Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение поведения некоторых защитных групп в условиях твердофазного синтеза пептидов в водной среде

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение поведения некоторых защитных групп в условиях твердофазного синтеза пептидов в водной среде"

-- Т- - М

На правах рукописи

Селиванов Ренат Самиюлович

Изучение поведения некоторых защитных групп в условиях твердофазного синтеза пептидов в водной среде

03. 00. 23 - Биотехнология 02. 00. 03 - Органическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Санкт-Петерб ург - 1996

Работа выполнена на кафедре молекулярной биотехнологии Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор

Гинак Анатолий Иосифович;

кандидат химических наук Куликов Сергей Владимирович.

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор

Рамш Станислав Михайлович;

кандидат химических наук Буров Сергей Владимирович

Ведущая организация: Санкт-Петербургский

государственный университет

Защита состоится 199бг в /О часов на

заседании Диссертационного Совета Д 063.25.09 в Санкт-Петербургском государственном технологическом институте (техническом университете).

Адрес: 198013, С. -Петербург, Московский пр., 26, СПбГТИ(ТУ), Ученый Совет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета).

Отзывы и замечания, заверенные печатью, просим направлять в одном экземпляре в адрес ученого совета.

Автореферат разослан 199бг

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д 063. 25. 09 ? Т. Б. Лисицкая кандидат технических наук ¿^с

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время пептиды находят все более широкое применение в биохимических исследованиях и медицине. Основным химическим методом их получения является твердофазный синтез. До настоящего времени основные разработки твердофазного синтеза пептидов (ТФСП) базировались на применении органических ра^вори-телей.

В ряде лабораторий мира сделаны попытки прове< ТФСП в водной среде. При этом отдельные стадии процесса, например образование пептидной связи в водной среде, удлось провести достаточно эффективно. Однако, осуществить полный цикл ТФСП в водной среде до сих пор не удавалось. Анализ литературы показал, что основной причиной этого явилось отсутствие якорной группы, способной удерживать в ходе синтеза растущий пептид и позволяющей отщеплять его в водной среде в мягких условиях. Практический интерес к якорным групп м такого типа отчетливо проявился в литературе последних лет. Их применение в современном ТФСП •позволило облегчить и удешевить процедуру отщепления синтезированного пептида.

Цель исследования. Целью данной работы язился синтез 5-гидроксиметил-2-нитрофеноксиуксусной кислоты - новей якорной группы л-нитробензильного типа - и ее производных, а также изучение возможности ее использования для твердофазного синтеза пептидов, проводимого как в водной, так и неводной средах.

Научная новизна и практическая ценность. Предложена якорная группа, позволяющая отщеплять пептид путем некаталитического восстановления в водной среде. На ее основе впервые реализована схема проведения всех стадий ТФСП в водной среде. Показана применимость данной якорной группы для проведения ТФСП как в водной, так и в неводной средах.

Показано, что хлорирование этилового и фенилового эфиров 5-метил-2-нитгофенокси; ксусной кислоты сульфурилхло-

ридом и дихлормоноксидом, а также реакция между 1-ацетокси-5-метил-2-нитробензолом и сульфурилхлоридом в условиях радикального галогенирования приводят к введению хлора в бензольное ядро.

Установлено влияние растворителей, нуклеофилов и оснований на скорость и селективность гидролиза фенилового эфира в присутствии замещенного 4-нитробензилового эфира. Наибольший выход получен при проведении реакции в эквимолярной смеси N. Н-диметилацетамид (ДМАА) - вода в присутствии триэтиламина.

В ходе сравнения методов определения содержания свободных аминогрупп высоконагруженных гидрофильных полимерах показано, что только метод с применением соляной кислоты явился адекватным и достоверным.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на симпозиуме по органической химии, 1995г., Санкт-Петербург и на 14^ Американском пептидном симпозиуме, 1995г, Колумбус.

