиологический индекс тимуса уменьшился в 1,6 раза по сравнению с таковым в контроле, вследствие интенсивной инволюции органа Альтерация вилочковой железы в этих условиях связана, в основном, с усиленной эвакуацией лимфоцитов На 21 сутки действия препарата отношение массы тимуса к массе почки приближалось к норме (рис 6)

Морфологическую структуру тимуса исследовали через одну, две и три недели действия капсаицина Анализ гравиметрических и морфометрических данных показал, что у опытных животных через две недели действия капсаицина достоверно уменьшился абсолютный объем тимуса (контроль 76,59 мм3, опыт 53,28 мм3), в том числе, объем коры (контроль 51,8 мм3, опыт 35,8 мм3) и мозгового вещества (контроль 17,19 мм3, опыт 12,2 мм3, Р <0,05, рис 7) Объем соединительно-тканной стромы (Стс) имел лишь тенденцию к уменьшению Статистический анализ показал, что кора тимуса под влиянием капсаицина уменьшалась значительнее, чем мозговое вещество Это может быть связано с разной плотностью сенсорной иннервации этих структурно-функциональных зон большая часть сенсорных окончаний сосредоточена в коре лишь отдельные

Контроль 7 сут 14 сут 21 сут

Рис б Морфофизиологические индексы тимуса (МТимуса/МПочки) у крыс-самцов Вистар в разные сроки после введения капсаицина (150 мг/кг) *-Р <0,05, **-Р <0,01 к контрольному уровню

сенсорные отростки располагаются в глубоких областях паренхимы органа [Lorton D et al, 1990]

Клеточный пул субкапсулярной зоны (СКЗ) тимуса пополняется только прекурсорами из костного мозга, сюда в норме рециркуляции лимфоцитов не происходит Поэтому подсчитывали общее количество на единице площади гистологического среза СКЗ и число больших, средних, малых лимфоцитов, лимфобластов, лимфоцитов с фигурами митозов и с пикнотически измененными ядрами, плазмоцитов, эозинофилов, макрофагов, тканевых базофилов и эпителиоцитов Вычисляли абсолютное число клеток и их процент СКЗ отчетливо дифференцируется благодаря наличию множества лимфобластов, которые располагаются в 1-3 ряда, и пониженной, по сравнению с мозговым веществом, плотностью клеток Исследования проводили на светооптическом и ультраструктурном уровнях, что нужно для индентификации отдельных клеточных типов

Через две недели действия препарата на 27% снизилось общее число клеток на стандартной площади СКЗ (контроль 238,74±4,44, опыт 173,62 ±4,57, Р <0,01) В основном изменялась лимфоидная паренхима Аналогичный эффект часто наблюдается после действия длительного стресса и при хроническом воспалении [Корнева Е А, 1993, Харченко В П и др, 1998] Статистический анализ показал, что в СКЗ после введения капсаицина не менялось число лимфоцитов, закончивших дифференцировку (средних), лимфобластов и клеток с фигурами митозов Стабильность митотических индексов вилочковой железы отмечена и при других воздействиях [Зайратьянц О В, 1992], что связано с жесткой настройкой ритма пролиферации, который устанавливается в филогенезе В то же время в опыте на 60% уменьшилось количество малых лимфоцитов (контроль 145,68±2,66, опыт 58,17±1,49, Р <0,01) Причиной уменьшения числа этих лимфоцитов, которые не закончили дифференцировку и не прошли аутоиммунную селекцию, может быть усиление их эвакуации под влиянием нейропептидов, выделяемых из окончаний КЧН Известно, что лимфоциты имеют рецепторы к нейропептидам [van Hagen Р et al, 1996] После неонатальной капсаициновой обработки в периферической крови у крыс увеличивается число CD4+, CD25+ Т-лимфоцитов [Santoni G et al, 1999], эффект блокирует предварительное введение антагониста вещества П - SR 140333 [Santoni G et al, 2003] При акцидентальной инволюции из тимуса чаще эвакуируются клетки, не прошедшие аутоиммунную селекцию [Агеева В А, Самусев Р П, 2000]

Общ Об К°Ра

Рис 7 Общий объем тимуса и объемы его структурно-функциональных зон у контрольных и обработанных капсаицином (150 мг/кг, через две недели) крыс *- Р < 0,05 к контрольному уровню

Уменьшение лимфоидной паренхимы тимуса в этих условиях связано и с самоуничтожением лимфоцитов в СКЗ у опытных крыс число лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза выросло в 6,5 раз (контроль 1,13±0,41, опыт 7,23±1,68, Р <001) Полагают, что такой эффект может быть следствием нарушения нервной регуляции [Offen D et al, 1995] Вещество П рассматривают как физиологический антагонист апоптоза лимфоцитов [Dimri R et al, 2000] Влияние нейропептидов может реализовываться через каскад каспаз в тимоцитах, так как интенсивная тепловая стимуляция сенсорных окончаний ограничивает индуцированную стрессом активацию каспаз в тимусе [Круглов С В и др , 2002] Капсаицин стимулирует апоптоз культивируемых клеток человеческой аденокарциномы, оказывая протекторное действие на опухоль желудка через Вс1-2 [Lo Y et al, 2005] На электроннограммах тимуса опытных крыс встречались лимфоциты с морфологическими признаками апоптоза с конденсацией хроматина и формированием осмофильных скоплений около ядерной мембраны, с расширенной эндоплазматической сетью [Ярилин А А, 1998, Saraste А, 1999] Они располагались в СКЗ, тогда как в норме гибель лимфоцитов путем апоптоза осуществляется в мозговом веществе [Кемилева 3 , 1984]

Под действием капсаицина в пять раз увеличилось абсолютное число макрофагов на единице площади СКЗ (контроль 1,32±0,27, опыт 6,51+1,1, Р <0,01) Среди них встречались клетки с липидными включениями и остатками погибающих лимфоцитов, нередки были ассоциации «макрофаг - тканевой базофил», что свидетельствует об активации иммунитета [Стручко Г Ю и др, 2001] В норме макрофаги локализуются в мозговом веществе тимуса, их появление в СКЗ связано с участием в утилизации алоптозных тимоцитов и свидетельствует о нарушении механизмов аутоселекции [Ruff М et al, 1985]

После введения капсаицина в СКЗ вилочковой железы в четыре раза выросло число плазмоцитов (контроль 1,24±0,17, опыт 5,12+1,3, Р <0,01) Они располагались паравазально, среди них встречались клетки Мотта, которые в норме присутствуют только в мозговом веществе тимуса Их появление в коре отмечается в ситуациях хронического стресса, при активации иммунных механизмов [Gordon S et al, 2001] Плазмоцитарная реакция сопровождалась ростом популяции эозинофилов (контроль 0,67+0,27, опыт 7,12±1,1, Р <0,01) Они так же чаще всего располагались в СКЗ Делимфотизация СКЗ тимуса в опыте сопровождалась появлением телец Гассаля, которые являются местом утилизации тимоцитов, в норме немногочисленны и локализуются в медуллярной зоне [Ерофеева JIМ и др, 1997] В норме в паренхиме тимуса отсутствуют тканевые базофилы [Авакимян СБ и др, 2002] Капсаициновая обработка приводила к резкому увеличению их числа в СКЗ (3,32±0,52, Р <0,01) Реакцию популяции тканевых базофилов на капсаицин можно представить в виде схемы 1

У опытных крыс цепочки из 5-10 дегранулирующих ТБ появлялись в межкапсульных перегородках и в СКЗ Известно, что эта зона - место созревания и селекции аутотолерантных тимоцитов [Быков В JI, 1999] Здесь на них могут влиять медиаторы ТБ Гепарин нарушает иммунные реакции через снижение бластогенеза [Metcalf D et al, 1997], тормозит миграцию лимфоцитов к месту действия антигенов [Baramm D et al, 1997], изменяет транспортную функцию лимфатических сосудов [Борисова РП, Бубнова НА, 1999] Серотонин угнетает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и модулирует по принципу обратной связи вазодилататорную активность вещества П [Khahl Z,

Helme К., 1996]. Пистамин через [lt-рецепторы обеспечивает включение механизмов гиперчувет-вительности [Iwamoto Y., 1992; Hever G. et al,. 1998; Stins M.et at, 2001]. усиливает проницаемость сосудов, вытесняя кальций из эндотелия и подавляя процессы гистогенеза [Kudlaez Е., 1998]. Желатиназа и фмбро-нектин Способствуют Продвижению ТП в паренхиму тимуса [I larvima 1. et al.. 1994].

Схема 1. Влияние капсаициновой деифференпкщии но локализацию тканевых базофилов тимуса крыс Вистар [Жукова Е.М., 2006].

Вблизи капилляров и посткапиллярных вен у л в междо.чьковых перегородках скапливались ТБ с признаками усиления иммунных функций: появлением метахроматичсского ободка по периферии клетки и светлых неокрашенных участков, увеличением конденсации секреторных Гранул. Эта популяция ТБ тимуса, хотя и имеет общее происхождение с экстралимфоидными (соединительнотканными), отличается от них условиями днфференцировки [Быков В.Л,, 1999]. В их липидных структурах активируется наработка иммунных факторов: простагландииов. лейкоториенов, нигокинов, NO [Jarvikallio Л, et al,, 2003; Scardina G, ct al., 2006] Механизм депонирования секреторных гранул в тканевых базофилах под действием капсаиципа не совсем понятен. Возможно, он связан с тем, что вещество Г! но конкурентному принципу блокирует Hj-ауторсцепторы гистамина на клеточной мембране ТБ [Metcalfe D, ct al., 1997]. Известно, чго этот неЙронегггид активирует Экспрессию TNF-a в ТБ грызунов [ОкаЬе Г. et al.. 2000]. Синтетический аналог нейропептидоа S115-M усиливает секрецию иммунных факторов в ТБ через активацию G-белков их клеточной мембраны [Chalidi A. et al., 1996]. При «запорото вом», раздражении сенсорных окончаний ускоряется синтез в ТБ лейкотриеион [Scholzen Т. et al., ¡999]. На третьей неделе действия капсаицина размер долек тимуса не отличался от урок ¡¡я контроля. Нормальная структура тимуса восстанавливалась, хотя признаки инволюции органа еще присутствовали.

Тимус - это не только центральный орган иммуногенеза, но н эндокринная железа. Его эндокринная функция вязана с продукцией гормонов эпителиоцитами [Новых А.А. и др., 2002]. В работе исследовали срезы тимуса, окрашенные альдегадфуксином по Габа-Дыбану, который избирательно выявляет эпителиоциты и макрофаги коры.

Включение механизмов гиперчувствительности черев ауторецепторы

КАПСУЛА ТИМУСА

КЛПСАШПГН (J50 иг/кг)

КОЖА

СУБКАПСУЛЯРНЛЯ ЗОНА ТИлУСА (пролиферация и дифферйщировка ^ тимещитов): ТБдегранулируют к р мигрируют череп V ' ' ■

В НУТ PH КОРТИКАЛЬНАЯ ЗОНА ТИМУСА (селекция ауто-

: Гисташн, (Жротйн1[н;.>Ю,-' ■ иррсш-лачдины^про'казьс-;

тол ера нтн ых ткмоци го в):

МОЗГОПОП Ш1ЩСТВО

IM МУ С А___(депонирование

зрелых тимоцитое).

ВНУТРИДОЛЬКОВОЕ J

ПЕРИВАСКУЛЯРНОЕ ' ПРОСТРАНСТВО Т11МЖА j (транспорт зрелы к т и моцитов

ТБдспонируют [>Ali. усиливая наработку иммунных факторов

В первую неделю действия капсаицина на срезах тимуса опытных животных часто встречались светлые эпителиальные клетки, окрашенные в фиолетовый цвет На срезе они часто контактировали друг с другом Морфометрический анализ показал увеличение (Р <0,01) числа альдегидфуксинположительных эпителиоцитов (ЭпАФ+ контроль 13,42+2,71 опыт 24,3312,47, рис 8)

Данные свидетельствуют об усилении синтеза тимических гормонов в ответ на выброс из КЧН нейропептидов, действие которых

реализуется через NK-1 и ваниллоидные рецепторы на мембране эпителиоцитов [Garland А et al, 1994, Bisaggio R et al, 2001] Есть доказательства усиления активности эпителиальных клеток разных органов после введения экзогенных

нейропептидов в малых дозах (5-10 мг/кг) и стимулирующих доз капсаицина [Bodo Е et al, 2004, Stander S et al, 2004]

Во вторую неделю действия препарата число Эп АФ+ снижалось в два раза по сравнению с таковым в контроле (Р <0,05) и в три раза (Р <0,01) по сравнению с таковым в предыдущий срок наблюдения (рис 8) Сокращение числа Эп АФ+ сопровождается снижением уровня тимических гормонов [Henry К, 1981] Синтез гормонов тимуса снижается под действием хронического стресса [Петров С А и др, 2001], при старении [Гриневич ЮА, Чеботарев ВФ, 1989] Пониженный уровень этих гормонов у мышей генетической линии NZB / W с врожденным аутоиммунным конфликтом [Агеев А К, 1973], у больных с аллергиями, ревматическими аутоиммунными и хроническими воспалительными заболеваниями [Зайратьянц OB, 1992, Шурлыгина AB и др, 2000, Gordon S et al, 2001] Возможно, одной из причин этих эффектов является сенсорная дистрофия и низкий уровень эндогенных нейропептидов Прослеживается связь между изменением содержания нейропептидов и уровнем тимулина (гормона дистантного действия, выделяемого из тимуса в кровь) при коррекции патологической болевой гиперчувствительности [Dardenne М et al, 2006]

Во все сроки действия капсаицина на срезах тимуса, окрашенных по методу Габа-Дыбана, выросло количество альдегидфуксинположительных макрофагов (Мф АФ+, контроль 6,49±1,62, семь суток действия капсаицина 11,67+1,48, две недели - 27,56±3,38, три недели - 21,37+2,19, рис 8) Это свидетельствует об усилении их фагоцитарной активности и может быть результатом действия нейропептидов КЧН Известно, что при стимуляции тахикининовых рецепторов усиливается продукция цитокинов в культуре моноцитов крови [Derocq J et al, 1996], при добавлении экзогенного вещества П повышается функциональная

3 30

Контроль 7сутКс 14 сут Кс 21 сут Кс

Рис 8 Изменение числа альдегидфуксинположительных эпителиоцитов (Эп АФ+) и макрофагов (Мф АФ+) на стандартной площади среза тимуса у контрольных крыс и в разные сроки после введения капсаицина (150мг/кг) *-Р <0,05, ** -Р <0,01 к контрольному уровню

активность макрофагов [Damas J et al, 1996] Рост числа макрофагов может нарушать эвакуацию тимических гормонов [Brennan Р et al, 1991] На 21 сутки после введения капсаицина активность эпителиоцитов тимуса восстанавливалась, количество Эп АФ+ не отличалось от нормы, тогда как число Мф АФ+ было выше контроля в два раза (рис 8)

2.2. Реакция селезенки крыс Вистар на введение капсаицина. Для оценки клеточного состава лимфоидной и нелимфоидной ткани селезенки применялись современные количественные методы, позволяющие выявлять перестройки цитоконструкции органа при экстремальных воздействиях и судить об изменении активности иммунных процессов в организме [Аверина Т M, 2000, Григоренко Д Е и др, 2003] Исследования проводили через одну, две и три недели после введения капсаицина (150 мг/кг) половозрелым крысам Вистар В качестве контроля использовали животных, которым вводили растворитель для капсаицина В трех группах половозрелых крыс одинаковой массы (180,12+11,32 г) на 7, 14 и 21

сутки после введения капсаицина определяли отношение массы селезенки к относительно стабильной величине -массе почки Масса почки и селезенки у интактных и контрольных крыс (с введенным растворителем для капсаицина) достоверно не различалась (селезенка 0,712±0,032 г, почка 0,853±0,021 г) Через неделю действия капсаицина масса селезенки выросла в 2,4 раза по сравнению с таковой в контроле, что обеспечило достоверное (Р <0,01) увеличение селезеночно-почечного индекса в 2,5 раза (рис 9)

Через две недели действия капсаицина значение селезеночно-почечного индекса приближалось к контрольной отметке и на 21 сутки достоверных изменений показателя не выявлено (рис 9) Первоначальное увеличение массы селезенки является ответом на выброс нейропептидов из окончаний КЧН и обеспечивается ростом объема микроциркуляторного русла и притоком клеток Известно, что спленомегалия часто наблюдается при иммунизации, аутоиммунной гемолитической реакции и обеспечивается ростом числа бластов, плазмоцитов, эритроцитов [Isaacson Р, 1996] Последующее снижение массы селезенки связано с изменением клеточного состава органа при развитии нейродегенеративного процесса Есть данные о фазных перестройках селезеночного индекса у животных в онтогенезе, об его уменьшении у старых животных, что связывают с нарастающей дегенерацией нервных окончаний [Сапин M 3, Амбарцумян Е Ф , 1990]

Статистический анализ данных морфометрии выявил значительные изменения клеточного состава лимфоидной ткани селезенки на второй неделе действия капсаицина В перартериальных лимфоидных муфтах (ПАЛМ) опытных крыс значительно увеличилось число всех форм лимфоцитов, кроме бластов, причем число малых лимфоцитов возросло на 38% (Р <0,01) и средних - на 39% (Р <0,01, табл 1) В норме лимфоидная ткань селезенки отличается высоким уровнем

