Изучение полиморфизма гена фотопериодической регуляции цветения и клубнеобразования CONSTANS у растений Solanum

Дробязина, Полина Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение полиморфизма гена фотопериодической регуляции цветения и клубнеобразования CONSTANS у растений Solanum
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение полиморфизма гена фотопериодической регуляции цветения и клубнеобразования CONSTANS у растений Solanum"

На правах рукописи

uuj4b42SB Дробязина Полина Евгеньевна

ИЗУЧЕНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА ФОТОПЕРИОДИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ ЦВЕТЕНИЯ И КЛУБНЕОБРАЗОВАНИЯ CONSTANS У РАСТЕНИЙ SOLANUM

Специальность 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

О 5 ДЕК 2008

Москва - 2008

003454256

Работа выполнена в лаборатории ДНК маркеров растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель -. доктор биологических наук, профессор

Эмиль Ефимович Хавкин

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Галина Викторовна Новикова,

доктор биологических наук Татьяна Анатольевна Ежова

Ведущая организация: Центр молекулярной биотехнологии

РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева

■ 2008 г. в J'f

Защита состоится / / • / i/V ■ 2008 г. в / ! часов на заседании

диссертационного совета Д.006.027.01 при ВНИИСБ РАСХН

по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская, 42.

Тел. 7(495) 977 6544, факс 7(495) 977 0947; e-mail: iab@iab.ac.ru

Автореферат разослан_2008 г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИСБ РАСХН.

Ученый секретарь

диссертационного совета (J^Jy^utj^ к.б.н. С.А. Меликова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование ключевых хозяйственно ценных генов культурных растений в связи с их функциональным разнообразием позволяет выявить гены-кандидаты, контролирующие продуктивность растений и качество урожая (Frary and Doganlar, 2003; Doebley et al., 2006; Izawa, 2007; Ross-Ibarra et al., 2007), а также создать новые инструменты молекулярной селекции.

Сезонные изменения длины дня (фотопериода) влияют на многие процессы жизнедеятельности растений. Среди этих процессов наиболее подробно изучен переход к цветению. Основополагающие физиологические и генетические исследования, проведенные с модельным растением Arabidopsis thaliana, показали, что ген CONSTANS (СО) играет ключевую роль в фотопериодической регуляции цветения (Putterill et al., 1995). Принято считать, что ортологи СО арабидопсиса играют такую же роль у риса и некоторых других достаточно подробно исследованных видов растений (Griffits et al., 2003; Turck et al., 2008). Однако в последние годы становится все более очевидным, что генетические системы модельных растений, арабидопсиса и риса, не отражают всего многообразия путей регуляции процессов перехода к цветению. В частности, эти процессы недостаточно исследованы у многих хозяйственно ценных видов растений.

Изучение генетической регуляции перехода картофеля к цветению и клубнеобразованию - важная в практическом отношении задача, решение которой позволит изменять скороспелость этой культуры и продвигать ее в новые регионы. Клубнеобразование растений картофеля зависит от длины дня. Такая зависимость связана с происхождением и последующей селекционной историей картофеля. Большинство современных сортов происходят от длиннодневного (ДЦ) чилийского подвида Solanum tuberosum ssp. tuberosum (группа Chilotanum, Huaman and Spooner, 2002). Однако при выращивании в умеренных широтах Европы и Северной Америки, а также в результате

селекции на признак раннеспелости (Glendinning, 1983) были созданы сорта, нейтральные по отношению к длине дня (НД). Другие культурные и дикорастущие формы (S tuberosum ssp. andigena, S. demissum, S stoloniferum и др.) формируют клубни в условиях короткого дня (КД) (Разумов, 1931; Чайлахян, 1984; Ewing and Struik, 1992; Rodriguez-Falcon et al., 2006).

В начале данного исследования гомолог СО арабидопсиса у представителей рода Solarium представлялся наиболее подходящим геном-кандидатом, связанным с адаптацией этих растений к длине дня (Martinez-Garcia et al., 2002). Гомологи CO изучали в связи с фотопериодической регуляцией перехода к цветению у НД томатов (S lycopersicum) (Ben-Nairn et al., 2006). С. Прат и ее коллеги (Rodriguez-Falcon et al., 2006) исследовали гомолог СО арабидопсиса у андийского картофеля (S tuberosum ssp. andigena) как регулятор фотопериодического контроля цветения и клубнеобразования. В отличие от КД андийского картофеля, структура и предполагаемые функции гомолога СО у ДД чилийского картофеля и производных от него современных ДЦ/НД сортов картофеля ранее не были изучены.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был анализ структурного и функционального полиморфизма гомологов гена СО (CONSTANS-LIKE, COL) в серии генотипов клубненосных Solanum, различающихся по географическому происхождению, плоидности и скорости развития (включая скороспелость), и создание простых методов различения и идентификации этих гомологов.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать первичное строение гена COL у культурных и дикорастущих растений клубненосных форм Solanum, различающихся по фотопериодической реакции и скорости развития.

2. Провести филогенетический анализ охарактеризованных последовательностей COL у Solanum в сопоставлении с

последовательностями гомологов СО у других покрытосеменных растений.

3. Определить число копий и особенности экспрессии COL у клубненосных форм Solanum, различающихся по плоидности и фотопериодической реакции.

4. Разработать методы различения и идентификации локусов COL картофеля и его дикорастущих сородичей, пригодные для селекции с использованием молекулярных маркеров (Marker-Assisted Selection).

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые охарактеризованы гомологи гена СО у широкого круга клубненосных форм Solanum и проведен сравнительный анализ этих генов Впервые показано, что ген COL у растений Solanum представлен двумя формами, которые различаются строением экзона 2 и интрона 1, а также характером экспрессии и, по-видимому, представляют два локуса COL. Созданы системы SCAR и CAPS маркеров, позволяющие надежно различать и идентифицировать эти два локуса COL. Полученные результаты открывают новые возможности для сравнительных генетических и эволюционных исследований молекулярных механизмов, регулирующих переход к цветению и клубнеобразованию у картофеля и его дикорастущих сородичей. SCAR и CAPS маркеры двух локусов COL могут стать эффективным инструментом молекулярной селекции, в частности, при картировании генов COL.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение» и «Заключение», выводов и списка литературы, включающего 155 названий. Работа изложена на 115 машинописных страницах, содержит 22 рисунка и 7 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Растительный материал. В работе использовали семена (Solanum chacoense, S demissum, S. phureja, S stoloniferum, S tuberosum ssp. andigena) и клубни (S tuberosum ssp. tuberosum), полученные из Всероссийского института растениеводства им. Н.И. Вавилова, С.-Петербург; ВНИИ картофельного хозяйства, Коренево, Московская обл.; National Plant Germplasm System (NPGS), Старджен Бей, США; Centre for Genetic Resources, Вагенинген, Нидерланды. Автор выражает сердечную благодарность всем коллегам, предоставившим материал для данного исследования.

Условия выращивания растений. Для выделения геномной ДНК растения выращивали при постоянном свете и комнатной температуре. Для выделения РНК поддерживали режим 16/8 и 8/16 часов света/темноты соответственно для ДД и КД.

Выделение ДНК и РНК. Геномную ДНК выделяли из молодых листьев, используя модифицированный СТАВ метод (Doyle and Doyle, 1987). Тотальную РНК выделяли из молодых листьев при помощи TRIzol® Reagent (Invitrogen, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Для синтеза кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием фермента PowerScript (Clontech, США) по стандартному протоколу с поли(Т) праймером (табл. 1).

Праймеры и адаптеры, использованные в работе. Олигонуклеотиды, использованные в работе в качестве праймеров и адаптеров, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Праймеры и адаптеры, использованные в работе

Праймер/ адаптер Последовательность Применение

COlong-F 5'-ATC-CTC-CTG-TTA-AGA-ATA-ACA-ATA-AGA-ACA-A-3' амплификация последовательности экзона 2 гена ¡COLI

COlong-R 5'-GAA-CTG-GCA-CAA-CAC-TAT-CTT-CAA-CA-3'

COshort-F 5'-CCT-CCT-GTT-AAG-AAG-AAC-AAT-AAG-ACC-TT-3' амплификация последовательности экзона 2 гена sCOLl

COshort-R 5 >-G AC-TTT-GTT-GTT-GCT-GCT-GTT-GGT-3'

sCO_inl-F 5' -AAA-ATT-MTA-CTC-CTA-C AT-GTA-AAA-AAT-AAC-3' амплификация последовательности интрона 1 гена sCOLl

CO inl-Rl 5 '-CTG-GAG-GAC-CAT-ARA-GGG-TTC-C -3'

ICO ml-F 5'-TTT-TTC-ACA-CAC-AAC-ATA-TAT-ACT-CCT-3' амплификация последовательности интрона 1 гена ICOL1

CO_inl-R2 5 '-CAT-CAT-AGA-ACC-ACY-GCY-AAC-G -3'

COm-F 5'-ATG-GTT-GTT-GYT-GAA-TCC-TCC-TG-3' амплификация последовательности экзона 2

COm-R 5'-TCY-AGT-GTT-AKA-ATT-GTC-ATA-CTC-CAT-3'

CO-F 5'-CGT-GTC-CCR-ATT-MTG-CCC-ATT-3' амплификация частичных гомологов (80% полной последовательности гена)

CO-R 5'-GAA-GCA-TAC-CTT-ATG-GTT-TTC-TCA-AAT-TT-3'

Ac-F 5 '-CWG-GAT-TTG-CGG-GAG-ATG-A-3' амплификация гена актина

Ac-R 5 '-TAC-CAG-TTG-TAC-GTC-CAC-TRG-C-3'

поли(Т) 5'-TTT-TTT-TTT-TTT-TTT-NN-3' обратная транскрипция мРНК

поли(Т)ас!2 5'-CCC-AGG-ACA-TAA-TAC-GCG-C-(T)i5-3' обратная транскрипция мРНК для RACE-PCR

адаптер 1 5'-AAG-CAG-TGG-TAT-CAA-CGC-AGA-GTA-CGC-rGrGrGrG-3' быстрая амплификация 5'-концов кДНК

адаптер 2 5 '-CCC-AGG-ACA-TAA-TAC-GCG-C-3' быстрая амплификация 3'-концов кДНК

adl-F 5'-AAG-CAG-TGG-TAT-CAA-CGC-AGA-GTA-C-3' быстрая амплификация 5'-концов кДНК

adl-R 5 '-CAT-AAT-TGG-GAC-ACG-GTG-GTG-AC-3'

ad2-F 5 '-GAT-AGT-GTT-GTG-CCA-GTT-CAG-AAC-3' быстрая амплификация 3'-концов кДНК

ad2-R 5'-CCC-AGG-ACA-TAA-TAC-GCG-C-3'

Амплификация геномной ДНК и кДНК. Геномную ДНК и кДНК амплифицировали по универсальной программе, используя температуру отжига праймеров 62°С. Полученные продукты амплификации разделяли с помощью электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле в 1х ТАЕ буфере (40 тМ ТпБ-ацетат,

1 mM EDTA, pH 7,6) в течение 60 мин при 6 V/cm. Фрагменты ДНК после окрашивания бромистым этидием визуализировали с помощью видеосистемы в проходящем УФ свете.