Публикации. По теме диссертации опубликованы одна статья и тезисы двух докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машиноппного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы результатов и обсуждений, главы экспериментальных исследований, выводов и списка литературы. Работа содержит 17 таблиц, 26 схем и 4 рисунка. Библиографический указатель включает 147 источников литературы, из них 101 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы (Глава 1) посвящен анализу современных данных о реагентах и методах проведения отдельных стадий пептидного синтеза в водных средах.

Результаты и обсуждение (Глава 2)

Нами изучены два возможных пути получения 5-( трет-бутилоксикарбониламиноацетилоксиметил)-2-нитрофеноксиуксус-ной кислоты (1а), ранее не описанной в литературе.

Исходным соединением служил 5-метил-2-нитрофенол (II), полученный с выходом 16-18% нитрованием м-крезола с последующим разделением изомеров (схема 1).

о

'з сц сн3

Реакцией нитрокрезола (II) с эфирами хлорукеусной кислоты в условиях межфазного катализа (МФК) были получены фениловый и этиловый. эфиры 5-метил-2~нитрофеноксиуксусной кислоты (-Illa, б) с выходами 80 - 85%. Показано преимущество МФК перед другими методами синтеза данных производных (схема 2).

Эфиры (1т1а, б) не реагировали с хлором как в присутствии радикальных инициаторов, так и при облучении.

сн3

JT СЩШЛСОъ ¿¿s — я, A/fíSпмсол LUI

ал

NUí

t SOzClzMBH

пл

Cí

¥ §

Ba.h)!

1

(2)

снгВг

rOl 60% ^ o 20-25%

щ Мао ш щ

Обработка производных (Illa, б) сульфурилхлоридом ь присутствии азодиизобутиронитрила привела к эфирам 5-метил-2-нитро-4-хлорфеноксиуксусной кислоты (IVa, о) с выходом 60%. В отсутствие радикального инициатора реакции

замедлялась. Добавление безводных хлорного железа или хлористого алюминия ингибировало процесс. Обработка эфиров (Illa, б) дихлормоноксидом, полученным in situ, привела к производным (I Va, б) с выходом 70%. При использовании данных реагентов в реакционной массе эфиры 5-хлорметил-2-нитрофеноксиуксусной кислоты не обнаружены.

Обработка эфиров (Illa, б) бромом или N-бромсукцинимидом привела к образованию эфиров 5-бромметил-2-нитрофеноксиуксусной кислоты, однако выделить их из реакционной массы не удалось. Спектр ПМР показал, что содержание этих производных в реакционной массе не превышало 20-25%.

5-метил-2-нитро-1-ацетоксибензол (V) был получен с выходом 85-90% (схема 3) реакцией нитрокрезола (II) с уксусным ангидридом в присутствии триэтиламина. Кипячение продукта (V) в сульфурилхлориде в присутствии азодиизобу-тиронитрила привело к 5-метил-2-нитро-4-хлорфенолу (VI) с выходом 70%. 5-Бромметил-2-нитро-1-ацетоксибензол (VII) был получен реакцией соединения (V) с N-бромсукцинимидом в присутствии азодиизобутиронитрила.

При проведении процесса в четыреххлористом углероде продукт (VII) был получен с выходом 45%. Применение метил-ацетата позволило повысить выход производного (VII) до 70%.

Действием трег-бутилоксикарбонилглицина (ДМФА, карбонат калия, бромид тетра-я-бутиламмония) соединение (VII) было превращено в 5-( грег-бутилоксикарбониламиноацетилокси-метил)-2-нитро-1-ацетоксибензол (VIII) с выходом 90%.

Аминолиз последнего 2-диметиламиноэтиламином в ДМФА привел к 5-( грег-бутилоксикарбониламиноацетилоксиметил) -2-нитрофенолу (IX) с выходом 95% (схема 4).