2,5

S F ЯС**

/ТЧ

Ы 1 5 ■ / \

i / т^

Р 1

и I

0,5 ■

Контроль 7сугКс 14сугКс 21сутКс

Рис 9 Селезеночно-почечный индекс

у контрольных крыс Вистар и в

разные сроки после введения

капсаицина (150мг/кг) *-Р<0,05,

** -Р <0,01 к контрольному уровню

лимфоцитопоэза Снижение числа малодифференцированных форм и увеличение количества лимфоцитов, закончивших дифференцировку, характерно для развивающихся адаптационных процессов в лимфоидной ткани при действии хронического стресса [Сапин М Р, Никитюк Б Д, 2000] Аналогично меняется состав лимфоцитов при патологии «блуждающей селезенки», где может иметь место нарушение иннервации органа [Moll S et al, 1996] Действие капсаицина приводило к снижению доли плазмоцитов в ПАЛМ 2,5 раза (табл 1, Р <0,01)

Таблица 1

Процентный состав клеток в структурах селезенки крыс Вистар в норме и через две

недели после введения капсаицина

Клеточные элементы Группы животных Структурные компоненты

ПАЛМ ЛУ МЗ

Малые лимфоциты Контроль 25,41 ± 1,47 27,03 ±0,79 6,06 ± 0,64

14 сут Кс 35,02 ± 1,26** 36,27 ±1,63** 4,24 ±0,31*

Молодые формы клеток (бласты) Контроль 6,68 ±0,43 9,56 ± 0,48 21,66 ± 1,28

14 сут Кс 6,63 ± 0,47 7,06 ± 0,48 15,28 ± 1,29*

Большие лимфоциты Контроль 5,86 ± 0,49 9,55 ±0,76 17,76 ±1,67

14 сут Кс 7,76 ±0,51* 7,17 ±0,33* 13,38 ± 1,13**

Средние лимфоциты Контроль 14,07 ± 0,55 24,54 ± 1,29 20,03 ± 1,47

14 сут Кс 19,67 ±1,02** 22,01 ± 1,16 13,85 ±0,82**

Плазмоциты Контроль 5,57 ± 0,44 _ _

14 сутКс 1,22 ±0,21** 1,56 ±0,23** 2,98 ±1,19**

Макрофаги Контроль 8,46 ± 0,67 4,54 ±0,52 4,05 ±0,43

14 сут Кс 2,01 ±0,87** 1,58 ±0,21** 8,54 ±0,47**

Деструктивно измененные клетки Контроль 12,73 ± 0,68 8,14 ±0,54 7,11+1,02

14 сутКс 17,67 ±1,24** 7,11 ±0,45 25,86 ±1,95**

Ретикулярные клетки Контроль 21,22 ±0,98 16,64+1,56 23,33 ± 0,97

14 сут Кс 10,02 ± 0,57** 17,24 ± 1,16 15,87 ±0,59*

Примечание указаны средние величины с ошибкой средней величины

**- Р <0,01,* - Р <0,05, к величине показателя у контроля по t-критерию Стьюдента Появлялись эти клетки в ЛУ и в МЗ, где в норме они обычно отсутствуют Плазматизация селезенки с преимущественным увеличением числа молодых форм свидетельствует об активации системы гуморального иммунитета [Харченко В П и др, 1998] Изменение клеточного состава селезенки у опытных крыс свидетельствует об усилении иммунной функции органа Активировались области ПАЛМ, которые рассматривают как Т -зависимые зоны [Houte A et al, 1990]и где выявлена самая высокая плотность сенсорных волокон и вП- рецепторов [Blanchi R et al, 1996] В не фильтрующихся зонах красной пульпы селезенки появились вторичные лимфоидные узелки, что является морфологическим признаком активации В-системы иммунитета [Смирнова ТС, Ягмуров ОД, 1993] Иммунологическими методами показано, что введение вещества П активирует Т- и В -клеточный иммунитет [Goetzl V et al, 1995, Чейдо M А, 1997]

В маргинальной зоне (МЗ) под действием капсаицина уменьшилось число всех форм лимфоцитов и выросло количество макрофагов (табл 1) Депонирование фагоцитов в паренхиме селезенки замечено после хирургической невротомии и удаления нервных узлов чревного сплетения [Поскребышева Е А, 1970, Волкова

О.В., 1978|. Известно, что введение экзогенного вещества П активирует макрофаги через NK-1 рецепторы in vitro [Ramcshawar P., 1997: Yamabe M. el al.. 19981. В таких условиях мои оку клеарные фагоциты усиливают наработку фактора некроза опухоли (TNF-а) и про воспалительных нитокинов ИЛ-1. ИЛ-6 | D Ickers он С. et aL 1998]. В ПАЛМ и лимфатических узелках (ЛУ) число селезеночных макрофагов сократилось. Вследствие нарушения целостности клеточных мембран сидерофагов, в межклеточное пространство попадал гемосидерин, который может играть роль ау то антигена [Федоров H.A., Я; шва И.С., 1982].

В периферической кропи животных после невротомии спинномозговых узлов обнаружено появление белков со свойствами аутоантигенов [Никифоров

Л.Ф., I 97.?J Усиление депонирования и распада эритроцитов в селезенке может приводить к снижению гематокрита крови, что обнаружено после неонатального введения капсаицина [Lippe I. et al., 1993]. Такие эффекты имеют место при активации иммунных механизмов [Харченко В,П. и др., 1998], На срезах селезенки опытных крыс появлялись много ядерные мегак ар понято подобные клетки Березовского -Штернберга (рис. 10).

Рис. 10. Крупные мегакариоцшпоподоЬные клетки Березовского - Штернберга а красной пульпе селезенки крыс Вистар (капсаицин. 150 мг/кг, 14 суток). Окраска гематоксилином - эозином, увеличение X 1200.

Появление таких клет ок сопровождалось тромбоцитепенией и нарушением в системе свертывания крови. Тромбоцитопения наблюдается при эктопии селезенки, что связывают со сдавливанием или перекручиванием селезеночной пожки, через которую в орган поступают нервные отростки, в том числе и афферентные [Moll S. et а!., 1996]. Действие капсаицина приводило к увеличению числа деструктивно-измененных клеток в селезенке: в МЗ их число выросло в три раза (табл. 1). 11а 21 день действия капсаицина селезенка казалась увеличенной, сохранялись участки измененной окраски паренхимы. В целом структура восстанавливалась, что связано с нормализацией уровня нейропептидов в сенсорных окончаниях.

2.3. Изменение структуры подколенного лимфатического узла крыс Вистар после введения капсаицина. Прежде всего, на действие капсаицина реагировало микроциркуляторное русло подколенного лимфатического узла (Ш1У). Если у контроля площадь крове нос ных сосудов занимала около пяти процентов от обшей площади среза 11ЛУ, на седьмые и четырнадцатые сутки действия препарата она достоверно увеличивалась (Р <0.05: рис. 11). Па 21 сутки наблюдения лишь отдельные капилляры и непуды оставались расширенными, В целом площадь микроциркуляторпого русла не отличалась от уровня контроля. Анализ результатов позволяет присоединиться к мнению А. М. Чернуха с соавт. [1984] о связи нарушений нервной регуляции с изменением капяллярно-пенозпой проницаемости. Известно, что неонатальная обработка капсаицниом изменяет плотность распределения сосудов 'твердой оболочки головного мозга [Neumann S. et al., 1996J, слизистой желудка [Wächter С. el al.r 1995], повышает активность

щ

4Я&- * W

* ^

р

%

•л

* щ * >

jm Л - w. Ш

Площадь 8 сосудов на

срезеПЛУ, 6_|________

в процентах

Контроль 7сутКс 14сутКс 21сутКс

Р ис 11 Относительная площадь кровеносных сосудов подколенного лимфоузла у контрольных крыс и в разные сроки после введения капсаицина (150 мг/кг) * - Р <0,05 к величине показателя у контроля

холинэстеразы нейронов шейно-грудного отдела у крыс [Румянцева Т А, Шилкин В В, 2001]

В первую неделю действия препарата рост объема микроциркуляторного русла обеспечивался за счет расширения сосудов Через две недели гиперемия

сосудов была редким событием, и этот рост обеспечивался за счет образования новых сосудов на фоне притока тканевых базофилов, которые способны регулировать этот процесс [Gheri В, Balboni G, 1983] Показано увеличение

концентрации ТБ вблизи сосудов в аутотрансплан-тированных тканях [Май-бородин ИВ и др, 2003] При трансплантации нарушается иннервация, в том числе и сенсорная, что делает трансплантированную ткань похожей на денервированную Показано, что ТБ в аутотранстплантантах могут синтезировать нейропептиды - стимуляторы ангиогенеза [Seegers Н et al, 2003]

Подколенный лимфатический узел характеризуются хорошо развитым корковым веществом, которое в норме у крыс превышает мозговое [Бородин Ю И, 1990] У контрольных крыс, которым вводился растворитель для капсаицина, относительная площадь коркового вещества составляла 63,52±0,73%, мозгового -24,18±0,19%, корково-мозговой (К/М) индекс- 2,62 (рис 12) Через неделю действия капсаицина относительная площадь коркового вещества ПЛУ у опытных животных увеличивалась на 12% (71,11±2,07%, Р <0,05, рис 12)

Изменение структуры имело сходство с реактивным откликом ПЛУ на асептическое воспаление через неделю после подкожного введения скипидара собакам [Шурина AM, 1978] Площадь мозгового вещества ПЛУ в первую неделю действия капсаицина сократилась (Р <0,05) Это привело к достоверному (Р <0,01) увеличению (К/М) индекса в 1,6 раза Через две недели площадь коркового вещества ПЛУ у опытных крыс сократилась по сравнению с таковой в предыдущий срок наблюдения и с таковой у контроля (50,17±3,49%, Р <0,01) Одновременно выросла относительная площадь мозгового

Контроль 7сут КС 14 сут Кс 21 сут Кс

Рис 12 Изменение корково-мозгового (к/м) индекса подколенного лимфатического узла у крыс в разные сроки после введения капсаицина (150 мг/кг) ** -Р < 0,01 к величине показателя у контроля

вещества (38,62±3,79%, Р <0,01), что привело к уменьшению К / М индекса в два раза относительно контроля (1,28±0,27, рис 12)

По данным литературы, на второй неделе после чувствительной невротомии у крыс снижается общая территория коркового вещества ПЛУ [Григорьева Т А, 1963] Аналогичные изменения выявлены в ПЛУ у собак после иссечения центральных отростков нейронов спинальных ганглиев на уровне Ь2.з — S2-3 [Склянова Н А, 1979] На 21 сутки наблюдения размеры коры, мозгового вещества и К / М индекс в ПЛУ у опытных крыс не отличались от контроля (рис 12) Фазные изменения корково-мозгового индекса лимфатических узлов отмечены и при других воздействиях Такая реакция отражает явление динамической стереотипии лимфатических узлов при действии дестабилизирующих факторов любой природы [Бородин Ю И, 1990]

В цитологическом составе структурно-функциональных зон ПЛУ у опытных крыс достоверные изменения отмечены через две недели действия капсаицина (табл 2)

Таблица 2

Цитологический состав структурно-функциональных зон ПЛУ у контрольных крыс и через две недели после введения капсаицина (150 мг/кг, указан процент от общего числа

клеток, в группах по шесть животных)

Клеточные элементы Лимфобласты Средние лимфоциты Малые лимфоциты Макрофаги

Герминативный центр

Контроль 0,49 ± 0,03 10,14 ±0,28 88,43 ±0,71 0,94 ± 0,67

Опыт 1,29 ±0,08** 31,04 ±1,52** 64,58 ±1,59* 3,09 ± 1,69*

Паракортнкальная зона

Контроль 0,81 ±0,11 9,92 ±0,59 88,04 ±1,02 1,23 ±0,45

Опыт 0,95 ±0,03* 2,47 ± 0,41** 90,24 ±2,48 6 34 ±2,37*

Клеточные элементы Тлазмо-Зласты Незрелые плазмоциты Зрелые плазмоциты Макрофаги Средние лимфоциты Малые лимфоциты

Мозговые тяжи

Контроль 1,49 + 0,15 14,43+1,16 74,82 ±1,61 2,94 ±0,66 2,14 ±0,21 4,18 ±0,27

Опыт 10,13 ± 1,1** 34,74 ±3,13** 40,88 ± 3,22** 6,13 ±0,36* 4,04 ±0,8* 4,08 ± 0,59

Мозговые синусы

Контроль 1,31+0,05 10,88 ±0,51 51,82 ±2,46 10,62 ±0,65 5,84 ±0,52 19,53 ±0,72

Опыт 11,55 ± 0,59** 9,44 ± 0,54 18,45 ± 1,41** 14,34 ±0,66* 9,13 ±0,53* 37,09 ± 0,53**

Примечание так же как в таблице 1

В герминативных центрах ПЛУ увеличилось число лимфобластов, что связано с выделением нейропептидов, которые оказывают долговременное стимулирующее влияние на пролиферацию лимфоцитов [Eglezos A et al, 1991] В то же время число зрелых лимфоцитов снизилось, что связано со стимулирующим действием медиаторов КЧН через специальные рецепторы [Serizawa Н et al, 1996] на миграцию лимфоцитов [Stem С, 2003] Сокращение числа дифференцированных лимфоцитов приводило к «запустению фолликулов», которое имеет место после невротомии ПЛУ [Григорьева Т А, 1966] В мозговых тяжах и синусах накапливались малые лимфоциты, что свидетельствует о

нарушении механизмов дифференцировки и эвакуации лимфоцитов и часто наблюдается при действии хронического стресса [Moore Т et al, 1990] В утолщенных мозговых тяжах ПЛУ опытных крыс увеличилось количество плазмобластов и сокращалось число зрелых плазмоцитов, появлялись клетки Мотта, многоядерные клетки, тканевые базофилы, гибнущие лимфоциты, нейтрофилы, возрастало число макрофагов (табл 2)

Есть сведения о снижении общего количества плазмоцитов в ткани лимфатических узлов после хирургической невротомии [Григорьева ТА, 1966] Активация макрофагов наблюдается при повреждении других отделов рефлекторной дуги (Чевагина НН, 1986) Наблюдаемые эффекты связаны с действием нейропептидов КЧН Известно, что число фагоцитов на культивируемых

срезах лимфатических узлов у j . £ животных после введения экзогенных

нейропептидов резко увеличивается [Ryu S et al, 2000], в таких условиях усиливается наработка макрофагами иммунных факторов, в частности, цитокинов [Paegelow I et al, 1989] Активно реагировала на введение капсаицина популяция тканевых базофилов (ТБ) В норме у крыс они локализованы в капсуле и краевых синусах ПЛУ (рис 13)

Рис 13 Увеличение популяции тканевых базофилов в подколенном лимфатическом узле крыс через две недели после введения капсаицина Полутонкий срез, окраска толлуидиновым синим Увеличение X1100

ТБ концентрировались вокруг капилляров и венул, что связано с их участием в инактивации излишков нейропептидов [Baram D et al, 1997] Такие эффекты наблюдаются при введении экзогенных нейропептидов и после неонатальной капсаициновой обработки [Alvtng К et al, 1991], при нейродермите и псориазе [Naukkarinen А et al, 1997, Jarvtkalho А et al, 2003] Клиницистами замечена стойкая гиперемия микрососудов и интенсивная реакция ТБ в подколенном ЛУ при ревматоидном артрите [Bruneileschi S et al, 1998]

Одной из причин роста популяции ТБ в ПЛУ после введения капсаицна может быть ограничение их элиминации путем апоптоза Известно, что фактор роста нервов, концентрация которого возрастает при дефиците нейропептидов [Donnerer J et al, 2004], через активацию протоонкогенного рецептора предотвращает апоптоз ТБ [Kawamoto et al, 1995] ТБ могут длительное время поддерживать гиперемию сосудов микроциркуляторного русла, а нейропептиды, могут усиливать реализацию гистамина [Sawynok J et al, 2000], взаимодействовать с Нз-ауторецепторами к гистамину, обеспечивая развитие гиперчувствительности и аллергии [Iwamoto Y et al, 1990]

Рост популяции ТБ в лимфатических узлах однозначно связывают с активизацией иммунных реакций в организме [Ковалевский Г В, 1976, Линдер Д П, Коган Э М, 1976, Умарова Б А и др , 2000] Через Бсв-рецепторы к IgE на поверхности ТБ регулируется интенсивность иммунного ответа [Клименко Н А, Татарко С В , 1995, Сапин М Р , 2000] На гистологических срезах ПЛУ у опытных

животных часто отмечали взаимодействие ТБ между собой и с лимфоцитами Усиление адгезии клеток-участников иммунного ответа свидетельствует об активации иммунитета и является реакцией на выброс нейропептидов Аппликации микродоз вещества П (10"10М) в среду для культивирования Т-лимфоцитов и макрофагов усиливают их взаимную адгезию [Vishwanath R, Mukherjee R, 1996]

