Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение регуляции биосинтеза белка в клетках растений на уровне белковых ...

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение регуляции биосинтеза белка в клетках растений на уровне белковых ..."

РГ8 ОД

^ НМйШжЩ0АКАДЕМИЯ ¡¡ЛУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МО.ТККУЛЯТКОП БИОЛОГИИ ¡1 ЕИОХШМ 1ш«.л.лйтхош1А

!1з правах рукописи

Ли ЛнатолчЧ Впа.п-91!П';гкч

УЯК 577.217.5

ИЗУЧИВ® РЕГУЛЯЦИИ БМОСИНТЕРЛ ГШД В КЛШАХ ГЛСЩР& НА УРОВНЕ БЕВДОШл 5'ЛГ. ТРА]'С.Т'Т""М

(0-3,ОС',с'1! - с-ислс1р'оогг.я лй-ия)

Автореферат .-лз-ортзияч г» сгягскэгото учорсй с1?пэпя т"1ътлглта г'л'.мс!гяч0сккг. 1г03к

Работа выполнена в лаборатории OiiJma n нуклышоиих кислот Института молекулярной биологии и биохимии нм.М.А.Айтхожина Наиио налъной АН Республики Казахстан.

Научный руководитель - кандидат биологических наук

В.К.Искаков

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

1.У. К«*йсомоаевп,

кандидат биологических наук

А.У.Ахшюв

Ведущая организация - Казахский государотьышый ушверситы

им.Аль-ФараОи, кафедра молекулярной биологии и генатчки, г.Алматы

ализированного совета К оси.(Л по защите диссертаций на. списка нив ученой степени кандидата биологических наук при Институте мо• лекулярной биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина Национальной АН Республики Казахстан.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Национальной АН Республики Нозахстал (г.Алмати, ул.иьъченко, £«).

, Автореферат разослан "К," апреля 1УУЗ j ода.

Ученый секретарь Специализированного совета,

Защита состоится "J.%" uati. I yy.'j г. в io на заседании Олици •

кандидат биологических. наук

СЯЩЛЯ 5СЛ! 'ЛКГЕИЮГИНА ГЛБОГЫ

Регуляция биосинтеза селкз является 11,цной из центральных проблем молекулярной биологии и биохимии. Тзучоние механизмов регуляции активности компонентов аппарата трансляции представляет собой одну из налболео важных задач в ро-шши этой проблемы. Откритио болит« Акторов трансляции - трансляционных ферментов, управллщих сложным многоступенчатым про-юсссм синтеза полкпептнда, исследование их структуры и функциональной роли открыло широкие перспективы в изучении возможных мэ-т1ншзм0в регуляции биосинтеза белка. Исторически сложилось тек, что наиболее изученным в этом отношении объектом из эукариотичес-ких клеток оказались ротикулоцитн кролики. Именно в них впервые были обнаружены и охарактеризованы механизмы регуляции активности двух ключевых факторов трансляции - фактора инициации 2 и фактора элонгации 2. Оба механизма основываются на фо сформировании факторов специфическими протэинкиназами, чтс^ сопровождается ингибиро-натем синтеза белка. Эти механизмы били позднее обнаружены и в целом ряду других клеток животных, что позволило считать фосфори-лированиэ е1Р-2 и ЕР-2 универсальными механизмами регуляции трансляции для всех эукариотических клеток.

Что касается растений, то в данном случае процесс трансляции изучен значительно слабое, И предполагается, что он регулируется гак же, как и в клетках животных. Однако, в последнее время стали накапливаться данный, свидетельствующие о различиях в трансляционных аппаратах, животных и растительных клеток. Это позволило предположить, что такие филогенетически далекие царства, как животные и растения могут иметь различные, только им присущие механизма ре: ул'яции трансляции.

Цель работы. Целью настоящей работа было изучение механизмов, ргулянии активности, фактора инициации трансляции 2 (е!Р-2) и фак-

тора ¡элонгации трансляции 2 (KF-2) в клетках, зародышей пшеницы. В связи с итим были поставлена следующие задачи:

1. Выделить очищенные препараты факторов eIF-2 и EF-2 из оа-{юдышея пшеницы.

2. Изучить влияние фосф&рилировшшя на активность этих факторов .

3. Нзмьрить константы диссоциации для комплексов фактора eIF-2 с ГТФ и ГДФ.

4. Провести поиск возможных, присущих лишь растениям, механизмов регуляции биосинтеза белка.