СНМуВос ШШуЬ <

Т/Г/ BocQyOM , r^Vi н*м/ЫхкМчк rrv

А ™ ЩШд0о/о 95%

СНгР&уВос CfiOGlyBoc ft)

тх 80-85% щ 1а 80%

Замещенный нитрофенол (IX) при взаимодействии с фенилхлорацетатом (ДМФА, карбонат калия, бромид тетра-н-бутиламмония, 18-20°С) был превращен в фениловый эфир 5-(трег-бутилоксикарбониламиноацетилоксиметил)-2-нитрофен-оксиуксусной кислоты (X) с выходом 64-74%. В ходе реакции наблюдалось частичное разложение фенилхлорацетата, что привело к необходимости использования его значительного избытка. Получить аналогичный л-нитрофениловый эфир не удалось из-за быстрого разложения л-нигрофенилхлорацетата. Мы полагаем, что разложение ароматических эфиров хлоруксусной кислоты в условиях данной реакции протекало с образованием хлоркетенового интермедиата. Повышение температуры до 50°С увеличило скорость основной реакции. При этом выход основного продукта (X) вьфос до 80-85%, сократилось время реакции и расход фенилхлорацетата.

Гидролиз полученного фенилового эфира (X) под дейст-

вием неорганических оснований протекал неселективно. Было изучено применение в данной реакции различных нуклеофилов (пиридин, имидазол, триэтиламин, 4-( N, N-диметиламино) -пиридин и 2-диметиламиноэтанол). Лучшим из них оказался триэтиламин. С его помощью гидролиз эфира (X) в смеси диоксан-вода (4:1, об.) привел к кислоте (1а) с выходом 10%.. Мы изучили влияние растворителей на селективность и скорЗсть гидролиза. Среди изученных растворителей (ДМАА, ДМСО, N-метилпирролидон (НМП), диоксан, диглим, ацетонитрил и этанол) лучшими оказались первые три. В смеси ДМАА-вода (4:1, об.) выход кислоты (1а) составил 80%.

Нами изучены два возможных метода получения 5-гидроксиметил-2-нитрофеноксиуксусной кислоты (16). Ключевым соединением в первом из них , служил 5-гидроксиметил-2-нитрофенол (XI). Для получения последнего было изучено восстановление З-гидрокси-4-нитробензойной кислоты, ее метилового эфира и хлорангидрида (Xlla, б, в). Продукт (XI) получен обработкой хлорангидрида (ХНв) борогидридом натрия с выходом 25 - 30%. К тем же выходам привело восстановление всех трех производных борогидридом натрия в присутствии хлорида алюминия (схема 5). "

сох тн сцон

щ. mt¡ т (5)

Ша-б а)Х-€Н, б)Х--Шъ,б) Х=-С/

Обработка фенилхлорацетатом производного (XI) в присутствии К2СО3 или заранее приготовленной калиевой соли соединения (XI) в ДМФА с добавлением бромида тетра-н-бутиламмония привела к сложной смеси продуктов.

Исходным соединением в синтезе кислоты (16) явилось бромпроизводное (VII),. которое было превращено в 5-ацет-оксиметил-2-нитро-1-ацетоксибензол (XIII) реакцией с аце-

татом натрия в ДМФА в присутствии бромида тетра-н-бутилам-мония при 60°С. Выход продукта (XIII) составил 77%. Ами-нолиз эфира (XIII) 2-ДИметиламиноэтиламином привел к 5-аце-токсиметил-2-нитрофенолу (XIV) с выходом 76%. Последний был превращен в фениловый эфир 5-ацетоксиметил-2-нитрофенок-сиуксусной кислоты (XV) с выходом 90%. Кислота (16) получена с выходом 80% щелочным гидролизом эфира (XV) (схема 6).