Сравнивая изменения структурного гомеостаза ПЛУ, вызванные капсаицином, и эффекты его невротомии (дорзальная ризотомия на уровне Ь2.з - S2. з, Склянова Н А, 1979), можно заметить отсутствие в первом случае эритроклазии и свободнолежащих эритроцитов Важно отметить сходство изменений в ПЛУ под действием капсаицина с возрастными перестройками изменением числа лимфоцитов, особенно в мозговом веществе, увеличением количества макрофагов во всех структурных зонах, что выявлено при исследовании трахеобронхиальных ЛУ в онтогенезе [Бородин Ю И и др, 1992] Возрастные перестройки структуры ПЛУ могут быть следствием ослабления эфферентной функции КЧН Известно, что с возрастом снижается плотность пептидергической иннервации и функциональная активность нейропептидов [Стовичек Г В , 1991, Ferrante F et al, 1991]

3. Реакция клеток венозной крови и биологических жидкостей на деафферентацию капсаицином 3.1. Реакция клеток венозной крови на введение капсаицина

Интегративным показателем структурных перестроек в тканях висцеральных органов является клеточный состав венозной крови При подсчете абсолютного клеточного состава в ее стандартном объеме установлено, что общее количество лейкоцитов на седьмые сутки действия капсаицина увеличилось, прирост обеспечили лимфоциты (контроль 85,11+5,25%, опыт 94,13+1,65%, Р <0,05, рис 14) В то же время относительное количество нейтрофилов венозной крови у опытных животных достоверно (Р <0,05) снижалось в сравнении с этим показателем у контроля (контроль 14,54±5,31%, опыт 4,82±1,81%, рис 14)

Изменения состава крови в первую неделю действия капсаицина, обусловлены, вероятно, выбросом нейропептидов КЧН Увеличение числа лимфоцитов может быть связано с ускорением их эвакуации из лимфоидных органов Есть сведения об увеличении числа белых клеток крови в периферической циркуляции у новорожденных крыс в ранние сроки после неонатального введения капсаицина [Helme R, Eglezos А, 1987] Показано, что вещество П стимулирует гематопоэз, в частности, миелопоэз и пролиферацию Т- и В- лимфоцитов [Rameshwar Р, Gascon Р, 1997] При иммунологическом анализе выявлено увеличение CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови новорожденных крыс после неонатальной обработки капсаицином [Santom G et al, 1999] Эффект обусловлен действием вещества П, так как блокируется антагонистом NK-рецепторов SR140333 Показано, что нейропептиды, действуя через NK- и ваниллоидные рецепторы на лимфоцитах, могут менять не только их структурную локализацию, но и функциональную активность [Lai Z et al, 2000, Li Y et al, 2000] Снижение числа нейтрофилов венозной крови в ранние сроки после введения капсаицина может быть связано с их миграцией в ткани висцеральных органов под действием нейропептидов, где они утилизируют субстанцию П [Dickerson С et al, 1998]

Через две недели действия капсаицина у опытных животных относительное число лимфоцитов венозной крови снижалось почти в два раза (55,32±4,12 %, Р

<0,01) по сравнению, как с предыдущим сроком

наблюдения, так и с контрольным уровнем (рис 14) Процент нейтрофилов -возрастал (43,13+3,81 %, Р <0,01) в три раза по отношению к контролю и в девять раз относительно предыдущего срока наблюдения (рис 14) Определенный вклад в этот эффект может вносить и ослабление синтетической способности костного мозга по наработке клеточных прекурсоров, которое, как известно, сопровождает невротомию [Волкова О В , 1978] и неонатальную капсаициновую обработку [Rameshwar Р, Gascon Р , 1997] Возможна и активация апоптоза лимфоцитов Известно, что интенсивное воздействие на сенсорные нейроны ультрафиолетом ускоряет процессы апоптоза лимфоцитов венозной крови [Донская И А и др , 1998] Через три недели действия препарата (на 21 сутки наблюдения) процентный состав венозной крови контрольных и опытных крыс достоверно не различался (рис 14) Таким образом, введение капсаицина приводило к развитию защитной воспалительной реакции, направленной на восстановление нарушенного гомеостатического равновесия Возникающие в этих условиях лейкоцитоз и нейтрофилез - характерные признаки развивающегося воспаления Причем реакция на действие капсаицина у нейтрофилов по отношению к лимфоцитам является «отсроченной»

3.2. Изменение клеточного состава перитонеального жидкостного смыва и бронхоальвеолярной лаважной жидкости после введения капсаицина В отдельной серии опытов исследовали состав перитонеального жидкостного смыва (ПЖС), как результата дренажной функции лимфоидных органов Для сравнения определяли клеточный состав бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ), которая в меньшей степени обеспечена лимфатическим дренажем из-за наличия в легких собственных дренажных механизмов [Kudlacz Е , Knippenberg R, 1994] и отражает клеточные перестройки в нижних отделах органа, обильно иннервированных КЧН [Verstegui С et al, 1997] Через две недели действия капсаицина увеличилось абсолютное количество клеток в стандартном объеме ПЖС на 61 % (Р <0,05, рис 15, слева) В составе ПЖС стало больше в 4,3 раза тканевых базофилов (ТБ, Р <0,01), в 1,5 раза - нейтрофилов (Нф) и на 28 % эозинофилов (Эф, Р <0,01) Среди ТБ отмечено большое количество дегранулирующих форм, которые контактировали с Эф и нейтрофилами (Нф) Обнаруженные эффекты связаны с капсаициновой блокадой медиаторов КЧН Есть сведения о включении вещества П в регуляцию функций Эф крови [Elshazly A et al, 1997] Прирост количества ТБ ПЖС может обеспечиваться усилением их эвакуации из тимуса под влиянием нейропептидов [Church М et al, 1989]

Контроль 7сугКс НсутКс 21 сугКс

Рис 14 Изменение относительного количества нейтрофилов (%Нф)и лимфоцитов (%Лф) в лейкоформуле венозной крови контрольных крыс и в разные сроки после введения капсаицина (150мг/кг) * -Р < ,0 05* -Р< 0,01 к контрольному уровню

AKKX106/mji

АККХ 10б/мл

ТБ

Рис 15 Абсолютное количество клеток в стандартном объеме смыва перитонеального жидкостного смыва (слева) и бронхоальвеолярной лаважной жидкости (справа) у контрольных крыс Вистар и через две недели после введения капсаицина (150 мг/кг) *-Р < 0,05, **-Р <0,01 к величине показателя у контроля

Известно, что введение вещества П в культуру перитонеальных ТБ стимулирует высвобождение гистамина [Amano Н et al, 1997], который взаимодействует с ^-рецепторами, вызывает увеличение капиллярно-венозной проницаемости с экссудацией компонентов крови в ткани (отек), стимулирует нервные окончания [Kudlacz Е et al, 1998] В сочетании с серотонином гистамин модулирует лейкоцитарную реакцию при остром воспалении [Metcalf D et al, 1997], через Н2-рецепторы действует на нейтрофилы, а через Н] - рецепторы - на моноциты, через Н3 -рецепторы на самих ТБ обеспечивает ауторегуляцию секреции, ограничивая развитие нейрогенного воспаления по механизму обратной связи [Herd С et al, 1995] Абсолютное количество лимфоцитов и нейтрофилов в ПЖС у опытных крыс достоверно не менялось, тогда как макрофагов было в два раза меньше, чем у контроля (Р <0,01, рис 15)

В бронхоальвеолярной лаважной жидкости (БАЛЖ) у опытных крыс абсолютное количество клеток выросло в 1,7 раза (Р <0,01), количество Эф, Лф и ТБ практически не менялось, в то же время на 23% выросло абсолютное число Мф (Р <0,01) и в 3,5 раза - Нф (Р <0,05, рис 15, справа) Результаты отражают отсроченную реакцию гранулоцитов на первичный выброс нейропептидов из сенсорных окончаний в ответ на введение капсаицина После неонатальной капсаициновой обработки в условиях резкого снижения количества нейропептидов в ткани легких отмечены существенные изменения в содержании Нф и Мф и их функциональной активности [Asai Н et al, 1991, Fahy J et al, 1995, Medeiros M et al, 2003] Вещество П, действуя через NK2 рецепторы (Но W et al, 1997), вызывает усиление продукции воспалительных цитокинов в культуре легочных макрофагов [Kudlacz Е, Kmppenberg R, 1994, Veronesi В et al, 1999] Неонатальная капсаициновая обработка повышает чувствительность легочной ткани к действию повреждающих факторов, например, озона [Baluk Р et al, 1992] Полагают, что С - волокна в легочных альвеолах защищают нижние отделы дыхательных путей от оксидантного повреждения [Sternerkock A et al, 1996] Их медиаторы, действуя по механизму аксон-рефлекса, снижают интенсивность озон-

индушроuai 1 Horij воспаления легких, при этом не включаются адренершческий и холинергичсский отделы нервной системы [Sakakibara Ы, ct al., 19941.

13 цитограмме ПЖС у контрольных Kpi.ic больше всего было нейтрофилов (Пф). макрофагов (Мф) и эозинофилов (Эф) (рис. 16. вверху, слева). Через две недели после капсаициновой обработки процент Нф, Эф и Лф в цитограмме 1!ЖС практически не менялся, процент ТВ вырос в 2.8 раза, относительное количество Мф сократилось (рис. 16, вверху, справа). Реакция базофилов И моноцитов связана с изменением содержания пейропептидов в периферических тканях и крови, которые действуют через тахикиниповые рецепторы [Chahdi Л. el al,. 1998J. Возможно и прямое реагирование ТВ на кансаицин через ваниллоидные рецензоры к этому препарату ¡Biro Т. et а!., 1998]. Сокращение процента макрофагов в ПЖС у опытных животных в этих условиях связано, вероятно, с усилением адгезивпости этих клеток при их активации, то есть с известным феноменом исчезновения макрофагов в острой фазе воспаления [Маяпский Д.! I., 19911. Ускорять миграцию макрофагов может жслатиназа, синтез которой усиливается под влиянием пейропептидов [Dorhlo М. et al., 1995].

ТБ2%

2%

Рис. 16. Цитограмма перитонеаяьного жидкостного смыва (вверху) и Бронхоапьвеолярцой лаважной Жидкости fвнизу) контрольных крыс Виспшр (слева) и через две недели после введения капсашрша (справа).

В цитограмме бронхоальвеолярной лаважной жидкости (ВАЛЖ) у контрольных крыс большую часть состава представляли макрофаги (Мф) и нейтрофилы (Нф, рис. 16. внизу, слева). У опытных животных через две недели действия капсаиципа в 2 раза возрастал процент нейтрофилов, тогда как снижалось процентное содержание Мф (на 16%) и ТВ от 4 до 2 % (рис. 16, внизу, справа). Потеря ТБ может быть связана с усилением их дегрануляции [Fewtrcll С, el al.. I982J. При анализе механизмов патофизиологических реакций н дыхательном тракте выявлена важная роль зкефалиназы, выделяемой ТВ, для дезактивации вещества II [Lasarus S,, Rorson D,, 1987|. Согласно данным морфологических исследовании, ТБ в легких непосредственно контактируют с аксонами блуждающею нерва, содержащего сенсорные волокна и контролирующего их

гомеостатическую функцию [Зуга MB, Мотавкин ПА, 1998] Вещество П в наномолярных концентрациях усиливает выработку тканевыми базофилами мышей ИЛ-1, ИЛ-3, TNF, нейропептиды активируют G-белки на клеточной их поверхности, что приводит к повышению цитозольного Са2+ [Ansel J et al, 1993]

3.3. Изменение вязкости венозной крови после инъекций капсаицина. Роль медиаторов первичных афферентных нейронов в регуляции физико-химических свойств крови (вязкости, гематокрита, уровня фибриногена) практически не исследовалась Известно, что вязкость крови определяет сопротивление сосудистого русла, в большей степени (почти на 70%), микроциркуляторного, вследствие действия неньютоновских сил В связи с этим, в собственных экспериментах исследовали вязкость венозной крови в разные сроки после введения капсаицина (150 мг/кг) безгепариновым способом на капиллярном вискозиметре ВК-4 У интактных крыс и с введением растворителя для капсаицина (группа placebo-контроль), вязкость крови составляла, соответственно, 4,34±0,21 и 4,31 ±0,17 относительных единиц У опытных животных через одну и две недели действия капсаицина вязкость крови достоверно увеличивалась по отношению к контролю, соответственно, до 5,27±0,31 (Р <0,01) и 4,86±0,78 относительных единиц (Р <0,05) На 21 сутки после введения капсаицина достоверных отличий исследуемых показателей от уровня контроля не выявлено

В литературе представлены достаточно противоречивые сведения о влиянии капсаициновой обработки на физико-химические и биохимические показатели периферической крови [Schratzberger Р et al, 1997, Li Y et al, 2000, Kempaiah R, Snnivasan K, 2004] Это связано с использованием разных доз препарата и различиями в чувствительности к нему у крыс и мышей [Barada К et al, 1997, Mezei Z et al, 1997, Kang H et al, 1998, Vass Z et al, 1998] После неонатального введения капсаицина вязкость крови возрастала на 22% [Lippe et al, 1993], у половозрелых крыс вязкость крови увеличивается на 68% уже в первые часы после внутривенного введения капсаицина в дозе 5 мг/кг [Holzer Р et al, 1995, Carobi С, 1996] Данные клинических наблюдений [Muchova J et al, 2001], свидетельствуют об изменениях вязкости крови при возрастной или патологической дегенерации сенсорных окончаний и снижении функциональной активности медиаторов афферентных нервов Имеет место значительное снижение иммунореактивности к веществу П в местах локализации периферических сенсорных отростков у больных с хроническим и острым ревматоидным артритом, которое сопровождается нарушением реологии и коагуляционного гемостаза [Burt R et al, 2001]

3 4. Роль капсицин-чувствительных нейронов в регуляции свертывания крови. В отдельной серии исследовали параметры гемокаогуляции на 7, 14 и 21 сутки после введения крысам капсаицина (150 мг/кг) Для этого определяли тромбиновое время свертывания крови при добавлении раствора тромбина (0,1 мл) со стандартной активностью 32-35 с [Балуда ВП и др, 1980] Этот показатель характеризует внутренний механизм первого этапа свертывания крови В эти же сроки эксперимента определяли протромбиновое время цитратной капиллярной крови, которое характеризует внешний путь активации протромбокиназного комплекса Анализ полученных результатов показал, что у контрольных животных, которым вводили растворитель для капсаицина, тромбиновое время не менялось в ходе эксперимента (контроль, рис 17)

Через неделю действия капсаицина тромбиновое время увеличивалось на 12% (контроль 35,34±2,61 с, опыт 41,23±3,42 с, Р <0,05, рис 17) Эффект вызван

действием нейропептидов КЧН, которые выделяются из периферических окончаний под действием капсаицина и снижают функциональную активность

тромбоцитов Данные литературы подтверждают собственные выводы эндогенные пептиды действительно являются ингибиторами

свертывающей активности

тромбина [Пасторова BE и др, 1999, Макаров В А и др, 2002]

Показано, что биогенные амины при остром эмоциональном стрессе могут действовать опосредованно через стимуляцию наработки ИЛ-1(3, который в свою очередь влияет на агрегацию тромбоцитов [Перцов С С , 1997] Через две недели действия препарата величина тромбинового времени уменьшалась (контроль 34,33+2,31 с, опыт 14,24±3,23 с, Р <0,01, рис 17)

Эффекты гиперкоагулемии, вызванные капсаицином, могут сопровождаться активацией тромбиногенеза, так как запуск коагуляционного каскада всегда приводит к образованию тромбина [Бышевский А Ш, 1996] Это подтверждено на модели с неонатальным введением капсаицина [Damon N et al, 1990] При подсчете клеточного состава на мазках крови у опытных животных в этот срок эксперимента отмечено почти двукратное уменьшение количества тромбоцитов Известно, что тромбоцитопения всегда сопровождает патологию подвижной селезенки, которая приводит к перекручиванию селезеночной ножки и ухудшает проводимость нервных путей [Moll S et al, 1996] На 21 сутки эксперимента достоверных отличий тромбинового уровня от контрольных значений не выявлено Изменений протромбинового времени свертывания цитратной капиллярной крови в разные сроки действия капсаицина так же не выявлено

В отдельной серии опытов исследовали систему свертывания крови у калсаицинобработанных и контрольных крыс в условиях нарушения передачи импульсации от чувствитель-ных нейронов в ЦНС В качестве теста использовали показатель тромбинового времени Через две недели после введения капсаицина тромбиновое время свертывания крови крыс снижалось (контроль 35,12±3,13 с, опыт 17,15 ±4,32 с, Р <0,01, рис 18) Ложная операция (вскрытие оболочки спинного мозга) достоверно не меняла исследуемый показатель (34,21+4,34 с, рис 18) У животных с введенным капсаицином после ложной операции тромбиновое время было ниже, чем таковое у контроля (Кп+ ложная операция 25,41+ 2,53 с, Р <0,05, рис 18) Трем группам крыс проводили электрокоагуляцию дорзальных рогов спинного мозга (ДРСМ) на уровне спинного мозга Th 4, что прерывало нервную передачу со вставочных нейронов спинного мозга в центральную нервную систему У интактных крыс такая операция приводила к увеличению тромбинового времени (электрокоагуляция ДРСМ 42,33+2,87 с, Р <0,01, рис 18) Предварительная обработка животных капсаицином (150 мг/кг, за 14 дней) предотвращала этот эффект (Кс + электрокоагуляция ДРСМ 22,11+3,14 с, Р <0,05,