Научная ^овизно. В настоящей работе впервые показано, что DAl-киааза из ротикулоцитов кролика фосфорилируот фактор е1Р-2 из зародышей пшеницы по р- и т-суОьодшшцам, а но по а-субъедшшце, как ьто имеет место в клетках животных. Измеренные константи диссоциации свидетельствуют о том, что сродство фактора eIF-2 к ГДФ всего в 10 pay выше, чем к ГТФ, в то время как в клетках животных эти различия оцениваются в 2-У порядка. Эти. результаты позволили заключить, что механизм регуляции активности фактора инициации 2 в зародышах пшеницы отличается от механизма регуляции этого фактора в клетках животных.

Также впервые показано, что фактор элонгации 2 из зародышей пшеницы фосфорилируется Саг</калмодулин-зависимой киназой из рети-ку^оцитои кролика, однако эндогенной EP-2-фосфорнлируыщей актив-

U

кости в экстрактах из различных растительных объектов не обнаружено. Эти данные свидетельствуют о том, что, хотя активность EF-2 растений потенциально может регулироваться фосфорилировшшом, данный механизм регуляции не реализуется в растительных клетках.

Кроме того впервые обнаружено, что полиироантоцианидин - но-лифенолыгоэ соединение из верблюжьей колючки ALhagl ktrglsorum S. ингибирует трансляцию в бесклеточной системе трансляции, изоира-

олню подавляя активность фактора инициации 2.

?§0Ш™ч5скдя_и_п£акт1™^ Работа имеет

еоретическое и методическое значение для последующих исследований о выяснению регуляторных механизмов биосинтеза бежа и продстав-швт интерес для специалистов в области молекулярной биологии, ¡иохимии и физиологии растений. Обнаруженное иигибирущев действие юлинроантоцианидина но биосинтез бежа предполагаем возможность »го использования в качестве противоопухолевого препарата.

Материалы диссертационной работа докладываюсь на международных симпозиумах: "Molecular organization ol bioLogical structures" (Mo3Cosv, 1989), "Fsegulatlon of translation", (Riga, 1989), Xth Bilateral Syirposlwi USSH-France "Organization mi expression of eukaryotlc an! prokaryotic genera" (Kiev, 1990), ) International Youth School-cohierence on Genetics, (Albena, 1990), "Protein biosynthesis", (Fushchino, 1991), на втором Съезда Зс8союзного общества физиологов растений« (Млнск, 1990), на втором Зсесотоном Симпозиуме "Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии" (Самарканд, 1991), на V конференции биохимиков республик Средней Азий и Казахстана (Ташкент, 1991).

Публикации. По материалам диссертаций опубликована 28 работ.

Структурп^и_дбмм_дзботь1. Диссертация состоит из введв!шя, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов. Работа изложена на i30 страницах машинописною Текста, содержит 5" таблиц, рисунков и список цитируемой литературы, вклютапцпй ¿L&V наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I.Изучение регуляции активности фэктора инициация 2 из зародышей пшениц« (WGeIP-2).

Енделе1Ш9_и_характв2Исттоа_?5е1Р-2. 'Согласно предложенному &

настоящей работе модифицированному методу очистки било цолученс около I мг очищенного препарата фактора инициации 2 из зародшо? пшеницы. Относительная молекулярная масса нативного ИСеТк'-г былн определена методом гель-фильтрации и составила приолизительнс 1Ь0СЮ0. По данным электрофореза ь полиакриламидном геле в присутствии ДС-На (рисЛ) препарат содержит четыре полипоптида с Мг 37000 (а), 40000 (р). 42000 (7), 52000 (С). Найденные волнчинь Нг и их соотношение хорошо совпадают с результатами почти всех групп исследователей, шделявших и характеризовавших ЙСе1Р-2.

* ч

£ 01

-5

94

67

43

УО

•¿и

Рис.I. Улектрофореграмма очищенных препаратов е!Р-2 из ретикулоцитов кролика (дорожка 1) и из зародышей пшеницы (дорожка 2). 3 -маркерные белки (справ указаны их молекулярные массы в кДа).

его^ктирности. В настоящей работе была проверена способность фактора инициации 2 из зародышей пшеницы служить субстратом для специфической еИ'-й-кинази.

активируемой ,в присутствии двуспиральной НИ (ЬА1-киназы), виде ленной из ретикулоцитсв кролика. Известно, что эта киназа фюсфори-пирует а-субъедишщу е!Р-2 из клеток животных, вследствие чего происходит внгибированнэ инициации трансляции. В настоящей работе было обнаружено, что факторы из рэтикулоцитов кролика и из зароды-ней пшеницы фосфорилируются различным образом (Рис.2). Инкубации очищенного препарата иА1-ниназы из регикулоцитсв кролика в присутствии 1т-згРШФ, приводила к ез автофосфорилированию и активации (Рис.2, дорожка I). При добавлении в инкубационную смесь очищенного препарата е1Р-2 из рэтикулоцитов кролика (ЯЕе1Р-2), как и следовало ожидать, происходит фосфорилировагага ого а-субъединицы (до-рокка 2). Однако у фактора из зародышей пшеницы в этих кз условиях ПА1-кинззэ фосфорллируот р- и ?-субъодиницы (дорожка 3). Эти ро-