/¡сОЛ/а

ВцМВг,

ДМФ4

СЦОЛс

Ч^ОЙс

щш

, Ж

уметет

ДМФА

гЛОАс [О] tfaOH

К0Ж№ М2. ZF

(6)

Щ U

Для проведения ТФСП в водной среде (ТФСПВС) необходим гидрофильный полимер. Нами изучена возможность постполимеризационной модификации карбоксильных катионитов на основе гидрофильных набухающих акрилатных сополимеров, полученных в ГосНИИОЧВ, - солозы К (содержание карбоксигрупп 0.8 ммоль/г), солозы КГ (содержание карбоксигрупп 3.0 ммоль/г) и макропористого акрилатного полимера ольвагеля (содержание карбоксигрупп 3.0 ммоль/г).

Солозы К и КГ были превращены б аминоалкилполимеры последовательной обработкой тионилхлоридом, а затем 1, 6-ди-аииногексаном. Такая обработка не привела к появлению аминогрупп на ольвагеле. Последни;: был превращен в аминоалки-лированный полимер при кипячени в 5% водном растворе ИаОН с избытком бромида З-бромпропиламмония (схема 7).

@-С02Н

SOCb

-COCI

H2NfCH2)6NH2

(P^-C0NH( CH2) 6NH2 (7)

(р>со2н + вЛ1сн2) зИНзВг На0Н — ®-соо( сн2) Знн2

Для определения содержания аминогрупп был использован пикриновый тест. Для образца модифицированной солсзы К получено значение 0.74 ммоль/г, соответствующее содержанию карбоксигрупп в.исходном полимере. Солоза КГ дала значение 0. ббммоль/г, что намного ниже исходного содержания карбоксигрупп, а для ольвагеля данный метод дал почти нулевое значение. При этом модифицированный ольвагель интенсивно окрашивался при обработке 2,4,6-тринитробензолсульфокисло-той (ТНБС) в 0.1М боратном буфере, что говорило о присутствии аминогрупп. Увеличение содержания как карбоксильных, так и аминогрупп, по-видимому, привело к возрастанию гидрофильности полимера, что вызвало неадекватность результатов пикринового теста, проводимого в дихлор-иетане. В связи с этим была изучена пригодность ряда реагентов и методов для количественного определения аминогрупп на гидрофильных полимерах в водной среде (табл.1).

Таблица 1.

Результаты определения содержания аминогрупп на гидрофильных полимерах.

Носитель Методы определения, емкость, ммоль/г

1 2 3 4 5 6 7

Ольвагель 0. 47 0. 50 0. 45 1. 66 0. 62 0. 56 0. 06

Солоза КГ 1.12 0. 66

Солоза К 0. 70 0. 74

Амийоэтил- 0. 29 0. 30

целлюлоза

Примечание: реагенты 1-7 см ниже:

1) ТНБС в 0.1М боратном буфере;

2) 0. 1М раствор бромкрезолового зеленого (Б3> в 20% водном метаноле;

3) 0.1М водный раствор пиридиниевой соли БЗ;

4) 0. 2М водная соляная кислота с последующей отмывкой ее избытка, смывки хлорида и титрованием по Фольгарду;

5) 0. 1М водный раствор п-толуолсульфокислоты (ПТСК);

6) 0.1М водный раствор пиридиниевой соли ПТСК;

7) пикриновый тест в дихлорметане.

Из полученных данных (табл.1) видно, что применение НС1 для солозы К и аминоэтилцеллюлозы привело к значениям, полученным с помощью пикринового метода. В то яе время, результаты определения содержания аминогрупп на солозе КГ и ольвагеле, полученные этими двумя методами, существенно различались. Остальные исследованные на ольвагеле методы давали заниженный результат по сравнению с применением НС1. Мы предположили, что расхождения в результатах анализа (табл.1), по-видимому, связаны со сложностью микроструктуры гидрофильных матриц, содержащих более 1 ммоль/г аминогрупп Для подтверждения этого на примере ольвагеля было проведено определение нагрузки с помощью 0.1М раствора ПТСК с добавлением IX ПАВ трех типов - анионного (додецилсульфата натрия, БББ), катионного (бромида цетилтриметиламмония, ЦТМАБ) и нейтрального (Тритон Х-100). Оказалось, что для образца ольвагеля с емкостью по НС1 2. ООммоль/г применение катио1лтго ПАВ дало значение емкости 0. СО ммоль/г, нейтрального ПАВ - 1. ООммоль/г. Таким образом, добавление ПАВ двух данных типов привело к повышению значения емкости, но результат, полученный с помощью НС1, не бы- достигнут. Добавление анионного .ПАВ дало значение 0.24 ммоль/г. Снижение значения емкости при использовании БОБ мы объяснили равновесной сорбцией на протош:рованных аминогруппах полимера анионов БОБ и ПТСК.