7 сут

14 сут

21 сут

Рис 17 Изменение тромбинового времени свертывания крови у конрольных крыс Вистар и в разные сроки после введения капсаицина (150 мг/кг) *-Р<0,05, **-Р<0,01к величине показателя у контроля

рис 18) Статистический анализ (двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями) выявил достоверные различия (Р <0,0268, t критич = 2,145) в величине показателя между группой с электрокоагуляцией ДРСМ у интактных и обработанных капсаицином крыс Полученный эффект связан с тем, что электрокоагуляция ДРСМ сопровождается с выбросом нейропептидов из периферических окончаний в кровь вследствие раздражения их центральных отростков Это приводит к увеличению тромбинового времени Предварительное истощение содержания нейропептидов в КЧН, предотвращает этот эффект, что свидетельствует о наличии в норме тормозного контроля со стороны центральной нервной системы над реализацией их эфферентной функции

3.5. Динамика изменений функциональной активности нейтрофилов венозной крови после введения капсаицина. Исследовали влияние изменения функциональной активности КЧН на способность нейтрофилов крови к наработке биоокислителей и на общий антиоксидантный потенциал крови Для этого применялась модель с дробным подкожным введением капсаицина половозрелым крысам-самцам Вистар В первую неделю действия капсаицина активность нейтрофилов практически не изменялась, однако чувствительность этих клеток к микробным стимулам существенно снижалась Относительное число HCT -позитивных нейтрофилов в периферической крови обнаруживало тенденцию к снижению - 8,12±1,31 % (контроль 9,43+3,02 %) В индуцированных тестах на этот срок действия препарата показатель HCT теста снижался в тесте с продигиозаном -до 11,23+2,21 % (контроль - 19,12+3,77%, Р <0,05) и со стафилококком - до 10,33+3,24 % (контроль - 14,42±2,48 %, Р <0,05, рис 19)

В целом, показатели и-НСТ - теста с использованием продигиозана достоверно снижались в 1,6 раза, с убитой стафилококковой вакциной — в 1,4 раза по сравнению с таковым в контроле Снижение реактивности нейтрофилов -результат действия нейропептидов, выделяемых из периферических окончаний КЧН Нейропептиды могут действовать на лейкоциты через NK-1 рецепторы, связанные с G -белками и тирозинкиназной системой [De Kose V et al, 1994, Schratzberger P et al, 1997] Аналогичным эффектом обладают малые дозы капсаицина (5-10 мг/кг), снижающие воспалительный ответ при септическом воспалении у крыс [Demirbilek S et al, 2004] Через две недели действия препарата, когда уровень нейропептидов в периферических сенсорных окончаниях снижается [Holzer Р, 1998], наблюдалось достоверное (Р <0,05) увеличение активности

Рис 18 Тромбиновое время у разных экспериментальных групп крыс Вистар * - Р <0,05, ** - Р < 0,01 к показателю у интактных крыс

нейтрофилов периферической крови в с - НСТ—тесте (19,32+3,22 %), и и-НСТ -тссте с проднгиозаном (27,17±3,91 %) и стафилококком (28,16+4,33 %; рис. 19).

Таким образом, па этот срок наблюдения активность популяции ней троф ильных

лейкоцитов периферической крови в с -НСТ -тесте возросла в два раза но сравнению с таковым В контроле, в и -ИСТ (после дополнительной стимуляции проднгиозаном) - в 1,4 раза. Активность нейтрофилов, стимулированных убитой стафилококковой вакциной, возросла в два раза по сравнению с таковой в контроле; Па 21 сутки действия капсанцина процент НСТ-позитивных нейтрофилов в крови у опытных животных был достоверно ниже (Р <0,(35) контрольного уровня как в спонтанном, так и в индуцированном варианте (рис. 19). Анализ результатов позволяет предположить, что причиной изменения способности нейтрофилов к продукции био окислителей в рг[зные сроки после введения канеаицина являются фазные изменения уровня пейронептидов в окончаниях сенсорных нейронов.

Общую ан ти оксид ai ] гную активность (АОА) плазмы крови определяли биохеми; 1юм инее цен 1ным методом с перекисью водорода. Контролем в этой серии служили крысы, которым вводился растворитель для капсанцина. Статистическая обработка показаний хемилюминометра выявила тенденцию к увеличению АОА плазмы венозной крови у опытных крыс в первую неделю действия капсанцина. Усиление хемилюминесцснтною ответа связано с появлением а плазме крови нейропептидов, которые усиливают способность полиморфпоядерпых лейкоцитов и моноцитов к продукции активных метаболитов, что изменяет анпюкеидаитную активность [Brain S,, 1997],

Известно, что нейропептиды в физиологически значимых (наномолярных) концентрациях оказывают праймирующий эффект на нситрофилы [Tominaga К. et al., 1999], инициируют хемотаксис моноцитов [Ruff M. et al., 1985] и нейтрофилов [Galoyan S. el al., 2003], активируют их цитотоксическую функцию, модулируя воспалительную реакцию [Serra M. et al.. 1988]. Через две недели действия капсанцина величина ДОЛ снижалась в 1,6 раза (опыт: контроль: 46,61±2,13: опыт: 28,16±2,34 относительных единиц; I1 <0,05). Это сочеталось с повышением способности полиморфпоядерпых лейкоцитов к продукции биологических окислителей, и было следствием блокады медиаторов КЧ11 вследствие селективного действия капсанцина. На двадцать первые сутки эксперимента величина АОА у опытных крыс ne отличалась от контрольного уровня. Изменения ЛОЛ периферической крови у крыс после введения капсаицина связаны с изменением уровня нейропептидов в сенсорных окончаниях, вызванного действием препарата.

^ 30 и в"* н

% 25 -Н

У 20

15 10 -5 -

0

□ с-НСТ Ни-НСТ(пр)

□ н-1 [СТ(ст)

J

Контроль 7 сут,

14сут. 21 сут.

Рис. 19. Процент НСТ-позтпивных нейтрофилов в венозной крови (спонтанный и индуцированный тест) контрольных крыс и в разные сроки после введения капсагщина (150мг/кг). * - Р <0.05; **-Р

<0,01 в сравнении с таковым у контроля

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Фармакологическая деафферентация капсаицином позволяла временно «выключать» чувствительную иннервацию с последующим ее восстановлением, и исследовать эффекты дисбаланса нейропептидов капсаицин-чувствительных нейронов (КЧН) в коже, лимфоидных органах, крови, биологических жидкостях Полученные результаты подтверждают гипотезу о двойной афферентно-эфферентной функции первичных афферентных нейронов [Holzer Р, 1992], дополняя ее новыми данными о наличии центральной регуляции их функциональной активности

Постоянный перенос воды, ионов, макромолекул между кровью, лимфой и интерстицием - основа для поддержания гомеостаза и жизнеобеспечения тканей и органов Установлено, что капиллярно-венозная проницаемость кожи для витального красителя под влиянием капсаицина многократно возрастала В длительном хроническом эксперименте выявлено снижение проницаемости сосудов в ответ на кожные аппликации ирритантов у крыс в процессе старения, что раскрывает причины нарушения трофики тканей в ходе индивидуального развития Впервые обнаружены половые различия в реагировании на аппликацию ирритантов у экспериментальных животных у половозрелых самок тест по Менкину был интенсивнее, чем у самцов, что связано с более высоким содержанием нейропептидов в их периферических тканях и органах У старых животных (одного и полутора лет) эффект не вьивлялся, что связано, возможно, с возрастным снижением содержания нейропептидов в периферических сенсорных окончаниях Принципиально важные данные получены в экспериментах с хирургической перерезкой дорзальных рогов спинного мозга у интактных и обработанных капсаицином крыс Они свидетельствуют о наличии тормозного контроля со стороны центральной нервной системы над функциональной активностью капсаицин-чувствительных нейронов Ограничение тормозного контроля ЦНС может усиливать спонтанное тоническое выделение нейропептидов из сенсорных окончаний и способствовать возникновению микроциркуляторных нарушений

Дисбаланс нейропептидов после введения капсаицна приводил к снижению структурных резервов тимуса, сокращению его объема за счет уменьшения рабочей паренхимы - лимфоцитов, росту популяции тканевых базофилов, изменению их структурной локализации и активности После введения препарата угасала синтетическая способность эпителиоцитов тимуса, увеличивалось число макрофагов и усиливалась их функциональная активность Блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов сопровождалась структурными перестройками, которые приводили к дисфункции Т- и B-систем иммунитета Проведенный анализ позволяет заключить, что нервные влияния являются для тимуса существенным фактором морфогенеза Отмечено определенное сходство в нарушениях при блокаде нейропептидов капсаицином и при действии хронического стресса, под влиянием аутоантигенов и с увеличением возраста Основа этих процессов - дегенерация нервных элементов Возможно, влияния медиаторов первичных афферентных нервов находятся в антагонистических взаимоотношениях с действием медиаторов классических эфферентных систем (симпатической, парасимпатической, гормональной)

Под влиянием капсаицина наблюдались значительные изменения структуры селезенки, наиболее выраженные в области трабекул и окружающего их

пространства, где локализованы многочисленные нервные проводники Длительное действие капсаицина приводило к сокращению площади структур белой пульпы, плазматизации маргинальной зоны, сладжу эритроцитов в сосудах Блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нервов сопровождалась появлением в селезенке крупных мегакариоцитоподобных клеток, что говорит о нарушении тромбоцитопоэза Селезенка важна для реализации адаптационно-трофических механизмов, доказано ее участие в реакциях стресса, эмоционального возбуждения, воспаления Она является важным переключающим звеном в гемодинамике и в процессах основного обмена, в частности, при переходе на гликолиз при экстремальных температурных воздействиях Капсаицин-чувствительные нейроны в этой структуре могут координировать переключение с пластического на энергетический обмен при стрессе

В работе впервые получены данные о структурных перестройках в подколенном лимфатическом узле в динамике после введения капсаицина усиленная работа микроциркуляторного русла сопровождалась фазными изменениями корково-мозгового индекса При блокаде медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов патоморфологические изменения развивались по типу стрессовой реакции и выражались в сокращении объема коры и увеличении мозгового вещества за счет утолщения мякотных тяжей и расширения мозговых синусов В лимфоидной паренхиме увеличилось число незрелых лимфоцитов, в мозговом веществе усиливалась плазматизация, увеличивалась численность фагоцитов во всех структурно-функциональных зонах Морфометрия срезов подколенного ЛУ выявила значительный рост популяции тканевых базофилов Отмечено сходство возрастных и патологических (при развитии ревматоидного артрита) изменений этой структуры, которые являются следствием истощения содержания нейропептидов и сокращения плотности сенсорной иннервации

Одновременно проводился анализ клеточного состава крови и биологических жидкостей Важность такого комплексного подхода обоснована при экспериментальном исследовании результатов стрессовых воздействий Анализ лейкоформулы венозной крови в динамике действия капсаицина выявил фазные изменения относительного числа лейкоцитов и нейтрофилов, при неизменном уровне моноцитов В ранние сроки действия капсаицина возрастало число клеток белой крови, а нейтрофилов - сокращалось Реакция нейтрофилов объясняется их миграцией в ткани для утилизации нейропептидов, эффект лейкопении - с угнетением кроветворной функции находящейся в зоне действия капсаицина области костного мозга Впервые показано влияние дисфункции КЧН на продукцию нейтрофилами биоокислителей увеличение в ранние сроки действия препарата и резкое снижение в условиях фармакологической деафферентации количества активных нейтрофилов в индуцированном варианте НСТ-теста, характеризующим резервные возможности данной функциональной системы Эти фазные перестройки связаны, вероятно, с изменением уровня нейропептидов под действием капсаицина На фоне изменения способности полиморфноядерных лейкоцитов к продукции биологических окислителей, менялась и общая антиоксидантная активность венозной крови Выявлены более существенные сдвиги клеточного состава перитонеального жидкостного смыва, по сравнению с бронхоальвеолярной лаважной жидкостью, что может быть связано с менее плотной сенсорной иннервацией легких по сравнению с лимфоидными органами, результирующей дренажа которых является перитонеальный смыв Полученные

эффекты связаны с дисбалансом нейропептидов первичных сенсорных нейронов и свидетельствуют о развитии защитной воспалительной реакции, направленной на восстановление нарушенного гомеостаза

Выявлены фазные изменения вязкости крови у капсаицинобработанных животных, что является результатом дисфункции сенсорных нейронов Собственные данные свидетельствуют о фазных изменениях показателя внутрисосудистого свертывания - тромбинового времени - в динамике после введения капсаицина и отсутствие реакции в тесте с определением протромбинового (тромбопластиного) времени, что свидетельствует о включении медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов в контроль внутренних механизмов образования протромбокиназы Обобщая результаты собственных исследований, можно заключить, что получены новые данные, раскрывающие физиологические механизмы реализации эфферентных функций первичных сенсорных нейронов Полученные результаты позволяют предположить, что чувствительные к капсаицину непйроны являются анатомическим субстратом для реализации нейроиммунных взаимодействий и модулируют влияние классических эфферентных нейронов на иммунитет, обеспечивая проявление феномена неспецифической резистентности Анализ собственного материала и данных литературы позволяет предполагать, что физиологическая роль капсаицин-чувствительных нейронов заключается не только в передаче информации в ЦНС, но и в регуляции микроциркуляции и гомеостатических механизмов Координируя работу эффекторов тканевого и гуморального гомеостаза при интенсивных и длительных стрессовых, болевых, температурных, лучевых и токсических воздействиях, капсаицин-чувствительные нейроны организуют специфическую защитную реакцию - нейрогенное воспаление Полученные в работе результаты развивают концепцию двойной афферентно-эфферентной функции первичных сенсорных нейронов, дополняя ее новыми фактами локальных периферических влияний КЧН и принципиально новыми результатами о контроле над реализацией их функциональной активности со стороны центральной нервной системы

ВЫВОДЫ

1 Влияние первичных афферентных нейронов на капиллярно-венозную проницаемость снижается в ходе индивидуального развития и различается у молодых животных разного пола

2 Вызванное капсаицином усиление капиллярно-венозной проницаемости кожи устраняется после перерезки проводящих путей дорзальных рогов спинного мозга, то есть сосудистые эффекты капсаицин-чувствительных нейронов находятся под рефлекторным тормозным контролем центральной нервной системы

3 Подкожное введение крысам капсаицина приводит к изменению структурного гомеостаза лимфоидных органов, общий характер которых свидетельствует об активации клеточного и гуморального иммунитета

4 В тимусе блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов приводит к сокращению объема лимфоидной паренхимы, к росту числа, функциональной активности макрофагов, изменению структурной локализации тканевых базофилов, снижению гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов

5 В селезенке под действием капсаицина активируются герминативные центры, усиливается фагоцитарная активность сидерофагов, плазматизация органа и адгезивность клеток, нарушается трансформация мегакариобластов

6 В подколенном лимфатическом узле при блокаде медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов растет объем микроциркуляторного русла, популяция тканевых базофилов, число макрофагов в мозговых синусах и плазмоцитов в мякотных тяжах

7 Действие капсаицина приводит к снижению относительного числа лимфоцитов венозной крови и росту процента нейтрофилов, у которых ослабевает способность к продукции биоокислителей, что сопровождается снижением общей антиокислительной активности крови

8 Блокада капсаицин-чувствительных нейронов сопровождается ростом числа тканевых базофилов и эозинофилов в перитонеальном жидкостном смыве, макрофагов и нейтрофилов в бронхоальвеолярной лаважной жидкости

9 Действие капсаицина приводит к увеличению вязкости крови и активации механизмов внутрисосудистого свертывания После электрокоагуляции дорзальных рогов спинного мозга эффект ослабевает, что доказывает наличие центрального контроля над проявлениями эфферентной функции капсаицин-чувствительными нейронов

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Выявлены общие закономерности и специфические особенности изменений анатомической организации и клеточного состава лимфоидных органов при экспериментальном нейрогенном воспалении, которые обосновывают возможность применения агонистов и антагонистов тахикининовых и ваниллоидных рецепторов для предотвращения аллергизации и хронизации воспалительных процессов

2 Разработанная концепция может быть учтена в практической медицине для обоснования применения препаратов с целью повышения резистентности организма в целях профилактики патологий психосоматической природы, в частности, ревматоидного артрита, и хронических воспалительных заболеваний

3 Основные результаты диссертации могут быть включены в учебные программы по психофизиологии, клинической психологии (раздел психосоматика)

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК-

1 Жукова, Е М Возрастные изменения активности пептидергических окончаний в коже у крыс/EM Жукова, Г Г Князев//Физиол журн им ИМ Сеченова - 1995 - Т 81, №7-С 145-147 - ISSN0869-8139

2 Спиридонов, В К Влияние блокады капсаицин-чувствительных нервов на развитие экссудативной реакции при иммунном ответе и асептическом воспалении / В К Спиридонов, Е М Жукова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 1996 -Т 123, №10 - С 434-436 - ISSN 0365-9615 (Соавт)

3 Жукова, ЕМ Исследование трофической функции сенсорных нейронов при капсаициновой блокаде и предварительной перерезке спинного мозга // Бюллетень Сибирского отделения РАМН - 1997 - № 3 - С 43-45 - ISSN 0869-8139

4 Жукова, Е М Реакция клеток подкожной соединительной ткани на активацию и блокаду пептидергической системы / Н Ф Воробьева, Г Г Князев, В К Спиридонов, Е М Жукова//Патологическая физиология и экспериментальная терапия - 1997 - №1 -С 2123 -ISSN0031-2991 (Соавт)

5 Жукова, Е М Морфофункциональные изменения селезенки крыс после капсаициновой блокады периферических афферентных нейронов /ЕМ Жукова, Н Ф Воробьева // Морфология - 1998 - Т 114 - № 6 - С 44-46 - ISSN 0004-1947

6 Жукова, ЕМ Влияние частичной перерезки спинного мозга на сосудистую проницаемость кожи нормальных и обработанных нейротоксической дозой капсаицина крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2000 - Т 129, №4 - С 402403 -ISSN0365-9615

7 Жукова, Е М Двигательная активность и эмоциональная реактивность в новой обстановке у крыс после фармакологической блокады или стимуляции или блокады периферических капсаицин-чувствительных нейронов // Журнал высшей нервной деятельности - 2000 - Т51 - № 1 - С 114-116 - ISSN 0044-4677

8 Жукова, ЕМ Динамика изменений функциональной активности нейтрофилов венозной крови после введения капсаицина крысам Вистар /ЕМ Жукова, О П Макарова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины- 2002 - Том 134, № 3 - С 271274 - ISSN 0365-9615

9 Жукова, Е М Роль капсаицин-чувствительных нейронов в контроле структурной организации тимуса // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины- 2005 - Т 140-№8-С 222 - ISSN 0365-9615

10 Жукова, ЕМ Участие афферентных капсаицин-чувствительных нейронов в контроле гомеостаза венозной крови и биологических жидкостей // Успехи современного естествознания - 2003 - № 4 - С 45 - ISSN 1681 -7494

11 Жукова, Е М Участие оксида азота в реализации адаптационной функции капсаицин-чувствительных нейронов // Вестник Томского государственного Университета -2006 -№21 -С 51-52-ISSN 1561-7793

Публикации в научных журналах, сборниках статей, материалах конференций.

