Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение принципов пространственной организации гликопротеинов методом теоретического конформационного анализа

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение принципов пространственной организации гликопротеинов методом теоретического конформационного анализа"

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи УДК 547.962'458:543.63

АВАНОВ Александр Яковлевич

ИЗУЧЕНИЕ ПРИНЦИПОВ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ГЛИКОПРОТЕИНОВ МЕТОДОМ ТЕОРЕТИЧЕСКОГО КОНФОРМАЦИОННОГО АНАЛИЗА

03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание учёном степени кандидата биологических наук

Ереван - 1989

Работа вшюяиена в Институте бжохжмжж АН АрыССР

Научяне руководители:

Официальные оппожмтн:

академик АН СССР Н. К. Кочетков

кандидат химических наук, отаршкЖ жаучюй оотрудннк Г.М.Лнпкнвд

доктор бнологнчвоких наук, профессор Р.М.Налбавджн

каждвдат химических наук, отариж1 кауппгЁ сотрудник В.П.Панов

Ведущее учреждение - Институт бноорганическо! химии им. М.М. Шемякина АН СССР

Защита ооотоитож

в чаоов на ааоедахии опециаяненрованного Совета К.055.01.08

по присуждению учёно! степени кандидата биологических наук при Севанском ордена Трудового равного Знамени гооударотвенном университете (375049 Ереван, ул.Мраажна I, Ервважскж! госуннверси-тет, биологический факультет, кафедра биохимии).

С диосертацие! можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат раеоолан

Учёта! секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук

/Л.Г^Ажанжи/

/У TJJ JX v J^XJ.

..

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Гликопротеины представляют собой один из важнейших классов биополимеров. Биологические свойства глико-протеинов в значительной степени определяются их углеводными цепями. Так, углеводные цепи гликопротеинов играют важную роль в процессах дифференцировки и злокачественного перерождения тканей, во взаимодействиях гругаюспецифических гликопротеинов с антителами. В ряде случаев именно углеводные цетш задает физико-химические свойства гликопротеинов. Это обстоятельство стимулирует особый интерес к роли углеводов в составе гликопротеинов. Вместе с тем, вопрос о пространственном строении углеводных цепей в составе гликопротеинов и гликопептидов остается открытым. Экспериментальные данные показывают, что присутствие углеводных цепей определенным образом влияет на конформационное состояние пептидного • остова. Поэтому исследование роли углеводных цепей в пространственной организации гликопептидов и гликопротеинов представляется весьма важным и актуальным.

Цель работы состоит в исследовании методом теоретического конформационного анализа в приближении механической модели молекулы неваленттшх взаимодействий с участием как 0-, так и и-связанных углеводных цепей, которые влияют на формирование конформа-ций пептидного остова гликопептидов, а также принципов пространственной организации грулпоспецифических и антифризных гликопротеинов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведен всесторонний анализ взаимодействий боковых углеводных цепей между собой и с пептидным остовом. Определены преимущественные конформации реальных гликопептидаых фрагментов, выделенных из грулпоспецифических гликопротеинов. Предложена пространственная

модель грутшоспецифических гликопротеинов с внешней компактной углеводной оболочкой. Предложена пространственная структура ан-тифризных гликопротеинов, которая позволяет объяснить механизм функционирования этих важных объектов. Рассмотроно пространственное строение сайта N-гликозилирования в связи с вопросами биосинтеза гликопротеинов. Создана универсальная программа для расчета на ЭВМ конформаций сложных гликопептидов и гликопротеинов, которая существенно экономит расчетную процедуру.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на УП Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Пу-щино, 1982) и УШ Всесоюзной конференции по химии и биохимии углеводов (Тбилиси, 1987).

Список публикаций включает 4 наименования.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и выводов. Работа изложена на 260 страницах машинописного текста, содержит 65 рисунков и 54 таблицы. Список цитируемой литературы включает 255 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава I представляет собой литературный обзор и состоит из двух частей. В первой части приведены общие сведения о гликопро-теинах. Состав и структура углеводных цепей - как 0-, так и ц-гликанов - хорошо изучены. Принцип их построения одинаков: они состоят из кора, антенных ветвей и концевых детерминантных остатков, определяющее биологическую специфичностьтликоиротеина. 0-гликаны имеют общий дисахаридный кор, тогда как N-гликаны - пен-тасахаридный кор. Этими участками углеводные цени присоединяются к полипептидному остову: 0-гликаны, в основном, через остатки Thr и Ser, N -гликаны - исключительно через остатки Aon.

Претранственная структура О-гликанов оцределяется невалентными взаимодействиями соседних антенных ветвей между собой, тогда как дая ц-гликанов характерны раскрытые конформацш, в которых антенные ветви удалены друг от друта и не взаимодействуют между собой. Такая структура N-гликанов обусловливает возможность эффективных взаимодействий с поверхностью белковой глобулы. Напротив, компактные структуры О-гликанов оказываются оптимальными в образовании плотноупакованных углеводных оболочек в группоспецифичес-ких гликопротеинах (ГСШ). К О-гликозилпротеинам относятся также антифризные гликопротеины (АФГП), которые обусловливают понижение температуры замерзания крови некоторых видов рыб, обитающих в морях арктического и антарктического бассейнов. Рассматриваются физико-химические данные по АФШ и обсуждается механизм их функционирования.

В случае N-гликозилпротеинов рассматриваются стереохимические условия присоединения углеводной цепи к остатку Asn в последовательности Asn-X-Thr/Ser (X -любой остаток, кроме Pro ), именуемой сайтом N-гликозилирования.

Во второй части главы изложены основы метода теоретического конформационного анализа в приближении механической1 мод ели молекулы. Рассмотрены параметризация функций невалентных, электростатических взаимодействий, функции, моделирующие водородную связь и торсионный эффект. Приведено краткое описание программы для кон-формационннх расчетов на ЭВМ и ее принципиальная блок-схема.

Глава 2 посвящена теоретическому конформационному анализу

гликопептидов, характерных для последовательностей ГСШ. Они вклю-

чпют гликозшшрованные остатки Thr, углеводные боковые цепи кото-

рих моделируются дисахаридным кором СНО - Gal^l -3GalNAco<1:

/

СН .,С O-Thr (СНО)-NHCH ч.

CH^CO-Tiir (ОНО) -Thr(CHO ) -MHCH-j, CH3CO-Ihx (СНО) -Ala-Thr (ОНО) -NHCH-j»

CH^CO-Pro-Thr(CHO)-Thr ССНО )-Tiir(CHO)-Pro-Ser (CHO)-Thr(CHO)-NHCH^.

Для понимания конформационных особенностей ГСГП проведён анализ ближних и средних взаимодействий боковых углеводных цепей как с пептидным остовом, так и друг с другом. Ближние взаимодействия рассмотрены на традиционном в конформационном анализе пептидов модели - метиламиде и-ацетил-^-треонине с гликозилированной боковой цепью СН-jCO-Thr(сно)-NHCH^ . Показано, что углы вращения $ и

в дисахаридном звене и углы гращения ) и ^(с/ -с^)

в боковой цепи остатка Иаг(сно) (рис.1) являются жёсткими конфор-мационными параметрами и равны, соответственно, 60°, 20°, -40° и 160°. Углы, согласно международной номенклатуре, отсчитываются по часовой стрелке от заслонённой конФормации. Отсюда следует, что допустимые значения угла соответствуют транс ориентации связей и 0»-С1, что обусловлено взаимодействиями боковой углеводной цепи с пептидным остовом. Для угла возможны все три значения (-6о°, 6о°, 180°), соответствующие минимумам торсионного потенциала вокруг связи С-сР. Параметры оптимальных кон^ормаций глико-пептида сн^со-тьг(сно)-ынсн^ даны в таблице 1, в которой состояния R иЬ пептидной цепи соответствуют областями (^ -70°) и (^-120°) кон^ормационных карт аминокислотных остатков, а нижний индекс является идентификатором трёх упомянутых областей значений утла •. углам -60°, 6о° к 180° соответствуют индексы 1 , 2 из.

Поскольку в аминокислотной последовательности ГСГП имеются участки, состоящие только из гликозилированных остатков треонина (серина), представляет интерес рассмотреть взаимодействия между соседними гликозилированными остатками. Из конформационного анализа гликопептида CH,c0-Thr(CH0)-Thr(CH0)-NHCH, следует, что для

Рис. 1. Модель гликозшшрованного остатка треонина сНзСО-Саа^-ЗваШАс«! )Ткг-ШСН3 с указанием углов вращения. Значение угла вращения ^ на ньгоменовской проекции соответствует 0е.

с*

Рис.2. Молекулярная модель гликопептида снузо-(аа:1у!>1-

ЗС5а1ЛАсо11 )ТЬг-(Са1^1-3(5а111Ас«1 )ТЬг-ННСНз В ОПТИМЭЛЬНОЙ

свёрнутой кон^ормации и^-н^

Рис.3. Молекулярная модель гликопептида сн^со-Сса!^-

ЗОаЛЛАсо<.1 )ТЬг-А1а-(0а1Д1 -Зйа1ЫАс«1 ЗТЬт-ШСН^ в оптимальной развёрнутой кон^ормации Ь1ЬЬ1.

Таблида i.

Энергия (ккал/моль) и углы вращения (град.) в оптимальных кон^ор-мадиях гликопептида сн3со-(йа1^1-3&а1ЫАсо(1 )ГЫ-:КНСН3._

Конформер

Е

об.

f У

Конформер

~'об.

^ V Ji

•19.9

-22.5

-18.5

-71 -48 -49 -72 -33 51 -57 -35 -178

-22.3 -20.8 -21 .8

-118 148 -48 -133 166 59 -142 181 -177

двух гликозилированных остатков, расположенных рядом вдоль пептидной цепи, самыми низкоэнергетическими являются СЕёрнутые кон^рма-ции ^я., и и1в1 , в которых дисперсионные взаимодействия соседних

боковых углеводных цепей (ев ц^-11,о ккал/моль) обуславливают

12

заметную энергетическую дифференциацию кон^ормаций (табл.2). Отметим, что в случае конформации типа нв высока вероятность значений угла ^ второго остатка, близких к 0°. Это указывает на возможность образования в гликопептидной цепи ^-изгибных структур.

Таблица 2.

Параметры низкоэнергетических конформаций гликопептида сн,со -ты (ОНО ) -ТЫ (ОНО ) -NHCH - .

Коя$ор- 7? ТР об. в1~в2 (ккал/моль) Углы иращения (град.)