На основании полученных данных можно заключить:

1) из изученных методов только применение НС1. привело к адекватным результатам для всех исследованных гидрофильных полимеров;

2) пикриновый тест пригоден для определения аминогрупп на гидрофильных полимерах с содержанием последних, не

превышающем 0. 8 ммоль/г.

Мы изучили поведение соединения (1а) в условиях проведения отдельных стадий ТФСПВС. Кислота (1а) в растворе проявила высокую устойчивость по отношению к 2М водному пиридину и 1М водно-спиртовому раствору тиосульфата натрия.

При обработке водно-спиртового раствора соединения '{а) дитионитом натрия был получен Вос-глицин с выходом 84% (схема 8).

СЦ0-СУ4 W-Ct.% СНг

(01 *** (Q1---Л Ю

^^OOiCOX ^Y^OC/iCOX SСОЩЖ A/Oí NH

ЯСО-ацш,пептиди/! +ЯСОгН

Х-O/i аминоа/тилпаммер

Группу (1а) присоединили с помощью преформированного оксибензотриазолового эфира к аминометилированному сополимеру стирола с 1% дивинилбензола (АМССД) и к солозе К. Данный метод не позволил присоединить группу (1а) к солозе КГ, ольвагелю и аминоэтилцеллюлозе до отсутствия остаточных аминогрупп.

При обработке образца солозы К с присоединенной якорной группой (1а) водным раствором дитионита натрия был получен Вос-глицин с выходом 69%.

Отщепить Вос-глицин от АНССД с закрепленной группой (1а) не удалось ни водно-спиртовым раствором дитионита натрия, ни при использовании межфазных переносчиков 18-краун-6 и бромида тетра-я-бутиламмония.

Якорная группа (1а) была присоединена к солозе КГ трехкратным ацилированием 150% избытком ее 2-нитро-4-сульфенилового (Nsp) эфира в 2М водном пиридине с до оавлснием, 1% (масс.) SDS. При обработке полученного носителя водным раствором дитионита натрия Вос-глицин был получен с выходом 60%.

Солозу К с присоединенной якорной группой (1а) обработали 100% трифторуксусной кислотой (1 ФУК) в течение 30 минут. При этом получили носитель с содержанием глицина 0.75 ммоль/г. Фильтрат от деблокирования Вос-группы не содержал аминокислот. Следовательно, группа (1а) устойчива к обработке 100% ТФУК, что позволяет сочетать использование якорной группы (1а) и Вос-группы в ТФСП.

В качестве объекта для твердофазного синтеза в водной среде был выбран пептид хемотаксиса Н-Уа1-61у-Уа1-А1а-Рго-йу-0Н (XVI).

На солозе К, содержащей группу (1а), в еодной среде был синтезирован пентапептидилполимер со свободной а-аминогруппой (рис.1). Протокол ТФСПВС приведен в таблице 2.

И у

Ирэ-Нрэ-

Уа1

0№р Н-

Кря^ОИзр

Крэ-

А1а

Мрз^ОНвр Ирэ-

Рго

Ирэ Ире Н

ОИвр

а»

Вос-ЬР Н- -Р -Р

-р

н-

Рис. 1 Схема твердофазного синтеза в водной среде пентапептидилполимера. .