12 Жукова, ЕМ Влияние капсаицина на экссудативную реакцию у иммунизированных и неммунизированных мышей /ЕМ Жукова, В К Спиридонов // Сб науч тр «Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии» -Томск - 1992-С 105-108

13 Князев, Г Г Центральная модуляция эфферентной функции капсаицин-чувствительных нейронов / Г Г Князев, 3 С Толочко, Г Б Князева, Е М Жукова // Тезисы доклада II съезда физиологов Сибири - Новосибирск - 1995 -С 202-203 (Соавт)

14 Жукова, Е М Участие афферентных пеитидергических нейронов в регуляции термочувствительности и сосудистой проницаемости у крыс разного пола и возраста / ЕМ Жукова, Г Г Князев//Там же, с 157-158

15 Жукова, ЕМ Роль афферентных капсаицин-чувствительных нейронов в организации васкулярного компонента нейрогенного воспаления / ЕМ Жукова, Г Г Князев // Патофизиология органов и систем Типовые патологические процессы Тез докл IPocc конгр по патофизиологии -М - 1996-С 266

16 Жукова, ЕМ Эффекты введения нейротоксических доз капсаицина на гистофизиологию ткани селезенки /ЕМ Жукова, Н Ф Воробьева // Колосовские чтения-97 Тез докл III Международной конф - С-Петербург - 1997 - С 35-36

17 Жукова, ЕМ Влияние капсаициновой блокады афферентного звена центральной нервной системы на морфофункциональное состояние селезенки крыс /ЕМ Жукова, Н Ф Воробьева // Проблемы профилактической лимфологии и санаторно-курортной реабилитации Мат научно-пракгич конф -Новосибирск - 1997-С 61-63

18 Жукова, Е, М Реологические свойства крови в условиях блокады и стимуляции периваскулярных отростков афферентных нервов // Тез докл III съезда физиологов Сибири и Д/Востока -Новосибирск - 1997 - С 73

19 Жукова, Е М Двигательная активность и эмоциональная реактивность в новой обстановке у крыс после фармакологической стимуляции или блокады периферических чувствительных нейронов // Там же, с 73-74

20 Жукова, ЕМ Активация тучных клеток в тимусе крыс после блокады периферических афферентных нейронов капсаицином /ЕМ Жукова, Н Ф Воробьева //

Проблемы лимфологии и эндоэкологии Труды НИИКиЭЛ СО РАМН - Новосибирск -1998 - Т 7 - С 124-125

21 Жукова, ЕМ Реакция ткани селезенки на стимуляцию афферентного звена центральной нервной системы малыми дозами капсаицина // Современные лечебные и диагностические технологии в спец мед помощи Тез докл научно-практич конф -Новосибирск - 1997-С 50-51

22 Жукова, Е M Физиологическая роль афферентных капсаицин-чувствительных нейронов в контроле морфофункционального состояния тканей и целостности гистогематических барьеров /ЕМ Жукова, H Ф Воробьева // XYII съезд физиологов России Тез докл - Ростов-на-Дону - 1998 - С 136

23 Жукова, Е M Новая концепция взаимодействия афферентного отдела центральной нервной системы с иммунитетом /ЕМ Жукова, H Ф Воробьева // Морфологические науки - практике здравоохранения и ветеринарии Тез докл научно-пракг конф - Омск - 1999 - С 20-21

24 Жукова, Е M Клеточный состав венозной крови и биологических жидкостей после фармакологической блокады нейропептидов периферических афферентных нервов / Е M Жукова, О П Макарова, H П Бгатова // Сборник научн трудов конф, посвящ 70-летию чл-корр СО МАНВШ А И Рыжова - Томск - 1999 - С 169- 170

25 Жукова, Е M Морфофункциональные изменения в лимфоидных органах после капсаициновой блокады периферических афферентных нейронов / ЕМ Жукова, Л А Обухова, H Ф Воробьева // Всеросс конф «Нейроиммунопатология» Тез докл -Москва - 1999 - С 33-34

26 Жукова, Е M Роль эффекторов тканевого и гуморального гомеостаза в развитии хронического воспалительного процесса после фармакологической деафферентации /Е M Жукова, Л А Обухова // Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма Тез докл IY Междунар симп - Бишкек -1999, ТII - С 35-36

27 Жукова, Е M Роль афферентных капсаицин-чувствительных нейронов в поддержании морфофункционального состава лимфоидных органов и биологических жидкостей /ЕМ Жукова, Л А Обухова, О П Макарова, H П Бгатова // Всеросс научн конф с международным участием, к 150-летию со дня рождения И П Павлова Тез докл -Санкт-Петербург - 1999 - С 151

28 Жукова, Е M Морфологические изменения в легких и в составе бронхоальвеолярного лаважа крыс при экспериментальном нейрогенном воспалении //10 Нац конгресс по болезням органов дыхания Тез докл - Санкт-Петербург - 2000 - С 14

29 Жукова, Е M Тучноклеточная реакция в тимусе и биологических жидкостях крыс Вистар после фармакологической деафферентации /ЕМ Жукова, О П Макарова // Патогенез хронического воспаления Тез докл на II Всеросс симп с международным участием - Новосибирск - 2000 - С 27

30 Жукова, Е M Участие капсаицин - чувствительных нейронов спинальных ганглиев в контроле функциональной активности регуляторов гемостаза // Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии Тез докл на междунар симп -Новосибирск -2000 -С 110-111

31 Zhukova, ЕМ Morphoctructural changes and reaction of homoeostasis effectors m the knee lymph nodes after capsaicin injections in neurotocsical doses by Wistar's rars // International Scientific and Practical Conf devoted to the 10 л anniversary of the Republic of Kazakhstan «Actual Problems ofExper and Clin Physiology»-Alma-Ata -2001 -P 130-131

32 Жукова, E M Морфоструктурные перестройки и реакция эффекторов гомеостаза в тимусе крыс Вистар после действия нейротоксических доз капсаицина // XVIII съезд физиол общества им И П Павлова Тез докл - Казань - 2001 —С 338

33 Жукова, E M Динамика морфоструктурных перестроек подколенного лимфатического узла крыс Вистар после введения нейротоксической дозы капсаицина //

Актуальные вопросы экспериментальной и клинической морфологии Тез докл межрегиональнойнаучн конф -Томск -2001 -С 22-24

34 Жукова, Е М Морфология тимуса при изменении функциональной активности нейропептидов первичных сенсорных нейроцитов после введения нейротоксической дозы капсаицина // Всерос конф «Нейроиммунопат » Тез докл - Москва - 2002 -С 28-29

35 Жукова, ЕМ Влияние капсаициновой деафферентации на функциональную активность нейтрофилов периферической крови крыс Вистар // IV Съезд физиологов Сибири и Д/Востока Тез докл - Новосибирск -2002 - С 91-92

36 Жукова, ЕМ Динамика изменений морфофизиологических индексов тимуса при модуляции активности сенсорных нейропептидов // IV Съезд физиологов Сибири и Д/Востока Тез докл - Новосибирск - 2002 - С 92

37 Жукова, Е М Реакция эпителиальной стромы тимуса на выключение афферентной иннервации после капсаициновой блокады // Эндокринная регуляция физиол функции в норме и патологии Тез докл II научной конф с междунар участием — Новосибирск -2002 -С 23

38 Жукова, ЕМ Состояние коагуляционного гемостаза у крыс в условиях фармакологической деафферентации капсаицином // Гомеостаз и экстремальные состояния организма тез докл IX Междунар симпозиума - Красноярск - 2003 - С 50

39 Жукова, Е М Усиление апоптоза тимоцитов в условиях снижения содержания нейропептидов в периферических отростках капсаицин-чувствительных нейронов Механизмы регуляции висцеральных функций Тез докл международного симп - Санкт-Петербург -2003 -С 107-108

40 Жукова, ЕМ Участие сенсорных нейропептидов в контроле структурного гомеостаза лимфоидной паренхимы и функциональной активности эпителиоцитов тимуса //Росс научно-практ конф , к 50-летию ЧГМА Тез докл - Чита -2003 -С 329-330

41 Жукова, ЕМ Участие капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции сосудистой проницаемости // Бюллетень сибирской медицины - 2005 - Т 4 - С 5-6 ISSN 1682-0363

42 Жукова, Е М Динамика изменений сосудистой проницаемости и термочувствительности кожи у крыс Вистар после введения капсаицина // Механизмы функционирования висцеральных систем» Тез докл на Росс конф с междунар участием, Санкт- Петербург, 2005 - С 94-95

43 Жукова, ЕМ Участие оксида азота в реализации эфферентной функции капсаицин- чувствительных нервов // Патогенез - М НИИ общей патологии РАМН, 2006 - Том4, № 1 -с 50

44 Жукова, Е М Роль капсаицин-чувствительных нервов и окиси азота в регуляции микроциркуляторного русла подколенного лимфоузла крыс // XIX съезд физиологического общества им ИП Павлова Тез докл -Москва -2007 -С 145

45 Жукова, Е М Роль капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов тимуса // Бюллетень Сибирского отделения РАМН - 2007 - Т 125 - № 3 - С 138-141 ISSN 0869-8139

ЛИСТ СОКРАЩЕНИЙ

NK-1 - нейрокининовые рецепторы

АОА - антиокислительная активность

вП (sP) - вещество П, substantia Р

КГРП (CGRP)- кальцитонин-ген-родственный

пептид, N0- оксид азота

ДРСМ - дорзальные рога спинного мозга

Кс - капсаицин, КЧН - капсаицин-

чувствительные нейроны

Эф - эозинофилы,

Мф - макрофаги, Лф - лимфоциты

Нф - нейтрофилы, Тр - тромбоциты

ПАЛМ - перитонеальные лимфоидные муфты,

МЗ - маргинальная зона

ПЖС - перитонеальный жидкостный смыв,

БАЛЖ - бронхоальвеолярная лаважная

жидкость

ПЛУ - подколенный лимфатический узел ТБ - тканевые базофилы РА- ревматоидный артрит ЦНС- центральная нервная система

Подписано к печати 15 июня 2007 г Тираж 100 экз Заказ № 595 Отпечатано "Документ-Сервис", 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел 335-66-00

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Жукова, Елена Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Участие первичных афферентных нейронов в физиологической регуляции висцеральных функций.

1.2. Общая характеристика медиаторов первичных афферентных нейронов - нейропептидов.

1.3. Капсаицин - природный модулятор активности первичных сенсорных нейронов.

1.4. Современные данные о сенсорной иннервации, анатомии и физиологии вилочковой железы, селезенки и подколенного лимфатического узла.

1.5. Участие капсаицин-чувствительных нейронов в контроле капиллярно-венозной проницаемости, ноцицепции, функций эффекторов воспаления и в патогенезе психосоматических расстройств.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Участие капсаицн-чувствительных нейронов в регуляции капиллярно-венозной проницаемости.

3.1. Изменение капиллярно-венозной проницаемости кожи бедра у крыс-самцов Вистар в онтогенезе.

3.2. Динамика изменений капиллярно-венозной проницаемости кожи у крыс-самцов Вистар после введения капсаицина.

3.3. Влияние половых различий в уровне сенсорных нейропептидов на капиллярно-венозную проницаемость в коже у крыс Вистар разного возраста.

3.4. Влияние частичной перерезки спинного мозга на капиллярно-венозную проницаемость у интактных и обработанных капсаицином крыс.

Глава 4. Структурные и функциональные изменения в лимфоидных органах в условиях дисбаланса нейропептидов первичных афферентных нейронов.

4.1. Изменение структурного гомеостаза тимуса и функциональной активности его эпителиоцитов у крыс Вистар после введения капсаицина.

4.2. Реакция селезенки крыс Вистар на введение нейротоксической дозы капсаицина.

4.3. Изменение структурной организации подколенного лимфатического узла крыс Вистар после введения капсаицина.

Глава 5. Реакция клеток венозной крови и биологических жидкостей на деафферентацию капсаицином.

5.1. Клеточный состав венозной крови в динамике после введения нейротоксической дозы капсаицина.

5.2. Клеточный состав перитонеального жидкостного смыва и бронхоальвеолярной лаважной жидкости после введения капсаицина.

5.3. Изменение вязкости крови после инъекций капсаицина.

5.4. Участие капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции системы свертывания крови.

5.5. Динамика изменений функциональной активности нейтрофилов венозной крови после введения капсаицина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций лимфоидной ткани, биологических жидкостей и капиллярно-венозной проницаемости"

Актуальность проблемы. Роль афферентного звена центральной нервной системы в регуляции периферических гомеостатических процессов изучается в течение длительного времени [Павлов И.П., 1951; Хаютин В.М., 1999]. Новый аспект этих исследований - выявление физиологической роли первичных сенсорных нейронов тройничных и спинальных ганглиев [Beitran J. et al., 2007; Tang L., 2007]. Эти нейроны не только передают в центральную нервную систему информацию о действии физических и химических факторов, но и оказывают эффекты на периферии, механизмы которых не определены [Albutaihi I. et al., 2004; Demirbilek S. et al., 2004; Lo Y. et al., 2005].

Первичные афферентные нейроны способны генерировать как градуальные, так и импульсные сигналы и реализуют в качестве медиаторов нейропептиды группы тахикининов - вещество П (вП) и кальцитонин-ген-родственный пептид [КГРП; Nagy I., Rang Н. 1999]. Нейропептиды подвержены селективному действию капсаицина [Geppeetti, Р. et al., 1988], который в последние годы стал одним из основных инструментов для исследования их функций [Tang L., 2007]. В последние годы разрабатывается концепция, согласно которой капсаицин-чувствительные нейроны (КЧН) не только передают сигнальную информацию с периферии в ЦНС, но и с помощью своих медиаторов контролируют периферические гомеостатические процессы [Holzer Р., 1998; Beitran J.et al., 2007]. Несмотря на то, что в этой области проведено большое количество исследований, механизмы реализации эфферентной функции КЧН не установлены. Особенно мало фактов, доказывающих проявление влияний афферентного звена ЦНС в органах иммунной защиты, в крови и других биологических жидкостях, недостаточно исследована их роль в регуляции капиллярно-венозной проницаемости.

Использование селективного действия капсаицина на первичные афферентные нейроны спинномозговых ганглиев, позволило разработать модификацию метода фармакологической деафферентации, которая лишена недостатков хирургической невротомии и ганглиоэктомии. В зависимости от использованной дозы капсаицин может избирательно повреждать нейроны спинномозговых ганглиев [Nagy I. et al., 1993; Arbuckle J., Docherty R., 1995; Румянцева T.A., Шилкин В.В., 2001], вызывать атрофию тонких немиелизированных волокон С- и , частично, А-типа первичных афферентных нейронов [Vizzard М. et al., 1995], снижать порог восприимчивости термочувствительных рецепторов [Lu Z. et al., 1990; Szalasi А., Blumberg P., 1990]. В результате избирательного повреждающего действия высоких доз капсаицина на чувствительные нейроны в тканях развивается нейродистрофический процесс с наиболее выраженными повреждениями капилляров и вен. Возможное участие нейропептидов в организации нейрогенного воспаления привлекло внимание клиницистов, которые подключились к этим исследованиям.