Быстрая амплификация 3'- и 5'-концов кДНК (RACE-PCR). Для

быстрой амплификации 5'-концов кДНК проводили ОТ-ПЦР с дополнительным отжигом адаптера 1 (табл. 1), аналогичного SMART-праймеру фирмы ' Clontech. Далее проводили несколько дополнительных циклов амплификации с адаптер 1-специфичным праймером (adl-F) и ген-специфичным праймером (adl-R). Для быстрой амплификации 3'-концов кДНК при ОТ использовали модифицированный прайм ер поли(Т)ас12. Далее проводили ПЦР с ген-специфичным праймером (ad2-F) и адаптер2-специфичным праймером (ad2-R).

Клонирование гомологов гена СО. Амплифицированные прямой ПЦР фрагменты клонировали методом ТА-клонинга в pGEM-T Easy Vector System I (Promega, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Далее плазмиду нарабатывали в штамме Е coli XL 1-blue и определяли нуклеотидную последовательность вставки, используя автоматический анализатор MegaBACE 500 (GE Healthcare, США). Последовательности охарактеризованных гомологов СО депонировали в ГенБанке (http://www.ncbi. nlm.nih.gov).

CAPS анализ. Образцы ДНК амплифицировали с праймерами COm-F и COm-R (табл. 1), далее реакционную смесь разбавляли в 3 раза желтым буфером (СибЭнзим, Россия), ампликоны подвергали рестрикции с ßssECI в течение 4 ч при 60°С. Продукты рестрикции разделяли в 1,5%-ном агарозном геле.

ПЦР в реальном времени. ПЦР анализ в реальном времени проводили на приборе АНК-32 (Институт аналитического приборостроения, Россия),

используя зонды TaqMan. При анализе экспрессии мРНК COLI для нормировки использовали совокупность генов актина картофеля, амплифицируемых с парой праймеров Ac-F и Ac-R (табл. 1). Эффективность ПЦР (Е) определяли в серии разведений плазмиды и вычисляли по формуле (1+Е) = Ю('Шорс). Дальнейшие вычисления проводили при помощи пакета программ Q-Gene (Simon, 2003) с учетом двукратной повторности анализа для каждого образца. Для определения количества копий гомологов гена СО в геномах Solanum проводили анализ ПЦР в реальном времени с геномной ДНК и рассчитывали соотношение двух гомологов относительно друг друга.

Методы анализа последовательностей генов. Производные аминокислотные последовательности получали с помощью программы EditSeq (DNASTAR, США) и Vector NTI 8 (Invitrogen, США) с использованием стандартного генетического кода. Поиск гомологов производили в GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank/), SOL Genomic Network (http://www.sgn.cornell.edu/) и TIGR (http://www.tigr.org/tdb/). Выравнивание нуклеотидных и производных аминокислотных последовательностей проводили с помощью программ BLAST 2.2.18, доступной на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast), и Vector NTI Suite 8 (Invitrogen, США). Дендрограммы строили с использованием метода связывания ближайших соседей (Neighbor Joining, NJ) в программе MEGA 4.0 (Tamura et al., 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Конструирование праймеров для исследования гомологов СО у видов Solanum. В гене СО арабидопсиса выделяют высококонсервативные участки, кодирующие два домена цинкового пальца (B-boxl и В-Ьох2) на N-концевой части белка и один coil-coil домен (ССТ) около С-конца белка. Эти консервативные последовательности разделены вариабельным центральным участком (middle region, MR), в котором находится один интрон (Robson et al.,

2001). Такая же картина наблюдается у других исследованных видов растений (Griffits et al., 2003). Однако гомологи СО у растений рода Solanum, включая S. lycopersicum (Ben-Naim et al., 2006), содержат два интрона, и в этом случае MR соответствует второму экзону (рис. 1).

Структурный анализ гомологов СО у видов Solanum. Клонировано 26 гомологов СО у длиннодневных и короткодневных форм Solanum, в том числе у сортов картофеля, различающихся по скороспелости (табл. 2).

Таблица 2. Клоны COLI растений Solanum, охарактеризованные в данном исследовании

Генотип (номер по каталогу) Характеристика фотопериодической реакции и скороспелости Регистрационные №№ последовательностей COL, депонированных в ГенБанке

ICOL1 sCOLl

S demissum{К23315) кд EU708969 DQ499755, EF143445

S stolomferum (CGN23072, К61) кд EF143434, EF143435 EF143433, EF143436

S tuberosum ssp andigena (PI703632, PI704448) КД EF143438, EF143439 EF143437, EF143440

S tuberosum ssp tuberosum L. сорта Bastoneza (K7580) дц DQ472734 -

Early Rose (K24035) ДП/НД раннеспелый DQ499754 EU708970

Russet Burbank (K24158) ДД/НД позднеспелый EF143450 EF143451

Приекульский ранний (K1350) ДД/НД раннеспелый EF143446 EF 143447

Изора (Kl 1279) да/нд раннеспелый EF143449 EF143448

Jubel (K24078) да/нд позднеспелый EF143442 EF143441

Prof. Wohltmann (K2147) ДДОЭД позднеспелый EF143444 EF143443

C0in1-R1 COihort-F

„ I COin1-R2 COionn-F Cpehort-R

CO-F Г J CCWR^0-"* CO-R

b.p 1 6t 89 189 318 330 481 642659 868 J1002 1034 1863 2010 2083 2139 2222

968

| Вт1)охГ~ [ B-b»x2 Г _ _ ~~~ ______ ~T ■CC l ' l

ртЬчааа'ж f ; СО^у-ао^ц^Т-г^.ТТ^тя!**.', „ i_________üawu.--л .т.:,;.,. „ • •»•'•••¡ум . -„..», ^

ATG '-^-•' "'-1-—1 • ------—--------——-1-:-1-- -TGА

C0.hort-F CO.M-R

6C0.h„rt-F COl y(J»hort-K ad1-F adi-R CO^FCO^-Pad^F0"0] | <?0m-R

ad1-R F 7 ad2-F | | V0™"R ad2-R

, T , , __ T >_V V" _, T „

ad«pt*r1-Iii i-----» _I «i « « l-1-1 - adapMrl

bp 1 89 150 278 407 419 580597 80*0829 А 972 1119 1248 1331 1525

410 905 940

Г ГЕРб5х1~"1*~В^[>ох2—1 " " I г ССТ | '

I (ras^f-k'. vi'^gfer-v/ у ;.......■;■,■. л. 1.....mn^.trryr г. УГУ .........■-■у:?;1-1*! . ■ ,

АТО^1 ' ¿L-^-..... ' — " 1 !^-TGA

Рис. 1. Структура гена (а) и кДНК (б) гомологов СО у картофеля. Экзоны, интроны гена COLI и основные домены белка COLI обозначены соответственно темно-серыми, белыми и светло-серыми прямоугольниками. Вертикальные стрелки показывают позиции прямых (F) и обратных (R) праймеров, используемых для амплификации (последовательности праймеров указаны в таблице 2). Цифры под линиями показывают положение праймеров, экзонов и интронов гена COLI, а также доменов белка COLI.

У всех исследованных генотипов Solanum MR последовательность белка гомологов СО содержит три консервативных мотива - WLLLNPP, DD/EYLDLAEYGGV/D и R/VG/EDSWPVQ, которые соответствуют мотивам (E-X-S)-W-L-L, L-V-D/G-Y и G-X-D/E-X-I/V-V-P, отмеченным ранее у белков COLI двудольных растений и злаков (Grifïlts et al., 2003). Еще один мотив, NFQLG, характерный для гомологов СО у Solanum, присутствует у белков COL тополя, гороха и ипомеи, но отсутствует у арабидопсиса, видов Brassica и злаков. Таким образом, по своей структуре все геномные и мРНК последовательности гомологов СО у растений Solanum, охарактеризованные в ходе данного исследования, относятся к функциональной группе COL la (Griffits et al., 2003). Некоторые другие консервативные мотивы, например, GMLFGR/GEVV, SQFNDQYSV и E/NGQG/RKSLILY, уникальны для рода Solanum.

Филогенетический анализ генов COLI у видов Solanum. При

выравнивании последовательностей охарактеризованных нами генов COL Solanum с депонированными в ГенБанке гомологами установлен высокий уровень сходства по производным аминокислотным последовательностям консервативных доменов: 75-91% по В-box домену и 88-100% по домену ССТ. В отличие от консервативных доменов, MR обнаруживает значительную генетическую изменчивость: гомология составляет 85% внутри рода Solanum; за пределами рода Solanum этот показатель варьирует от 45 до 84%, в том числе 55% для гена СО арабидопсиса (AY086574).

При построении филогенетического дерева, основанного на попарном выравнивании производных аминокислотных последовательностей (рис. 2), белки CO/COLI образуют кластеры, соответствующие систематическому положению исследованных видов растений: астериды, представленные видами рода Solanum и близкородственным видом Ipomoea nil (порядок Solanales), отличны от эурозид 1 (горох и тополь), эурозид 2 (арабидопсис, виды рода

Brassica) и однодольных растений (Liliopsida), представленных злаками (рис, ячмень, пшеница, райграс).