Для защиты а-аминогруппы использовали о-нитрофенил-. сульфениг^ную группу (Ира-группу), которую отщепляли 0. 2 -0. ЗМ водным раствором тиосульфата натрия в течение 1 часа. Для подтверждения полноты удаления защитной группы в данных условиях в контрольном опыте после деблокирования тиосульфатом натрия мы провели количественное определение аминогрупп пикриновым методом. После этого ту же навеску обрабатывали насыщенным раствором сухого НС1 в этилацетате и повторяли тест. Совпадение значений двух тестов говорило о полноте отщепления Ирв-группы тиосульфатом натрия в выбранных нами условиях. Следует отметить, что на стадии дипепти-

дилполимера повтор пикринового теста на одном и том же образце приводил к более низкому значению, чем предыдущий анализ. Это можно объяснить потерей пептидных цепей, связанной с образованием 2, 5-дикетопиперазина (ДКП) во время обработок раствором триэтиламина.

Ацилирование аминоацил-полимера проводили ИБр-эфирами ^Б-аминокислот в 2М водном пиридине с добавлением 1% БОБ (раствор А). Полноту ацилирования контролировали с помощью ТНБС в ДМФА с добавлением триэтиламина или в 0.1." боратном буфере. Обычно для полноты реакции требовались две обработки по 2 часа 100% избытком Иер-эфира при 18-23°С. При ацилировании пролилглицил-полимера требовалось трехкратное повторение процесса.

Таблица 2.

Протокол ТФСП в водной среде на солозе К._

Операция Добавляемые компоненты Время, мин Кол-во повторов

1. Ацилирование 2 экв. йар-эфира в 2М пиридине с 1% ( масс.) БОБ (Раствор А) 120 2-3

2. Промывка' Раствор А 2 4

3. Промывка ' Вода 2 4

4. Деблокирование 0. 2-0. ЗМ На23203 60 1

5. Промывка Вода 2 4

6. Промывка Этанол 2 2 '

7. Промывка СН2С12 2 6

В. Промывка Этанол 2 2

После обработки Ирэ-пептидилполимера тиосульфатом натрия носитель сохранял желты:: цвет. Основной причиной загрязнения явилось образование 2,2-динитродифенилдисуль-фида. ^то, очевидно, вызвано побочной реакцией диспропор-ционирования продукта реакции тиосульфата и Ирэ-группы. С

целью исключения влияния данного дисульфида на ТФСПВС в его регламент ввели промывку спиртом для предварительного удаления влаги и промывку дихлорметаном (табл. 2).

Полученный пентапептидилполимер обработали Nsp-эфиром Вос-валина. Порцию Вос-гексапептидилполимера деблокировали ТФУК. Пептидилполимер со свободной а-аминогруппой обработали водным раствором дитионита натрия с добавлением гидрокарбоната натрия при температуре 18 - 25°С. Данная процедура привела к отщеплению пептида (XVI). После очистки колоночной адсорбционной хроматографией на силикагеле пептид (XVI) был получен с выходом 11% и чистотой по ВЭЖХ 96%.

Полноту отщепления пептида (XVI) мы подтвердили отсутствием аминокислот в гидролизатах образцов носителей, оставшихся после отщепления пептида (XVI).

Вос-гексапептидилполимер обработали водным раствором дитионита натрия в присутствии гидрокарбоната натрия. Вое пептид (XVII) очистили хроматографией на силикагеле. Его выход составил 11% в расчете на первую аминокислоту. Чистота препаратов по данным ВЭЖХ составила 96%.

К пентапептидилполимеру присоединили с помощью Nsp-эфира (NO2) Z-валин. Обработка -полученного полимера раствором дитионита натрия привела к пептиду (XVI). После очистки колоночной хроматографией на силикагеле выход пептида (XVI) составил 11% с чистотой по ВЭЖХ 96%.

С целью выяснения причин низкого выхода ТФСПВС, а также для изучения применимости якорных груп. (1а, б) в ТФСП в органических растворителях мы синтезировали гексапептидилпэлимер на образце АМССД с присоединенной группой (1а). ТФСП был проведен на автоматическом синтезаторе Applied Biosystem. Протокол приведен в таблице 3.