На основании полученных данных предположили, что нейропептиды оказывают регулирующее влияние на кровоток и капиллярно-венозную проницаемость как непосредственно [Hölzer Р., 1998; Permkumar L., 2001], так и через тканевые базофилы [Stewart М. et al., 1996; Biro Т. et al., 1998; Egan С. et al., 1998]. Механизмы этого влияния продолжают активно исследовать [Warren J., 1994; Hever G. et al., 1998]. Имеется очень важный не выясненный аспект работ в этом направлении - выявление роли центральной нервной системы и других регулирующих систем в регуляции функциональной активности КЧН спинальных ганглиев.

Инъекции капсаицина приводят к выделению медиаторов (нейропептидов) не только из кожных окончаний КЧН, но и висцеральных органов. Этот эффект известен, возможно он реализуется по механизму аксон - рефлекса [Scardina G. et al., 2007]. В первую очередь он проявляется в органах, получающих наиболее обильную и прямую (без переключения в интрамуральных ганглиях) иннервацию от чувствительных к капсаицину нейронов. Лимфоидная ткань содержит максимально большое число окончаний первичных нейронов спинальных ганглиев, поступающих сюда без переключения [Feiten D. et al., 1993]. Центральный орган иммуногенеза - тимус - по плотности иммунореактивности к веществу П уступает только головному мозгу [Jurjus А. et al., 1998]. Пептидсодержащие нейроны ганглиев С2-С4 иннервируют одновременно кожу верхней части спины и тимус [Elfvin L. et al., 1993]. Иммунореактивные к веществу П (вП)-волокна связаны с сосудами капсулы и межкапсульных перегородок тимуса [Atoji J. et al., 1997], в медуллярной зоне лежат свободно между ОХ-8+-тимоцитами и тучными клетками [Lorton D. et al., 1990]. В тимусе выявлена и наиболее высокая плотность рецепторов к веществу П [Jurjus А. et al., 1998], которая снижается после неонатальной капсаициновой обработки [Santoni G. et al., 2000]. Сенсорную иннервацию селезенки обеспечивают волокна спинномозговых ганглиев уровня Д6 и Дю, которые не переключаются в интрамуральных ганглиях. Прямую чувствительную иннервацию получают так же синовий и подколенные лимфатические узлы [Склянова H.A., 1979]. Роль КЧН в регуляции клеточных реакций лимфоидной ткани при развитии нейродистрофического процесса не исследована.

Не проводилось изучения структурного гомеостаза дренирующих лимфоидную ткань биологических жидкостей после фармакологической деафферентации капсаицином. В то же время эти данные важны для понимания физиологических основ функционирования первичных сенсорных нейронов, обеспечивающих реализацию адаптационных механизмов в норме и при развитии патологических процессов.

Чувствительный нейрон, как первое звено рефлекторной дуги, играет важную роль в регуляции отношений нервной системы с периферическими тканями [Акоев Г.И., Чалисова Н.И., 1997]. Афферентная функция первичных афферентных нейронов, связанная с восприятием раздражений разной модальности, изучена довольно подробно, тогда как локальная эффекторная - интенсивно исследуется в последние годы [Chen Н. et al., 2007; Elekes К. et al., 2007]. Накапливаются данные, свидетельствующие о включении первичных афферентных нейронов в контроль гематотканевых барьеров и нейроиммунных взаимодействий [Крыжановский Г.М. и др., 1997; Ма W., Quirion R., 2007], о влиянии нейропептидов на функциональную активность клеток иммунной защиты, в частности, на выработку цитокинов [Savino W., Dardenne N., 2000; Santoni G. et al., 2003; Matsumoto H. et al., 2007].

Таким образом, для раскрытия механизмов реализации эфферентной функции КЧН важно установить, как изменяется капиллярно-венозная проницаемость в условиях перестройки активности сенсорных нейропептидов в онтогенезе, у животных разного пола, в норме и при усилении их активности, при ослаблении контроля со стороны центральной нервной системы. Необходимо проанализировать перестройки анатомической организации лимфоидных органов, получающих наиболее обильную прямую иннервацию от КЧН, клеточные реакции в дренирующих их биологических жидкостях при развитии нейрогенной дистрофии. Важно показать зависимость функциональной активности клеток лимфоидных органов и крови от состояния КЧН.

Цели и задачи исследования. Учитывая вышеизложенное, основной целью работы являлось изучение капиллярно-венозной проницаемости кожи, клеточных реакций и структурного гомеостаза в лимфоидных органах, крови, биологических жидкостях в условиях изменения функциональной активности капсаицин-чувствительных нейронов и выявление роли центральной нервной системы в контроле их эфферентной функции.

Исходя из цели исследования, были поставлены следующие задачи

1. Исследовать регуляцию капсаицин-чувствительными нейронами капиллярно-венозной проницаемости кожи у животных разного возраста и пола;

2. Установить роль центральной нервной системы в контроле эфферентной функции капсаицин-чувствительных нейронов;

3. Определить изменения структурного гомеостаза лимфоидных органов в условиях блокады медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов;

4. Выявить зависимость между состоянием капсаицин-чувствительных нейронов и функциональной активностью эпителиоцитов и макрофагов тимуса;

5. Оценить динамические изменения клеточного состава крови и биологических жидкостей после капсаициновой деафферентации;

6. Выявить изменения в системе свертывания крови и реологии в условиях изменения функциональной активности первичных афферентных нейронов.

Основные положения работы, выносимые на защиту 1. Блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов усиливает капиллярно-венозную проницаемость и лейкоцитоз крови, снижает функциональную активность эпителиоцитов тимуса, способность нейтрофилов к продукции биоокислителей и общую антиокислительную активность крови, стимулирует активность фагоцитов, активирует внутрисосудистые механизмы свертывания крови, увеличивая ее вязкость.

2. Фармакологическая деафферентация капсаицином вызывает истощение структурных резервов тимуса, усиливает иммунную и нарушает кроветворную функции селезенки, увеличивает популяцию макрофагов и тканевых базофилов подколенного лимфатического узла.

3. Реализация периферических эффектов капсаицин-чувствительных нейронов находится под контролем центральной нервной системы.

Научная новизна. Впервые показано, что вызванное введением капсаицина усиление экстравазии витального красителя в области локализации сенсорных окончаний в коже устраняется после перерезки проводящих путей дорзальных рогов спинного мозга, что доказывает наличие рефлекторного тормозного контроля над эффектами капсаицин-чувствительных нейронов со стороны центральной нервной системы. Контроль капиллярно-венозной проницаемости капсаицин-чувствительными нейронами различается у молодых животных разного пола и ослабевает в результате снижения активности сенсорных нейропептидов в онтогенезе.

Получены экспериментальные доказательства участия капсицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций и структурного гомеостаза лимфоидных органов. Блокада капсаицин-чувствительных нейронов приводит к сокращению объема лимфоидной паренхимы тимуса, активации популяций макрофагов и тканевых базофилов, снижению гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов. В селезенке в условиях дисбаланса медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов активировались герминативные центры, усиливалась фагоцитарная активность макрофагов и плазматизация красной пульпы, нарушалась трансформация мегакариобластов. В подколенном лимфатическом узле при блокаде медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов расширялся объем микроциркуляторного русла, увеличивалась популяция тканевых базофилов и число макрофагов в мозговых синусах, усиливалась плазматизация мякотных тяжей. Эти результаты обсуждаются и сравниваются с патологическими и возрастными перестройками структуры лимфоидных органов. В работе обосновывается концепция, позволяющая считать первичные сенсорные нейроны анатомическим субстратом нейроиммунных взаимодействий.

Выявлены общие закономерности и особенности изменения клеточного состава венозной крови и биологических жидкостей в условиях нарушения нормального функционирования капсаицин-чувствительных нейронов. Установлено, что блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов приводит к перестройкам клеточного состава перитонеальной жидкости и бронхоальвеолярного жидкостного смыва, увеличению вязкости крови, ускорению свертываемости, снижению способности нейтрофилов к продукции биоокислителей и общей антиокислительной активности крови. Показано, что капсаицин-чувствительные нейроны регулируют способность тромбоцитов к наработке тромбина, ключевого фермента внутрисосудистого свертывания. Этот эффект ослабевает после электрокоагуляции проводящих путей дорзальных рогов спинного мозга, то есть эфферентная функция капсаицин-чувствительных нейронов по регуляции системы свертывания крови контролируется центральной нервной системой.

Теоретическая и практическая значимость. Настоящая работа вносит важный вклад в понимание роли первичных афферентных нейронов: подтвреждается гипотеза об их двойной афферентно-эфферентной функции. Получены новые доказательства участия капсаицин-чувствительных нейронов в контроле капиллярно-венозной проницаемости, структурного гомеостаза лимфоидных органов, функциональной активности клеток крови и биологических жидкостей, системы свертывания крови. Раскрытие механизмов трофического действия нейропептидов в иммунных органах позволяет предполагать их включение в регуляцию нейроиммунных взаимодействий в качестве анатомического субстрата, в обеспечение реакций гиперчувствительности, хронизации воспалительных патологий. В этой связи выполненная работа имеет и практическую ценность для клиницистов. Впервые получены данные, подтверждающие наличие рефлекторных тормозных влияний на физиологическую активность афферентных нейронов спинальных ганглиев в норме со стороны центральной нервной системы. Патологические воздействия на эти нейроны могут приводить к развитию заболеваний психосоматической природы. Результаты исследования расширяют современные представления о роли капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции клеточных реакций при развитии нейрогенного воспаления. Обоснована перспективность исследования механизмов периферического действия медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов в клинике для коррекции хронических воспалений и нейропатических болей. Материалы используются при чтении лекции по курсу «Клиническая психология» (тема «Психосоматические и соматотрофные расстройства») в НВКУ (военном институте). Модификация метода капсаициновой деафферентации применяется для научно-исследовательской работы в лаборатории функциональной нейроморфологии ГУ НИИ физиологии СО РАМН.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Всесоюзной конференции «Нейрогуморальные механизмы регуляции висцеральных органов и систем» (Томск, 1989); научной конференции «Патогенез хронического воспаления» (Новосибирск, 1991); Всесоюзном симпозиуме «Современные проблемы клинической и экспериментальной психонейроиммунологии» (Томск, 1992); II и III Съездах физиологов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1995;

1997); I Съезде патофизиологов России (Москва, 1996); III Международной конференции «Колосовские чтения-97» (Санкт-Петербург, 1997); Международном симпозиуме «Проблемы лимфологии и эндокринологии» (Новосибирск, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Морфологические науки - практике здравоохранения» (Омск, 1999); Всероссийской научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова (Санкт-Петербург, 1999); I и II Всероссийских конференциях с международным участием по нейроиммунопатологии (Москва, 1999; 2002); Международной конференции «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2000); IV Международном симпозиуме "Проблемы саногенного и патогенного эффектов экологического воздействия на внутреннюю среду организма" (Бишкек, 1999); Международной научной конференции к юбилею Казахского института физиологии (Алма-Аты,

2001); Международном конгрессе нейроморфологов (Санкт-Петербург,

2002); Всероссийской научно-практической конференции (Чита, 2003); Международном симпозиуме «Механизмы регуляции висцеральных функций» (Санкт- Петербург, 2003, 2005); IX Международном симпозиуме «Гомеостаз и экстремальные состояния организма» (Красноярск, 2003); V Сибирском физиологическом съезде, (Томск, 2005); I Сибирском съезде лимфологов с международным участием «Проблемы экспериментальной, клинической и профилактической лимфологии» (Новосибирск, 2006); Всероссийской научной конференции «Механизмы индивидуальной адаптации», (Томск, 2006), XVII (Ростов-на - Дону, 1998); XVIII (Казань, 2001) и XIX (Москва, 2007) Съездах Всероссийского физиологического общества.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 45 научных работ. В ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК, опубликовано 13 статей.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Жукова, Елена Михайловна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Эфферентная функция первичных сенсорных нейронов, передающих в центральную нервную систему информацию о действии физических и химических факторов среды, обнаружена достаточно давно, [Павлов И.П., 1951; Хаютин В.М., 1999], однако механизмы ее реализации не изучены [Beitran J., et al., 2007; Tang L., 2007]. Выявление физиологической роли первичных сенсорных нейронов - новый аспект исследования физиологической регуляции периферических гомеостатических процессов [Albutaihi I. et al., 2004; Demirbilek S. et al., 2004; Lo Y. et al., 2005]. Решению этой актуальной проблемы современной физиологии посвящена данная работа. В ней получены новые доказательства проявления эффектов заднекорешковых нервов на периферии: их участие в контроле сосудистой проницаемости, структурного гомеостаза лимфоидной ткани и функциональной активности ее клеточных составляющих. Впервые экспериментально доказано наличие тормозного контроля со стороны центральной нервной системы над реализацией локальных эффектов чувствительных нейронов спинальных ганглиев. Этому способствовало применение сочетания классических методов невротомии с модифицированной экспериментальной моделью фармакологической деафферентации капсаицином.

Хирургическая невротомия (дорзальная ризитомия, иссечение спинномозговых узлов, перерезка седалищного, блуждающего нервов и т.д.) не позволяет исключать эффекты оперативного вмешательства или проводить чистую деафферентацию, так как практически все периферические нервные стволы являются смешанными. Анализ результатов острых опытов приводил к нечеткой, а порой, и не правильной трактовке наблюдаемых изменений [George F., Sampol J., 1994; Абдуллаев M.C., Маметова Е.Г., 2000]. Решению задачи способствовало выявление медиаторов первичных сенсорных нейронов - нейропептидов и открытие их селективной чувствительности к растительному алкалоиду капсаицину [Geppetti Р. et al., 1988]. Дробное подкожное введение нейротоксической дозы препарата половозрелым крысам предотвращает сенсибилизацию [Hay М., Kunze D., 1994], активирует окончания капсаицин-чувствительных нейронов (КЧН) в коже и висцеральных органах по механизму аксон-рефлекса, приводит к полному выбросу медиаторов из секреторных депо в сенсорных окончаниях [Yoshihara S. et al., 1998].

Эффекты выброса нейропептидов наблюдаются в течение семи суток [Kanj N. et al., 1998], что объясняют блокадой ваниллоидных рецепторов на клетках, участвующих в утилизации биогенных аминов на периферии [Bodo Е. et al., 2004]. Через две недели за счет частичной дегенерации концевых отростков КЧН, уровень нейропептидов в области их локализации значительно снижается, а через три недели -восстанавливается [Hölzer Р., 1998]. Сенсорная денервация капсаицином позволяет временно «выключать» чувствительную иннервацию с последующим её восстановлением и дает возможность в динамике исследовать эфферентные влияния КЧН. В начале 90-х годов высказано предположение, что локальные эффекты КЧН реализуются через взаимодействие их медиаторов (нейропептидов) с регуляторами тканевого и гуморального гомеостаза [Pascual D., Bost A. et al., 1990].

Считалось, что обратную связь в обеспечении взаимных влияний сенсорных нейронов с этими структурами осуществляют гипотетические эндогенные ваниллоиды, которые так и не были обнаружены [Macho A. et al., 1998]. При попытках доказать эту гипотезу, были собраны многочисленные данные о наличии тахикининовых и ваниллоидных рецепторов на лимфоцитах, тканевых базофилах, макрофагах [Hail N., 2003; Hwang S., Valtschanoff J., 2003]. Позже установлено: через ваниллоидные рецепторы на этих клетках активируются системы утилизации нейропептидов [Permkumar L., 2001; Kihara N. et al., 2003], и этот эффект блокируется капсаицином [Liu М. et al., 2003; Scotland R. et al., 2004; Tominaga M. et al., 2004]. Согласно другой концепции, которую предложил Питер Хольцер [Hölzer Р., 1998], на сенсорные окончания действуют продукты синтеза активированных нейропептидами клеток, в то время как чувствительные к капсаицину нейроны сами обладают двойной афферентно-эфферентной функцией. Периферические влияния этой группы нейронов реализуются через тахикининовые и ваниллоидные рецепторы на лимфоцитах, тканевых базофилах, макрофагах [Hail N., 2003; Hwang S., Valtschanoff J., 2003; Donnerer J. et al., 2004; Stander S. et al., 2004]. Обратную связь обеспечивают медиаторы, выделяемые при активации этих клеток (серотонин, гистамин, цитокины, лейкотриены, NO, протезы, тромбин, опиоиды и т.д.). Эти вещества активируют капсаицин-чувствительные нейроны, действуя на их мембранные рецепторы.

Следует подчеркнуть, что чувствительные нейроны принципиально способны к выполнению двойной афферентно-эфферентной функции: под действием энергии внешних раздражителей в их терминальных отростках возникает рецепторный или градуальный потенциал [Kumazava Т., 1990]. Его амплитуда зависит только от силы раздражителя и определяется временем его действия. Модулированные по амплитуде аналоговые сигналы от рецепторных окончаний не могут передавать информацию на большие расстояния, однако они контролируют синтез медиаторов в соме сенсорных нейронов, и на уровне аксонов этих нейронов трансформируются в ПД-регенерируемые или импульсные сигналы [Эккерт Р. и др., 1992]. Из всего множества нервных элементов животного организма такими свойствами обладают только чувствительные нейроны.