Последовательности белков COLI Solanum отчетливо разделились на две структурные группы, различающиеся прежде всего длиной MR (рис. 3). Весьма существенно, что все проанализированные генотипы Solanum, вне зависимости от их фотопериодической реакции, имеют оба варианта гена, которые мы назвали коротким (sCOLl) и длинным (ICOL1). Функциональный гомолог StCOL3 из андийского картофеля (С. Прат, личное сообщение) и функциональные гомологи томата (LeCOl, AAS67377, и LeC03, AAS67379) принадлежат к кластеру sCOLl.

Solaraceas (30 форм)

eurosids I

СогюЫасеэе (1 ферма) _ Fafceceae (1 форма) jSalcaceas (3 Фср*ы) Brassicacsae (13 Ферм) J eurosids 11 Poaceae [5 Форм) ]liBopsida

asterids

Q5 Q4 Q3 Q2 СП Q0

генетические расстояния

Рис. 2. Филогенетический анализ последовательностей белков CONSTANS у двудольных и однодольных растений. В основании ветвей указаны значения bootstrap (в процентах для 100 повторностей).

Полиморфизм второго экзона генов COLI у видов Solanum. Поскольку наиболее заметные различия форм COL связаны с экзоном 2, более детально был проанализирован структурный полиморфизм геномных и мРНК последовательностей этого экзона. Каждый из проанализированных генотипов содержит оба варианта гена (sCOLl и ICOL1), которые различаются, в первую

100

msa АВ0437Ю gStl ABF56054 gSta AB043702 mStCOL3 UStt I AB043714 i|Stt RB AB043716 gSsAB043701 gStt PWAB043708 gSta AB043705 OS« PRAB043712 gStt JAB043706 gStt ER 'jSs AB043698 gStt PRAB043711 mSJ СОЗ AASG7379 mSta 1.3

mSI C02AAS67378 rgSsAB043700 gSsAB043699 IflSd

gStt В ABF17844 gStt PWAB043709 gStt I AB043713 gStt JAB043707 mSta 1.1 gSta AB043704 mStt ER ABF 50053 gStt RB AB043715 gSta AB043703 mS) C01 AAS67377

-j 8

Q6 04 02

генетические расстояния

Рис. 3. Филогенетический анализ последовательностей белков CONSTANS растений Solanum.

Аббревиатуры генотипов Solanum объединены в названии последовательностей с соответствующими номерами регистрации клонов в ГенБанке. g и m -производные аминокислотные последовательности, соответствующие последовательностям геномной ДНК и кДНК. Sl - Solanum lycopersicum', Sd - S. demissum\ Sst - S. stoloniferum; Sta - S. tuberosum subsp. andigena\ Stt - S tuberosum subsp. tuberosum (B - Bastoneza, ER - Early Rose, I - Изора, J - Jubel, PR - Приекульский ранний, PW - Prof. Wohltmann и RB - Russet Burbank).

pCOi рСОв 1 2 34 5 6 78 910 К 12

рссн pCOs 13 14 1S 1S 17 18 19 20 21 22 23 К 24

pcoi pCOs 12345678 9 10 12

pcoipcas 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Рис. 4. Анализ генотипов Solanum с помощью SCAR и CAPS маркеров, а - SCAR маркеры, различающие sCOLl и ICOL за счет вариант-специфичной амплификации экзона 2.6- CAPS маркеры, различающие sCOLl и ICOL за счет вариант-специфичной рестрикции эндонуклеазой ÄssECI. pCOl -плазмида pGEM-T, содержащая ICOL; pCOs - плазмида pGEM-T, содержащая sCOLl; 1,2 - chacoense (CGN22725, PI472810), 3,4 - S. phureja (K9882, CGN18315), 5,6 - 5". stoloniferum (K3554, CGN23072); 7,8 - S. tuberosum ssp. andigena (PI703632, PI704448), 9,10 - S. demissum (K23315, K23306); 13-18 -сорта-ветераны tuberosum картофеля (Early Rose, Изора, Приекульский ранний, Russet Burbank, Prof. Wohltmann, Jubel); 19-23 - формы tuberosum картофеля, относящиеся к группе Chilotanum (Magelanes, К7586, Dorma, Кб 108, Azul, K7528, Natalina, K7525, Bastoneza, K7580); К - отрицательный контроль; 12,24 - маркер молекулярной массы GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus.

очередь, на 18 нуклеотидов за счет количества повторов ААС/ААТ и CAA/CAG, кодирующих полиаспарагиновые (polyN) и полиглутаминовые (polyQ) участки. Соотношение двух синонимичных кодонов как для аспарагина, так и для глутамина составляет в этом экзоне 3:2. Таким образом, полиаспарагиновый мотив у sCOLl (KNNKNNFDNDHNN) отличается от polyN повтора у 1COL1 (NNNKNN1NNNNNN). Полиглутаминовые мотивы у sCOLl в два раза короче, чем у 1COL1. Помимо повторов, sCOLl и 1COL1 различаются 11 несинонимичными нуклеотидными заменами и двумя синонимичными, что приводит к 12 аминокислотным заменам в соответствующих белках.

Оба варианта COLI генов присутствуют у всех генотипов Solanum, независимо от их фотопериодической реакции, и в каждом индивидуальном растении. Чтобы доказать присутствие каждого из двух вариантов COLI в геномах растений Solanum, использовали три независимых подхода. Первый - это описанное выше клонирование геномных и мРНК последовательностей второго экзона sCOLl и ICOL1 гомологов. Полученные последовательности депонированы в ГенБанке (табл. 2) и представлены на рис. 3. Второй подход основан на дифференциальной амплификации двух генов COLI в геномах индивидуальных растений. Для этого были созданы SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) маркеры: ген sCOLl амплифицируется с праймерами CO_short-F и CO_short-R (рис. 1, табл. 1) с образованием фрагмента длиной 284 п.н., а при амплификации ICOL1 с праймерами CO_long-F и CO_long-R (рис. 1, табл. 1) образуется фрагмент длиной 225 п.н.; если в геноме содержатся оба гена, в каждой пробе присутствуют оба фрагмента ДНК (рис. 4а). Третий подход также позволяет проводить анализ индивидуальных растений и основан на сочетании амплификации второго экзона с рестрикцией ДНК, различающей два варианта гена. Наличие замен в нуклеотидных последовательностях позволило подобрать сайт рестриктции, характерный для sCOLl варианта и

отсутствующий у ICOL!, и создать CAPS (Cleaved Amplified Polymorphics Sequence) маркер, различающий два варианта гена за счет специфичной рестрикции. В результате такого анализа после амплификации и расщепления эндонуклеазой ÄwECI варианта sCOLl обнаруживаются два фрагмента длиной 213 и 130 п.н., а в случае ICO LI - только один (360 п.н.). Если генотип содержит оба варианта гена, результатом CAPS анализа является наличие трех фрагментов (рис. 46).

Вне зависимости от их фотопериодической реакции и скорости развития, все генотипы Solanum, проанализированные с помощью прямого секвенирования, SCAR и CAPS маркеров, содержали одновременно sCOLl и ICOL1. Индивидуальные растения, проанализированные с помощью SCAR и CAPS маркеров, содержали одновременно оба гена.

Являются ли sCOLl и ICOL аллелями одного локуса или это независимые локусы? Для ответа на этот вопрос описанные выше методы SCAR и CAPS анализа использовали для изучения дигаплоидов картофеля, полученных во ВНИИ картофельного хозяйства (рис. 5). Образец 303-1 представляет собой дигаплоид сорта Aurelia, генотипы 326, 327 и 329 -дигаплоиды сорта Покра Все индивидуальные растения дигаплоидов содержали оба варианта COLI. Таким образом, есть достаточно оснований предполагать, что sCOLl и ICOL1 являются независимыми локусами, а не аллелями одного локуса COLI.

Полиморфизм интрона 1 генов COLI у видов Solanum. При анализе охарактеризованных нами последовательностей первого интрона гомологов гена COLI у формы картофеля Bastoneza (DQ472734) и S. demissum (FJ415965) и EST последовательностей, выделенных из картофеля сортов Kennebec (СК249622) и Shepody (DR037627 и DN588901), было обнаружено, что по строению первого интрона гомологи COLI Solanum разделились на две группы, различающиеся по длине на 32 п.н. за счет четырех инделов (2, 9, 24 и 1 п.н.). В

этом случае более короткий интрон 1 соответствует гену ¡COLI, а более длинный - sCOLl. Гомология по последовательностям интрона 1 между sCOLl и ICOL1 составляет 66%, тогда как последовательности интрона 1, принадлежащие каждому из двух генов, практически идентичны у всех исследованных генотипов (98%).

- ■

Рис. 5. Анализ дигаплоидов картофеля с помощью SCAR и CAPS маркеров, а - SCAR маркеры, различающие sCOLl и ICOL, б - CAPS маркеры, различающие sCOLl и ICOL. 1 - 326, 2 - 327, 3 - 329, 4 - 303-1, 5 - плазмида pGEM-T, содержащая sCOLl, 6 - плазмида pGEM-T, содержащая ICOL, 7 -отрицательный контроль, 8 - маркер молекулярной массы GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus.

SCAR маркеры интрона 1 COLI генов Solanum, позволяющие различать sCOLl и ICOL1. В ходе исследования была разработана система SCAR маркеров, основанная на дифференциальной амплификации интрона 1 sCOLl и ICOL1 в геномах индивидуальных растений. При амплификации варианта sCOLl с праймерами sCO_inl-F и CO_inl-Rl (рис. 1, табл. 1) образуется фрагмент длиной 179 п.н. (рис. 6а, в), а при амплификации гена ICOL1 с праймерами lCO_inl-F и CO_inl-R2 - фрагмент длиной 188 п.н. (рис. 66, г).

Таким образом, исследования строения интрона 1 у гомологов COLI с помощью прямого секвенирования и SCAR маркеров подтвердили сделанный ранее вывод о том, что все проанализированные генотипы Solanum, вне зависимости от их фотопериодической реакции и скорости развития, содержат одновременно гены sCOLl и ICOL1.

а1 2 34 56 7 8 9 10 1Ш

ж«:

б1 2 345 6 7 89 10 11

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 05,

Г13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 24 <25г

Рис. 6. SCAR маркеры, различающие sCOLl (а, в) и 1COL (б, г) путем специфичной амплификации интрона 1.