1

3

— Ш -DAI-0

— 7

; " О

- а

Рис.2. Фосфорилированиз RReIP-2 и WGelF-2 DAI-ки-назой из ретккулоцигов кролика. Препараты инкубировали в присутствии [7-згр] АТФ, затем проводили электрофорез и радио-автография. I- ЮАГ-кстюза, S - DAI- киназа + RHsIF-2, 3 - DAI- киназа + TOelF-2. Г j\: ':* ! " Обозначены положения DAI-

ШйА 1 ч-> кииазн и субъедиштц факто-

ров.

зультаты хорошо согласуются с дшгпнмя К.Рраугашг с соавт. о фзефо-рилирсвапк>т (3- it 7- субя-едалиц melF~Z р-пзетгэтшоЯ киназой (Browning et ti., Тос5оралтгроЕЗЯге гтетгг-коптролпруег.юй

— У

- 0

~ С£

- а -

киназой также описано в работах Р.Еенне с соавт. и Р.Гану. Однако ни в одном случае фо сформирование субъединиц WüeIF-2 не сопровождалось шгибировашем трансляции в бесклеточной системе из зароди-

«

вей пшеницы, из него авторы заключили, что в зародышах пшенмш, по-видамсму, на функционирует гомил-контродируемая система регуляции трансляции (Berne et al., 19Ш; Clarke, Rarm, 1987).

Поскольку известно, что в Оесклэточной системе трансляции, выделенной из ретикулоцитов кролика, в присутствии небольших количеств двуспиральной РНК происходит активация üAI-киназы, которая фосфорилирует а-субъединицу eJLF-2, что в свою очередь приводит к ингибировашю белкового синтеза, было интересно узнать, как влияет присутствие двуспиральной РНК на босклеточную систему трансляции из зародышей пшеницы. На рис.3 представлена зависимость эффективности трансляции от количества даущгаральной РНК (поли(1):поли(С) в бесклеточшх системах, трансляции из зародышей пшеницы (кривая I) и из ретикулоцитов кролика (кривая 2). '1'рансляция в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика существенно ингиоируется при концентраций дву спиральной РНК. около 10 нг/мл, тогда как на систему из зародышей гшюницы присутствие двуспиральной НИ во всем испытанном диапазоне концентраций не оказывает существенного влияния. Таким образом, DÄI-киназа из ретикулоцйтов кролика фосфорилирует WGeIf-2, to не па а-субъедкнице, как в случае с RRelF-?, а по ß- и

7-субъедшшцам, кроме того присутствие двуспиральной РНК в широком

*

интервале концентраций не ингмбярует бесклеточную систему тра'лсля-ции из зародышей пшеницы, в отличие от системы из ретикулоцитов. Эти данные свидетельствуют о том, что в зародышах пшеницы не функционирует система регуляции трансляции посредством фосфэрилирсва-ния eIF-2.

Для нормального протекания трансляции фактор инициации /. после каждого цикла шшшшцш долкен осмоннвать связанный ГД1> ш

50 %

0.2 0.1 0-Г. 0.8 1.0

[дс ГНК] , икг/цл

Fhc.3. Влияние двусшралъноЗ Flili па трансляции в Сесклзтачш;: системах из зароднетй пшеницы '(кривая I) и из ретлкудоцитсв кроят-Ita (кривая 2 ).

ГТФ. Этот обмен на монет протекать сш.тойрокзвольно, так как сродство фактора к ГДФ в ндэтках кивопшх ьа 2-3 порядка'гаав, ччи ?: ГТФ, и осушестЕЛяется при помощи вспсмогзтэлыюго Фактора е1Т-2С. Механизм регуляции актк-ности фактора инициация 2 в клетках етсот них посредством его фосфорилпрованпя ззклвчветсп в тон, что ф-эсф?-риллровшпшй eIF-2 прочно связывает этот вспомогательна фактор, пслодствио чего последний становится недоступным дпг.э для H-tocî'^ -молекул eIF-2, нуклеотидаыД обмзн блокируется, п кзге-•тацлл иигт.бируется. Тагам образам одним из ваяшх услспгЛ çyroayi-'nmpomrnn этого мэханизмэ регуляции яеллбтея большая pstnrrjn п -ррдглро Ф-штора к ГТ'Э я ГДЭ. В связи с аот* яа»<я сияя яз'^п?"?