В последние годы на разных экспериментальных моделях делались попытки доказать включение сенсорных нейропептидов в регуляцию капиллярно-венозной проницаемости кожи [Baluc Р., 1998; Bianchi М. et al., 1998; Asakura К. et al., 2000]. В собственных опытах установлено, что экстравазия витального красителя голубого Эванса из сосудов в кожу крыс под действием капсаицина усиливалась почти в три раза по сравнению с контролем и эффект сохранялся в течение длительного времени. Поскольку капсаицин является высокоселективным препаратом, эти данные доказывают включение нейропептидов КЧН в контроль капиллярно-венозной проницаемости. Согласно данным литературы, действие экзогенных нейропептидов сопровождается выпотом плазменных белков и лейкоцитов [Holzer Р, 1998]. Полагают, что вазоактивный медиатор - вещество П может запускать нейрогенное воспаление, активируя его ключевые эффекторы - моноциты и гранулоциты [Маянский Д.Н, 1991]. В механизм усиления капсаицном экстравазии белков включаются TNF-a и IL-lß [Herbert M, Hering S. 1995], оксид азота [Herbert M. et al, 1995; 1998] и выделяемый при дегрануляции тканевых базофилов гистамин, который усиливает проницаемость, вытесняя кальций из эндотелия сосудов [Kudlacz Е. et al, 1998].

В длительных хронических опытах впервые выявлено снижение проницаемости сосудов в ответ на кожные аппликации ирритантов у крыс в процессе старения, что свидетельствует о нарушении трофики тканей в ходе индивидуального развития. При обсуждении этих результатов учитывали данные литературы о значительном снижении иммунореактивности к нейропептидам [Cha С. et al, 1996; Khalil Z, Helme R, 1997] и сокращении объема нейрогенной реализации КГРП из периваскулярных нервов [Kawasaki H, Takasaki К, 1992] у старых животных. При старении нарушается и структурная организация периферических нервов [Мамедова Э.Г, 1993]. Впервые обнаружены половые различия в реализации эфферентной функции КЧН у животных: у половозрелых самок концентрация витального красителя в зоне действия ирританта была выше, чем у самцов. Эффект связан с различиями в содержании нейропептидов в периферических органах и тканях у животных разного пола [Oh Е. et al., 2000]. У старых животных (одного и полутора лет) эффект не выявлялся, что связано с возрастным снижением содержания нейропептидов в периферических сенсорных окончаниях.

Принципиально важные данные получены в экспериментах с хирургической перерезкой и электрокоагуляцией дорзальных рогов спинного мозга у интактных и обработанных капсаицином крыс. Они свидетельствуют о наличии тормозного контроля со стороны центральной нервной системы над функциональной активностью КЧН. Вероятно, ограничение тормозного контроля ЦНС может усиливать спонтанное тоническое выделение нейропептидов из сенсорных окончаний и способствовать возникновению микроциркуляторных нарушений.

Полученные результаты опровергают мнение о том, что эфферентная функция КЧН не подвержена центральным влияниям [Holzer Р., 1992] и подтверждаются результатами экспериментов, в которых показано модулирующее влияние ЦНС на реализацию локальных эффектов другой субпопуляции КЧН - афферентных нейронов тройничных ганглиев [Knyazef G. et al., 1991]. Согласно данным литературы, вызванная электростимуляцией седалищного нерва миграция лимфоцитов в подкожную соединительную ткань конечностей крыс обусловлена действием нейропептидов через NK-1 рецепторы на их клеточной поверхности [Herzberg U. et al., 1996; Poon А., Sawynok J., 1998].

Известно, что жизненно важные органы не иннервируются капсаицин-чувствительными нейронами напрямую (без переключения в интрамуральных ганглиях). Наибольшая часть прямых окончаний этих нейронов попадает в подкожную соединительную ткань и лимфоидные органы [Tanabe Т. et al., 1996]. В связи с этим, исследовали клеточный состав лимфоидных органов, крови и биологических жидкостей (перитонеальный жидкостный смыв, как результирующую дренажной функции лимфоидных органов), функциональную активность эпителиоцитов тимуса и вспомогательных клеток иммунного ответа (нейтрофилов) в динамике после введения нейротоксической дозы капсаицина половозрелым крысам Вистар. При разработке экспериментальной модели учитывали сведения о том, что иммунореактивность к веществу П в лимфоидных органах крыс выше, чем у мышей [Geppetti Р. et al., 1988], и у крыс, в отличие от мышей, она существенно меняется под влиянием капсаицина [Mitchell В. et al., 1997].

Анализируя реакцию тимуса на введение препарата, учитывали, что это орган иммуногенеза и эндокринная железа. Эту структуру определяют как нейро-иммуно-эндокринный модуль. Его эндокринная функция связана с продукцией гормонов (тимозина, тимулина и т.д.), иммунная - с дифференцировкой стволовых прекурсоров в Т-клетки, ответственные за клеточный (Thl) и гуморальный (Th2) иммунные ответы. Вилочковая железа у грызунов и человека получает обильную афферентную иннервацию [Piantelli М. et al., 1990]. В разных структурно-функциональных зонах органа, особенно в капсуле и межкапсульных перегородках, присутствуют иммунореактивные к веществу П волокна, которые часто связаны с кровеносными сосудами, а в области септ могут лежать свободно между тимоцитами и тканевыми базофилами [Atoji Y. et al., 1997; Gulati P. et al., 1997]. Выявлена значительная плотность NK-1 рецепторов к нейропептидам на изолированных тимоцитах крыс [van Hagen Р. et al, 1996] и на мембранах лимфоцитов кортико-медуллярного соединения тимуса крыс in vivo [Jurjus А. et al., 1998].

Собственные данные свидетельствуют о первоочередной реакции микроциркуляторного русла и популяции тканевых базофилов тимуса на введение капсаицина. В первую неделю наблюдаемые эффекты вызваны действием нейропептидов, которые выделяются в ответ на введение препарата. В этих условиях увеличилась масса и размеры долек тимуса и, вследствие этого, морфофизиологический индекс. Эффект связан с расширением объема капиллярно-венозного русла и увеличением числа тканевых базофилов (ТБ). Активированные тканевые базофилы, которые имеют NK-1 и ваниллоидные рецепторы к нейропептидам [Wallace A. et al., 1992; Nemeth J. et al., 1998], выделяют с секреторными гранулами протеазы, способные инактивировать нейропептиды [Brown J. et al., 2001]. Обнаружена специфика реагирования на капсаицин разных субпопуляций тканевых базофилов тимуса. В норме тканевые базофилы локализуются в капсуле и межкапсульных перегородках тимуса. После введения капсаицина дегранулирующие тканевые базофилы наблюдались в субкапсулярной и медуллярной зонах, где их секреторные продукты (гистамин, гепарин, ПГЕ, протеазы, NO) могут влиять на созревание, пролиферацию, дифференцировку, депонирование и аутоселекцию тимоцитов [Liderman М. et al., 1998; Weidner С. et al., 2000].

Отдельные тканевые базофилы тимуса, локализованные в области внутридольковых периваскулярных пространств, имели морфологические признаки усиления иммунных функций: накопление секреторных гранул без дегрануляции, увеличение контактов со вспомогательными клетками иммунной защиты (макрофагами, лимфоцитами). Они скапливались вокруг капилляров внутридольковых перегородок. Известно, что активированные без признаков дегрануляции тканевые базофилы усиливают наработку иммунных факторов [Быков В.Д., 1999]. Такая реакция связана с действием нейропептидов КЧН, поскольку введение экзогенной субстанции П активирует экспрессию TNF-б в тканевых базофилах грызунов [Okabe Т. et al., 2000], интенсивное и длительное раздражение сенсорных окончаний ультрафиолетом усиливает наработку тканевыми базофилами лейкотриенов [Scholzen Т. et al., 1999].

Реакция лимфоидной паренхимы тимуса на капсаицин имела фазный характер. В первую неделю действия препарата в области перегородок тимуса отмечалось появление лимфоидных фолликулов с герминативными центрами, окруженными плазмоцитами. В таких структурах происходит антигеннезависимая пролиферация и дифференцировка B-лимфоцитов в плазмоциты [Hoffman W. et al., 1990]. Лимфоидные фолликулы появляются в B-зависимых зонах селезенки, лимфатических узлов, в расширениях внутридолькового периваскулярного пространства тимуса при бронхиальной астме, ревматоидном артрите [Харченко В.П. и др., 1998]. Их появление однозначно связывают с усилением иммунных функций.

Через две недели действия капсаицина в тимусе отмечались морфологические признаки дисфункции Т-системы иммунитета: снижение общего числа лимфоцитов, особенно молодых, уменьшение общего объема за счет сокращения субкапсулярной зоны и, частично, мозгового вещества. Это приводило к снижению массового индекса органа. Сокращение числа молодых лимфоцитов в субкапсулярной зоне связано с появлением дегранулирующих тканевых базофилов. Гепарин, выделяемый из ТБ с секреторными гранулами, нарушает иммунные реакции, ограничивая скорость бластогенеза лимфоцитов [Metealf D. et al., 1997]. Гепарин замедляет миграцию лимфоцитов к месту действия антигенов [Lider О. et al., 1990], подавляет лейкоцитарную инфильтрацию тканей [Baram D. et al., 1997], регулирует транспортную функцию лимфатических сосудов [Борисова Р.П., Бубнова H.A., 1999].

Уменьшение удельного объема лимфоидной паренхимы связано и с активацией механизмов апоптоза. Об этом свидетельствует накопление в субкапсулярной зоне лимфоцитов с морфологическими признаками апоптоза, макрофагов с остатками лимфоцитов в цитоплпзме и тимических телец. Обычно лимфоциты с аутоантигенами самоуничтожаются в мозговом веществе тимуса, здесь же, преимущественно, локализуются фагоциты и тельца Гассаля. Собственные результаты подтверждаются данными исследования тимуса после неонатальной капсаициновой обработки [Santoni G. et al., 2000]. В этих условиях периферические чувствительные окончания полностью дегенерируют, резко уменьшается уровень нейропептидов, что приводит к снижению пролиферативного ответа Т-лимфоцитов на митогены и росту числа «апоптозных» лимфоцитов в тимусе. Биохимическими исследованиями так же показано угнетающее влияние неонатально введенного капсаицина на пролиферацию тимоцитов и усиленное накопление биохимических маркеров апоптоза (каспаз) в клетках лимфоидного ряда [Savino W., 2000]. Эти данные подтверждают гипотезу о том, что вещество П является функциональным антагонистом апоптоза [Dimri R. et al., 2000]. Апоптоз, в отличие от некроза, усиливается не только при внешнем повреждающем воздействии, но и как реакция на эндогенные факторы, при воздействии физиологических факторов в нефизиологических концентрациях и сочетаниях [Маянский А.Н. и др., 1999]. Собственные результаты позволяют предположить, что таким фактором может быть дисбаланс нейропептидов в капсаицин-чувствительных нейронах.

Данные литературы указывают на ведущую роль симпатической, парасимпатической и гормональной систем в контроле взаимодействия нервной и иммунной систем [Ярилин A.A., 1998]. Показано, что норадреналин модулирует ответ первичных и вторичных антител, пролиферацию лимфоцитов, активность натуральных киллеров [Weihe Е. et al., 1991; KishimotoH., Sprent J., 2000], индуцированный стрессом выброс глюкокортикоидов усиливает апопотоз тимоцитов [Brennan Р. et al., 1991; Cohen J., 1993; Bernard G. et al., 1997]. Сведения об участии нейропептидов в нейроиммунных взаимодействиях противоречивы. Есть доказательства угнетающего действия экзогенных нейропептидов и капсаицина на иммунный ответ in vivo [Veronesi В. et al., 1999]. В опытах in vitro показано стимулирующее действие экзогенной субстанции П на пролиферацию лимфоцитов и стволовых клеток [Shih С., Bernard G., 1997], вазоактивного интестенального нейропептида на дифференцировку тимоцитов [Bellinder D. et al., 1997; Kinoshita Y., Hato F., 2001]. Методом проточной цитофотометрни выявлено снижение числа апоптозов тимоцитов под действием нейропептидов [Payan D., 1989], однако этот метод не позволяет отделять апоптозы от некрозов. Иммуногистохимически показано стимулирующее влияние нейропептидов на апоптоз лимфоцитов с участием механизмов экспрессии антигена CD95 (Fas или АПО-1) [Олейник Е.А., Шибаев М.И., 2000]. Данные биохимических исследований свидетельствуют об активации биохимических маркеров апоптоза (каспаз) в ткани тимуса in vivo при аутоиммунизации и стимуляции ваниллоидных рецепторов капсаицином [Gorman A. et al., 1999].

Анализ собственных результатов (в том числе и данных о наличии центральной регуляции функциональной активности КЧН) и литературных данных позволяют предположить, что медиаторы чувствительных к капсаицину нейронов участвуют в контроле аутоиммунной селекции и могут избирательно модулировать иммунитет. Обнаруженные в работе признаки акцидентальной инволюции тимуса у опытных крыс (делимфотизация коры, вазодилатация и расширение периваскулярных пространств, рост числа апоптозных тимоцитов и тимических телец, депонирование макрофагов в субкапсулярной зоне), часто имеют место при действии хронического стресса и аутоиммунизации [Харченко В.П. и др., 1998]. Возможно, в механизмы иммунодефицитных состояний при этих патологиях включается дисфункция медиаторов КЧН.

В собственных исследованиях впервые получены данные гистохимического анализа об изменении гормонсинтезирующей активности эпителиоцитов тимуса под действием капсаицина. В ранние сроки действия препарата железистая функция тимуса усиливалась, о чем свидетельствует рост числа эпителиоцитов, окрашенных альдегидфуксином. Следует отметить, что активация эпителиоцитов стимулирует процесс самоуничтожения тимоцитов [Ярилин A.A., 1999].

Через две недели действия препарата число альдегидфуксин-положительных эпителиоцитов уменьшалось, что свидетельствует о снижении синтеза гормонов. Следует отметить, что в литературе есть сведения о стимулирующем влиянии гипофизарных гормонов и адреналина на продукцию тимозина эпителиоцитами [Cohen J., 1993; Bernard G. et al., 1997; Bisaggio R. et al., 2001]. Известно, что при старении снижается пролиферация и гормонсинтезирующая активность эпителиоцитов тимуса [Гриневич Ю.А., Чеботарев В.Ф., 1989], что может быть следствием возрастной дегенерации сенсорных окончаний [Стовичек Г.В., 1991]. Секреция гормонов тимуса снижена при ревматоидном артрите, дерматомиозите, прогрессирующем системном склерозе [Ruchti С., Hess М., 1990; Miller М. et al., 1999]. Дефицит гормонов тимуса отмечен у больных с гинекологическими воспалительными патологиями [Шурлыгина A.B. и др., 2000], у мышей линии NZB/W [Gerswin М. et al., 1978], при развитии тимом [Henry К., 1981] и активации аутоиммунных процессов [Харченко В.П., 1998]. Клиницисты отмечают, что при этих болезнях снижение секреции гормонов тимуса сопровождается развитием нейродегенеративных процессов [MilicevicN. et al., 1994].

Дисбаланс нейропептидов вследствие действия капсаицина может стать причиной активации аутоиммунных процессов. Физиологические аутоиммунные процессы регулируют структурный и биохимический гомеостаз, патологические - развиваются при нарушении регуляции иммунного ответа на аутоантигены и сохранении функции по распознаванию и элиминации других антигенов [Челышев Ю.А., 1995; Хитров Н.К., 1998]. Таким образом, собственные результаты доказывают включение КЧН в контроль морфологической организации тимуса и функциональной активности тимических эпителиоцитов. Имеется определенное сходство в нарушениях при стрессовых воздействиях, с возрастом и при нейрогенной дистрофии. Основа этих процессов -дегенерация нервных элементов. Возможно, влияния медиаторов КЧН находятся в антагонистических взаимоотношениях с действием медиаторов классических эфферентных систем (симпатической, парасимпатической, гормональной).

В селезенке под действием капсаицина существенно менялась структура трабекул и околотрабекулярного пространства, где локализованы многочисленные кровеносные сосуды и нервные проводники. Изменение морфофизиологических индексов органа соответствовало фазным перестройкам уровня сенсорных нейропептидов в разные сроки после введения препарата. Прежде всего, на введение капсаицина реагировали структуры белой пульпы (лимфоидные узелки и периартериальные лимфоидные футляры), а так же маргинальная зона. Эти образования увеличивали свои размеры, в них росло число бластов, наблюдался острый лейкоцитоз синусов. В первую неделю действия препарата увеличивалась популяция плазмоцитов, которые скапливались вокруг синусов селезенки. Усиливалась макрофагальная реакция, что свидетельствует о напряжении тканевого и гуморального иммунитета. В красной пульпе появлялись вторичные лимфоидные узелки (морфологическое свидетельство усиления В-системы иммунитета), росло число фагоцитов (макрофагов), в межклеточном пространстве накапливался гемосидерин.

Наблюдаемые эффекты связаны с выбросом нейропептидов из капсаицин-чувствительных нейронов под влиянием препарата. Иммунологические исследования свидетельствуют о стимулирующем действии вещества П на вызванную Кон-А пролиферацию культивируемых лимфоцитов селезенки у нормальных и неонатально обработанных капсаицином крыс, причем эффект предотвращает антагонист №С-1 рецепторов 8Р 140333 [БагШии в. е1 а1, 1999].