Безводный фтористый водород не отщепил пептид (XVI). Образец полученного полимера обработали дитионитом натрия.в присутствии гидрокарбоната натрия в 10% водном спирте, использованном для смачивания АМССД. Однократная очистка обессоливанием на сефадексе G-10 привела к пептиду (XVI) с выходом 97% и чистотой по ВЭЖХ 96%.

Таблица 3.

Протокол ТФСП в неводной среде.

Стадия Реагенты Время, мин Кол-во повторов

1. Деблокирование 50% ТФУК/СН2С12 2 + 30 1 1

2. Промывка СН2С12 2 6

3. Нейтрализация 5% НЕ13/СН2С12 2 3

4. Промывка СЙ2С12 2 6

5. Ацилирование 100% избыток ОБТ, Вос-амино-кислоты, ДЦГК 90 2

6. Промывка СН2С12 2 6

На том же образце АМССД были получены вручную три образца пептидилполимеров, в которых {(-конец был защищен Вос-группой, (М02) г-группой и солеобразованием с ТФУК. Однако, отщепления продуктов (XVI) и (XVII) от полученных образцов в условиях, примененных для АМССД, мы не наблюдали. Анализ гидролизатов данных пептидилполимеров .до и после отщепления показал наличие необходимых аминокислот, однако, их содержание было значительно ниже исходной емкости.

Мы провели вручную ТФС пептида (XVI) и его Вос-произ-водного (XVII) на гидрофильной солозе К с закрепленной группой (1а) в неводной среде (протокол см табл.3). Для контроля ацилирования был использован непрерывный мониторинг аминогрупп с помощью индикатора бромкрезолового зеленого. После отщепления д..тионитом натрия и очистки адсорбционной хроматографией пептид (XVI) получен с выходом

11%, Вос-пептид (XVII) - с выходом В%. Чистота по ВЭЖХ 96%. После отщепления полимер не содержал аминокислот.

Для сравнения пептид (XVI) был синтезирован вручную согласно таблице 3 на хлорметилированном стирол-дивинилбензольном полимере, к которому в условиях МФК был присоединен Вос-глицин. Пептид отщепили обработкой бромистым водородом в трифторуксусной кислоте. Очистка обессоливанием на ТЭК-геле НИ-40 дала пептид (XVI) с выходом 38% и чистотой по ВЭЖХ 96%.

Основываясь на результатах проведенных ТФСП, можно прийти к выводу, что причина низких выходов связана не с Проведением ТФСП в водной среде, а с побочными реакциями в ходе пептидного синтеза.

В ходе ТФСПВС было определено содержание аминогрупп После каждой стадии деблокирования (табл.4). Оказалось, что йа стадии деблокирования защищенного дипептидилполимера последующего ацилирования происходило заметное снижение емкости.

Таблица 4,

Емкость пептидилполимеров по ходу ТФСП в водной среде.

■ Число аминокислотных остатков

2 3 4 5

Емкость, а)1 0. 38

ммоль/г 0. 58 б)1 0. 45 0. и2 0. 422

в)1 0. 47

Кратность 2 3 2 2

ацилирования

при получении

Примечание: начальная емкость 0.59 ммоль/г; 1) емкости приведены для трех вариантов сочетания ацилирования и деблокирования: а) деблокирование тиосульфатом натрия' + ацилирование; б) деблокирование HCl в этилацетате + ацилирование с предварительной нейтрализацией; в) деблокирование HCl в этилацетате + ацилирование с in situ нейтрализацией; 2) полимеры получены из трипептидил-полимера, синтезированного по методу в).

Было изучено влияние методов деблокирования Nps-пролилглицилполимера и последующего ацилирования на емкость трипептидилполимера. Применение НС1 в зтилацетате для удаления Nps-группы позволило повысить емкость трипептидилполимера. Проведение ацилирования в условиях in situ нейтрализации привело к еще большему значению (табл. 5).