'".141 и "."ссоц'лзшти i'.c!-'iij.ckc<ïb вГГ-2 из unpawn.".?? jrw.tnst с

и ГГФ. Полученные нами величины констант диссоциации составили К^'ГТФ)^ 1.5 х 10 "6 U, Kd(m-)=J.5 х Ю-7 М, т.е. сродство 'ft"jalF-2 к ГДФ всего в 10 раз выше, чем к ГГФ, тогда как для фактора из клеток животных зта разница составляет 2-3 порядка (Табл.1).

Таблица I.

Кнштические параметры взаимодействия И'Ф и ГДФ с eIF-2 из различных источников

Константы диссоциации комплексов Источники препарата fclF-ü

Асцитные клетки опухоли йрлиха* Ретикулоцити кролика** Еародаши пшеницы

Kdrat нЫ КаШ>. нМ К/ТФ/К/ДО 1600 5 320 250Ü зи 81 150U 150 1U

*Рапп1егз et al., 1988.

**Walton, Gill, 1975. Близкие величины Kd для комплексов WGeUr-2 с гушшловыми нуклооти-дами свидетельствуют о том, что при достаточном соотношении кон цертраций ГТФ к ГДФ обмен нуклеотидов может происходить без участия дополнительного е1Р-2В-подобного белкового фактора. К таком;, же выводу приводят результаты раоог, в которых не удалось обнаружить функциональных аналогов eIF-2B в растительных объектах (1л: et al., 1982; Osterhout et al., 1983). Следовательно, можно говорить о существенном отличии механизмов регуляции инициации транс, лпции в зародышах пиешщы по сравнению с клетками milothhx.

2.Изучение регуляции активности фактора ол^нгацил i.:

из зародышей пшеница ДОЕР~2 >.

Выделение Л^Х'ЗШЭТогдастжОЩЗ^г. Выделенный в настоящей работе преггерпт №51Т-2 по данным двумерного электрофореза (рис.4А) имеет Мг ЮОООи и представлен тремя зарядовыми изомера;«! с газоэлектрическими точками (р1) в интервале от 6,1 до 6,4: два главных компонента с р1 6,1 и 6,2 п минорный - с р1 6,4. Величины р] были определены с помощью карбамилировашюй карбоангидрвзы (СагЬа-гпу1у(е™, Рйагшас1а), которая при двумерном электрофорезе образует сэрию пятен с 1.'г 30000. Наличие нескольких зарядовых изомеров (до чотнрех компонентов) было также описано для ЕР-2 из меток животных .

Фосфори^рованиа^ТО С целы:;

выяснения способности фактора ЕР-2 звродцмй пшеницы к фосфорили-рованию, очищенный 1фешрэт этого фактора инкубировали с ЕР-2-ки-нззой ретикулоцитов кролика в присутствии 17-згР1АТФ и затем анализировали двумерным электрофорезом (рис. 4Б и <Ш). Из электрофо-рограммы (рис.4Б) видно, что в результате" реакции 1п ЬНго-фосфо-рилирования изоэлектрическая точка одного из главных зарядовых изомеров ЕР-2 (р.Г 6,1) сдвигается в кислуя область до волгпшы р1 5,8. Как следует из радиоавтографа того та голя (рис. 4В), именно ота фракция молекул ЕР-2 наиболее интенсивно фасфорилирсвгпа. Следовательно, по крайней море часть молекул ЕР-2 зародыаей шеищу/ (более 50?) является аутентичным субстратом для ер-2-к;шзгн газетного игоисхокдения. Небольшое количество радиоактивных фосфзтгш грушг содержится также в двух других зарядом« изомерах (с р1 6,'-: и 6,4), том но менее они почта не изменяют сеоих электрофорэтгдо-;:пх подвижостоЯ. Следует отметить, что при стандартных услсгияя реакции 1п {го-фэсфорилирования посредством ЕР-2-киназп ретикулоцитов крог.ккз ш-2 зеродгаюй пггешщи фосфорштсруатсп до токоЯ гч '.'т^пенл, что и ЕР-2 ретикулоцитов кроликл".

и,

к1СГ3 g m

94 -

67 -

13 -

30 -

94 -

67 -

411 -30 -

IEK

i

- IY

С A

EK-2

Hic.4. Двумерный электрофорез препаратов WGEF-2. A - WGEF-2, Б - WGEP-2, фосфзрилировашшй EF-2-ки-назой из ■ рютикулоцито1 кролика, Б -' радиоаьто-грамма геля Б. Слова показаны положения маркерных белков, справа - положение фактора (ЕР-2) и карбоан-гидразы ((ЗА).