мация У 1 У

R1R1 -52.5 -10.7 -69 -39 -65 -61 -47 -50

R1B1 -52.3 -12.0 -71 -44 -48 -66 120 -51

Расчёт гликопептида сн3со-ты(сно)-Ааа-ты(сно)-инсн3 , в котором гликозюшрованные остатки треонина разделены одним остатком (Ala) , показал (табл.3 ), что для такой последовательности наиболее характерны развёрнутые кон^ормации типаь.ъь. , в которых боковые

цепи двух гликозилированных остатков располагаются по одну сторону от пептидного остова, имеют одинаковую ориентацию и одинаковые значения углов ^ , что обусловлено эффективными дисперсионными взаимодействиями между ними (Е01_е^=-7 ккал/моль, табл.з).

Таким образом, из расчёта рассматриваемых модельных гликопеп-тидов следует, что взаимодействия 6окоеых углеводных целей между собой и с пептидным остовом допускает ограниченный набор значений углов вращения V,

I

Полученные результаты позволили провести кон-Тюрмационный анализ самого крупного фрагмента, выделенного из ГСГП со специфичностью А и Еесьма характерного для него по аминокислотной последовательности - гликогептапептида сн^со-Рго-йхг(сно)-Ни- (сно)-Тйх(сно)-Рго-Б ег(сно)-тьг(оно)-ынсн^. Этот фрагмент включает два кон^орма-ционно независимых участка - гликопентапептид Рго-т}1г(сно)-тьг(сно)-ТЬг(СНО)-Рго и гликотетрапептид Т^(СН0)-Рго-Зег(0Н0)-ТЬг(СН0).

Таблица

Низкоэнергетические конформации гликопептида CH,CO-Thr(СНО)-Ala-Ihr(СНО)-NHCH,.

КоиТкэр- Еоб. Углы вращения (град.)

мадия (ккал/моль) •Р V & * V * h

Ь1ЪЬ1 -52.3 -7.0 -118 150 -51 -136 162 -105 148 -51

Ъ2ЪЪ2 -52.3 -6.6 -133 154 54 -139 149 -134 160 59

-54.5 -6.7 -141 172 -171 -140 144 -140 -177 -172

Первый фрагмент принимает развёрнутые конформации, стабилизированные взаимодействиями О-гликозилированных боковых цепей между собой. Для вторбго фрагмента характерна конформация с -изгибом, обусловленная присутствием остатка Pro е его центральной части. Для всего гликогептапептида наиболее вероятны конформации полусвёрнутой про-

Таблица 4. Оптимальные конформации гликогептапептидного фрагмента ГСГП

CH,CO-Pro-Thr(ОНО)-Thr(СНО)-Thr(CHO)-Pro-Ser(ОНО)-Thr(СНО)-NHCH.,, СНО - Gal¿,1 -3GalNAc*1.

Конформация Е /ккатк ЧЛОЛЬ' vP h Углы вращения (град.) ^ h vP %л ü> * %Л h

вь1ъ2ь1нн1ъ1 -156.9 120 -120 156 -53 -128 160 51 -118 155 -61 -40 -61 -45 -50 -168 160 -80

въ1ъ2ъ1вв2в1 -154.0 133 -121 164 -61 -135 156 60 -126 166 -58 151 -67 157 59 -III 154 -60

RR - конформация й -изгиба.

Таблица 5. Геометрические и энергетические (ккал/моль) параметры гликозилированного

долитреонина в конформации ß-структурно! шпильки.

Конформация EThr(CHO) t i * Углы вращения (г -тякей vP ^ \ У <±> %L рад.) в остатках -изгиба ^ tt+i S«U

(ь1ь2)аъ1й^в1ь1(ъ2ь1)п -20.9 -23.7 -149 157 -61 -149 161 60 -155 165 -62 -33 -90 -10 -Т50 153

* - стрелки указывают на ориентацию боковых цепэё остатков треонина, соответственно, над ) зли под ( / ) срэдне§ плоскостью А-шпильки.

странственной Формы с ^-изгибом на с-концевом участке въъъвнь и ^-структурного тяжа вьььввв (табл.4). Показано, что наиденные для коротких гликопептидов закономерности справедливы также в случае более длинного гликогептапептида. На примере последнего проанализирована стереохимическая роль остатка Pro в гликопептидной последовательности.

Таким образом, анализ рассмотренных гликопептидов показал, что в о-гликозилированной пептидной цепи может реализоваться плотная упаковка олигосахаридных цепей.

В главе з рассмотрена модель пространственной организации группоспецифических гликопротеинов. Характерное своеобразие ГСГП -преобладание в аминокислотном составе трёх остатков (Thr, ser, Pro), из которых практически все остатки Thr и Ser гликозилирова- • ны объёмными олигосахаридными цепями, а также наличие компактной внешней углеводной оболочки - делает актуальным постановку и решение следующей задачи: при каких стереохимических условиях в гли-копротеинах с большим содержанием 0-гликозилированных остатков может образоваться структура с пептидным каркасом внутри и углеводным чехлом снаружи. С этой целью выполнен кон^ормационный расчёт полипептидных цепей, моделирующих характерные участки ГСГП.

Показано, что молекулы ГСГП не могут образовать традиционных вторичных структур о(-спирали и у5 -структурного складчатого слоя из-за. наличия в этих случаях недопустимого по критерию ван-дер-ваальсовых контактов пространственного сближения между боковыми углеводными цепями. В то же время, в ГСГП не исключены участки^Ь-структурных тяжей, которые стабилизированы дисперсионными взаимодействиями углеводных цепей при остатках с номерами i и i+2. Вместе с тем, высокое содержание остатков Pro и Ser способствует образованию р-изгибов, обусловливающих поворот пептидной цепи на 180° .

р

Рис.4. Молекулярная модель гликозилиронанного политреонина в оптимальной конФормации уЗ-структурной шпильки.

Потенциальную предрасположенность аминокислотной последовательности ГСГП к образованию -тяжей и р-изгибов можно объединить е модели ^-структурной шпильки (рис.4). Эта разновидность суперЕторичной структуры представляет собой два развёрнутых, соединённых водородными связями пептидных тяжа, между которыми находится р-изгиб. При этом, для р>-тяжей наиболее вероятна конформа-ция ..,Ь1Ь2Ъ1..., в которой значения углов ^ соседних остатков чередуртоя (-60°, 60°, -6о° ...), а для ^б-изгибов - конформация . Параметры оптимальной конформации а-структурной шпильки

приведены в таблице 5, а её молекулярная модель изображена на рис.4.

Проведённый анализ показывает, что в полипептидной цепи с большим содержанием гликозилированных остатков образование р-структурной шпильки допустимо только при определённом расположении углеводных цепей, когда они направлены в стороны, противоположные водородным связям в шпильке. Конформации углеводных цепей при остатках, которые в шпильке находятся один против другого и образуют между собой водородные связи, должны быть одинаковы. С учётом средних размеров р-тяжей в шпильках и углеводных боко-еых цепей, а также ван-дер-ваальсовых радиусов атомов уб-структурная шпилька может тлеть следующие размеры: длина ~53 А, шири-

0 о

на*-^ А, высотами А.

Расчётные данные показывают, что из всех известных структур уб-структурная шпилька с пептидным остовом, изолированным плотно упакованными олигосахаридными цепями, невосстанавливающие концы которых находятся е контакте с внешней средой, может служить доминирующим структурным элементом в пространственной организации молекул ГСГП. Учитывая, однако, небольшие.размеры ^-шпильки

20 остатков) по сравнению с молекулами ГСГП (~500 остатков), возникает вопрос, каким образом шпильки располагаются относительно друг друга с образованием компактной структуры гликопротеина.

С этой целью анализируется возможная упаковка р-структурных шпилек в структуру £-баррела. уб-Баррел представляет собой супервторичную структуру из ^-структурных фрагментов, расположенных в параллельных плоскостях. В данном случае в параллельных плоскостях располагаются ^-шпильки. Если элементы баррела - уй-тяж, р -изгиб и "петлю", соединяющую шпильки между собой, обозначить, соответственно, символами А, ъ и 1, то структуру баррела можно за-

писать в виде ^ър^р!^ ... В зависимости от типа "петли" 1, ориентация уа-тяжей в соседних уь-шпильках может быть параллельной ' или антипараллельной (рис.5). Однако, независимо от типа баррела, расстояние между р-шпильками, исходя из условия компактности баррела, должно быть близко высоте гликозилированной р -шпильки (около 14 I). Этот параметр может служить критерием при отборе оптимальных структур баррела.

Расчётная процедура при анализе возможных упаковок р -структурных шпилек сводилась к поиску оптимального расположения -тяжей в звене путём минимизации потенциальной энергии. Для этого кроме расстояния мезду р> -шпильками во внимание принимался дополнительный переменный параметр - смещение -тяжей относительно друг друга в параллельных плоскоотях. Относительное расположение углеводных цепей меящу ^-шпильками обоих типов баррела схематически показано на рис.5. Из расчёта следует, что в антипараллельном барреле (рис.5,а,б) углевод-углеводные взаимодействия между соседними р> -шпильками могут иметь место лишь между остатками с одинаковыми значениями углов -6о°, -60° или 6о°, 6о° (табл.6). Аналогичные стабилизирующие взаимодействия в параллельном барреле (рис.5,в) возможны лишь для оотатков с разными значениями углов

( 60 и -60°).

Энергетические параметры взаимодействий боковых углеводных цепей соседних шпилек в барреле обоих типов даны в таблице 6. Из этой таблицы следует, что энергия стабилизирующих взаимодействий между углеводными цепями.в звеньяхпри различных взаимных ори-ентациях составляет одну и ту же величину, около -16 ккал/моль, как в антипараллельном, так и параллельном барреле. Это указывает на возможность практически свободного скольжения соседних ^-шпилек относительно друг друга. Важно отметить, что энергетическая

а. .

2 "г

"1 "1

1

Ж

Ь

4

7

<*2Ъ1>И1(Ъ2Ъ1>т,' <Ь1Ъ2>п1(Ъ1Ъ2>п

В. . =-16.4 Ъ1"Ъ1

Е- . Ь .0 "ъ2-ъ2

б.

о/

5А

/

СНО »>1

/

7

/

"ГЧгтк:

л

в.

— НА-

^г^1^^ КЬ2>п1<Ъ1Ь2>п

Рис.5. Схематическое изображение антипараллельного (а,б) и параллел баррела (в). Приведены стекинги между углеводными цепямн и значен» их энергий.

стабильность упаковки ^-шпилек в барреле обусловлена только углевод-углеводными взаимодействиями (табл.6).

Таблица 6.

Энергетические параметры оптимальных кон*ормаций звена у31з в барреле.