1, 2 - S. chacoense (CGN22725, PI472810), 3, 4 - phureja (К9882, CGN18315), 5,6 - S. stoloniferum (K3554, CGN23072); 7, 8 - S. tuberosum ssp. andigena (PI703632, PI704448), 9, 10 - S. demissum (K23315, K23306); 13-18 -сорта-ветераны tuberosum картофеля (Early Rose, Изора, Приекульский ранний, Russet Burbank, Prof. Wohltmann, Jubel); 19-23 - формы tuberosum картофеля, относящиеся к группе Chilotanum (Magelanes, K7586, Dorma, K6108, Azul, K7528, Natalina, K7525, Bastoneza, K7580); 11, 24 - отрицательный контроль; 12, 25 - маркер молекулярной массы GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus.

Копийность sCOLl и ICOLl в геномах Solanum. Так как оба гена, sCOLl и ICOL1, присутствуют одновременно в геномах всех форм Solanum, возникает вопрос: не связаны ли различия в фотопериодической реакции этих растений с различным числом копий sCOLl и ICOL 11 Соотношение числа копий sCOLLICOLl определяли методом ПЦР в реальном времени и показали, что у тетраплоидных форм S1. stoloniferum и S. tuberosum ssp. andigena или гексаплоида S demissum это соотношение составляет 1:1 или 1:2, независимо от плоидности геномов и фотопериодической реакции. У различающихся по скороспелости сортов тетрашгоидного картофеля Early Rose, Prof. Wohltmann, Russet Burbank, Изора, Приекульский ранний и Осень соотношение sCOLl: ICOLl составляет 1:1.

Профили экспрессии sCOLl и ICOL1. Являются ли гены sCOLl и ICOL1 функциональными или это псевдогены, обладающие только структурным сходством с функциональным гомологом СО арабидопсиса и COLI томатов? Для ответа на этот вопрос исследовали экспрессию двух COLI генов методом ПЦР в реальном времени у ДД/НД раннеспелого сорта картофеля Early Rose. Отбор проб РНК производили через каждые 2-3 ч при двух световых режимах.

В условиях КД (16/8 ч темноты/света) sCOLl обнаруживает два пика экспрессии: после 10 ч темнового периода и на закате. При этом дневной пик мРНК почти вдвое превышает ночной. Экспрессия ICOL1 достигает минимального значения за 6 ч темнового периода и достигает максимума на закате, когда количество мРНК в 10 раз превышает ночной уровень (рис. 7а). Таким образом, ночные тренды экспрессии sCOLl и ICOL1 направлены противоположно, тогда как в дневной период они совпадают. Максимальное превышение уровня экспрессии sCOLl над ICOL1 было 30-кратным в ночной период и пятикратным - в дневной (рис. 7в).

В условиях ДЦ (8/16 ч темноты/света) ночные тренды экспрессии sCOLl и ICOL1 совпадают (рис. 76), выходя на максимум на рассвете; при этом уровень экспрессии sCOLl в 14 раз выше, чем у ICOL1. В отличие от sCOLl у

часы

4,50 4,00 3,50 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50

J 25,0 *

2 20,0

.35 is,o О

О 10.0 IA

Рис. 7. Динамика экспрессии sCOLl и ICOL1 у ДД/НД картофеля, сорт Early Rose.

Накопление COL1 мРНК в расчете на мРНК актина на ДД (а) и КД (б); соотношение величин экспрессии sCOLl к ICOLI на ДД и КД (в).

IC0L1 днем наблюдается дополнительный дневной пик экспрессии в 17 ч. Тем не менее, минимальный уровень дневной экспрессии sCOLl втрое превышает пик экспрессии 1СОЫ (рис. 7в).

Таким образом, экспрессируются оба гена COL1, однако они резко различаются по динамике экспрессии и количеству синтезируемой мРНК.

ОБСУЖДЕНИЕ

Структурный полиморфизм генов COL1 у растений Solarium.

Структурный полиморфизм генов является первичной мишенью естественного и искусственного отбора. Исследования такого полиморфизма важны для понимания механизмов окультуривания и адаптации растений и позволяют обнаружить гены-кандидаты, отвечающие за экономически важные признаки продуктивности культурных растений (Doebley et al., 2006; Izawa, 2007; Ross-Ibarra et al., 2007). При исследовании первичного строения генов COL1 у растений рода Solanum с целью связать структурный полиморфизм этих генов с фотопериодической реакцией/скороспелостью этих растений было установлено, что, как и следовало ожидать, строение первого и третьего экзонов COL1, кодирующих В-box и ССТ домены белка COL1, оказалось высококонсервативным (75-100% сходства). Напротив, второй экзон, кодирующий срединную часть белка, обнаружил значительный полиморфизм. В соответствии с этим полиморфизмом белки COL1 были разделены на два варианта (короткий, sCOLl, и длинный, 1COL1), различающиеся по длине полиаспарагиновых (polyN) и полиглутаминовых (polyQ) участков, кодируемых, соответственно, ААС/ААТ и CAA/CAG повторами. Гены sCOLl и ICOL1 также различаются 13 вариант-специфичными однонуклеотидными заменами (single-nucleotide polymorphisms, SNPs) в кодирующей последовательности второго экзона. Результаты изучения полиморфного первого интрона COL1 подтверждают представление о двух генах COLL Можно предположить, что эти гены соответствуют двум локусам COL1,

которые возникли в результате дупликации гена COLI еще до дивергенции видов рода Solanum.

Являются ли гены COLI у Solanum функциональными ортологами СО арабидопсиса? Для ответа на этот вопрос использовали два подхода. Во-первых, установили, что охарактеризованные нами белки COLI у Solanum по строению идентичны функциональной группе 1а гомологов CO/COL (Griffits et al., 2003), для которых доказана роль в переходе к цветению у арабидопсиса (Putterill et al, 1995), черной горчицы (Lagercrantz and Axelsson, 2000; Lagercrantz et al., 2003), ипомеи (Liu et al., 2001) и нескольких видов злаков (Griffits et al., 2003; Nemoto et al., 2003; Yano et al., 2000). Два локуса COLI обнаружены у всех исследованных нами форм Solanum и, очевидно, возникли еще до видовой диверсификации рода Solanum

Второй и более убедительный подход основан на исследовании экспрессии генов COLI. По динамике экспрессии два гена COLI ДД чилийского картофеля сорта Early Rose во многом сходны с теми генами COLI, для которых доказано непосредственное участие в фотопериодическом контроле цветения. По характеру экспрессии stCOL3 андийского картофеля на КД более всего напоминает экспрессию sCOL в условиях ДД.

Таким образом, по-видимому, оба гена, ICOL1 и sCOLI, являются функциональными. Однако характер экспрессии sCOLI делает этот ген более предпочтительным кандидатом на роль ключевого фотопериодического регулятора цветения и клубнеобразования. Независимым методом, способным установить функциональность генов ICOL1 и sCOLI, станет трансформация со мутантов арабидопсиса. С этой целью выделены кДНК обоих генов из картофеля сорта Early Rose, созданы несущие их конструкции, а также клонированы фрагменты downstream генов FLOWERING LOCUS Т (FT) и APETALA1/FRUITFUL для того, чтобы в дальнейшем провести параллельно фенотипический и молекулярный анализ восстановления дикого типа у трансформантов арабидопсиса.

Белки CO/COLI не имеют ДНК-связывающих мотивов, поэтому связывание COL белков с промотором downstream гена FT опосредовано через вспомогательный ССААТ-связывающий фактор (Hepworth et al., 2002). Существование такого взаимодействия показано in vitro и in planta на томатах и арабидопсисе (Ben-Naim et al, 2006; Wenkel et al., 2006; Cai et al., 2007). Нельзя исключить, что 1COL1 и sCOLl могут взаимодействовать с образованием подобных транскрипционных комплексов. Эффективность такого взаимодействия может определяться соотношением процессов деградации/стабилизации белков 1COL1 и sCOLl в течение суточного цикла их экспрессии, в том числе структурой 1COL1 и sCOLl, в частности, длиной гидрофильных полиаспарагиновых и полиглутаминовых мотивов. Кроме того, наличие вариант-специфичных SNPs также может оказывать существенное влияние на функции sCOLl и ICOL1. Примером тому служит пара генов FTITFL1, также вовлеченных в переход растений к цветению (Hanzawa et al., 2005). Дальнейшие исследования предполагаемого взаимодействия ICOL1 и sCOLl и их экспрессии (например, путем прямого анализа белков 1COL1 и sCOLl) позволят лучше понять особенности тонкой регулировки процессов фотопериодической регуляции двух конкурирующих процессов в растениях Solanum - цветения и клубнеобразования.

Какова функция генов COLI у картофеля? При анализе генов COLI в генотипах Solanum, отличающихся по своей фотопериодической реакции и скорости развития, не обнаружено отчетливой связи между географическим происхождением, плоидностью и скоростью развития (включая скороспелость картофеля) этих генотипов и исследованными свойствами COLI генов Solanum. Полиморфизм COLI по первичной структуре кодирующей последовательности и интронов не был непосредственно связан с фотопериодической реакцией/скороспелостью этих растений. Все проанализированные генотипы содержали одновременно sCOLl и ICOL1, при этом соотношение этих двух генов также не было связано с фотопериодическим ответом ДЦ и КД форм

Solanum и скороспелостью картофеля. По-видимому, первичная структура COL1 не является точкой приложения процесса первичного окультуривания растений Solanum, а также последующей адаптации и селекции картофеля к длине дня. Возможно, эту роль выполняют си-регуляторные элементы COL1 в нетранслируемых последовательностях гена.

Судя по профилям экспрессии sCOLl и ICOL1 оба гена функциональны, но это не означает, что они контролируют фотопериодическую регуляцию развития Solanum. Отсутствие связи между полиморфизмом гена COL1 и фенотипическим проявлением признака можно объяснить тем, что геном-кандидатом для фотопериодического контроля цветения и клубнеобразования картофеля служит не COL1, а другие гены, например, гены фоторецепторов (PHYA, PHYB, CRY1 и CRY2), гены GIGANTEA (GI), SUPPRESSOR OF PHYA-105-1 и CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC 1, влияющие на экспрессию гена CO/COL1 и деградацию/стабилизацию белка CO/COL1 (Rodriguez-Falcon et al., 2006; Turck et al., 2008).