ел

RF-2

г*«;

Поскольку известно, что фосфорилиро'ъание фактора KF-2 клето! кивотных сопровождается ингибиро вашем синтеза белка in vitro и, по-видимому, in vivo, нами было исследовано влияние фссфорилироьа-шя на активность ЕР-2 зародышей шеншш (табл. 2). Фосфорилиро-вшпшй фактор зародышей пшеницы, так же кок и его аналог ил клето; »íiíBOTHUx, теряет свою активность в поли(1))-зовисимой бесклеточно! трансляционной системе, что сопровождается ингибиропанием синтез; полифонилалашта. Такого ингибирования m наблюдается в прнсугст вин антагониста кплдадулина - трифторпоразина или в отсутстьш квд.пдулина и ионоп Са£' (табл. 2). Последней обстоятельство е№

раз подтверждает 0а217калмодул1Ш-зависимую регуляцию активности ЕР-2-киназц клеток животных, описанную ранее.

Таблица 2.

Влияние фоефоршшрования на активность ЕР-2 зародышей паеницц в полти)-зависимой бвсклеточной системе трансляции

[3Н1Фенилалашш,

Добавки

полимеризовашшй, пмоль

Без добавок 23,0

ЕР-2-киназа 8,5

№-2-кгашза + трифторшразин. 25,3

ЕР-2-киназа без Са2+ и калмодулина 22,8

Очищенный препарат ЕР-2 прединкубировался с указашшми добавками и затем вносился в Оесклеточную систему трансляции.

Таким образом, ({актор ЕР-2 зародышей пшеницы является аутентичным субстратом для ЕР-2-киназы клеток кивотных и его активность потенциально может регулироваться фосформлированием. Естественно "возникает вопрос: реализуется ли эта возможность в клетках растэ-ний, или, иначе говоря, имеется ли в клетках растений ЕР-2-нинаэа, аналогичная таковой клеток кивотных?

Для того, чтобы ответить на эти вопросы, цитоплазматичесюад окстрактн из покоящихся и прорастапцих (6-48 ч при 25°С) зародыша пшеницы тгкубнровалк с (т-згР!АТФ в присутствии каявэдулнна й ионов Саг> и подвергали электрофорезу (рис. 5, дорожки 4-7). В некоторых вариантах для у сплетя чувствительное-:- детекция ЕР-2-киназы в инкубационнуп смесь вносили 5 мкг очивдш-.го 1Р.Е?-2 (ря?.

1 4

5, дор. 5 и 7). В указанных экстрактах наблюдается большое количество полипепгидов, являющихся субстратами для протеин-кицаз зародышей пшеницы. Однако ни в одном из вариантов опыта не наблюдалось фосфорилировашя фактора Ш-2 за счет эндогенной ЕР-2-кшаз-ной активности (рис.5 Б). Аналогичный результат был получен и с экстрактами зародышей кз созрэвающих (стадии мелочно-восковой и восковой спелости) семян пшеницы.

Рис.Б. фосфоршшрование WGeIF-2 In vitro. А - электрофореграмма, Б - радвоавтограша геля А. Образцы инкубировали clг-згР]АТФ, затем проводили электрофорез и радиоавтографию.

I - EF-2-кииаза из ротикулоцнгов кролика, 2 - WGEF-2, 3 - WGEF-2 + EF-2-гашаза из ретикулоцитов кролика, 4 - экстракт из покоящихся, зародышей пшеницы, б - экстракт из покоягдихся зародышей шюницч i rGEF-г. 6 - экстракт.из прорастающих зародышей гтшетздь " - экстракт из прорзстащих зародышей шегащы + Vi'GEF-2.

1 2 3 4 5 6 7

'1 2 3 4 5 6 7

А

Б

Такта образок, при (п у£{гс-фоафортштровашга в цитоплазнатп-4»>c33ä экстрактах яэ иокояетхея, либо активно м^тоболизиругаих

- И) -

зародышей пшеницы £Р-2-киназшй активности обнаружить ны уда ляп . Нельзя, однако, исключить возможность того, что активность LP ^ кинази может оить но каким-либо причинам подавлена и проявляты.л лишь на определенных стадиях развития. Кроме того одной из причин невозможности зарегистрировать фосфорилированио EF--2 может являться наличие в экстрактах зародышей пшеницы ^специфической фосфа-тазной активности. Действительно, но нашим данным уровень удельной фосфатазной активности в экстрактах из покоящихся зародышей составляет о.ойб ед/мг белка, и он увеличивается при прорастании в 3 раза (до 0,231 ед/мг белка), что видно Даке по снижению уровня суммарного фосфорилирования белков in vitro (ср. дорохки 4,5 и 6,7 на рис. ББ). Для проверки этой возможности зародыши проращивали в присутствии i'i2P 1ортофосфата, а затем с помощью ускоренной методики получали обогащенный препарат EF-2 и анализировали методом электрофореза (рис.6). В качестве ингибитора эндогенных фосфатаз в состав буферов вводили молибдат натрия. Обогащенный препарат содержит большое количество сопутствующих полипептидов, однако фактор №-2 вполне отчетливо различим (рис. РА, дорожка I). Радиоав-тограмма геля, представленная на рис.СБ (дорокка I), показывает отсутствие какого-либо включения радиоактивных фосфатных групп в молекулы EF-2. В следующем варианте опыта в качестве контроля в экстракт вносили ¿0 мкг очищенного EF-2 зародышей пшеницы, предварительно нрофосфорилированного EP-2-киназой ретикулоцитов кролика в присутствии ( г ^ИАТФ. инкубировали 10 мин при 25°С и затем проводили аналогичную процедуру ускоренного получения обогащенного препарата ЕР-2. Как видно из рис.йБ (дорокка P.i предварительно фосу&орилированний фактор сохраняет свое фосфорилированное состояние, несмотря т повышенный ФэсФатазный уровень в цитогишзматичос-