КонФормации звена

Энергия (ккал/моль) взаимодействий между углеводными цепями остатков КН«.(К-1)С К^Кд Кд»(К+1)0 КЫ«-(К+2)С

^2Ь1)п1(Ъ2Ъ1)п

(ъ2ъ;)пкъ>2)п (ь1ъ^)пкъ1ь*)п (ь1ь*)п1(ь^ь1)п

(ь1ь2)пкь1ь2)п (ь1\)пкь*ь1)п

Антипараллельный баррел -16.4

-7.1

-7.5 -8.5

-16.5

Параллельный баррел -17.9

-8.1 -8.7

-8.6

Кон'Тнэрмации взаимодействующих остатков соседних уз-шпилек, (Ь1ь3)п - конАюрмации р>-тяжей,

кс - остатки, расположенные в соседних шпильках прут против друга.

В согласии с экспериментальными данными, предлагаемая структура р -баррела удовлетворяет критерию плотной упаковки углеводных цепей вокруг пептидного остова ГСГП. Более того, возможность смещения ^»-шпилек друг относительно друга в барреле позволяет молекуле ГСГП образовать наиболее компактную по углевод-углеводным взаимодействиям структуру, в которой концевые детерминантные углеводные остатки, тем не менее, доступны для межмолекулярных взаимодействий, например, с антителами. Исходя из числа аминокислотных

остатков в ГСГП, а также среднего числа остатков в р> -структурной шпильке и "петле" (~19), следует, что баррел ГСГП может состоять из 20-25 уз -шпилек . В этом случае молекула ГСГП будет представлять вытянутый стержень длиной ~300 А и диаметром ~60 А. Осевое отношение (~о.2) в такой модели соответствует экспериментально определённому Фактору дисимметрии ГСГП (о.1-0.2).

Таким образом, в этой главе показано, что по стереохимическим критериям 0-гликозилпротеины могут образовать структуру, в которой полипептидный остов изолирован слоем плотноупакованных углеводных цепей. Наличие компактной углеводной оболочки в молекулах ГСГП демонстрирует уникальную ситуацию, когда пространственная структура гликопротеина определяется, главным образом, углевод-углеводными взаимодействиями.

В главе 4 изложены результаты теоретического ковариационного анализа гликопептидов

СН3С0 -ТЬг (Бив ) 3-ВНСН3, СЯ3С0-ТЬт(3^) 3-Т1и(Зив)3-ЮСН3, ОН3СО-ТЬх(Зиё)3-А1а-Т11г(Зив)3-1ШСН3, в которых - наиболее распространённые в ГСГП трисахаридные

боковые цепи

Рисыл -гав.1^\ -заа1НАс«1, й1оЫАс«1 -ЗйаШАси! ,

ва^а! -3 (в1сЫАсуз1 -6)йа1НАсо<1 .

Анализ кон*ормационных состояний трисахаридов показал, что взаимодействия концевых остатков между собой могут собственно ограничивать конйормационяую подвижность в пределах дисахаридных звеньев. Например, трисахарид Рис И -2йа1уеЛ -ЗйаГКАс*! обладает значительной структурной жёсткостью, обусловленной неЕалентными взаимодействиями несвязанных остатков Рис и йаШАс в его оптимальной

конпКормацжи углы ^ и ^ в звене Fue-Gal раины 20°, 20°, а в

е о

звене Gal - GaUtAc - 40° , -60°,

Конйормационный расчёт треонина, гликозилированного указанными трисахаридами, показал, что его ковариационное состояние не зависит от наличия третьего остатка на невосстанавливагацем конце углеводной цепи и, -практически, не отличается от состояния треонина, гликозилированного дисахаридным кором,

В гликодипептидах CH^CO-Tiirísugj^-Thrísugj^-HHCH^,независимо от углеводной компоненты, наиболее низкоэнергетическими являются свёрнутые 5чэрмы с одинаковой ориентацией боковых цепей ( -60°). Такой же результат получен для гликодипептнда сн^со-тьхСсно)-Thr(CHO)-NHCH3 (табл.2). Совпадение результатов указывает на отсутствие влияния дополнительного (третьего) гексозного остатка на конфирмационное состояние гликодипептидов.

В случае гликотрипептидов углеЕод-углеводные контакты особенно существенны в кон*ормациях развёрнутой формы bitbi с одинаковой ориентацией олигосахаридных цепей. Аналогичные результаты получены также для гликотрипептидов с дисахаридным кором в 6окоеой цепи.

Таким образом, найдено, что е ближних и средних углевод-пептидных и углевод-углеводных взаимодействиях участвуют, в основном, остатки дисахаридного кора. Это обстоятельство позволяет ввести "дисахаридное приближение" в качестве модели при анализ? гликопеп-тидов с длинными углеводными цепями. Соглаоно этому приближению, в кон'Тормационном анализе гликопептидов с длинными углеводными цепями достаточно ограничиться их дисахаридным кором.

В главе 5 изложены результаты теоретического кон*ормацнонного анализа регулярных кон^ормаций анти^ризного гликопротеина, повторяющимся звеном которого является гликопептид Ala-Ala-Thr(CHO). Прежде всего былн рассмотрены наиболее стабильные вторичные

структуры полипептидов - ог-спираль и уЗ-структура. При поиске оптимальных кон^ормаций ос-спирали и ^-структуры е качестве нулевых приближений для углов вращения tf и У в основной цепи остатков Ala и Thr были взяты значения этих углов в стандартных правой oí -спирали и параллельной и антипараллельной ^6-структурах, при которых находили допустимую упаковку боковых дисахаридных звеньев на поверхности полипептидного остова. Найденные после минимизации потенциальной энергии три оптимальные конФормации гликопротеина приведены е таблице 7.

Таблица 7.

Углы вращения (град.) и энергия (ккал/молъ) оптимальных спиральных кон*ормаций гликопротеина (А1а-А1а-(ва1а1-ЗОвШАои1)ТЬг)п.

Структура EIhr(CHO) Esi-si+3 Ala Ala Thr(CHO) 1 M V f У Ii

«-спираль с2-спираль с3-спираль -30.3 -2.4 -29.3 -0.5 -34.6 -10.2 -64 -45 -64 -45 -64 -46 -74 -145 160 -145 160 -147 150 -65 -76 155 -76 155 -70 155 40

По стереохимическим критериям для АФГП вполне допустимы как «-спираль, так и с2-спираль (тяж антипараллельной р-структуры), однако, самой низкоэнергетической является с3-спираль с осью симметрии 3-его порядка (табл.7). Её особенность состоит в том, что дисахаридные звенья йа1^1 -Зйа1НАсо(1 боковых цепей располагаются по одну сторону от оси спирали и эффективно взаимодействуют »-ежду собой 0з„ „ =-Ю.2 ккал/моль^. Молекулярная модель АФГП в этой кон^ормацяи показана на рис.6. Существование антифризного гликопротеина е водном растворе в кон^рмации с^-симметричной спирали подтверждается рядом экспериментальных исследований, в первую очередь, 1Н-ЯМР спектроскопией. В этой структуре расстояние между

О

ближайшими вдоль пептидной цепи дисахаридными звеньями (9.2 А) равно удвоенному размеру кристаллографической ячейки льда X едоль оси оси преимущественного роста льда, что делает возможным образование Еодородных связей между гидроксилъными группами остатков Gal и молекулами еоды в решётке льда.

03- 9-2 А---03--9.2 А -"03

Рис. 6. Модель структуры АФГП в кон|юрмаши левой спирали типа поли Pro XX с осью симметрии третьего порядка.

Таким образом, предлагаемая структурная модель АФГП объясняет механизм понижения температуры замерзания воды молекулами АФГП путём их адсорбции на поверхности эмбриональных кристаллов льда и блокировки соответствующих сайтов их роста.

В главе б приведены результаты конформационного анализа аспа-рагина, гликозилированного дисахаридом GlcHAc^l-4G1cNAc£,1 (ОНО), а также олигопептидов CH^CO-Asn-X-Tiur-NHCH^ (где X - Gly, Ala, Pro1), моделирующих сайт N-гликозилирования, и их гликозилироЕанных производных.

Для сайта N-гликозилирования найдены активные конФормации,

уцовлетворягацие структурным условиям протекания реакции трансгли-козилирования: положению остатка Asn в р> -изгибе пептидной цепи и образованию водородной сеязи между боковыми цепями остатков asn и Mir . .о"'). в активных кон*ормациях остаток Asn занимает i+2 положение ys-изгиба, а для остатка (х) в центральном положении наиболее вероятно кон^ормационное состояние L (табл.8). Серьезным доводок того, что триплетный сайт гликозилируется в кон^ор-мациях с центральным остатком в состоянии L, служит тот факт, что последовательности Aan-Pro-Thr/Ser с остатком Его, у которого состояние L отсутствует, не гликозилируются вовсе. Активные конфор-кации сайта н-гликозилирования показаны на рис.7.

Таблица 8.

Активные кон^ормации сайта N-гликозилирования CH,CO-Asn-aXy-a?iir-KHCHo.

Кон^ормация Еоб. Углы вращения (град.) в остатках

(ккал/моль) Asn Gly Thr

4 У h У У к: h

-24.4 -85 -30 170 79 30 106 -80 155 -60 -178

Й22ЬВ1 -25.0 -71 -32 76 -52 59 94 -81 150 -55 175

В гликозилированном остатке аспарагина (рис.8) углы Ъ , и ^ принимают значение ~1бо°, соответствующее транс ориентации связей с^-н и к-н в углеводных остатках. Гликозилирование остатка Аза накладывает заметные ограничения на свободу вращения угла в его боковой цепи: по ближним углевод-пептидным взаимодействиям допустимы значения лишь в узкой области около 90°. Три возможных значения угла ^ (-60°, 60° и 180°) в гликозилированном аспараги-не равновероятны, что согласуется с данными ЯМР для водных раство' ров гликопептицов с остатком Аап(сно). Углы $ и У равны -60°

Рис.7. Молекулярные модели сайта и-гликозилирования Аап-01у-№г в активных конформациях й^ьв^ (а) и й^ьв^ (б).

0.1?

* о ; уС2

Н1

н

С1'

сз

л

с в

РИС.8. Модель ГЛШШПвПТВДа СН3С0-(01оНАо)й1-4а1оНАой1)АвП-ШСНэ с указанием углов вращения. Положения атомов на ныоменовских проекциях соответствуют значению 0° углов ^ и ^ .

и о°, соответственно.