Действие капсаицина после двух недель приводило к сокращению площади структур белой пульпы, плазматизации маргинальной зоны. Это можно рассматривать как признак развивающейся аутоиммунной реакции, поскольку показано, что хирургическая деафферентация висцеральных органов сопровождается появлением в крови белков со свойствами аутоантигенов [Никифоров А.Ф. и др, 1963]. У обработанных капсаицином животных в гемокапиллярах наблюдали увеличение числа и столбирование эритроцитов, появление крупных мегакариоцитоподобных клеток Березовского-Штернберга, что говорит о нарушении тромбоцитопоэза. При развитии коммитированной мегакариоцитарной стволовой клетки, вслед за экспотенциальным увеличением числа стволовых клеток за счет митотического деления, наступает стадия серийной репликации ядра без деления клеток с последующим отделением тромбоцитов [Шиффман Ф, 2000]. Видимо, блокада медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов нарушает этот процесс и в целом дифференцировку клеток крови в селезенке.

Собственные результаты анализа клеточного состава селезенки у опытных крыс были во многом сходны с описанными в литературе эффектами хирургической деаффферентации селезенки [Волкова О.В., 1978]. Их можно сравнивать и с результатами спеленэктомии, которая сопровождается развитием вторичного иммунодефицита, гемолитической анемией, появлением признаков ДВС-синдрома, почечной недостаточностью, гематологическими расстройствами на фоне низкой активности В-клеточного иммунитета, что клиницисты связывают с нарушением симпатического и опиоидного контроля [Ваит М. е1 а1, 1997]. Однако в этих условиях разрушаются и сенсорные проводники, поэтому нельзя исключать эффекты деафферентации.

Селезенка важна для реализации адаптационно-трофических механизмов, доказано ее участие в реакциях стресса, эмоционального возбуждения, воспаления. Она является важным переключающим звеном в гемодинамике и в процессах основного обмена, в частности, при переходе на гликолиз при экстремальных температурных воздействиях. Микроциркуляторные и структурные нарушения в этом органе в условиях фармакологической деафферентации позволяют предположить, что медиаторы капсаицин-чувствительных нейронов могут координировать механизмы пластического и энергетического обмена. Возможно, это -один из путей реализации их эфферентных влияний, нарушение которых может быть одной из составляющих нейрогенного компонента хронизации патологических процессов. Полагают, что локальным механизмом регуляции иммуногенеза в селезенке является баланс функциональной активности адренергических и АХ-позитивных нервных волокон [Рахишев А.Р., Досаев Т.М., 1993]. Собственные результаты показывают, что КЧН, обладающие двойной афферентно-эфферентной функцией, могут рассматриваться как анатомический субстрат для реализации нейроиммунных взаимодействий в селезенке.

В работе впервые получены данные о структурных перестройках в подколенном лимфатическом узле (ПЛУ) в динамике после введения нейротоксической дозы капсаицина. В ранние сроки наблюдения площадь ПЛУ существенно возрастала в основном за счет развивающегося отека. Патоморфологические изменения выражались в набухании клеток мозговых синусов, сопровождались эффектами десквамации эндотелия, интенсивной лейкоцитарной инфильтрацией, распространяющейся от капсулы во внутренние области. Сходные эффекты отмечались в работе A.M. Шуриной [1977] на модели асептического воспаления при введении скипидара в лапу собак.

Наиболее значимые изменения структуры ПЛУ наблюдались через две недели действия препарата. Они развивались по типу стрессовой реакции и выражались в уменьшении площади мозговых тяжей, межузелковой, паракортикальной зон и увеличении общей площади центров размножения. Морфометрия срезов подколенного ЛУ выявила значительный рост популяции тканевых базофилов. Сходные изменения наблюдались в этой структуре у собак после сенсорной невротомии и интенсивной антигенной стимуляции [Склянова H.A., 1979; Гуляева Н.И., 1988], в трахеобронхиальных лимфатических узлах с увеличением возраста [Бородин Ю.И. и др., 1992]. Возрастные перестройки морфологии подколенного ЛУ могут быть следствием истощения медиаторного пула капсаицин-чувствительных нейронов. Известно, что при старении уменьшается плотность пептидергической иннервации и слабеет функциональная активность нейропептидов [Стовичек Г.В., 1991].

Показано, что локальная аппликация капсаицина на область локализации подколенных лимфатических узлов у крыс сопровождается патологическими изменениями, сходными с ревматоидным артритом (РА) [Lorton D. et al., 2000]. В культуре фибробластов больных с РА вещество П усиливает экспрессию белков клеточной адгезии [Lambert N. et al., 1998], стимулирует пролиферацию клеток хрящевой и костной ткани in vitro [Sakkas L. et al., 1995; Shih C., Bernard G., 1997]. Многие исследователи и клиницисты полагают, что в патогенез РА включается дисбаланс нейропептидов [Ziehe М., 1996; Brunelleshi S. et al., 1998; Gotis-Graham I. et al., 1998; Raap T. et al., 2000 и др.]. Это используют для разработки методов клинической диагностики артритов [Miller L. et al., 1999], так же как и эффект усиления экспрессии матричной РНК к NK-1 рецепторам у больных ревматоидным артритом [Calsa L. et al., 1998; Sakai К. et al., 1998].

Применяемые для терапии ревматоидного артрита эмпирически подобранные противовоспалительные препараты (ацетилсалициловая кислота, иидометацин, бутадиои), частично снимающие боль и отечность суставов, влияют на выделение нейропептидов из окончаний афферентных нейронов и тормозят деструкцию сенсорных окончаний [Matchimoto М. et al., 1995; Ziehe М., 1996]. Противомалярийный препарат хлорохин и противоглистный препарат левамизол, улучшающие состояние у больных РА, снижают отек, вызванный антидромной стимуляцией сенсорных нейронов у экспериментальных животных [Payan D., 1989; Covas М. et al., 1995]. Ремиссии при обострении атрита у больных можно добиться применением иммуносупрессивных средств, введение которых останавливает развитие нейрогенного отёка, вызванного аппликациями горчичного масла и связанного с выбросом вещества П [Sann Н., Pierau F., 1998; Buma Р. et al., 2001]. У крыс генетической модели Lewis, склонных к аллергическому аутоиммунному артриту, блокада катехоламинов 6-гидроксидофамином усиливает скорость и остроту проявлений артрита [Lind С. et al., 1997], а предварительная обработка капсаицином приводит к снижению уровня нейропептидов и сдерживает развитие патологического процесса, снижая его остроту [Feiten D. et al., 1992].

Применяемые для терапии РА глюкокортикоиды способны влиять на кальциевые каналы проводимости мембран [Baila Т. et al., 1994], открытие которых сопровождается свободной диффузией нейропептидов из периферических афферентных окончаний [Szolczanyi J., 1996; Poon А., Sawynok J., 1998]. To есть действие глюкокортикоидов тоже связано со стимуляцией сенсорных окончаний, однако их применение имеет значительные побочные эффекты. Поэтому лучшим эффектом обладают разные способы термического и механического раздражения подкожных окончаний этих нейронов: гипертермия, массаж, мануальная и лазерная акупунктура [Марр Р. et al., 1990]. У больных ревматоидным артритом уровень нейропептидов в сыворотке повышен [Anichini М. et al., 1997], поэтому лечебный эффект имеет введение нестероидных противовоспалительных препаратов, снижающих уровень вещества П в синовиальной жидкости [Sacerdote Р. et al., 1995], природных и синтезированных антагонистов ванилоидных и нейрокининовых рецепторов [Szallasi A., Blumberg Р., 1990; Goldstein D. et al., 2000]. Эффективны инъекции блокаторов Са -каналов проводимости, уменьшающие скорость экстравазии нейропептидов [Asakura К. et al., 2000], термическая и механическая стимуляция сенсорных окончаний в коже с помощью массажа, мануальной и лазерной акупунктуры [Heine Н., 1994; Lambert N. et al., 1998]. Сочетанная коррекция (родоновые воды+облучение гелий-неоновым лазером) значительно ускоряет восстановление ткани лимфоузлов после денервации [Гончаренко Е.Ю., Загуменников С.В., 1998].

Одновременно в работе проводился анализ клеточного состава крови и дренирующих эти органы биологических жидкостей после фармакологической деафферентации капсаицином. Важность такого комплексного подхода обоснована при экспериментальном исследовании стрессового воздействия у- излучения на организм [Горизонтов П.Д. и др., 1983].

Анализ лейкоформулы венозной крови в динамике действия капсаицина выявил фазные изменения относительного числа лейкоцитов и нейтрофилов, при неизменном уровне моноцитов. В ранние сроки действия капсаицина возрастало число клеток белой крови, а нейтрофилов - сокращалось. Данные литературы подтверждают, что на третьи сутки после неонатальной обработки капсаицином число С04+-лимфоцитов возрастает, эффект связан, вероятно, с выбросом вещества П и блокируется антагонистом NK-рецепторов SR140333 [Santoni G. et al., 1999]. Реакция нейтрофилов объясняется их миграцией в ткани для утилизации нейропептидов [Xu Р. et al., 2006]. Эффект лейкопении на второй неделе действия капсаицина, связан, вероятно, с угнетением кроветворной функции находящейся в зоне действия капсаицина области костного мозга. Известно, что хирургическая деафферентация костного мозга действительно угнетает его синтетическую потенцию. Свой вклад может вносить усиление адгезии и миграции лейкоцитов. Методом прижизненной световой и электронной микроскопии в крови у кроликов в ранние сроки после введения вещества П замечено образование агрегатов лимфоцитов и тромбоцитов, а в более поздние - наблюдалась миграция лимфоцитов через «высокий» эндотелий посткапиллярных венул [ОЫеп А. е1 а1., 1989]. При патологических воздействиях на периферические сенсорные окончания формируется специфическая защитная реакция - нейрогенное воспаление. Основными эффекторами воспаления являются мононуклеарные и полиморфноядерные фагоциты.

При анализе собственных результатов получены новые данные о включении клеточных элементов биологических жидкостей в реакцию на капсаицин. Выявлены более существенные сдвиги клеточного состава перитонеального жидкостного смыва (ПЖС), по сравнению с бронхоальвеолярной лаважной жидкостью (БАЛЖ), что может быть связано с менее плотной сенсорной иннервацией легких по сравнению с лимфоидными органами, результирующей дренажа которых является ПЖС [CastagHuolo I. е1 а1., 1997; №капо Т. е1 а1., 1998]. Полученные эффекты связаны с дисбалансом нейропептидов КЧН и свидетельствуют о развитии защитной воспалительной реакции, направленной на восстановление нарушенного гомеостаза. При бронхиальной астме отмечена активация эозинофилов, лимфоцитов, дендритных клеток и макрофагов нижних отделов легких, имеющих достаточно плотную сенсорную иннервацию. Этот эффект модулируют антагонисты вещества П [Эогйю М. е1 а1., 1995; ^об в. е1 а1., 2000].

В работе подтверждается предположение о том, что капсаицин-чувствительные нейроны контролируют не только структурную локализацию клеточных эффекторов биологических жидкостей, но их функциональную активность. Ранее существовало мнение, что влияние сенсорных нейропептидов реализуется исключительно через контроль функций макрофагов [Brunelleschi S. et al., 1990; Chancellor-Freeland С. et al., 1995], которые имеют рецепторы к веществу П и при культивировании in vitro способны синтезировать нейропептиды [Sakakibara Н. et al., 1994]. Одним из активаторов мононуклеарных фагоцитов является белок острой фазы (СБР), концентрация которого в крови меняется под действием капсаицина [Но W. et al., 1997]. Наряду с этим, появились сведения и об активирующем влиянии вещества П на хемотаксис и фагоцитоз нейтрофилов [Biasi D. et al., 1993]. Анализ собственных результатов позволил впервые показать влияние дисфункции КЧН на продукцию нейтрофилами биоокислителей: увеличение в ранние сроки действия препарата и резкое снижение в условиях блокады медиаторов КЧН. Вызванное введением капсаицина снижение уровня нейропептидов сопровождалось значительным сокращением количества активных нейтрофилов в индуцированном варианте НСТ-теста, который характеризует резервные возможности данной функциональной системы.

Вследствие изменения способности полиморфноядерных лейкоцитов к продукции биологических окислителей, менялась и общая антиокислительная активность венозной крови. Есть сведения об усилении «респираторного взрыва» нейтрофилов при увеличении концентрации вещества П после мануальной терапии [Brennan P. et al., 1991]. Показано активирующее действие вещества П на продукцию нейрофилами супероксидного аниона [Iwamoto I. et al., 1990].

При исследовании влияния капсаициновой обработки на реологические свойства крови впервые выявлены фазные изменения вязкости крови и плазмы у экспериментальных животных. Анализ собственных данных позволяет предположить, что введение нейротоксической дозы капсаицина проводит к развитию нейрогенной дистрофии. Хотя роль нарушений транскапиллярного обмена в генезе дистрофических процессов не вызывает сомнений [Чернух A.M. и др., 1984], механизмы участия в нем КЧН не исследованы. Лишь в одной работе приводятся данные об изменении показателей свертывания крови после неонатального введения капсаицина новорожденным крысам разного пола [Lippe I. et al., 1993]. Исследование системы коагуляционного гемостаза после чувствительной невротомии дало противоречивые результаты [George F., Sampol J., 1994].

Собственные данные свидетельствуют о фазных изменениях показателя внутрисосудистого свертывания - тромбинового времени - в динамике после введения капсаицина и отсутствие реакции в тесте с определением протромбинового (тромбопластиного) времени, что свидетельствует о включении медиаторов капсаицин-чувствительных нейронов в контроль внутренних механизмов образования протромбокиназы. Отмеченный рост тромбинового времени через неделю действия капсаицина связан, вероятно, с действием нейропептидов, поскольку есть сведения о антикоагулянтных и фибринолитических эффектах простейших пролинсодержащих пептидов, их влиянии на клеточный и плазменный гемостаз [Пасторова В.Е. и др., 1999; Макаров В.А. и др, 2002]. Возможно, биогенные амины действуют опосредованно через стимуляцию ИЛ-lß, который нарабатывается при остром эмоциональном стрессе и влияет на агрегацию тромбоцитов [Перцов С.С., 1997]. Важно, что влияние капсаицина на коагуляционный гемостаз существенно менялось после коагуляции дорзальных рогов спинного мозга. Эта операция нарушает связь заднекорешковых нервов с центральной нервной системой, при этом сохраняется их целостность. Полученные результаты свидетельствуют о возможном участии капсаицин-чувствительных нейронов в регуляции коагуляционного гемостаза. Исследования в этой области могут иметь важное патогенетическое значение для выявления роли нервной системы в эффектах гиперкоагуляции (тромбоэмболии, ДВС-синдрома) при хронических воспалительных патологиях.

Кровь и биологические жидкости - активная среда организма, которая участвует в организации неспецифических и специфических защитных реакций, обеспечивая резистентность и реактивность организма. Постоянный перенос воды, ионов, макромолекул между кровью, лимфой и интерстицием - основа для поддержания гомеостаза и жизнеобеспечения тканей и органов. Известно, что благодаря контрактильным свойствам сосудистых стенок интерстициальный гель регулирует обмен жидкости в тканях, а его агрегатное состояние зависит от содержания гиалуронидазы и сопряжено с концентрацией ионов. В обзорных работах приводятся данные об изменении содержания гиалуронидазы при введении микродоз вещества П и капсаицина [Азап А. й а1, 1994]. Поскольку поверхность эндотелия имеет отрицательный заряд, антиоксидантная стабильность крови влияет на уровень микроциркуляторных процессов.

Обобщая результаты собственных исследований, можно заключить, что получены новые данные, раскрывающие физиологические механизмы реализации эфферентных функций первичных сенсорных нейронов -афферентного звена центральной нервной системы. Выявлены структурные перестройки в иммунных органах, получающих наиболее обильную иннервацию от этих нейронов. Исследован клеточный состав крови и дренирующих тимико-лимфатические органы биологических жидкостей. Отмечено особое значение первичных сенсорных нейронов в контроле проницаемости сосудов и механизмах внутрисосудистого свертывания, функциональной активности эпителиоцитов тимуса, макрофагов и нейтрофилов венозной крови.

Полученные результаты позволяют предположить, что капсаицин-чувствительные нейроны являются анатомическим субстратом для реализации нейроиммунных взаимодействий и модулируют влияние классических эфферентных нейронов на иммунитет, обеспечивая проявление феномена неспецифической резистентности. Несмотря на большое число исследований в этой области, анатомический субстрат нейроиммунных взаимодействий пока не определен [Абрамов В.В., 1991].

Анализ собственного материала и данных литературы позволяет предполагать, что физиологическая роль капсаицин-чувствительных нейронов заключается не только в передаче информации в ЦНС, но и в регуляции процессов микроциркуляции и гомеостаза лимфоидной ткани. Координируя работу эффекторов тканевого и гуморального гомеостаза при интенсивных и длительных стрессовых, болевых, температурных, лучевых и токсических воздействиях, эти нейроны организуют специфическую защитную реакцию - нейрогенное воспаление.

Полученные в работе результаты развивают концепцию двойной афферентно-эфферентной функции первичных сенсорных нейронов [Holzer Р., 1998], дополняя ее новыми фактами периферических влияниях капсаицин-чувствительных нейронов спинальных ганглиев и принципиально новыми результатами о контроле над реализацией их функциональной активности со стороны центральной нервной системы.