ком экстракт'; .

- Ib -

1 2 3

12 3

-EF-2-

ША

S. §§

A

Б

Рис.6. Фосфорилирование WGEF-2 in vivo. А - электрофореграмма, Б -радаоавтограмма геля А. I - экстракт из зародышей пшеницы после in VIио-фосфорилирования, 2 - предварительно фосфорилированзшй WGEF-2 + экстракт (см. объяснения в тексте), 3 - очищенный препарат WGEF-2.

Таким образом, поскольку в настоящей работе не удалось зарегистрировать эндогенной KF-2-фюсфорилирувдэй активности в зародышах пшеницы ни in vitro, ни In vivo, мокно предположить, что, хотя активность EF-2 ззродишей пшеницы потенциально мокот регулироваться фосфорклированиен, однако, из-за отсутствия эндогенной спе-щфпоской Саг*/калмодулин-зависимой EF-2-киназы, данный механизм рогуляшш в зародышах пшеницы не реализуется.

Конечно, нельзя полностью исключить возможность того, что г.этинкость EF-2-мвнази в зародышах паэнкцы каким-либо образом по-лпвдзно, с чэн и связаны трудности ее обнаружения. В литературе глгасааа по граГшеО кэро два примера подобного ингкбирования (в г j'-ьтура кллтск ГС—12 л в ооцзтах Кспорио Zae fíe), которое предпо-

ложителыю служит для регуляции дифференциации и развития клеток. Поэтому вполне вероятно, что в эмбриональных тканях пшеницы активность ЕР-2-киназц может быть заингибирована, но проявляется на других стадиях онтогенеза растения. В связи с этш нами било исследовано фосфорилированиэ фактора ЕР-2 в цитоплазматических экстрактах из дифференцированных органов и тканей пшеницы: листьев, корней, нормальных и этиолированных, проростков, пыльцы. Кроме того исследовались экстракты из других растений, в том числе из листьев и пыльцы табака, проростков и корешков кукурузы и гороха, но нигде 'не удалось обнаружить ЕЕ-2-фосфорилирующей активности.

Таким образом, на протяжении большей части жизненного цикла растения ЕР-2-киназная активность не проявляется. Это позволяет считать, что белковый синтез в клетках высших растений не регулируется посредством фосфорилирования фактора ЕЕ-2. Не исключено, что этот механизм все ке реализуется на определенных этапах развития растения (например в хода гаметогенеза) или при воздействии стрессовых факторов (тепловой шок, гипоксия), и эти возможности требуют дополнительного изучения.

3.Изучение влияния полипроантоциашишна на трансляцию.

В связи с тем, что в настоящей работе в зародышах пшеницы но было обнаружено регуляции активности факторов трансляции посредством их фосфорилирования, характерной для клеток животных, возникает вопрос о существовании альтернативных, присущих лишь растениям механизмов регуляции трансляции. Поскольку известно, что при вируенш. ищокнмях в растениях значительно возрастает содер-жани': Невольных соединений, которые присутствует только в растительных клетках, представлялось еозмоишм, что о—/ веслетка могут непосредоть'.-нно ьлиять на процесс трансляции. возможность

была нами исследована на примере шштроантоцианидина (РРА) - по-лифенольного соединения из верблюжьей колючки, которое обладает противоопухолевым действием (О.Сапко, Р.Кунаева, неопубликованные данные).

Для того, чтобы выяснить влияние РРА на биосинтез белка, в присутствии возрастаниях количеств этого соединения измеряли эффективность трансляции эндогенной мРНК 6 лизатз из ретикулоцитов кролика (по включению (1ЛС1лейцина), Поли(и)-зависимой элонгации (по включению [14С]фенилаланииа) и образования тройственного комплекса (по связыванию '[3531метаошша) (табл.3). Полученные данные показывают, что трансляция эндогенной мРНК и образование тройственного комплекса существенно ингибируются в присутствии РРА, в то время, как элонгация пептида практически не изменяется. Эти результаты свидетельствуют о том, что РРА специфически ингибирует еЕР-2-зависимую стадию инициации - образование тройственного комп-

Таблица 3.