КонФормационный анализ гликозилированного сайта к-гликозили-рования СН^СО-(GlcNAcftl-4G1cNAcö1 )Ааn-X-Thr-HHCH^ (2 - Gly, Ala) показал, что гликозилирование приводит к переориентации боковой цепи остатка аспарагина от с- к N-концу пептидной цепи. Такая переориентация (с изменением значения угла от 180° к -6о°) закономерна, поскольку сохранение конФормации сайта и-гликозилирования с исходной ориентацией боковой цепи аспарагина невозможно после присоединения объёмной углеводной цепи из-за возникавших неЕалент-т:х отталкиваний с участием последней.

В заключении проводится сопоставление ближних, средних и дальних углевод-пептидных и углеЕод-углеводных взаимодействий е о- и ы-гликозилпротеинах как основных факторов, определяющих их пространственную структуру.

ВЫВОДЫ.

1. Показано, что в гликозилированных остатках Thr, Ser и Asn ближние невалентные взаимодействия углеводной цепи с пептидные остовом допускают ограниченный набор конформаций боковой цепи.

2. Показано, что в модельных гликопептидах, включающих несколько гликозилированных остатков Ihr, возможна плотная- упаковка между боковыми углеводными цепями.

3. Показано, что в расчётах конформаций гликопептидов в гликозилированных боковых цепях достаточно ограничиться дисахаридным ко-ром.

4. Показано, что в реальных Фрагментах группоспецифических глико-протеинов высока вероятность образования yö-структурных шпилек.

5. Предложена пространственная модель группоспеца^ических глико-

протеинов е виде р> -баррела с компактной внешней оболочкой из углеводных цепей.

6. Предложена пространственная модель антифризного гликопротеина в виде левой спирали с осью симметрии 3-го порядка, на осноЕе которой обсуждается механизм его функционирования.

7. Найдены активные конформации сайта н-гликозилироЕания Аап-Х-. Thr/Ser, е которых боковые цепи остатков Asn и оксиаминокислоты образуют между собой водородную связь Nf-H.. .с/. Рассмотрено влияние гликозилироЕания на конформационное состояние этого сайта.

8. Разработаны программы для конФормационных расчётов на ЭВМ.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Липкинд Г.М., Аванов А.Я., Кочетков Н.К. КонФормационный анализ гликопептидных фрагментов группоспециФических веществ крови // Биоорган, химия. 1982. Т.8, №4, С.512-523.

2. Аванов А.Я., Липкинд Г.М., Кочетков Н.К. КонФормационный анализ антиФризного гликопротеина // Биоорган, химия. 1982. Т.8, JG5, С.616-620.

3. Липкинд Г.М., Аванов А.Я. Принципы пространственной организации группоспециФических гликопротеинов // Биоорган, химия. 1989.

Т.15. Я6. С.82Т-835.

4. Аванов А.Я., Липкинд Г.М. КонФормационный анализ сайта и-глико-зилирования Asn-X-Thr в гликопротеинах // Биоорган, химия. 1990. T.I6, №3. С.

Подписано к печати 8.12.1989гГ Бум. 60x84 печ. 1,5 листа Заказ 330 БФ 04269 Тирак 100

Цех "Ротапринт" Ереванского госуниверситета.

Ереван, ул. Мравяна № I.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Аванов, Александр Яковлевич

Страницы

Введение.

Глава I. Литературный обзор.

1.1. Структурные особенности гликопротеинов.

1.1.1. Груп то специфические гликопротеины.

1.1.2. Анти*ризные гликопротеины.

1.1.3. Структурные условия ж-гликозилирования.

1.2. Теоретический конформационный анализ и методика расчёта.

Глава II. Конформационный анализ гликопептидных фрагментов группоспецифических гликопротеинов.

II. 1. Гликопептидные фрагменты с дисахаридными звеньями Gal^i-ЗбаЗЖоеО в боковых цепях.,.

II.2. Гликогептапептид Pro-Thr(Sug)n-Tiir(Sug)n-Thr(Sug) -Pro-Ser(Sue) -Thr(Sug) ИЗ группо-специфического гликопротеина со специфичностью А.

Глава III. Пространственная модель группоспецифических гликопротеинов. ш.1. о<-Спираль.

III.2. Зигзаг.

Ш.З. Jb-Структура. т.4. ^-Структурная шпилька.

III.5. 6-Баррел.

Глава IV. Конформадионнкй анализ гликопептилных фрагментов группоспецифических гликопротеинов с трисахаридными боковыми цепями.

IV. 1 . Трисахариды Fucoil -2Gal^e>1 -3GalNAcotf, Galpl -3 (GlcM<p1 -6)GallAc<xi

GlcNAcofl ~4Gal^1 -3GalMAco(1.

IV.2. Гликопептиды CH3CO-Thr(Sug)3~imCH3.

IV.3• Гликодипептиды CH3CG-Thr(Sug)Tlir(Sug)3зшсьц.»•.

IV.4. Гликотрипептиды CH^CO-Tlir(Sug)3-Ala

Thr (Sug) -5-Ш1СНо.

Глава v. Конформационный анализ антифризных гликопротеинов. v.1. Возможные структурные модели антифризных гликопротеинов.

V.2. Физико-химическая модель -функционирования антифризных гликопротеинов.

Глава VI. Конформационный анализ гликозилированного остатка Asn и сайта к-гликозилирования.2об

VI. 1 . Гликопептид CH3GO- (GlcNAcyo.1 -4GlcMc^>1 )Asn

ШСН3. vi. 2. Сайт и-гликозилирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение принципов пространственной организации гликопротеинов методом теоретического конформационного анализа"

Из всех классов биологически активных шкросоединенжй глико-протеины изучены менее всего. И хотя о роли и функциях большинства из них известно крайне мало, значение этих биополимеров трудно переоценить. Об этом свидетельствует тот ^акт, что к гликопротеинам относятся соединения самого широкого спектра метаболической активности : гормоны, нейропептиды, антигены, антитела, группоспецифичес-кие вещества, структурные белки, белки крови, мышц, биологические антифризы.

Как показывают исследования последних лет, многие белки оказываются носителями углеводных цепей, то есть гликопротеинами. Они настолько широко представлены в жвых организмах, что с уверенностью можно утвервдать, что большинство белков гликозилировано.

Обнаружение углеводных цепе? в составе молекул белковой природы вызываем осооый интерес к изучению их роли в гликопротеинах. Сами по себе углеводы, наряду с балками, являются важными компонентам химического состава организма. Их значение и роль е функционировании живых систем достаточно хорошо известны. В составе же гли-копротеинов их функции практически не изучены. Предполагается, что на поверхности клеточных мембран углеводы' принимают участие в межклеточных контактах; олигосахаридные цепи на поверхности гликопро-теинов способствуют транспортировке после,дних, в том числе, через ■мембрану клетки /1/; углеводные цепи играют роль антигенных детерминантов гликопротёинов и гликолипидов, находящихся на поверхности клеток.

Информация о химической структуре биополимеров играет нередко ключевую роль при определении их функций и механизма функционирования. Однако, на Фоне достижений в области пространственной организации полипептидных (и полинуклеотидных) макромолекул успехи анаяогичных исследований углеводов значительно скромнее. В ещё большей степени это относится к гликопротеинам. Отсутствие информации о пространственной структуре гликопротеинов существенно ограничивает возможности изучения многих важных процессов с их участием.

По типу гликозидной связи гликопротеины делятся на о- и ы-гликозилпротеины. Участие о- и н-гликанов в Армировании пространственной структуры соответствующих гликопротеинов обусловлено числом, структурой и взаимным- расположением углеводных цепей в молекуле. Так, доминирующая роль углеводных цепей в структурообразова-нии о-гликозилпротеинов определяется их преобладанием в составе этих соединений. Частным проявлением структуры о-гликозилпротеинов, отражающим специфический характер углевод-углеводных контактов в богатых олигосахаридными цепями гликопротеинах, является устойчивость последних воздействию протеолитических ферментов /2/.

Б н-гликозилпротеинах олигосахари,иные цепи представлены значительно реже, но благодаря своей сильно разветвлённой структуре, они принимают участие в углевод-пептидных и углевод-углеводных взаимодействиях и таким образом влияют на формирование пространственной структуры полипептидно?- цепи.

В последние года достигнут значительный прогресс в изучении гликопротеинов: установлены метаболические пути их биосинтеза с описанием роли клеточных органелл /3-14/; определены участники и некоторые структурные условия гликозилирования, характеризующие присоединение О- и н-гликанов; выявлены новые физиологически активные гликопротеины и процессы, в которых они принимают участие; интенсивно ведутся исследования структуры и Функции их углеводных составляющих /15-17/.

Несмотря на известный успех, достигнутый в установлении первичной структуры гликопротеинов, в настоящее время мало что известно как о прищипах пространственной организации этого класса макромолекул, так и структуре конкретных его представителей.

Настоящая работа посвящена изучению роли олигосахаридных цепей в пространственной организации гликопротеинов на примере модельных гликопептидов, фрагментов группоспециФических гликопротеинов крови (ГСГП), н-гликозилпротеинов, а также антифризных гликопротеинов (АФГП).

Наличие информации о роли углевод-углеводных и углевод-пептидных взаимодействий в детерминировании структуры гликопротеинов является, на наш взгляд, необходимым звеном в изучении принципов построения сложной структуры гликопротеинов. С этой целью проведён расчётный анализ, прежде всего, ближних углевод-пептидных взаимодействий в гликопептидах с двумя возможными типами гликозидной связи ('Иаг-О-Зие и где - углеводная цепь), а также средних углевод-углеводных взаимодействий на гликоде- и трипептид-ных фрагментах. Дальние углевод-углеводные взаимодействия рассмотрены на гликозшшрованном политреонине. Рэзультаты, полученные при анализе модельных гликопептидов, были использованы для предсказания пространственной структуры конкретных гликопротеинов.

Чтобы получить представление о пространственной структуре таких сложных молекул, как ГСГП, был проведён конФормационный анализ их реальных олигогликопептидных Фрагментов.

Считая справедливым основной тезис молекулярной биологии о структурно-функциональном соответствии, следует признать, что знание пространственной организации макромолекул может пролить свет на механизм их Функционирования. Наш рассмотрена пространственная структура антифризного гликопротеина, для которого накопилось достаточно экспериментальных данных, позволяющих судить о достоверности теоретических расчётов. Пространственная структура АФГП, обусловлс-ннбя средним углевод-углеводными взаимодействиями, объясняет механизм аномального понижения температуры замерзания жидкости этими гликопротеинами.

Сведения о пространственной организации активных центров в каталитических реакциях - как на ферменте, так и субстрате - необходимы для понимания стере ©химических условий ферментативного акта. Поэтому кроме анализа ближних взаимодействий в гликозилированном остатке аспарагина и с учётом этих данных исследованы также кон-формационные особенности специфической аминокислотной последовательности Азп-х-тьг, являющейся сайтом ж-гликозилирования (х -аминокислотный остаток).