Таким образом, основная причина низких выходов ТФСП связана с образованием ДКП.

Используя данные таблицы 5, мы внесли в схсму ТФСПВС следующие изменения: деблокирование безводного Nps-дипеп-тидилполимера pac-i вором хлористого водорода в зтилацетате с последующим ацилированием в условиях in situ нейтрализации. В синтезе на образце солоэы . К с использованием такой модификации общей схемы синтеза и очисткой гель-фильтрацией на сефадексе G-10 пептид (XVI) был получен с выходом 79% и чистотой по данным ВЭЖХ 96%.

Таблица 5.

Способы получения и выход трипептидилполимера.

Методы отщепления Nps-группы от защищенного дипептидилполимера

НС1/Этилацетат Na2S2ü3

Способ ацилирования дипептидил полимера Емкрсть по Н-А1а-Pro-Gly ммоль/г Выход, % Кол-во повторов Емкость по Н-А1а-Pro-Gly ммоль/г Выход, % Кол. повторов

Предварительная нейтрализация 0. 45 7 9% 3

In situ нейтрализация 0. 47 82% 3

Без нейтрали-тации 0. 38 66% 3

Сравнивая результаты проведенных ТФСП в водной и

неводной средах, можно заключить, что применение новой якорной группы (1а) при правильно выбранной схеме и методах синтеза дало возможность получить высокий выход пептида (XVI), структура которого предполагает склонность к образованию ДКП. При этом стадия отщепления конечного пептида происходила в мягких, неагрессивных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые реализована схема твердофазного синтеза пептидов, в которой все стадии проведены в водной среде.

2. Предложена новая якорная группа, позволяющая отщеплять синтезированный пептид некаталитическим восстановлением в водной среде в мягких условиях. Показана применимость данной .якорной группы для проведения ТФСП как в водной, так и в неводной средах.

3. Показано, что хлорирование этилового и фенилового эфиров 5-метил-2-нитрофеноксиуксусной кислоты в условиях радикального галогенирования сульфурилхлоридом и дихлормоноксидом привело к введению хлора в бензольное ядро. Реакция между 1-ацетокси-5-метил-2-нитробензолом и сульфурилхлоридом' в аналогичных условиях также привела к ароматическому замещению.

4. Установлено влияние растворителей, нуклеофилов и оснований на скорость и селективность ги, .ролиза фенилового эфира в присутствии замещенного 4-нитрбензилового эфира. Наибольший выход получен при проведении реакции в экчимолярной смеси ДМАА-вода в присутствии триэтиламина.

5. Показано, что микрометод с применением соляной кислоты является адекватным и достоверным для определения содержания свободных аминогрупп высоконагруженных гидрофильных полимеров.

Основное содержание диссертации изложено в работах:

1. Селиванов Р. С., Куликов С. В., Гинак А. И. Хлорирование эфиров 5-метил-2-нитрофеноксиукс.усной кислоты в бензольное кольцо в условиях радикального галогенирования // ЖОрХ - 1994. - Т. 30, N. 4. - С. 632-635.

2. Селиванов ' Р. С., Куликов С. В., Гинак А. И. 5-( трет-бутилоксикарбониламиноацетилоксиметил)-2-нитрофенокси-уксусная кислота: синтез и побочные реакции // Симпозиум по органической химии: Тез. докл. научн. конф., 21-24 мая 1995г. - С. -Петербург, 1995. - С. 8082.

3. S.V. Kulikov, К. S. Selivanov, A.I. Glnak New Anchor Group for SPPS, and its Use for Peptide Synthesis in Aqueous and Nonaqueous Media // 14^Й Amer. Pept. Symp. - Columbus, Ohaio. - June 18-23, 1995. - Poster 006.

18.03.96. Зак 59-70 РТП.ИК СИНТЕЗ Московская пр,2б