SCAR и CAPS маркеры, сконструированные на основе полиморфизма гена COL1 растений Solanum. Ген арабидопсиса СО влияет на скорость перехода к клубнеобразованию картофеля (Martínez-García et al., 2002). Мы применили стратегию генов-кандидатов для создания молекулярных маркеров на признак скороспелости картофеля. Хотя мы не обнаружили связи между присутствием/отсутствием одного из маркируемых вариантов гена СОЫ со скороспелостью или фотопериодической реакцией растений Solanum, однако дозы каждого из COL1 генов в геномах варьировали. С помощью разработанных в ходе данного исследования SCAR и CAPS маркеров можно оценивать дозу COL генов в геноме создаваемых сортов картофеля. Кроме того, эти маркеры могут быть использованы для картирования генов COL1 и регулируемых этими генами признаков, при изолировании полноразмерных последовательностей этих генов методом прогулки по хромосоме (Matsumura et

al., 2008), а также при создании других маркеров, полезных для селекции с помощью молекулярных маркеров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе исследований охарактеризованы гомологи гена СО арабидопсиса у растений рода Solanum: проанализирован структурный полиморфизм этих гомологов у пяти клубненосных видов Solanum, различающихся по фотопериодической реакции, а также изучена экспрессия этих генов у картофеля.

Было показано, что, в отличие от генов CO/COL других растений, COL ген Solanum состоит из трех экзонов и двух интронов. Во всех геномах ДЦ и КД видов Solanum этот ген представлен двумя вариантами - /COLI и sCOLl. Эти варианты различаются по строению экзона 2 (прежде всего, за счет числа повторов ААС/ААТ и CAA/CAG, кодирующих гидрофильные полиаспарагиновые и полиглутаминовые мотивы) и за счет нескольких инделов в интроне 1. Анализ дигаплоидов картофеля позволил предположить, что эти варианты являются независимыми локусами, а не аллелями одного локуса COLI. У каждого индивидуального растения ICOL1 и sCOLl присутствуют одновременно. Оба COLI гена представлены в геномах всех видов Solanum: по-видимому, дупликация гена COLI предшествовала дивергенции исследованных видов. Соотношение ICOL1 и sCOLl в геномах растений Solanum не связано с их фотопериодической реакцией и плоидностью. Динамика и уровень экспрессии двух локусов COLI у ДЦ сорта картофеля Early Rose различаются и по-разному изменяются в зависимости от длины дня. Все это позволяет считать, что растения Solanum содержат два функциональных гена - ICOL1 и sCOLl. Поскольку уровень экспрессии sCOLl во много раз превышает уровень экспрессии ICOL1, именно sCOLl представляется наиболее подходящим

кандидатом на роль фотопериодического регулятора цветения и клубнеобразования.

SCAR и CAPS маркеры, позволяющие быстро и надежно различать ICOL1 и sCOLl, могут в дальнейшем стать полезным инструментом для эволюционных и биотехнологических исследований растений рода Solanum и молекулярной селекции, например, при картировании генов COLI.

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы гомологи гена CONSTANS у пяти ДД и КД видов Solanum, показано, что COLI у картофеля и его дикорастущих сородичей представлен двумя вариантами - ICOL1 и sCOLl, которые значительно различаются по строению экзона 2 и интрона 1.

2. Показано, что оба COLI гена обнаруживают профиль экспрессии, характерный для фотопериодической реакции, причем экспрессия двух генов по-разному реагирует на длину дня и ночи.

3. На основе полученных результатов разработаны три системы SCAR и CAPS маркеров, позволяющих быстро и надежно различать и идентифицировать гены ICOL1 и sCOLl. С помощью этих маркеров доказано, что оба гена характерны для каждого вида Solanum и присутствуют одновременно в каждом индивидуальном растении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дробязина П.Е. и Хавкин Э.Е. Гомологи АРETALA1/FRUITFUL у растений •pomSolanum. Физиол. растений, 2006,53(2): 243-249.

2. Дробязина П.Е. и Хавкин Э.Е. Структурный гомолог гена CONSTANS у картофеля. Физиол. растений, 2006, 53(5): 786-789.

3 Drobyazina Р.Е. and Khavkin Е.Е. Structural homologs of CONSTANS and LEAFY in potato and its wild relatives Acta Hort., 2007, 745: 411-420.

4. Drobyazina P.E. and Khavkin E.E. Structural homologs of CONSTANS and LEAFY in potato and its wild relatives. Abstracts, Solanaceae VI, Madison WI, 2006, p. 214.

5. Drobyazina P.E. and Khavkin E.E. Two structural variants of the CONSTANS-LIKE gene in long- and short-day Solanum plants. Abstracts. ASPB Plant Biology & Botany Joint Congress, Chicago, 2007, p 168, P28011.

6. Drobyazina P. and E. Khavkin, 2008. Two CONSTANS-LIKE1 genes in long- and short-day Solanum plants. Abstracts. XVI FESPB Congress, Tampere, Finland, 2008. Physiol. Plant, vol. 133, P10-020.

7. Drobyazina P.E., Khavkin E.E. Two CONSTANS-LIKE genes in Solanum plants. Abstracts. Control of Flowering Time and Application for Plant Breeding, Science meeting in Salzau, Germany, September 2008, p. 35.

Отпечатано с готового оригинал-макета

Подписано в печать 06.11.2008 г.

Усл. печ. д. 1,75._Зак. 555._Тираж 100 экз.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А. Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44 Тел.:977-00-12, 977-40-64

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дробязина, Полина Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Введение.

1.2. Переход растений к цветению.

1.2.1. Фотопериодический путь перехода к цветению.

1.2.2. Взаимная регуляция генов фотопериодического пути и других индуктивных путей регуляции перехода растений к цветению.

1.2.3. Гены-интеграторы цветения.

1.2.4. Гены флорального морфогенеза.

1.3. Переход растений картофеля к клубнеобразованию.

1.3.1. Влияние условий окружающей среды на клубнеобразование картофеля.

1.3.2. Процесс перехода растений картофеля к клубнеобразованию.

1.3.3. Генетические основы перехода растений картофеля к клубнеобразованию.

1.4. Селекция при помощи молекулярных маркеров

Marker-Assisted Selection — MAS).

1.4.1. MAS.

1.4.2. ДНК маркеры.

1.5. Патентная литература, посвященная генам, контролирующим переход растений к цветению.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение полиморфизма гена фотопериодической регуляции цветения и клубнеобразования CONSTANS у растений Solanum"

Общая характеристика работы. Сезонные изменения длины дня (фотопериод) влияют на многие процессы жизнедеятельности растений. Среди этих процессов наиболее подробно изучен переход к цветению. Основополагающие физиологические и генетические исследования, проведенные с модельным растением Arabidopsis thaliana, показали, что ген CONSTANS (СО) играет ключевую роль в фотопериодической регуляции цветения (Putterill et al., 1995). Принято считать, что ортологи СО арабидопсиса играют такую же роль у риса и некоторых других достаточно подробно исследованных видов растений (Griffits et al., 2003; Turck et al., 2008). Однако в последние годы становится все более очевидным, что генетические системы модельных растений, арабидопсиса и риса, не отражают всего многообразия путей генетической регуляции процессов перехода растений к цветению. В частности, эти процессы недостаточно исследованы у многих хозяйственно ценных видов растений.

Картофель является четвертой по значимости, после зерновых, культурой, ежегодное производство которой в мире достигает 300 миллионов тонн. Урожай картофеля формируется за счет биомассы клубней. Клубнеобразование растений картофеля зависит от длины дня (Разумов, 1931; Чайлахян, 1984; Ewing and Struik, 1992). Такая зависимость связана с происхождением этой культуры и ее дальнейшей селекционной историей.

Большинство современных сортов картофеля происходит от длиннодневного (ДД) чилийского подвида Solarium tuberosum ssp. tuberosum (группа Chilotanum, Huaman and Spooner, 2002). Однако при выращивании в умеренных широтах Европы и Северной Америки, а также в результате селекции на признак раннеспелости (Glendinning, 1983) были созданы сорта, нейтральные по отношению к длине дня (НД). Другие культурные и дикорастущие формы (S. tuberosum ssp. andigena, S. demissum, S. stoloniferum и др.) формируют клубни в условиях короткого дня (КД) (Ewing and Struik, 1992; Rodriguez-Falcon et al., 2006).

Изучение генетической регуляции перехода к цветению и клубнеобразованию — важная в практическом отношении задача, решение которой позволит изменять скороспелость картофеля методами молекулярной селекции и таким образом продвигать эту культуру в новые регионы.

Исследование связи полиморфизма ключевых генов с функциональным разнообразием культурных растений позволяет выявить гены-кандидаты, контролирующие продуктивность растений и качество урожая, представляется важной теоретической и прикладной задачей, .поскольку во многих случаях эти гены являются основной мишенью естественного отбора и селекционного процесса (Frary and Doganlar, 2003; Doebley et al., 2006; Izawa, 2007; Ross-Ibarra et al., 2007).

Изучение генов-кандидатов, отвечающих за скорость развития, позволяет на основе полиморфизма этих генов создавать молекулярные инструменты - ДНК-маркеры - для дальнейшего использования в молекулярной селекции. Применение ДНК-технологий позволяет существенно расширить возможности традиционной селекции растений, а также значительно ускорить и сделать более направленным селекционный процесс.

Концепция генов-кандидатов широко применяется для идентификации генов развития. Суть этого подхода состоит в том, что многие гены очень медленно изменяются в процессе эволюции. Такой консерватизм структуры позволяет использовать гены, уже охарактеризованные у других видов растений, порой из достаточно отдаленных таксонов, для поиска гомологичных нуклеотидных последовательностей в генетических базах данных, а также делать предположения о функции полученных гомологов по аналогии с уже изученными генами.