Диссертация состоит из шести глав, выводов и библиографии. Первая глава включает литературный обзор по гликопротеинам и описание метода теоретического конФормационного анализа (ТКА). Здесь же приводится принципиальная схема работы программы и алгоритм расчёта.

Вторая глава посвящена конформационному анализу коротких гликопептидов, в которых остатки треонина и серина содержат в боковых цепях дисахаридные звенья, инвариантные для о-гликозилпротеи-нов.

В третьей главе рассматриваются элементы известных вторичных структур и возможность их реализации для молекул ГСГП. Предлагаемая пространственная модель учитывает особенности их химического состава ж аминокислотной последовательности и удовлетворяет имеющимся физико-химическим данным о ГСГП.

В четвёртой главе описан конформационный анализ некоторых ди-и трисахаридов, а также гликопептидов с трисахаридными боковыми цепями. В результате сравнения полученных данных с данными второй главы постулируется "дисахаршдное приближение", как модель при анализе более сложных гликопептидов.

Б пятой главе приведён конформационный анализ антифризных гликопротеинов. Предлагаемая пространственная модель АФГП периодична по структуре и позволяет объяснить их активность в понижении температуры замерзания через механизм адсорбции на эмбриональных кристаллах льда.

В шестой главе рассмотрены стереохимические аспекты ж-глико-зилирования. Сначала проведён конформационный анализ гликозилиро-ванного остатка аспарагина, затем описан анализ трипептидной маркерной последовательности, служащей сайтом и-гликозилирования, до и после гликозилированиЯо

Б заключении даётся сжатое описание результатов расчёта; подчёркивается важность ближних, средних и дальних взаимодействий с участием углеводных фрагментов боковых цепей и их взаимообусловленность в детерминировании уникальной пространственной структуры гликопротеинов.

Выводы, содержащие краткое перечисление основных итогов работы, и список цитируемой литературы завершают текст диссертации.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Аванов, Александр Яковлевич

Выводы.

1. Показано, что в гликозилированных остатках ближние невалентные взаимодействия углеводной цепи с пептидным остовом допускают ограниченный набор конФормацик.

2. Показано, что в 0-гликозилпептидах, включающих несколько глико-зилированных остатков треонина, возможна плотная упакоЕка между боковыми углеводными цепями.

3. Показано, что в расчётах конФормациЙ гликопептидов в боковых цепях достаточно ограничиться дисахаридным кором.

4. Показано, что в реальных фрагментах группоспециФических глико-протеинов Еысока вероятность образования^б-структурных шпилек.

5 . Предложена модель пространственной структуры группоспецифичес-ких гликопротеинов в виде уЗ -баррела с компактной внешней оболочкой из углеводных цепей.

6. Предложена модель пространственной структуры антиФризных гликопротеинов е виде левой спирали с осью симметрии з-го порядка и на её основе обсуждается механизм их Функционирования.

7. Найдены активные конФормации сайта и-гликозилирования и рассмотрено влияние гликозилирования на его конФормационное состояние.

8. Показано, что конФормашя пептидного остова о- и ж-гликозилпеп-тидов полностью детерминирована углевод-углеводными и углевод-пептидными взаимодействиями.

9. Разработаны программы для конФормационных расчётов на ЭВМ.

Заключение.

Результаты теоретического конформационного анализа о- и ы-гликозилпептидов, гликозилироЕанных полипептидов, а также Фрагментов молекул группоспецифических и антифризных гликопротеинов и сайта ж-гликозилирования позволяют сделать вполне конкретные еыеоды о пространственном строении некоторых сложных гликопротеинов и высказать определённые соображения относительно связи структуры с функциональной ролью таких молекул.

Анализ метиламидов ж-ацетильных производных треонина и аспа-рагина, гликозилированных ди- и трисахаридными цепями, показывает значительное сходство в конФормациях, выражающееся в одинаковых значениях соответствующих параметров ^, ^ боковой цепи и $ и ^ пептидного остова, определяющих углевод-пептидные взаимодействия на уровне контактов ближнего порядка. Каждый из углов и ^ имеет лишь одну область определения. Это обстоятельсто значительно ограничивает число возможных конФормационных состояний остатков тьг(сно) и Аап(сно). Такая жёсткость особенно существенна в отношении угла который в остатках тьг и Аап имеет большую свободу вращения.

Свобода вращения по углу %2 в остатках тьг и Аап настолько велика, что вносимое гликозилированием ограничение воспринимается не столько как различие, сколько конкретизация значения этого угла. Угол в остатках тьг и Азп отсутствует. Угол Д , как и в остатках тьг и Азп, имеет три области определения, соответствующие минимумам торсионного потенциала. Значения углов ^, Ф и Ф взаимообусловлены в такой же степени, как в остатках тЬг ж Аап. Это наблюдение имеет особо важное значение при сопоставлении конФормаци-онных свойств аминокислотных остатков и их гликозилированных производных: известно, что чем ближе переменная боковой цепи к пептидно

МУ остову, тем больше её влияние не только на ближние, но и средние и, повидимому, дальние взаимодействия. В этом смысле угол не играет столь важной роли, поэтому можно сделать вывод, что гли-козилирование, практически, не влияет на конФормадионные свойства треонина и аспарагина.

Углевод-пептидные и углевод-углеводные взаимодействия между соседними или разделёнными одним аминокислотным остатком гликози-лированными остатками треонина показали, что представление боковой олигосахаридной цепи дисахаридным кором достаточно для выявления конформационных особенностей, определяемых этими взаимодействиями. Поскольку олигосахаридные цепи соседних гликозилированных остатков расходятся в гиде Еекторов от пептидного остова в оптимальной свёрнутой конФормации, постольку остатки на невосстанавлиЕающих концах трисахаридных и более длинных боковых цепей не вступают между собой е средние взаимодействия.

Для гликопептидных фрагментов, в которых гликозилированные остатки разделены одним аминокислотным остатком, средние взаимодействия между их олигосахаридными боковыми цепями детерминируют разЕёрнутую конФормацию пептидного остова. При этом, взаимодействующие между собой боковые олигосахаридные цепи располагаются по одну сторону от плоскости пептидного остова и имеют тоздественные конФормации и одинаковую ориентацию в пространстве. Как и в свёрнутой конФормации, в этих взаимодействиях принимают участие, в основном, атомы и группы атомов, входящие в состав дисахаридных коров, что позволяет сделать выеод о возможности моделирования оли-госахаридных цепей дисахаридным кором ("дисахаридное приближение").

Учёт дальних углевод-углеводных взаимодействий существенен при анализе пространственной структуры гликопротеинов. В предложенной наш пространственной структуре ГСГП дальние взаимодействия также хорошо описываются в "дисахаридном приближений". Этому способстЕует то обстоятельство, что в предлагаемой структуре контакты между олигосахаридными цепями далеко отстоящих в полипептидной цепи друг от друга гликозилированных остатков не зависят от их длины. Это обусловлено спецификой гликозид-пептидной связи и оптимальными конФормациями, продиктованными ближними взаимодействиями. В результате боковой радикал гликозилированного остатка отходит почти перпендикулярно от пептидного остова лишь на начальном Фрагменте С°*-С1 .длиной 6-7 А. Олигосахаридная же составляющая, независимо от её длины, расположена в плоскости, параллельной плоскости пептидного остова.

В предложенной нами .для молекул ГСГП структуре многослойного баррела, каждый слой которого состоит из двухтяжевойр-шпильки, олигосахаридные цепи из соседних слоёв (^3 -шпилек) вступают друг с другом в очень сильные дисперсионные взаимодействия (стекинги), стабилизирующие структуру. Эта модель предусматривает надёжную экранизацию пептидного остова ГСГП от внешней среды, которую обеспечивает компактная внешняя оболочка из углеводных цепей.

Расчётный анализ реального Фрагмента, выделенного из ГСГП и весьма характерного для него, подтвердил возможность реализации для него отдельных элементов баррела.

Аналогичное соответствие классификации внутримолекулярных взаимодействий структурной иерархии макромолекул выявлено также при исследовании молекул антиФризного гликопротеина. Молекулы АШ1, подобно молекулам ГСГП, являются о-гликозилпротеинами, однако, в отличие от последних, имеют регулярную аминокислотную последовательность. Это обстоятельство, несомненно, делает АФГП более подходящим объектом для теоретического конформационного анализа, если принять, что регулярной первичной структуре должна соответствовать регулярная же пространственная структура.

С другой стороны, исходя из тезиса о структурно-Функциональном соответствии, очевидно, что пространственная структура анти-Фризных гликопротеинов должна объяснять механизм понижения температуры замерзания. Поэтому справедливо предположить, что пространственная структура АФГП в определённом смысле должна быть комплементарна структуре льда, так что информация о последней также может оказаться полезной при определении пространственной структуры молекул АФГП. Так, используя данные о механизме активности молекул АФГП через их адсорбцию на поверхности эмбриональных кристаллов льда, а также о структуре кристаллографической решётки льда, мы показали, что антиФризная активность полностью детерминирована аминокислотной последовательностью молекул АФГП.

Предлагаемая на основе конФормационного анализа пространственная структура АФГП объясняет механизм их активности в понижении температуры замерзания через их адсорбцию на поверхности раздела жидкой и твёрдой фаз. Именно в структуре левой спирали типа полиРго и с осью симметрии з-го порядка средние углевод-углеводные взаимодействия являются наиболее эффективными, то есть для молекул АФГП, как и ГСГП, наличие углеводных цепей играет решающую роль в формировании пространственной структуры. Так, очевидно, что негликозилированная аминокислотная последовательность,аналогичная таковой в АФГП, предпочитает конФормацию (X-спирали, тогда как реальные молекулы АФГП могут функционировать только в конформации левой спирали типа полирго п. Эта структура уникальна тем, что углеводные цепи располагаются не только специфическим образом, соответствующим структуре льда I, но и создают плотно упакованную гидрофобную оболочку вокруг пептидного остова. Этому способствуют метильные группы в боковой цепи остатков треонина и аланина, которые блокируют доступ молекул воды к поверхности растущего кристалла льда после адсорбции на нём молекул АФГП.

Таким образом, в о-гликозилпротеинах углевод-углеводные и углевод-пептидные взаимодействия являются определяющими при Формировании их пространственной структуры. В обоих рассмотренных случаях совершенно очевидно, что углеводные компоненты выполняют, по меньшей мере, две Функции: специфическую, определяющую биологическую активность конкретного соединения, и общую, экранирующую, по предохранению пептидной цепи от внешних воздействий.