Влияние РРА на синтез белка в бесклеточной системе из ретикулоцитов кролика, на образование тройственного комплекса и на шли (и)-зависимую элонгацию.

Концентрация [14С1лейщш, [З53]метиснш1, [14С]феш1лаланин,

РРА , ПО лт.58 риз 0 В 0 нны й связанный полимеризованный

МКМ иш/мин % иш/мин % имп/мин %

0 11712 100 20114 100 89983 100

I 6170 53 11062 55 91623 101

2 3296 28 . 4894 24 92322 102

5 2130 18 1596 8 88795 93

10 1904 16 970' 5 £1273 90'

докса еIР-2 * ГТФ*Мот-тР1Ж. Для проверки специфичности действия РР^ било проконтролировано образование тройственного комплекса №Се1Р-2 с Г'ТФ и Мет-тРНК в присутствии различных концентраций некоторых фс-нолышх со-:;лишний: кофейной кислоты, Мг 18016 (31зпа); кверце-тина, Мг 33826 (31/-7г,а) и РРА (Рис.7). Из графика видно, что только РГА обладал строгим ингибпрующим действием на образование тройственного комплекса.

со

'о

•8 3

а а га а к

3)

о ®

Я

р—ч

(Л

Г>00

ш о

200

~т

-9 -В -7 -в -5 -4 1й! [фенольного соединения] . М

Рис.7. Влияние различных фенольных соединений на образование тройственного комплекса: I- кофейная кислота, 2- кверцетин, 3- РРА

Таким образом, фенольное соединение полипроантоцианидин из верблюжьей колючки к1г[>1аогит отгибируат инициацию транс-

ляции на стадии образования тройственного комплекса, специфически подавляя активность фактора инициации 2. Можно ;,редположить, что фонолыше соединения подобш 1е полипроантоцианидипу могут играть

важную роль в механизме противовирусной защиты растений. Этот механизм может заключаться во взаимодействии ГРА-подобных соединений с е1Р-2, который вследствии этого становится неактивным в инициации трансляции вирусных ыРНК.

ВЫВОДЫ

1. Выделен и охарактеризован фактор инициации трансляции 2 из зародышей пшеницы (КСе1Г-2). Он состоит из 4-х субъедапшц (а, (3, 7. б) с Мг 37000, 40000, 42000 к 52000, соответственно. Относительная молекулярная масса нагивного фактора составляет 1500Ш.

2. Двуспиральная РНК в интервале концентраций 10 нг - I мкг/'мл не ингибирует синтез белка в Оесклеточной системе из зародышей пшеницы. Активируемая двуспиральной РНК БА1-киназа» выделенная из регикулоцитов кролика, фосфорйлирует ИЮеНЧ! по р- и 7-, но не по а-субъединице.

3. Изучены параметры взаимодействия «ае1Г-2 с ГДФ и ГТФ. Константа диссоциации комплекса ШеЦ-2*ГДФ составила 1,5 х Ю"7 М, а комплекса И(Зе1Т-2*ГТФ - 1,5 х 10~б. Столь близкие величины К^ для ГТФ и ГДФ свидетельствуют* что обмен нуклеогидов на молекуле *Се1Г-2 может происходить без участия дополнительного в1Т-2В-подо<5ного фактора и независимо от того, фосфорилирован 01Г-2 или нет.

4. Выделен и охарактеризован фактор элонгации трансляции 2 из зародышей пшеницы («СЕР-2). Это полипептид с Мг = 100000, имеющий три зарядовых изомера - два главных с р1 6,1 и 6,2 и минорный с р1 6.4.

5. К0ЕР-2 активно фосфоралируется специфической Саг*/калмодулин-зависшой ЕР-г-киназой, выделенной из рэтикулоцитов кролика, теряя при этом активность в Оесклеточной системе трансляции. Следовательно, активность растений потенциально может ре-

гулцроьаться фосфорилированием. Однако нам на удалось с. ,пиру жить эндогенной EF-2-фосфорилируюцей активности во -многих, но следованных растениях и растительных тканях mi in vitro, ни in vivo.