В самом начале нашего исследования, гомолог СО арабидопсиса у представителей рода Solarium представлялся наиболее подходящим геном-кандидатом, связанным с адаптацией этих растений к длине дня (Martinez-Garcia et al., 2002). Позже у НД томатов (S. lycopersicon) были описаны три гомолога СО, два из которых, по-видимому, участвуют в фотопериодической регуляции перехода к цветению (Ben-Naim et al., 2006). Испанские исследователи (Rodriguez-Falcon et al., 2006; Gonzalez-Schain and Suarez-Lopez, 2008) изучали гомолог CO арабидопсиса у андийского картофеля (S. tuberosum ssp. andigena), рассматриваемого как регулятор фотопериодического контроля цветения и клубнеобразования. В отличие от КД андийского картофеля, структура и предполагаемые функции гомолога СО у ДД чилийского картофеля и производных от него современных НД сортов картофеля ранее не были изучены. Подавляющее большинство современных сортов картофеля получено с использованием методов интрогрессивной гибридизации и могли сохранить аллели генов развития, перенесенные из дикорастущих сородичей. Поэтому было валено расширить рамки исследования полиморфизма гомолога СО у картофеля, включив в исследование клубненосные виды Solarium, наиболее часто вовлекаемые в селекцию картофеля.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был анализ структурного и функционального полиморфизма гомологов гена СО (CONSTANS-LIKE, COL) в серии генотипов клубненосных Solarium, различающихся по географическому происхождению, плоидности и скорости развития (включая скороспелость), и создание простых методов различения и идентификации этих гомологов.

В процессе работы предстояло решить следующие задачи:

1. Исследовать первичное строение гена COL у культурных и дикорастущих растений клубненосных форм Solarium, различающихся по фотопериодической реакции и скорости развития.

2. Провести филогенетический анализ охарактеризованных последовательностей COL у Solarium в сопоставлении с последовательностями гомологов СО у других покрытосеменных растений.

3. Определить количество копий и особенности экспрессии COL у клубненосных форм Solarium, различающихся по плоидности и фотопериодической реакции.

4. Разработать методы различения и идентификации локусов COL картофеля и его дикорастущих сородичей, пригодные для селекции с использованием молекулярных маркеров (marker-assisted selection).

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые охарактеризованы гомологи гена СО у широкого круга клубненосных форм Solarium и проведен сравнительный анализ этих генов. Впервые показано, что ген COL у растений Solarium представлен двумя формами, которые различаются строением экзона 2 и интрона 1, а также характером экспрессии и, по-видимому, представляют два локуса COL. Созданы системы SCAR и CAPS маркеров, позволяющие надежно различать и идентифицировать эти два локуса COL. Полученные результаты открывают новые возможности для сравнительных генетических и эволюционных исследований молекулярных механизмов, регулирующих переход к цветению и клубнеобразованию у картофеля и его дикорастущих сородичей. SCAR и CAPS маркеры двух локусов COL могут стать эффективным инструментом молекулярной селекции, в частности, при картировании генов COL.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гены CONSTANS-LIKE1 (COL1), охарактеризованные у картофеля и его дикорастущих сородичей, являются гомологами гена арабидопсиса CONSTANS и в генотипах Solarium представлены двумя вариантами (1СОЫ и sCOLl), являющимися локусами этого гена.

2. ICOL1 и sCOLl различаются по структуре интрона 1 и экзона 2, а также по характеру экспрессии.

3. Сконструированные на основе структурного полиморфизма COL1 генов SCAR и CAPS маркеры позволяют быстро и надежно различать и идентифицировать гены ICOL1 и sCOLl.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Дробязина, Полина Евгеньевна

ВЫВОДЫ

1. Охарактеризованы гомологи гена CONSTANS у пяти ДД и КД видов Solanum, показано, что COL1 у картофеля и его дикорастущих сородичей представлен двумя вариантами — 1СОЫ и sCOLl, которые значительно различаются по строению экзона 2 и интрона 1.

2. Показано, что оба COL1 гена обнаруживают профиль экспрессии, характерный для фотопериодической реакции, причем экспрессия двух генов по-разному реагирует на длину дня и ночи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Дробязина П.Е. и Хавкин Э.Е. Гомологи APETALA1/FRUITFUL у растений рода Solanum. Физиол. растений, 2006, 53(2): 243-249.

2. Дробязина П.Е. и Хавкин Э.Е. Структурный гомолог гена СОЖГЛА у картофеля. Физиол. растений 2006, 53(5): 786-789.

3. Drobyazina Р.Е. and Khavkin Е.Е. Structural homologs of CONSTANS and LEAFY in potato and its wild relatives. Acta Hort., 2007, 745: 411420.

4. Drobyazina P.E. and Khavkin E.E. Structural homologs of CONSTANS and LEAFY in potato and its wild relatives. Abstracts, Solanaceae VI, Madison WI, 2006, p. 214.

6. Drobyazina P. and E. Khavkin, 2008. Two CONSTANS-LIKE 1 genes in long- and short-day Solanum plants. Abstracts. XVI FESPB Congress, Tampere, Finland, 2008. Physiol. Plant, vol. 133, PI0-020.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оказалось, что, в отличие от генов CO/COL других растений, COL ген Solanum состоит из трех экзонов и двух интронов. Во всех геномах ДД и КД видов Solanum этот ген представлен двумя вариантами — ICOL1 и sCOLl. Эти варианты различаются по строению экзона 2 (прежде всего, за счет числа повторов ААС/ААТ и CAA/CAG, кодирующих гидрофильные полиаспарагиновые и полиглутаминовые мотивы) и за счет нескольких инделов в интроне 1. Анализ дигаплоидов картофеля позволил предположить, что эти варианты являются независимыми локусами, а не аллелями одного локуса COL1. У каждого индивидуального растения ICOL1 и sCOLl присутствуют одновременно. Оба COL1 гена представлены в геномах всех видов Solanum: по-видимому, дупликация гена COL1 предшествовала дивергенции исследованных видов. Соотношение ICOL1 и sCOLl в геномах растений Solanum не связано с их фотопериодической реакцией и плоидностью. Динамика и уровень экспрессии двух локусов COL1 у ДД сорта картофеля Early Rose различаются и по-разному изменяются в зависимости от длины дня. Все это позволяет считать, что растения Solanum содержат два функциональных гена — ICOL1 и sCOLl.

Поскольку уровень экспрессии sCOLl во много раз превышает уровень экспрессии 1СОЫ, именно sCOLl представляется наиболее подходящим кандидатом на роль фотопериодического регулятора цветения и клубнеобразования .

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дробязина, Полина Евгеньевна, Москва

1. Аксенова Н.П., Миляева Э.Л., Романов Г.А. (2006) Флориген обретает молекулярный облик. К 70-летию теории гормональной регуляции цветения. Физиология растений,. 53: 449-454.

2. Гуо Дж.Л., Янг К., Лианг Ф., Ванг 3. (2007) Молекулярное клонирование и экспрессия нового CONSTANS-подобного белка картофеля. Биохимия, 72: 1525-1531.

3. Константинова Т.Н., Аксенова Н.П., Голяновская С.А., Сергеева Л.И. (1999) Фотопериодическая регуляция клубнеобразования картофеля Solanum tuberosum, ssp. Andigena у растений in vivo и in vitro. Физиология растений, 46: 871-875.

4. Разумов В.И. (1931) Влияние переменной продолжительности дня на клубнеобразование. Тр. прикл. бот., генет., селекции, 27: 1-46.

5. Хавкин Э.Е. (1997) Молекулярные маркеры в растениеводстве. Сельскохозяйственная биология, № 5, 3-26.

6. Чайлахян М.Х. (1984) Фотопериодическая и гормональная регуляция клубнеобразования у растений. М.: Наука, 72 с.

7. Abe М., Kobayashi Y., Yamamoto S., Daimon Y., Yamaguchi A., Ikeda Y., Ichinoki H., Notaguchi M., Goto K., Araki T. (2005) FD, a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex. Science, 309: 1052-1056.

8. Ahearn K.P., Johnson H.A., Weigel D. Warner D.R. (2001) NFL1, a Nicotiana '-"v tabacum LEAFY-Like gene, controls meristem initiation and floral structure. Plant Cell Physiol., 42: 1130-1139.

9. Amador V., Monte E., Garcia-Martinez J.L., Prat S. (2001) Gibberellins signal. nuclear import of PHOR1, a photoperiodresponsive protein with homology to Drosophila armadillo. Cell, 106: 343-354.

10. Ausfn I., Alonso-Blanco C., Martinez-Zapater J.-M. (2005) Environmental regulation of flowering. Int. J. Dev. Biol., 49: 689-705.

11. Avivi A., Albrecht, U., Oster, H., Joel, A., Beiles, A., Nevo, E. (2001) Biological clock in total darkness: The Clock/MOP3 circadian system of the blind subterranean mole rat. PROC. NAT. ACAD. SCI. USA., 98: 13751-13756.

12. Banerjee A.K., Chatterjee M., Yu Y., Suh S.G., Miller W.A., Hannapel D.J. (2006) Dynamics of a mobile RNA of potato involved in a long-distance signaling pathway. Plant Cell, 18: 3443-3457.

13. Ben-Naim О., Eshed R., Parnis A., Teper-Bamnolker P., Shalit A., Coupland G., Samach A., Lifschitz E. (2006) The CCAAT binding factor can mediate interactions between CONSTANS-like proteins and DNA. Plant J., 46: 462476.

14. Bernier G, Perilleux C. (2005). A physiological overview of the genetics of flowering time control. Plant Biotechnol J. 3: 3-16.

15. Blazquez M.A. and Weigel D. Integration of floral inductive signals in Arabidopsis. 2000. Nature, 404: 889-892

16. Blazquez M.A., Ferrandiz C., Maduen F., Parcy F. (2006) How floral meristems are built. Plant Molecular Biology, 60: 855-870.

17. Blazquez M.A., Green R., Nilsson O., Sussman M.R., Weigel D. (1998) Gibberellins promote flowering of Arabidopsis by activating the LEAFY promoter. Plant Cell, 10: 791-800.

18. Blazquez M.A., Soowal L.N., Lee I., Weigel D. (1997). LEAFY expression and flower initiation in Arabidopsis. Development, 124: 3835-3844.

19. Bohlenius H., Huang Т., Charbonnel-Campaa L., Brunner A.M., Jansson S., Strauss S.H., Nilsson O. (2006) CO/FT regulatory module controls timing of flowering and seasonal growth cessation in trees. Science, 312: 1040-1043.

20. Borner R., Kampmann G., Chandler J., Gleissner R., Wisman E., Apel K., Melzer S. (2000). A MADS domain gene involved in the transition to flowering in Arabidopsis. Plant J., 24: 591-599.

21. Boss P.K., Bastow R.M., Mylne J.S., Dean C. (2004) Multiple pathways in the decision to flower: enabling, promoting, and resetting. Plant Cell., 16: SI 8-S31.

22. Busch M.A., Bomblies K., Weigel D. (1999) Activation of a floral homeotic gene in Arabidopsis. Science, 285: 585-587.