Наличие углеводного Фрагмента в боковой цепи аспарагина отражается на конформационном состоянии метиламида и-ацетиласпараги-на приблизительно в такой же степени, как в случае о-гликозилпептид-ной связи. Так, для угла ^ предпочтительна область положительных значений; углы ^ и ^ являются жёсткими конФормационными параметрами. Сочетание оптимальных значений углов и ^ приводит к тому, что в обоих случаях олигосахаридный фрагмент боковой цепи ориентируется, практически, параллельно плоскости развёрнутого пептидного остова. Однако, на этом аналогия с о-глико-зилпротеинами исчерпывается.

Углевод-углеводные взаимодействия в к-гликозилпротеинах, по всей видимости, имеют иной характер, чем в о-гликозилпротеинах. Об этом можно судить по тому обстоятельству, что гликозилирован-ные остатки аспарагина отстоят далеко друг от друга в аминокислотной последовательности, поэтому взаимодействия между их углеводными цепями правильнее относить к дальним. Тем не менее, эти углеводные цепи (и-гликаны) имеют настолько разветвлённую и объёмную структуру, что и в случае ж-гликозилпротеинов можно говорить об образовании компактной Енешней оболочки. Таким образом, отсутствие большого числа гликозилированных остатков в и-гликозилпротеинах компенсируется большой площадью поверхности каждого н-гликана. Естественно, что такие большие и сложные углеводные цепи могут быть присоединены к пептидной цепи в наиболее экспонированных её участках, то есть в конФормациях, доступных по стереохимическим критериям. Таковыми, как известно, являются повороты пептидной цепи, петли, в частности кон*ормация р-изгиба.

Проведённый конформационный расчёт показывает, что условия, необходимые дня протекания реакции н-гликозилирования, выполняются при нахождении остатка Asn в i+2-ом положении ^-изгиба. Однако, появление массивной углеводной цепи вносит коррективы при Формировании пространственной структуры N-гликозилпротеинов после полного синтеза молекулы. В частности, об этом можно судить по изменению конФормации сайта w-гликозилирования после присоединения дисахарид-ного звена, что прежде всего выражается в переориентации боковой цепи остатка аспарагина.

Подводя итог теоретического конформационного анализа 0- и н-гликозилпептидов, можно сказать, что в обоих случаях наиболее важным параметром, ответственным за углевод-пептидные взаимодействия ближнего порядка, является угол fa: именно этот угол и только он претерпевает заметные изменения (ограничения) при гликозилировании остатков Thr и Asn. Значения этого угла в обоих типах гликопептидов определяют расположение углеводного Фрагмента боковой цепи соответствующего остатка относительно плоскости его пептидного остова независимо от значений угла ¡С^. На уровне средних и дальних взаимодействий, а также в вопросах структурно-Функционального соответствия доминирующее влияние имеют значения угла fa.

На примере проведённого исследования хорошо прослеживается взаимообусловленность внутримолекулярных взаимодействий, условно поделённых на три уровня: ближние углевод-пептидные взаимодействия определяют оптимальные конФормации гликозилированных остатков, что в свою очередь обусловливает специфические средние углевод-углеводные взаимодействия, детерминирующие оптимальные конФормации вторичных структур отдельных Фрагментов пептидного остова гликопротеинов, которые, благодаря дальним углевод-углеводным взаимодействиям складываются в некоторую уникальную пространственную структуру, характеризующуюся компактной упаковкой углеводных цепей вокруг пептидного остова.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Аванов, Александр Яковлевич, Ереван

1. Bauer Н.С., Parent J.В., Olden K.- Biochera. Biophys. Res. Comiriun. 1985, v.128, p.368-375-

2. Bernard В.А., Yarnada K.M., Olden K.- J. Biol. Chern. 1982, v.257, p.8549-8554.

3. Rothman J.3., Lodish H.I?.- liature 1977, v.269, p.775-780.

4. Kruppa J.- Biochem. J. 1979, v.181, p.295-300.

5. Katz Б1.!., Rothiaan J.iD., Knipe D.M., Lodisii H.F.- J. Supra-raol. Struct. 1977, v.7, p.353-370.

6. Klenk H.B.- In: The molecular basis of microbiological pha-togenicity /Smith H., Skehel J., Turner Li., eds. .Valriheim, 1980, p.55-66.

7. Blobel G., Dobberstein В.- J. Cell Biol. 1975, v.67, p.835-851.

8. Лодиш X., Ротмен Дж.- В сб.: "Молекулы и клетки"/?ед. Георгиев Г.П. М.: Мир,1982, вып. 7, с. 149-175.

9. Melchers 1?.- Biochemistry 1971, v.10, p.653-659.

10. Rothman J.a.- Science 1981, v.213, p.1212-1219.

11. Roth M.J., Berger F.G.- J. Cell Biol. 1982, v.22, p.223-229.

12. Balch У/.Е., Dunphy W.G., Brael W.A., Rothman J.E.- Cell 1984, v.39, p.405-416.

13. Зайдес B.M., Березин B.3., Дданов B.M.- Вопросы вирусологии1986, N2, с, 133-148.

14. Habbard S.C., Ivatt R.S.- Ann. Rev. Biochem. 1981, v.50,p.55-83.

15. Липкинд Г.М., Веровский B.E., Кочетков H.K.- Биоорган, химия1982, т. 8, С. 963-970.

16. Веровский В.Е., Липкинд Г.М., Кочетков HJC«- Биоорган, химия1984» т.10, с. 1680-1687.

17. Веровский В.Е. Теоретический конформационный анализ углеводных цепей гликопротеинов. Диссертация на соискание учёной степени канд. хим. наук, М. 1986

18. Деревицкая В.А., Кара-Мурза С.Г., Кочетков Н.К.- Доклады АН СССР 1965, т.163, с.650

19. Kochetkov N.K., Derevitskaya V.A., Kara-Murza S.G.- Carbohydr. Res. 1967, v.3, p.403

20. Eylar E.H.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962, v.8, p. 195

21. Marks G.S., Marshall R.D., Heuberger A.- Bioeliem. J. 1963, v.87, p.274

22. Montreuil J., Biserta G., Chosson А.- Сотр. Rend. 1963, v.256, p.3372

23. Rothfus J.A., Smith E.L.- J. Biol. Chem. 1963, v.238, p.1402

24. Gottschalk A., Murphy W.H.- Bioehim. Biophys. Acta 1961, v.46, p.81

25. Tomita M., Marchesi V.T.- Proc. Natl. Acad. Sci. 1975, v.72, p.2964

26. Nilsson В., Norden N.E., Svensson S.- J. Biol. Chem. 1979, v.254, p.4545

27. Spiro R.G.-Adv. Prot. Chem. 1973, v.27, p.349

28. Haselbach A., Tanner W.- FEBS Lett. 1983, v. 158, p.335

29. Hanover J.A., Lennarz W.J.- Arch. Biochem. Biophys. 1981, v.211, p.1

30. Scholander P.E., llagg W., Walters V., Irving L.- Physiol. Zool. 1953, v.26, p.67

31. Shier W.T., Lin Y., De Vries A.L.- Bioehim. Biophys. Acta 1972, v.263, p.406

32. Веровский В.E., Липкинд Г.М., Кочетков Н.К.- Биоорган, химия 1983, т.9, с.254

33. Derevitskaya Y.A., Arbatsky I.P., Kochetkov N.K.- Eur. J.

34. Biochem. 1976, v.86, p.42334* Derevitskaya V.A.- Pure Appl. Chem. 1981, v.53, p.89

35. Деревицкая В.А.- В кн.: Прогресс химии углеводов /под ред. ТорговаИ.В. 1985, с.97, М.:Наука

36. Хъгоз Р.- Гликопротеины. М.: Мир, 1985

37. Montreuil J.- Adv. Carbohydr. Chem. Biochem. 1980, v.37, p.157

38. Montreuil J.- Pure Appl. Chem. 1975, v.42, p.431

39. Montreuil J.- Pure Appl. Chem. 1984, v.56, p.859

40. Homans S.W., Dwek R.A., Boyd J., Mahmoudian M., Richards W.G., Rademacher T.W.- Biochemistry 1986, v.25, p.6342

41. Brisson J.-R., Carver J.P.- Biochemistry 1983, v.22, p.3680

42. Brisson J.-R., Carver J.P.- Can. J. Biochem. Cell Biology 1983, v.61, p.1067

43. Brisson J.-R., Carver J.P.- Can. J. Biochem. Cell Biology 1983, v.61, p.1077

44. Li Z.-Q., Perkins S.J., Loucheux-Lefebvre M.H.- Eur. J. Biochem. 1983, v.130, p.270

45. Липкинд Г.М., Веровский B.E., Кочетков H.K.- Биоорган, химия 1983, т.9, с.1269

46. Longmore G.D., Schachter Н.- Carbohydr. Res. 1982, v.100, p.365

47. Brisson J.-R., Carver J.P.- Biochemistry 1983, v.22, p.1362

48. Paulsen H., Peters Т., Sinnwell V., Lebuhn R., Ueyer B.-Liebigs Ann. Chem. 1985, N3, p.489

49. Sutton B.J., Phillips B.C.- Biochem. Soc. Trans. 1983, v.11, p.130

50. Deisenhofer J.- Biochemistry 1981, v.20, p.2361

51. Деревицкая В.А., Лихошёрстов Л.М., Медведев С.А., Кочетков Н.К.-Извеатия АН СССР 1974, сер. хим. В2, с.461

52. Кочетков Н.К., Лихошёрстов Л.М#, Медведев С.А., Деревицкая В.А.-Доклады АН СССР 1976, т.227, C. 5&4

53. Kochetkov U.K., Derevitskaya V.A., Arbatsky N.P.- Eur. J.

54. Biochem. 1976, v.67, p.129

55. Goodwin S.D., Watkins W.M.- Eur. J. Biochem. 1974, v.47, p.371

56. Хургин Ю.И., Шерман Ф.Б., Лихошёрстов Л.М., Мартынова М.Д.-Доклады АН СССР 1983, т.268, о,502

57. Pusztai A., Morgan W.T.J.- Biochem. J. 1963, v.88, p.546

58. Donald A.S.R.r Boichim. Biophys. Acta 1973, v.317, p.42063♦ Kabat S.A., Bassett E.W., Pryzwansky K., Lloyd K.O., Kaplan I.E. Layng E.J.- Biochemistry 1969, v.4, p.1632