6. Полипроантсцианмдин - полифенольное соединение из верблюжьей колючки Alht:igi btrgteorm S, в концентрации 1-5 мкМ практически полностью инглоируат трансляцию в бесклеточной системе, специфически блокируя способность е1Р-2 образовывать тройственный комплекс 1е1Р-2*ГГФ'Мег-тПИ1). Эги дашше свидетельствуют, что вещества вторичного метаболизма могут играть роль в регуляции белкового синтеза в клетках растений.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

I. Srnail ov S.K., Shalkhln S.M., Lee A.V., Iskaliov В.К. Study of Initiation factor 2 (eIF-2) from wheat genn. Abstracts of International symposium "Molecular organisation of biological structures", Moscow, 1989, p.257.

- 2. S.Smallov, S.Shalkhln, A.Lee, B.Iskakov. Is there regulation of protein synthesis by phosphorylation of translation factors In planta? Abstracts of the Xth Bilateral Symposium USSR-France "Organisation and expression of eukaryotlc and prokaryotlc genom" Klov, 1990, p.15.

3. Smalloy S.K., Lee A.V., Mukhamedzanov B.C., Iskakov b.k. bunisenko O.tl. Inhibition of gene expression by plant phenolic compound-polyproantliocyanidin. Abstracts of V International Youth School-conTerence on Genetics, Albena, 1990, p.6.

S.K.Smal lov, D.G.Mukharaedzhanov, A.V.Lee, B.K.Iskakov, O.H.Denlsonko. Inhibitor of protein ayntheatr Initiation from ЛИщЦ klrgloonm S. PKBS Lett. 1990, v.275, .it ,2 p.99-101.

5. Smailov S.K., Lee АЛ., Shaikhin S.M., Iskakov B.K., Mu-khamedzhanov B.C., Sapko O.A., Kunaeva R.M. PPA - a novel specific Inhibitor of the ternary Met-tItHA»eIF-2*GTP complex lomatlon. Abstracts of 14th International tfiNA workshop. 1991, Rydzyna, Poland, p. 223.

6.' Smailov S.K., lee A.V., Shaikhin S.M., Iskakov B.K., Mu-khamedzhanov B.G., Sapko O.A., Kunaeva R.M. The role of phenolic

compounds at the level of gene expression In plant cells. Abstract

«

of 8th International Protoplast Symposium, Uppsala, Sweden, 199t, р.АЗб.

7. Smailov S.K., lee A.V., Shaikhin S.M., Iskakov B.K., Sapko O.A., Mukhamedzhanov B.G., Kunaeva-R.M. and Denlsenko O.N. PPA - a novel specific inhibitor of protein biosynthesis Initiation. Abstracts of International conference "Protein biosynthesis", Push-chlno, 1991, p.30.

8. Smailov S.K.* Shaikhin S.M., Lee A.V., Iskakov B.K. Difference in regulation mechanisms at the level of translation fac-. tors between animal and. plant cells. Abstracts of International conference,"Protein biosynthesis", Pushchlno, 1991, p.89.

9. С.М.ШаЙхин, С.К.СмаилоВ, А.В.Ли, E.В.Кожанов, Б.К.Искаков Взаимодействие фактора инициации трансляции 2 зародышей пшеницы с гуаниловнми нуклеотидами. Биохимия, 1991, г.56, с.2148-2158.

10. W.Kudlicki, W.D.Pickitig, G.Kramer, B.HardeBty, S.Smailov, A.Lee, B.Mukhamedzhanov, B.Iskakov. Eukaryotic protein synthesis initiation factor 2, a target for inactivation by proanthocyani-din. European Journal of Biochemistry, 1991, 197, p.623-629.

11. Shaikhin S.M., Smailov S.K., lee A.?., Kozhanov E.V,, Iskakov B.K. Interaction of wheat germ translation Initiation factor 2 with GDP and GTP. Biochimie, 1992, v.74, p.447-454.

12. W.Kudlicki,' W.U.Picking, G.Kramer, B.Hardesty, S.K.Smal-

]ov, B.G.Huehamedziianov, A.V.Lee, A.M.Shigaeya, B.K.IskaKov. A novel specific Inhibitor oi eIP-2 from Albagi Mrglaarum &. Известия AH PK, 1992, Серия биологическая, * 4, c.3-10.

13. S.SmailoY, S.Shalkhln. A.Ioe, B.Iskakov. Absence oi trana-latlonal control by phosphorylation of eIP-2 and EP-2 In plant cell. Abstracts of Cold Spring Harbor Meeting on "Tranalatlonal Control". 1992, p.226.

14. Смаилов C.H., Ли А.В., Искаков Б.К. Изучение фосфоршшро-вания фактора элонгации трансляции 2 (EF-2) зародышей пшеницы. Молекулярная биология, 1ЭЭЗ, принято в печать.

15. Smailov S.K., Lee А.V., Ialtakov В.К. Study of phosphorylation of translation elongation factor 2 (EF-2) from wlieat germ. PEBS Lett., 1993, принято в печать.