23. Cai X., Ballif J., Endo S., Davis E., Liang M., Chen D., DeWald D., Kreps J., Zhu Т., Wu Y. (2007) A putative CCAAT-binding transcription factor is a regulator of flowering timing in Arabidopsis. Plant Physiol., 145: 98-105.

24. Campbell B.A., Hallengren J., Hannapel D.J. (2008) Accumulation of BEL 1-like transcripts in Solanaceous species. Planta, in press.

25. Carmel-Goren L., Liu Y.S., Lifschitz E., Zamir D. (2003) The SELF-PRUNING gene family in tomato. Plant Mol. Biol., 52: 1215-1222.

26. Cerdan P.D., Chory J. (2003) Regulation of flowering time by light quality. Nature, 423:881-885.

27. Chailakhyan M.Kh. (1968) Internal factors of plant flowering. Annu. Rev. Plant Physiol., 19: 1-36.

28. Chapman H.W. (1958) Tuberization in the potato plant. Physiol. Plant., 11: 215224.

29. Chatterjee M., Banerjee A.K., Hannapel D.J. (2007) A BELLl-like gene of potato is light activated and wound inducible. Plant Physiol., 145: 1435-43.

30. Chen H., Banerjee A.K., Hannapel D.J. (2004) The tandem complex of BEL and KNOX partners is required for transcriptional repression of ga20oxl. Plant J., 38: 276-284

31. Chen H., Rosin F.M., Prat S., Hannapel D.J. (2003) Interacting transcription factors from the TALE superclass regulate tuber formation. Plant Physiol., 132: 1391-1404

32. Cheng X-F., Wang Z-Y. (2005) Overexpression of COL9, a CONSTANS-LIKE gene, delays flowering by reducing expression of CO and FT in Arabidopsis thaliana. Plant J., 43: 758-768.

33. Ciannamea S., Kaufmann K., Frau M., Tonaco I.A., Petersen K., Nielsen K.K., Angenent G.C., Immink R.G. (2006) Protein interactions of MADS box transcription factors involved in flowering in Lolium perenne. J. Exp. Bot., 57: 3419-3431.

34. Corbesier L., Coupland G. (2005) Photoperiodic flowering of Arabidopsis: integrating genetic and physiological approaches to characterization of the floral stimulus. Plant Cell Environ., 28: 54-66.

35. Doebley J.F., Gaut B.S., Smith B.D. (2006) The molecular genetics of crop domestication. Cell, 127: 1309-1321.

36. Ewing, E.E. and Struik, P.C. (1992) Tuber formation in potato: induction, initiation and growth. Hort. Rev., 14: 89-197.

37. Ewing EE, Wareing PF (1978) Shoot, stolon and tuber formation on potato (Solanum tuberosum L.) cuttings in response to photoperiod. Plant Physiol 61: 348-353

38. Farooq S., Azam F. (2002) Molecular markers in plant breeding-Ill: practical applications and difficulties encountered. Pakistan J. Biol. Sci., 5: 1148-1154.

39. Finkelstein R.R., Wang M.L., Li M., Lynch T.J., Rao S., Goodman H.M. (1998) The Arabidopsis abscisic acid response locus ABI4 encodes an APETALA2 domain protein. Plant Cell, 10: 1043-1054.

40. Frary A., Doganlar S. (2003). Comparative genetics of crop plant domestication and evolution. Turk J. Agr. For.27: 59-69.

41. Friedman M.J., Wang C.-E., Li X.-J., Li S. (2008) Polyglutamine expansion reduces the association of TBP with DNA and induces DNA binding-independent neurotoxicity. J. Biol. Chem., 283: 8283-8290.

42. Gao R., Matsuura Т., Coolbaugh M., Ztihlke C., Nakamura K., Rasmussen A., Siciliano., Ashizawa Т., Lin X. (2008) Instability of expanded CAG/CAA repeats in spinocerebellar ataxia type 17. Eur. J. Hum. Genet., 16: 215-222.

43. Gonzalez-Schain N.D., Suarez-Lopez P. (2008). CONSTANS delays flowering and affects tuber yield in potato. Biol. Plantar. 52: 251-258.

44. Gregory L.E. (1956) Some factors for tuberization in the potato plant. Am. J. Bot., 43: 281-288.

45. Griffiths S., Dunford R.P., Coupland G., Laurie D.A. (2003) The evolution of CONSTANS-Like gene families in barley, rice, and Arabidopsis. Plant Physiol., 131: 1855-1867.

46. Hamamoto H., Watanabe Y., Kamada H., Okada Y. (1997) Amino acid changes in the putative replicase of tomato mosaic tobamovirus that overcome resistance in Tm-1 tomatoio J. Gen. Virol., 78: 461-464.

47. Hannapel D.J., Chen H., Rosin F.M., Banerjee A.K., Davies P J. (2004) Molecular controls of tuberization. Am. J. Potato Res., 81: 5-16.

48. Hanzawa Y., Money Т., Bradley D. (2005) A single amino acid converts a repressor to an activator of flowering. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 102: 7748-7753.

49. Hepworth S.R., Valverde F., Ravenscroft D., Mouradov A., Coupland G. (2002) Antagonistic regulation of flowering-time gene SOC1 by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs. EMBO J., 21: 4327-4337.

50. Heyer A., Gatz C. (1992) Isolation and characterization of a cDNA clone coding for potato type A phytochrome. Plant Mol. Biol. 18: 535-543.

51. Heyer A., Gatz C. (1992) Isolation and characterization of a cDNA clone coding for potato type В phytochrome. Plant Mol. Biol., 20: 589-600.

52. Heyer A., Mozley D., Landschrutze V., Thomas В., Gatz C. (1995) Function of phytochrome A in Solanum tuberosum as revealed through the study of transgenic plants. Plant Physiol., 109: 53-61.

53. Hofer J., Turner L., Hellens R., Ambrose M., Matthews P., Michael A., Ellis N. (1997) UNIFOLIATA regulates leaf and flower morphogenesis in pea. Curr. Biol., 7: 581-587

54. Holm, M., Hardtke, C.S., Gaudet, R., Deng, X.W. (2001) Identification of a structural motif that confers specific interaction with the WD40 repeat domain of Arabidopsis COP1. EMBO J., 20: 118-127.

55. Huaman Z., Spooner D.M. (2002) Reclassification of landrace populations of cultivated potatoes {Solanum Sect. Petota). Am. J. Bot., 89: 947-965.

56. Jack T. (2004) Molecular and genetic mechanisms of floral control. Plant Cell, 16: S1-S17.

57. Jackson S, Thomas В (1997) Photoreceptors and signals in the. photoperiodic control of development. Plant Cell Environ 20: 790-795

58. Jackson S.D. Multiple signaling pathways control tuber induction in potato. Plant Physiol., 1999, 119: 1-8.

59. Jackson S.D., Heyer A., Dietze J., Prat S. (1996) Phytochrome В mediates the photoperiodic control of tuber formation in potato. Plant J., 9: 159-166.

60. Kang S.G., Hannapel D.J. (1995) Nucleotide sequences of novel potato (Solanum tuberosum L.) MADS-box cDNAs and their expression in vegetative organs. Gene. 166: 329-330.

61. Kang S.G., Hannapel D.J., Suh S.G. (2003) Potato MADS-box gene POTM1-1 transcripts are temporally and spatially distributed in floral organs and vegetative meristems. Mol Cells, 15: 48-54.

62. Kardailsky I., Shukla V.K., Ahn J.H., Dagenais N., Christensen S.K., Nguyen J.T., Chory J., Harrison, M.J., Weigel, D. (1999) Activation tagging of the floral inducer FT. Science, 286: 1962-1965.

63. Kobayashi Y., Kaya H., Goto K., Iwabuchi M., Araki, T. (1999). A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals. Science, 286: 1960-1962.

64. Kobayashi Y., Weigel D. (2007) Move on up, it's time for change—mobile signals controlling photoperiod-dependent flowering. Genes Devel., 21: 2371—2384.

65. Koehl P. and Levitt M. (1999) Structure-based conformational preferences of amino acids. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96: 12524-12529.

66. Kojima S., Takahashi Y., Kobayashi Y., Monna L. Sasaki Т., Araki Т., Yano M. (2002) Hd3a, a rice ortholog of the Arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hdl under short-day conditions. Plant Cell Physiol., 43: 1096-1105.

67. Koornneef M., Hanhart C.J., Van der Veen J.H. (1991) A genetic and physiological analysis of late flowering mutants in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 229: 57-66.

68. Koornneef M., Alonso-Blanco C., Blankestijn-de Vries IT., Hanhart C.J., Peeters A.J.M. (1998) Genetic interactions among late-flowering mutants of Arabidopsis. Genetics, 148: 885-892.

69. Krizek B.A. and Fletcher J.C. (2005) Molecular mechanisms of flower development: an armchair guide. Nature Rev. Genet. 6: 688-698

70. Machackova I., Konstantinova T.N., Sergeeva L.I., Lozhnikova V.N., Golyanovskaya S.A., Dudko N.D., Eder J., Aksenova N.P. (1998) Photoperiodic control of growth, development and phytohormone balance in Solanum tuberosum. Physiol. Plant. 102: 272-278.

71. Martmez-Garcia J.F., Virgo's-Soler A., Prat S. (2002) Control of photoperiodregulated tuberization in potato by the Arabidopsis flowering-time gene CONSTANS. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99: 15211-16

72. Mas P. (2005) Circadian clock signaling in Arabidopsis thaliana\ from gene expression to physiology and development. Int. J. Dev. Biol., 49: 491-500.

73. Matsumura H., Liu В., Abe J., Takahashi R. (2008) AFLP Mapping of soybean maturity genqE4. J. Hered., 99: 193-197.

74. Michael T.P., Park S., Kim T.-S., Booth J., Byer A., Sun Q., Chory J., Lee K. (2007) Simple sequence repeats provide a substrate for phenotypic variation in the Neurospora crassa circadian clock. PLoS ONE 2: e795.

75. Michaels S. D., Bezerra I. C., Amasino R. M. (2004) FRIGIDA-related genes are required for the winter-annual habit in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 101:3281-3285.

76. Michaels S.D., Amasino R.M. (1999) FLOWERING LOCUS С encodes a novel MADS domain protein that acts as a repressor of flowering. Plant Cell, 11: 949-956.