59. Donald A.S.R., Creeth J.M., Morgan W.T.J., Watkins W.M.-Biocliem. J. 1969, v.115, p.125

60. Derevitskaya V.A., Likhosherstov L.M., Martynova M.D., Kochet-kov U.K.- Carbohydr. Res. 1983, v.120, p.85

61. Watkins W.M.- In: Glycoproteins /Gottschalk A., ed. BBA Library 1972, v.5, part B, p.830

62. Шерман Ф.Б., Хургин Ю.И.- В сб.: Кон*ормационные изменения биополимеров в растворах. 1980, Тбилиси, Мецниереба, о.146

63. Tanford С.- The hydrophobic effect: formation of micelles and biological membranes. Wiley, New York, 1973

64. Scholander P.P., Van Dam L., Kanwisher J.?/., Hammel H.T., Gordon M.S.- J. Cell Сотр. Physiol. 1957, v.49, p.5

65. Gordon M.S., Amdur B.H., Scholander P.P.- Biol. Bull. 1962, y.122, p.52

66. De Tries A.L., Wohlschlag D.E.- Science 1969, v.163, p.1073

67. Black V.S.- Univ. Toronto Biol. Ser. 1951, v.59, p-53

68. De Vries A.L.- Ph. D. Thesis, Stanford Univ., 1968

69. Duman J.G., De Vries A.L.- Nature 1974, v.247, p.237

70. Scholander P.P., Maggert J.E.- Cryobiology 1971, v.8, p.371

71. Hargens A.R.- Science 1972, v.176, p. 184

72. Raymond J.A., Lin X., De Vries A.L.- J. Exp. Zool. 1975, v.193, p.125

73. De Vries A.L., Komatsu S.K., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1970, v.245, p.2901

74. Komatsu S.K., De Vries A.L., Peeney R.E.- J. Biol. Cliem. 1970, v.245, p.2909

75. Komatsu S.K.- Ph. D. Thesis, Univ. Calif., Davis, 1969

76. De Vries A.L., Vandehheede J.R., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1971, v.247, p.305

77. Peeney R.E.- Amer. Sci. 1974, v.62, p.712

78. Lin Y., Duman J.G., De Vries A.L.- Biochem. Biophys. Rss. Commun. 1972, y.46, p.87

79. Morris H.R., Thompson M.R., Osuga D.T., Ahmed A.I., Chan S., Vandenheede J.R., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1978, v.253, p.5155

80. Duman J.G., De Vries A.L.- CryoMology 1972, v.9, p.469

81. Raymond J. A., De Vries A.L.- Cry etiology 1972, v. 9, p. 541

82. Osuga D.T., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1978, v.253, p.5338

83. Smith R.N.- In: Antarctic Ecology /Holdgate M.W., ed. 1970, v.1, p.329, Acad. Press, London

84. Umminger B.L.- J. Exp. Zool. 1969, v.172, p.409

85. Peeney R.E., Hofmann R.- Nature 1973, v.243, p.357

86. Tomimatsu Y., Scherer J., Yeh Y., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1970, v.251, p.2290

87. Haschemeyer A.E., Guschlbauer W.- Nature 1977, v.269, p.87

88. Ahmed A.I., Peeney R.E., Osuga D.T., Yeh Y.- J. Biol. Chem. 1975, v.250. p.3344

89. Pranks P., Morris E.R.- Biochim. Biophys. Acta 1978, v.540, p. 346

90. Raymond J.A. Ph. D. Thesis, Univ. Calif., San Diego, 1976

91. Sekerka R.P.- J. Crystal Growth 1968, v.3, p.71

92. Раннелс I.К.- В сб.: Физика твёрдого тела /под ред. Жданова Г.С.-2521972, вып.7, с.38

93. Raymond J.А., De Vries A.L.- Proc. Natl. Acad. Sei. 1977, v.74» p.2589

94. Fletcher H.H.- The chemical physics of ice. Cambridge Univ. Press, Cambridge, England, 1970, p.111

95. De Yries A.L.- Science 1971, v.172, p.1152

96. Brown R.A., Yeh Y., Burcham T.S., Feeney R.E.- Biopolymers1985, v.24, p.1379

97. Burcham T.S., Osuga D.T., Yeh Y., Feeney R.E.- J. Biol. Chem.1986, v.261, p.6390

98. Burcham T.S., Knauf M.J., Osuga D.T., Feeney R.E., Yeh Y.-Biopolymers 1984, v.23, p.1379

99. Tiffany M.L., Krimm S.- Biopolymers 1969, v.8, p.347

100. De Yries A.L., Lin Y.- Bioehim. Biophys. Acta 1977, v.495, p. 388

101. Lin Y., Gross J.K.- Proc. Natl. Acad. Sei. 1981, v.78, p.2825

102. Ananthanarayana Y.S., Hew C.L.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977, v.74, p.685

103. Raymond J.A., Radding 1., De Yries A.L.- Biopolymers 1977, v.16, p.2575

104. Ananthanarayana Y.S., Hew C.L.- In: Biomolecular Structure, Conformation, Function and Evolution /Srinivason R., ed. 1980, v.2, p.191. Pergamon Press, Oxford

105. Yeh Y., Feeney R.E.- Accounts Chem. Res. 1978, v.11, p.129

106. Feeney R.E., Yeh Y.- Adv. Prot. Chem. 1978, v.32, p.191

107. Yandenheede J.R.,Ahmed A.I., Feeney R.E.- J. Biol. Chem. 1972, v.247, p.7885

108. Means G.E., Feeney R.E.- Chemical Modification of Proteins, p.20. Holden-Day Inc., San Francisco, 1971

109. Feeney R.E., Yandenheede J.R., Osuga D.T.- Naturwissenschaften1972, 3d.59, S.22

110. Zittle C.A.- Adv. Enzymol. 1952, v.12, p.439

111. Acree T.E.- Adv. Chem. Ser. 1973, v.117, p.208

112. De Vries A.L.- In: Pish Physiology /Hoar W.H., Randall R.E., eds. 1971, v. 6. Acad. Press, Hew York

113. Ahmed A.I., Osuga D.T., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1973, v.248, p.8524

114. Ahmed A.I., Yeh Y., Osuga D.T., Peeney R.E.- J. Biol. Chem. 1976, v.251, p.3033

115. Chen W.W., Lennarz W.J., Tarentino A.L., Maley P.- J. Biol. Chem. 1975, v.250, p.7006

116. Lucas J.J., Waechter C.J., Lennarz I.J.- J. Biol. Chem. 1975, v.250, p.1992

117. Kiely M.L., McKnight G.S., Schimke T.S.- J.Biol. Chem. 1976, v.251, p.5490

118. Parodi A.L., Leloir L.P.- Biochim. Biophys. Acta 1979, v.559, p.1

119. Jonson J., Clamp J.R.- Biochem. J. 1971, v.123, p.739

120. Parkhouse R.M.E., Melchers P.- Biochem. J. 1971, v. 125, p.235

121. Melchers P.- Biochemistry 1973, v.12, p.1471127. ßepeBmKaa B.A.- EHoopraH. xhmhh 1983, t.9, c.58I

122. Chen W.W., lennarz W.J.- J. Biol. Chem. 1978, v.253, p.5774

123. Marshall R.D., Neuberger A.- Adv. Carbohydr. Chem Biochem. 1970, v.25, p.407

124. Marshall R.D.- Abstr. Intern. Congr. Biochem. 7-th, 1967,p.574

125. Pless D.D., Lennarz W.J.- Proc. Uatl. Acad. Sei. 1977, v.74, p.134

126. Ronin C., Granier C., Van Riet schoten J., Bouehilloux S.~ Biochem. Biophys. Res. Commun. 1978, v.81, p.772-254133. Ronin С., Bouchilloux S., Granier G., Van Rietschoten J.-PEBS Lett. 1978, v.96, p.179

127. Bause E.- PEBS Lett. 1979, v.103, p.296

128. Bause E., Lehle L.- Eur. J. Biochem. 1979, v.101, p.531

129. Hunt L.T., Dayhoff Ш.О.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1970, v.39, p.757

130. Chou P.Y., Pasman G.D.- Biochemistry 1974, v.13, p.211

131. Venkatachalam C.M.- Biopolymers 1968, v.6, p.1425

132. Zimmermann S.S., Scheraga H.A.- Biopolymers 1977, v.16, p.811

133. Lewis P.I., Momany F.A., Scheraga H.A.- Biochim. Biophys. Acta 1973, v.303, p.211

134. Prasad R., Hudson В., Butkowski R., Hamilton J .W., Ebuer K.E.-J. Biol. Ghem. 1979, v. 254, p.10607

135. Bush C.A.- Biopolymers 1982, v.21, p.535

136. Beeley J.G.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977, v.76, p.1051

137. Aubert J.-P., Biserte G., Loucheux-Lefebvre M.-H.- Arch. Biochem. Biophys. 1976, v. 175, р.4Ю

138. Hart G.W., Brew K., Grant G.A., Bradshaw R.A., Lennarz W.J.-J. Biol. Chem. 1979, v.254, p.9747

139. Bause E., Hettkamp H., Legler G.- Biochem. J. 1982, v.203, p.761.

140. Wilson L.A., Skehel J.J., Wiley D.C.- Nature 1981, v.289, p.366

141. Wilson L.A., Ladner R.C., Skehel J.J., Wiley D.C.- Biochem. Soc. Trans. 1983, v.11, p.145

142. Beintema J.J.- Bioscience Rep. 1986, v.6, p.709

143. Mononen I., Karjalainen E.- Biochim. Biophys. Acta 1984, v.788, p.364

144. Struck D.K., Lennarz W.J., Blew K.- J. Biol. Chem. 1978, v.253, p.5786-255152. Aubert J.-P., Helbeque sr., Lefebvre M.H.P.- Arch. Biochem. Biophys. 1981, v.208, p.20

145. Waechter C.J., Lennarz W.J.-Ann. Rev. Biochem. 1976, v.45, p.95

146. Marshall R.D.- Ann. Rev. Biochem. 1972, v.41, p.673

147. Marshall R.D.- Biochem. Soc. Symp. 1974, v.40, p.17

148. Bause E., Hettkamp H., Legier G.- In: Glycopeptides /Yamakawa T Osawa Т., Handa S., eds., Tokyo, 1981

149. Bause E., Legier G.- Biochem. J. 1981, v.195, p.639

150. Ishii H., Suzuki A., Inoue Y., Chujo R.- Polymer J. 1983, v.15, p.617

151. Bush G.A., Düben A., Ralapati S.- Biochemistry 1980, v.19, p.501

152. Ohanessian J., Avenel D., Neuman A., Giller-Pandraud H.-Carbohydr. Res. 1980, v.80, p.1

153. Bush C.A., Blumberg К., Brown J.N.- Biopolymers 1982, v.21, p.1971

154. Delbaere L.T.J.- Biochem. J. 1974, v.143, p.197

155. Born M., Oppenheimer R.- Ann. der Phys. 1927, v.84, p.457

156. Hill T.L.- J. Chem. Phys. 1946, v.14, p.465

157. Hill T.L.- J. Chem. Phys. 1948, v.16, p.938

158. Westheimer F.H.- J. Chem. Phys. 1947, v.15, p.252

159. Rigir M., Westheimer P.H.- J. Amer. Chem. Soc. 1950, v.72, p.19

160. Китайгородский А.И.- Изв. АН СССР 1951, сер. Физ. т.15, с.157

161. Ramachandran G.N., Ramakrishnan С., Sasisekharan V.- J. Mol. Biol. 1963, v.7, p.95

162. Sasisekharan V.- Proc. Ind. Acad. Sei. 1961, A53, p.291

163. Lennard-Jones J.E.- J. Physica 1957, v.4, p.941

164. Slater J.C., Kirkwood J.G.- J. Phys. Rev. 1931, v.37, p.682

165. London P.- Z. physik. Chem. 1930, B11, p.222

166. Matsen P.A.- J. Amer. Chem. Soc. 1970, v.92, p.3526

167. Scott R.A., Scheraga H.A.- J. Chem. Phys. 1965, v.42, p.2209

168. Scott R.A., Scheraga H.A.- J. Chem. Phys. 1966, v.45, p.2091

169. Brant D.A., Plory P.J.- J. Amer. Chem. Soc. 1965, v.87, p.2791

170. Gibson K.D., Scheraga H.A.- Proc. Natl. Acad. Sci. 1967, v.58, p.1317

171. Gibson K.D., Scheraga H.A.- Proc. Natl. Acad. Sci. 1967, v.58, p.420

172. Липкинд Г.M., АрхипоЕа С.Ф., Попов Е.М,- I. структ. химии 1970, т.II, о.121

173. Smyth С.P.- Dielectric Behavior and Structure. McGraw Hill, New York, 1955

174. Poland D., Scheraga H.A.- Biochemistry 1967, v.6, p.3791

175. Del Re G.- J. Chem. Soc. 1958, p*4031

176. Del Re G.- Biochim. Biophys. Acta 1963, v.75, p.153

177. Berthod H., Pullman A.- J. Chem. Phys. 1965, v.62, p.942

178. Пюльман Б., Пшьман А.« Квантовая биохимия. M.: Мир, 1965

179. Rees D.A., Smith P. J.P.- J. Chem. So.pPerkin II 1975, ÎT8, p.830

180. Rees D.A., Smith P.J.P.- J. Chem. Soc. Perkin II 1975, IT8. p. 836

181. Kemp P.D., Pitzer K.S.- J. Amer. Chem. Soc. 1937, v.59, p.276

182. IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature. J. Mol. Biol. 1970, v.52, p.1

183. Попов E.M., Дашевский В.Г., Липкинд Г.M., Архипова С.Ф.-Молекулярн. биол. 1968, т.4, с.612

184. Соколов Н.Д.- В кн.: Водородная связь. М.: Наука, 1964, с.7

185. Lippincott E.R., Schroeder R.- J.Chem. Phys. 1955, v.23, p.1099

186. Schroeder R., Lippincott E.R.- J. Phys. Chem. 1957, v.61, p.921

187. Scott R.A., Scheraga H.A.- J. Chem. Phys. 1966, y.44, p.3054

188. Ooi T., Scott R.A., Yanderkooi G., Epand R.P., Scheraga H.A.-J. Amer. Chem. Soc. 1966, v.88, р.5б80

189. De Santis P., Giglio E., Loquori A.M., Ripamonti A.- Nature 1965, v.206, p.456

190. Liquori A.M.- J. Polymer Sei. 1966, part 6, v.12, p.209

191. Reeves R.E.- J. Amer. Chem. Soc. 1949, v-71, p.1737

192. Reeves R.E.- J. Amer. Chem. Soc. 1950, v.72, p.1499

193. Reeves R.E.- J. Amer. Chem. Soc. 1949, v.71, p.215

194. Scheraga H.A.- Adv. Phys. Org. Chem. 1968, v.6, p.103

195. Momany P.A., McGuire R.P., Burgess A.W., Scheraga H.A.-J. Phys. Chem. 1975, v.79, p.2361

196. Schellmann I.A.- Comp. rend. trav. lab. Carlsberg ser. chim. v.29, p.223

197. Klotz T.M., Pransen I.S.- J. Amer. Chem. Soc. 1962, v.84, p.3461

198. Lemieux R.U., Chu N.J.- Abstr. Pap. Amer. Chem. Soc. 1958, v.133, p-31N

199. Hermans J.Jr., Ferro D.- Biopolymers 1971, v.10, p.1121

200. Ponnuswamy P.K., McGuire R.P., Scheraga H.A.- Int. J. Pept. Prot. Res. 1973, v.5, p.73

201. Гурская Г.В.- Структура аминокислот. М.: Наука, 1966

202. Arnott S., Scott W.E.- J. Chem. Soc. Perkin II 1972, ЖЗ, p.324

203. Kreissler M.A., Arkhipova S.P., Lipkind G.M., Popov Е.1.-J. Chim. Phys. 1974, v.71, p.907

204. Липкинд Г.М., Архипова С.Ф., Попов E.M.- Изв. АН СССР 1970,сер. хим., т.2, с.315

205. Липкинд Г.М., Попов Е.М.- Молекулярн. биол. I97E, т,5, с.667

206. Липкинд Г.М., АвановАЛ., Кочетков Н.К.- Биоорган, химия 1982, т.8, с.512-258215. Düben A.J., Bush C.A.- Arch. Biochem. Biophys. 1983, v.225, p.1

207. Maeji N.J., Inoue Y., Chujo R — Biopolymers 1987, v.26, p.1753

208. Липкинд Г.М., Архипова С.Ф., Попов Е.М,- Молекулярн. биол. 1970, т.4, с.331

209. Lipkind G.M., Popov Е.М.- Int. j. Pept. Prot. Res. 1973, v.5, p.371

210. Попов E.M., Липкинд Г.М0- Молекулярн. биол. 197Г, т.5, с.624

211. Chou P.Y., Fasman G.D.- J. Mol. Biol. 1977, v.115, p.135

212. Birktoft J.J., Blow D.M.- J. Mol. Biol. 1972, v.68,p.187

213. Ramachandran G.M., Sasisekharan V.- Adv. Prot. Chem. 1968, v.23, p.438

214. Schimmel P.R., Flory P.J.- J. Mol. Biol. 1968, v.34, p.105

215. Bohak Z., Katchalski E.- Biochemistry 1963, v.2, p.228

216. Poljak R.J., Amzel L.M., Phizackerly R.P.- Progr. Biophys. Molec. Biol. 1976, v.31, p.67

217. Шульц Г., Ширмер P.- Принципы структурной организации белков. М.: Мир, 1982, с.115

218. Richardson J., Thomas К.A., Rubbin Н., Richardson D.C.-Proc. Natl. Acad. Sei. 1975, v.72, p.1349

219. Blake C.C.F., Geisow M.J., Oatley S.J.- J. Mol. Biol. 1978, v.121, p.339

220. Segal D.M., Padlan E.A., Cohen G.H., Rudikoff S., Potter M., Davies D.R.- Proc. Natl. Acad. Sei. 1974, v.71, p.4298

221. Banner D.W., Bloomer A.C., Petsko C.A., Phillips D.C.,

222. Pogson C.I., Wilson I.A., Corran P.H., Furth A.J., Millman J.R., Offord R.E., Priddle J.D., Waley S.G.- Nature 1975, v.255, p.609

223. Липкинд Г.М.t Аванов АЛ.- Биоорган химия 1989, т.15, с.821232. fvaroska I», Perez S.S., Marchessault R.H.- Carbohydr. Res. 1978, v.61, p.97

224. Hassel 0., Ottar В.- Acta Chem. Scand. 1947, v.1, p.929

225. Илиел Э., Аллинджер H., Энжиал С., Моррисон Г.- Конформа-ционный анализ. М.: Мир, 1969, с.68

226. Попов Е.М,- Молекулярн. биол. 1975, т.9, с.578

227. Bush С.А., Raiapati S., Matson G.M., Yamasaki R.B., Osuga D.T., Yeh Y., Feeney R.E.- Arch. Biochem. Biophys. 1984, v.232, p.624

228. Аванов А.Я., ЛнпкиндГ.М., Кочетков H.K.- Биоорган, химия 1982, т.8, 0,616

229. Bush O.A., Feeney R.E., Osuga D.T., Ralapati S., Yeh Y.-Int. J. Pept. Prot. Res. 1981, v.17, p.125

230. Bush C.A., Feeney R.E.- Int. J. Pept. Prot. Res. 1986, v.28, p.386

231. Berman E., Allerhand A., De Vries A.L.- J. Biol. Chem. 1980, v.255, p.4407

232. Rao B.N.W., Bush C.A.- Biopolymers 1987, v.26, p.1227

233. Homans S.W., De Vries A.b., Parker S.B.- FEBS Lett. 1985, v.183, p.133

234. Pauling Ъ.- J. Amer. Chem. Soc. 1935, v.57, p.2680

235. Tait M.J., Suggett A., Franks F., Abbett S., Quickended P.A.-J. Solution Chem. 1972, v.1, p.131

236. Lipkind G.M., Arkhipova S.F., Popov E.M.- Int. J. Pept. Prot. Res. 1973, v.5, p.381

237. Tvaroska I., Bleha Т.- Tetrahedron Lett. 1975, M, p.249

238. Lipkind G.M., Verovsky V.E., Kochetkov U.K.- Carbohydr. Res.1984, v.133, p.1

239. Lipkind G.M., Schashkov A.S., Kochetkov U.K.- Carbohydr. Res.1985, v.141, p.191

240. Sathyanarayana S.K., Rao V.S.R.- Biopolymers 1971, v.10, p.1605

241. Mann J., Marrinan H.J.- J. Polymer Sei. 1958, v.32, p.357

242. Lang C.Y., Marchessault R.H.- J. Polymer Sei. 1959, v.37, p.385

243. Ishii H., Inoue Y., Chujo R.- Polymer J. 1985, v.17, p.693

244. Avignon M., Huong P.V.- Biopolymers 1970, v.9, p.427

245. Nemethy G., Scheraga H.A.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1980, v.95, p.320

246. Ricart J.M., Perez J.J., Pons M., Giralt E.- Int. J. Biol. Macromol. 1983, v.5, p.279