77. Michaels S.D., Amasino R.M. (1999) The gibberellic acid biosynthesis mutant gal-3 of Arabidopsis thaliana is responsive to vernalization. Dev. Genet., 25: 194198.

78. Michaels S.D., Amasino R.M. (2000) Memories of winter: vernalization and the competence to flower. Plant, Cell and Environment, 23: 1145-1153.

79. Michaels S.D. and Amasino R.M. (2001) Loss of FLOWERING LOCUS С activity eliminates the late-flowering phenotype of FRIGIDA and autonomous pathway mutations but not responsiveness to vernalization. Plant Cell, 13: 935-941.

80. Millar A.J. (2003) A suite of photoreceptors entrains the plant circadian clock. J. Biol. Rhythms, 18: 217-226.

81. Miller T.A., Muslin E.H., Dorweiler J.E. (2008) A maize CONSTANS-Like gene, conzl, exhibits distinct diurnal expression patterns in varied photoperiods. Planta, 227: 1377-1388.

82. Molinero-Rosales N., Jamilena M., Zurita S., Gomez P., Capel J., Lozano R. (1999) FALSIFLORA, the tomato orthologue of FLORICA ULA and LEAFY, controls flowering time and floral meristem identity. Plant J., 20:685-693.

83. Mouradov A., Cremer F., Coupland G. (2002) control of flowering time: interacting pathways as a basis for diversity. The Plant Cell, SI 11-S130.

84. Nemoto Y., Kisaka M., Fuse Т., Yano M., Ogihara Y. (2003) Characterization and functional analysis of three wheat genes with homology to the CONSTANS flowering time gene in transgenic rice. Plant J. 2003, 36: 82-93.

85. Noh Y.S., Amasino R.M. (2003) PIE1, an ISWI family gene, is required for FLC activation and floral repression in Arabidopsis. Plant Cell, 15: 1671-1682.

86. O'Malley K.G., Banks M.A. (2008) Duplicated Clock genes with unique polyglutamine domains provide evidence for nonhomologous recombination in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha). Genetica, 132: 87-94.

87. Parcy F. (2005) Flowering: a time for integration. Int. J. Dev. Biol., 49: 585-593.

88. Park D.H., Somers D.E., Kim Y.S., Choy Y.H., Lim H.K., Soh M.S., Kim H.J., Kay S.A., Nam H.G. (1999) Control of circadian rhythms and photoperiodic flowering by the Arabidopsis GIGANTEA gene. Science, 285: 1579-82.

89. Poduska В., Humphrey Т., Redweik A., Grbic V. (2003) The synergistic activation of FLOWERING LOCUS С by FRIGIDA and a new flowering gene AERIAL ROSETTE 1 underlies a novel morphology in Arabidopsis. Genetics, 163: 1457-1465.

90. Putterill J., Laurie R., Macknight R. (2004) It's time to flower: the genetic control of flowering time. BioEssays, 26: 363-373.

91. Putterill J., Robson F., Lee K., Simon R., Coupland G. (1995) The CONSTANS gene of Arabidopsis promotes flowering and encodes a protein showing similarities to zinc finger transcription factors. Cell, 80: 847-858.

92. Redei. G.P. (1962) Supervital mutants of Arabidopsis. Genetics, 47: 443-460.

93. Riechmann J.L, Krizek B.A, Meyerowitz E.M. (1996) Dimerization specificity of Arabidopsis MADS domain homeotic proteins APETALA1, APETALA3, PISTILLATA, and AGAMOUS. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93: 4793-4798.

94. Roden L.C., Song H.R., Jackson S., Morris K., Carre I.A. (2002) Floral responses to photoperiod are correlated with the timing of rhythmic expression relative to dawn and dusk in Arabidopsis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 99: 13313-13318.

95. Rodriguez-Falcon M., Bou J., Prat S. (2006) Seasonal control of tuberization in potato: conserved elements with the flowering response. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 151-180.

96. Rosin F.M., Hart J.K., Van Onckelen H., Hannapel D.J. (2003) Suppression of a vegetative MADS box gene of potato activates axillary meristem development. Plant Physiol. 131: 1613-1622.

97. Ross-Ibarra, J., Morrell, P.L., Gaut, B.S., 2007. Plant domestication, к unique opportunity to identify the genetic basis of adaptation. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 104: 8641-8648.

98. Sablowski R. (2007) Flowering and determinacy in Arabidopsis. J. Exp. Bot., 58: 899-907.

99. Saitou N., Nei M. (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstruction of phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol., 4: 406-425.

100. Salom6 P. A., McClung C. R. (2005) What makes the Arabidopsis clock tick on time? Plant, Cell Environ., 28: 21-38.

101. Samach A., Onouchi H., Gold S.E., Ditta G.S., Schwarz-Sommer Z., Yanofsky M.F., Coupland G. (2000) Distinct roles of CONSTANS target genes in reproductive development in Arabidopsis. Science, 288: 1613—1616.

102. Sandelin E. (2004) On hydrophobicity and conformational specificity in proteins. Biophys. J., 86: 23-30.

103. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467.

104. Sarkar D. (2008) The signal transduction pathways controlling inplanta tuberization in potato: an emerging synthesis. Plant Cell Rep. 27: 1-8.

105. Sawa M., Nusinow D.A., Kay S.A., Imaizumi T. (2007) FKF1 and GIGANTEA complex formation is required for day-length measurement in Arabidopsis. Science, 318:261-65.

106. Shavorskaya O., Lagercrantz U. (2006) Sequence divergence at the putative flowering time locus COL1 in Brassicaceae. Mol. Phyl. Evol., 39: 846-854.

107. Sheldon C.C., Conn A.B., Dennis E.S., Peacock W.J. (2002) Different regulatory regions are required for the vernalization-induced repression of FLOWERING LOCUS С and for the epigenetic maintenance of repression. Plant Cell, 14: 2527-2537.

108. Simon P. (2003) Q-Gene: processing quantitative real-time RT-PCR data. Bioinformatics, 19: 1439-1440.

109. Spooner D., van Treuren R., de Vicente M.C. (2005) Molecular markers for genebanlc management. IPGRI Technical bulletin № 10. International Plant Genetic Resources Institute, Rome, Italy.

110. Sridhar V.V., Surendraraom A., Liu Z. (2006) APETALA1 and SEPALLATA3 interact with SEUSS to mediate transcription repression during flower development. Development, 133: 3159-3166.

111. Suarez-Lopez P., Wheatley K., Robson F., Onouchi H., Valverde F., Coupland G. (2001) CONSTANS mediates between the circadian clock and the control of flowering in Arabidopsis. Nature, 410: 1116-1120.

112. Sung S. and Amasino R.M. (2004) Vernalization in Arabidopsis thaliana is mediated by the PHD finger protein VIN3. Nature, 427: 159-164.

113. Tajima Т., Oda A., Nakagawa M., Kamada H., Mizoguchi T. (2007) Natural variation of polyglutamine repeats of a circadian clock gene ELF3 in Arabidopsis. Plant Biotechnology, 24:237-240.

114. Takada S., Goto K. (2003) TERMINAL FLOWER2, an Arabidopsis homolog of heterochromatin proteinl, counteracts the activation of FLOWERING LOCUS Г by CONSTANS in the vascular tissues of leaves to regulate flowering time. Plant Cell, 15:2856-2865.

115. Tamaki S., Matsuo S., Wong H.L., Yokoi S., Shimamoto K. (2007) Hd3a protein is a mobile flowering signal in rice. Science, 316(5827):1033-1036.

116. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol., 24: 15961599.

117. Titz B, Thomas S., Rajagopala S.V., Chiba Т., Ito Т., Uetz P. (2006) Transcriptional activators in yeast. Nucleic Acids Res., 34: 955-967.

118. Turck F., Fornara F., Coupland G. (2008) Regulation and identity of florigen: FLOWERING LOCUS T moves center stage. Annu. Rev. Plant Biol. 59: 573594.

119. Valverde F., Mouradov A., Soppe W., Ravenscroft D., Samach A., Coupland G. (2004) Photoreceptor regulation of CONSTANS protein in photoperiodic flowering. Science, 303: 1003-1006.

120. Van de Peer Y, De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput. Appl. Biosci., 10(5): 569-570.

121. Wang В., Lin D., Li C., Tucker P. (2003) Multiple domains define the expression and regulatory properties of Foxpl forkhead transcriptional repressors. J. Biol. Chem., 278: 24259-24268.

122. Weigel D., Alvarez J., Smyth D.R., Yanofsky M.F., Meyerowitz E.M. (1992) LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis. Cell, 69: 843-859.

123. Wenkel S., Turck F., Singer K., Gissot L., Le Gourrierec J., Samach A., Coupland G. (2006) CONSTANS and the CCAAT box binding complex share a functionally important domain and interact to regulate flowering of Arabidopsis. Plant Cell, 18: 2971-2984.

124. Wigge P.A., Kim M.C., Jaeger K.E., Busch W., Schmid M., Lohmann J.U., Weigel D. (2005) Integration of spatial and temporal information during floral induction in Arabidopsis. Science, 309: 1056-1059.

125. Wilson R.N., Heckman J.W., Somerville C.R. (1992) Gibberellin is required for flowering in Arabidopsis thaliana under short days. Plant Physiol., 100: 403408.

126. Yanovsky M.J., Izaguirre M., Wagmaister J.A., Gatz C., Jackson S.D., et al. (2000) Phytochrome A resets the circadian clock and delays tuber formation under long days in potato. Plant J., 23: 223-232.

127. Yanovsky MJ, Kay SA. 2002. Molecular basis of seasonal time measurement in Arabidopsis. Nature 419: 308-312.

128. Yun Z., Sun X.-D., Ni M. (2007) Timing of photoperiodic flowering: light perception and circadian clock, journal of integrative. Plant Biol., 49(1): 2834.

129. Автор выражает искреннюю признательность Галине Викторовне Новиковой (ИФР) и Нелле Леопольдовне Клячко (ИФР) за конструктивные замечания при обсуждении результатов данного исследования.

Информация о работе

Дробязина, Полина Евгеньевна
кандидата биологических наук
Москва, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Изучение полиморфизма гена фотопериодической регуляции цветения и клубнеобразования CONSTANS у растений Solanum - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы