Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей выявления ортофосфатов в нервных структурах головного и спинного мозга у некоторых представителей млекопитающих

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей выявления ортофосфатов в нервных структурах головного и спинного мозга у некоторых представителей млекопитающих"

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЕНИИ. ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ им.АКАД.Л.А.ОРЕШ!

ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ВЫЯВЛЕНИЯ ОРТЮОСФАТСВ В НЕРВНЫХ СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО И СПИННОГО МОЗГА 7 НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕ?. ШКОПИТАЩХ.

03.00.13 - физиология человека и зжвотных 03.00.11 - эмбриология,гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

КЕЛИКСЕТЯН ИРИНА ЕЕНИКСВНА

УЖ 576.04.661.718.1.599

-АКАДЕМИЯ НАУК АРКЕНКИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ км.АКАДЛ.А.ОРЕШ

На правах рукописи

ЫЕЛККСЕТНН ИРИНА ЕЕНИКОВНА

УЖ 576.04.661.718.1.599

ИЗУЧЕНИЕ оссбеннсстз;! выявления ортюсхйатсв Б НЕРВНЫХ СТРУКТУРАХ Г0Л03Н0Г0 к спинного МОЗГА У НЕКОТОРЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕ?. КЛЕКОПИТАЩГХ.

03.00.13 - физиология человека и .^квоишх

'03.00.11 - эмбриология,гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Работа выполнена в Институте физиологии км.Л.А.Орбели АН Армении.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор А.Т.;.Чклингарян

Официальные оппонента: заслуженный деятель науки

Армянской ССР, доктор ветеринарных наук, профессор

I*

К.В.Кадилов кандидат медицинсгаос наук Т.С.Аглиниян

Ведущая организация - Ереванский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет /V

_ Л^цита диссертации состоится * »¿'с " ь¿й^/Р/"?*-';'1991 г. в Ш " часов на заседании специализированного совета по физиологии человека и животных (Д 005.09.01) при Институте физиологии им.Л.А.Орбели АН Армении (375028, Ереван, ул.Брагьев Орбали, 22).

С диссертацией можно ознакомиться в бибшшотеке Института физиологии им Л.А.Орбелк АН Армении.

Автореферат разослан "

Ученый секретарь специализированного совета, ^—

кандидат медищнских наук ¿Оа^К.Г.Багдасарян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Согласно данным современной биохимии, досфорсодернасие соединения занимают одно из ведущих мест в обменных процессах жизнедеятельности клеток, тканей и органов. 3 противоположность этому, изучение фосфорсодержащих соединений остается и в настоящее время как одна из слабо разработанных глав современной ш:то- и гистохимии. Имеющиеся в иностранной литературе в этот.; направлении единичные исследования С ТапсПег, 1956; 1957; 1958; 1960; 1961; 1969;На1ЪЬиЬег еЬ а1„1970; 1971; 1972) не смогли продемонстрировать значение изучения фосфора как в цитологическом, так и морфологическом аспектах. Фактически, в этих исследованиях речь идет о возможности выявления ор-тофосфатов в ядрышках растительных и цитоплазме животных клеток (кукуруза, лук, печень белых крыс).

Ыежду тем, Чилингаряиом еше в 1954 году было показано, что выявление фосфора свинцом в ганглиях вегетативной нервной системы позволяет получить богатуя морфологическую картину, мало уступающую картине, полученной с помощью специальных нейрогистоло-гических методов исследования. Данный тест был использован в ряде диссертационных работ, вышедших из лаборатории И.Ф.Иванова (Евсеева, 1956; Цзрэв, 1956; Сушкоз, 1958; Петропавловская,1961).

Осаждение фосфора является сложным процессом и зависит не только от наличия фосфора и свинца, но и ряда других факторов, 'которые нашли свое выражение в сформулированной Чилингаряиом (1965; 1968) закономерности концентрационного взаимоотношения. Кроме того, била установлена танке закономерность последовательного выявления структур при заданном значении рН инкубационной смеси.

Данные, полученные в лаборатории гистохимии и нейроморфоло-гии Института физиологии им .Л .А.Орбели АН Армении за последние десятилетия, свидетельствуют о перспективности выявления клеточного фосфора не только в гистохимическом, но и морфологическом аспектах. Установление этих закономерностей позволило приступить к программному изучению фосфора в клеточных структурах и разработать новые ыорфологЕческие и гистохимические методы, с помощь» которых проводились исследования по изучению нервной и сосудис-

той систем (Паравяк, 1966; Сисакян, 1969; Мартиросян, 1975). Используя свинцовый метод Чклингаряна, Евсеевой (1956) и Аг-линцян (1972), было показано, что с помощью такого подхода можно получить не только богатые в морфологическом отношении результаты» Проведенные ими экспериментальные исследования свидетельствуют, что данный метод обладает довольно высокой чувствительностью и в состоянии улавливать изменения, мало доступные для большинства морфологических и гистохимических методов исследования.

При гистохимическом выявлении многих неспецифических фос-фатаз, где захватывающим агентом энзиматической реакции является ионы металлов, многие вопросы, касавшиеся метаболизма фосфора,в настояшее время остаются малопонятными и труднообъяснимыми, хотя по выявлению этих ферментов накопилось огромное количество исследований. Чилингаряном (1967; 1968) бьгло показано, что освобожденные под действием фермента фосфаты осаздаются в клеточных структурах также согласно закономерности концентрационного взаимоотношения.

Использование этих закономерностей могло бы служить основой в разработке не только гистохимических, но и отдельных морфологических методов, предназначенных для изучения многих клеточных структур нейтральной нервной си стыды ( перикариоки, отростки, осевые цилиндры нервных волокон), которые на светоопти-ческоы уровне возможно изучить только стпшальними нейрогисто-логпческкми методами (серебряная импрегнация, капризность и до-роговизпость которой общеизвестна).

Цель и задачи исследования. При выявлении ортофосайтов в нервных структурах мозга разных видов животных, особенно демонстрационными оказались в морфологическом отношении исследования, проведенные на кусочках свежей ткани (Чилингарян, 1903; 1968; Паравян, 1966; 1973), в результате которых преципитация продукта реакции происходила в различных клеточных структурах: на стенках капилляров и сосудов, в глиалышх и нервных клетках, осевых шишндрах нервных волокон, ядрах глиальних клеток. При этом особый интерес представляет выявление перикарионов, ден-дритов н шишков нервных клеток.

Однако на кусочках свежей ткани преципитация продукта реакции происходила лишь на поверхностных участках, на небольшой глубине (500-700 мил), и результат в определенной степени напоминал картину, полученную общеизвестным методом Гольджи. 3 более глубоких слоях окраска структур отсутствовала и лишь местами была заметна черная бесструктурная зернистость. Следовательно, применить эти методические приемы в экспериментальных исследованиях было крайне затруднено. В отличие от нейронов вегетативной нервной системы (Чилингарян, 1368), где удалось получить постоянные и воспрокзводршке результаты, на срезах фиксированного материала реакция нервных клеток различных отделов мозга носила резко непостоянный характер, а часто и отсутствовала.

Учитывая важность выявления ортофосфатов в нервных структурах центральной нервной системы, в настоящем исследовании были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить влияние различных фиксирующих смесей и обработок, препятствующих растворению ортофосфатов в клеточных структурах до проведения реакции. Иными словами, добиться стабилизации фосфора в клеточных структурах.

2. Создать наиболее оптимальные условия, обеспечивающие получение четких, а самое главное, воспроизводимых результатов по выявлению нервных клеток на срезах фиксированного материала различных отделов головного и спинного мозга.

3. Как известно, многие гистохимические методы выявления активности кислой фосфатазы основаны на применении соединений ионов свинца, которые связываются с фосфатом, освобовденным под действием фермента. При выявлении ортофосфатов ионы свинца также связываются с тканевым неорганическим фосфором, поэтому неудивительно, что преципитация свинна в обоих случаях происходит по одному и тому же принципу. В силу этого особый интерес представляли исследования по выявлению активности кислой фосфатазы с использованием закономерности концентрационного, взаимоотношения.

Научная новизна. Впервые показана возможность постоянного и воспроизводимого выявления клеточных ортофосфатов на срезах фиксированного материала мозга некоторых цлекопитакзх.

Установлено, что нейроны различных отделов коз га по своим условиям преципитации продукта реакции существенно, отличаются. Выявлены значительные отличия в рсационноспособноси; нервных клеток не только разных формаций мозга; но и нейронов, входящих в состав одно!") и той же ядерной группы, что по всей вероятности, обусловливается различием в их функциональном состоянии. Впервые показано, что выявление ортососфатов на срезах фиксированного материала мозга сопровождается получение!.: богатой морфологической картщн, при которой на неокрашенном фоне препарата обеспечивается избирательное выявление перккарионов и отростков нервных клеток.

Полученные нага: данные свидетельствуют, что при выявлении активности кислой фосфгтазы, ортсфосфорная кислота, расщепленная под действием фермента, также осзтдостся в неточных структурах мозга согласно закономерности конце нтрашоннсю взаимоотношения.

Научно-практическое значение работы. Выявление ортофосЛз-тов может иметь ваяшое значение, как метод при решении задач морфологиейского характера, а такке при решении ряда вопросов в области ци?о- и гистохимии.

Полученные данные свидетельствуют в пользу того обстоятельства, что разработанные методические подходы могут быть использованы и в экспериментальных исследованиях при выяснении ряда вопросов морфофункцконального характера, связанных с изучением центральной нервной системы.

Поскольку образованный в клеточных структурах преципитат свинца является электронноплотным (Гайер, 1974), то не и с ¡охоче на возможность использования предложенных тестов в ультраструктурных и ультрацитохимических исследованиях.

Выявление активности кислой фосфатазы с учетом закономерности концентрационного взаимоотношения позволяет предложить ряд новых подходов для выявления перикарионоз и отростков клеток разных формаций мозга.

Апробация работе. Материалы диссертации доложены на:

- ЗУ Закавказской конференции морфологов, Батуми, 1905;

- У1 Всесоюзной конференции по физиологии вегетативной

нервной системы, Ереван, I98S;

- У конференции молодых физиологов Закавказья, Баку,1986;

- 17 съезде Армянского физиологического общества, Ереван,

1287;

- 24 заседании Армянского общества анатомов, гистологов, эмбриологов, Ереван, 1988;

- У1 симпозиуме по проблеме "Структурная и функциональная организация мозжечка", Ереван, 1988.

Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 7 научных работах.

Объем к структура диссертации. Диссертация изложена на 170 страницах машинописи. Состоит из введения, обзора литературы (глава I), методики исследования (глава 2), экспериментальных данных (главы 3-5), обсуздения полученных результатов, выводов и списка литературы ( 83 работ отечественных и 125 зарубежных авторов). Диссертация иллюстрирована 60 рисунками и одной таблицей.

штсет исследования.

Объектом исследования служили некоторые виды животных из класса млекопитающих: кошки - 72; кролики - 34; крысы - 45. Изучались разные отделы мозга: кора больших полушарий, мозжечок, средний мозг, варолиев мост, продолговатый мозг, спинной мозг.

После легкого нембуталового наркоза животные декапитирова-лись, по возможности быстро извлекались соответствующие отделы мозга, которые разрезались острым лезвием на кусачки, толщиной 3-5 мм и, согласно требованиям дальнейшей обработки, помещались в соответствующие фиксирующие смеси. Для стабилизации фосфора в клеточных структурах наш применялись различные фиксаторы, среди которых для наших целей наиболее удобными оказались - 5%, 10% нейтральный формалин и формалин-келыиевый фиксатор (10$ раствор хлористого кальикя и Ъ% нейтральный формалин в соотношении 1:9). Фиксацию проводили на холода при 4°С. Материал изучался в разные сроки фиксации: 24-48 часов; 5-10

дней; 30 дней; 2-2,5 месяца. Готовились замороженные срезы толщиной 20-60 шш, которые собирались в различные растворы. Для наших целей применялись физиологический раствор, дистиллированная вода, 3% раствор хлористого кельция, 70° адатон. Срезы оставались в этих растворах от 30 минут до 3-х часов. Обработанные срезы переносились в соответствующие инкубационные смеси.

Использовались следующие методы исследования:

1."Выявление ортофосфатав в нервных структурах на срезах фиксированного материала по схеме Чилингаряна (1968). Срезы переносились в свинцовые растворы разного состава. В наших исследованиях применялись умеренные концентрации свинш, т.е. 0,01 Ы/0,38^/ раствор уксуснокислого свинца, приготовленный

на освобожденной от COg дистиллированной воде, к которому добавлялся I М ацетатный.буфер с разными значениями рН: 4,4; 4,7; 5,0; 5,6; 5,9; 6.2. В инкубационных смесях количество свинш оставалось неизменным, менялось только количество буфера. Во всех случаях к 100 мл 0,38? раствора уксуснокислого свинца добавлялось разное количество буфера от 2 до 60 мл (с интервалом 3-5 мл). Срезы в этих смесях оставались от 3 до 15 дней при 37°С. Далее промывались в дистиллированной вода к проявлялись в 0,5-1% растворе сернистого натрия. Затем срезы промывались несколько минут в дистиллированной воде, после чего заключались в глкцерин-яелатан.

2. Гистохимическое выявление ортофосфатов на срезах фиксированного материала с применением пониженных концентраций свинца. Срезы, полученные после формол-кальцкевой фиксации, тщательно промывались в 3% растворе хлористого кальция, обрабатывались 30 мен в 70°адатоне, снова трехсиенно промывались в кальциевом растворе 30 мин и переносились в заранее приготовленные свинцовые смеси, где учитывалась закономерность концентрационного взаимоотношения. В этой серии исследований стандартным являлся О,ОСЕ М раствор уксуснокислого сан ¡аз (20 мл 0,38$ раствор уксуснокислого свинца в 100 мл инкубационной смеси). Использовался I М ацетатный буфер рН 5,8 с количеством от I до 30 мл с интервалом 3-5 ш. Срезы инкубировались при 37°С от I до 10

дней, затем промывались в физиологическом растворе, проявлялись в 0,5-1$ растворе сернистого натрия, повторно промывались в физиологическом растворе и заключались в глицерин-желатин.

3. Выявление активности кислой фосфэтазы производилось

не формалинфиксированном материале по методу Гоморя в прописи Вольфа, Кабата, Ньюмана (1943).

4. Определение активности кислой фоафатазы с учетом закономерности концентрационного взаимоотношения по Чилингаряну (1965; 1968). Исследования производились на формалинфиксирован-ном материале при разных значениях рН среды, однако в работе цитируются только данные, полученные при рН 4,7, как оптимуме действия кислой фосфатазы, при рН 5,6 и 5,9 - как наиболее высокие значения, использованные нами при выявлении ортофос-фатов в структурах мозга. Вместо азотнокислого свинца в наших исследованиях мы применяли уксуснокислый свинец, концентрация которого равнялась 0,01 1.1. Количество буфера варьировалось от

5 до 40 мл с интервалом 5 мл, а количество 2% глицерофосфата -от 2 до 20 мл. Срез и инкубировались от I до 5 часов при 37°С. Наилучшие результата были получены после 2-3 часовой инкубации. Дальнейпая обработка производилась по вышеописанному способу.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ 0БСУ7ДЕНИЕ

I. Гистохимическое выявление ортофоофатов в клеточных структурах центральной нервной системы на срезах фиксированного материала.

При выявлении ортофосфатов в клеточных структурах мозга на срезах фиксированного материала установлено, что образование осадка сульфида свинца происходит в различных клеточетх структурах, причем, в зависимости от количества буфера в смеси, на-блщаптся качественные изменения в его локализации.

При рН 4,4 с 2 мл буфера в смеси осадок образуется в ядрах глпальних меток и на стенках единичных отрывчатых капилляров. С 5 мл буфера образование осадка наблюдается только в ядрах глиальних клеток. При дальне?.сек увеличении количества буфера

ядерная окраска ослабевает, и осадок образуется в нервных волокнах. С 10 мл буфера местами заметны слабые контуры нервных клеток. Количество буфера 15-20 мл снимает окраску всех структур.

При рН 4,7 с 2-5 мл буфера в смеси осадок сульфида свинш образуется на стенках капилляров и в единичных ядрах глпалькых клеток, а с 10 мл буфера реагируют только ядра глиальных клеток. При увеличении количества буфера до 15 мл окраска ядер глиалькых клеток становится неравномерной, и осадок наблюдает-ч ся в осевых цилиндрах нервных волокон. С 20 мл буфера на срезах реагируют только нервные клетки. При дальнейшем увеличении количества буфера окраска нервных клеток становится неравномерной и с 30 мл буфера структурное окрашивание не происходит.

При рН 5,0 с 2 мл буфера в смеси наблюдается умеренная окраска стенки капилляров. С 10 мл буфера осадок образуется в адрах глиалышх клеток, а с 15-20 мл буфера ядерная окраска постепенно ослабевает и начинают реагировать нервные волокна. Образование осадка в нервных клетках наблюдается с 25-30 мл буфера в смеси. При дальнейшем увеличении количества буфера осаждение сульфида свинца в структурах не происходит.

При рН 5,6 с 2 мл буфера осадок образуется на стенках капилляров и единичных сосудов, а с 10-15 мл буфера - в ядрах глиалышх клеток. С 20-25 мл буфера в смеси реакция ядер гли-альных клеток становится неравномерной, и начинают реагировать нервные волокна. Избирательное выявление нервных клеток происходит при количестве буфера 35-40 мл. При дальнейшем увеличении количества буфера наблюдается неравномерная реакция нервных клеток,и с 50 т буфера образование осадка не происходит ей в одной из перечисленных структур.

При рН 5,9 с 2-5 мл буфера в смеси осадок наблюдается на стенках капилляров к сосудов среднего калибра, окраска которых становится неравномерной с 10-15 мл буфера. Одновременно образование осадка происходит в ядрах глиалышх клеток, избирательная окраска которых наблюдается с 30 мл буфера в смеси. С 35 мл буфера начинают реагировать нервные волокна и единичные нервные клетки. Избирательное выявление нервных клеток происходит с ко-

личеством буфера 40-45 мл. С 55 мл буфера в смеси образование осадка в нервных структурах не происходи!!.

При pH 6,2 с 5 мл буфера в смеси наблюдается избирательное выявление сосудисто-капиллярной сети. При увеличении количества буфера до 10-15 г.лл реакция капилляров и сосудов становится неравномерной и начинают реагировать ядра глиальных клеток. При дальнейшем увеличении количества буфера образование осадка ка стенках капилляров и сосудов ке происходит, и с количеством буфера 25-35 мл на срезах реагируют только ядра глг.альных клеток. С 40 мл буфера в смеси образование осадка наблюдается в нервных волокнах, а с 50 мл - в нервных клетках. При увеличении количества буфера до 60 мл образование осадка на структурах яе происходит.

Кз всего изложенного становится ясно, что оптимальные пики осадденкя ортофосфатов в различных клеточных структурах резко отличаются. То есть, в тех условиях, когда образование осадка избирательно наблюдается в нервных клетках, в других структурах осаэдение осадка не происходит. Следовательно, для избирательного выявления нервных клеток необходимо такое концентрационное соотношение буфера с ионами свинца, которое является наиболее оптимальным пиком для образования осадка только в нервных клетках в пределах заданного значения pH среды. Образованно осадка в разных структурах на срезах фиксированного материала схематично происходит следующим образом: капилляры-ядра глиалькых клеток-» осевые цилиндры нервных волокон —• нервные клетки. Становится ясно, что здесь действует закономерность концентрационного взаимоотношения, т.е., если при pH 5,9 осадок образуется на стенках капилляров, значит в смеси использовано мигимолыюе количество буфера, и другие структуру не реагируют, для образования осадка в нервных клетках-требуется увеличение количества буфера до того предела, который соответствует пи-— осаэдхения ортофосфатов в этих структурах. Последовательное образование осадка в клеточных структурах наблюдается нами при гистохимическом выявлении ортофосфатов на срезах фиксированного материала мозга кошек, кроликов, крыс. Однако следует отметать, что у кроликов пси пиках осаядения продуктов реакции на

стенках капилляров к сосудов окраска последних или не происходит или заметны единичные отрывчатые капилляры. Иногда осадок на стенках капилляров наблюдается при нейроклеточном пике реакции.

У кошек на срезах кори больших полушарий реакция нервных клеток отличается непостоянством и выявляются лишь мелкие клетки верхних слоев и единичные пирамидные клетки средней величп~: ны. Слой глубоких пирамид не окрашивается. В ыозкечке четко реагируют перккарионы и короткие отростки клеток собственных ядер, а тел» клеток Пуркинье окрашиваются слабо. Иногда образование осадка происходит в телах и длинных отростках крупных клеток Гольджи. На срезах среднего мозга равномерно реагируют перикарионк к короткие отростки клеток ядра глазодвигательного нерва и крупных нейронов красного ядра. Выявляются также перикарконы и короткие дендриты мелких клеток серого вешества, окружающего Сильвиев водопровод. Ка срезах продолговатого мозга и варолиева моста особенно четкой реакцией отличаются крупные нейроны ретикулярной форшшш с интенсивной окраской пери-карионов и длинных отростков. Довольно постоянно реагируют нейроны ядра лицевого, подъязычного и блузда-ошего нервов. На срезах спинного мозга реагируют только яерикарионы и длинные отростки мотонейронов.

В отличие от кошек, у кроликов в коре больших полушарий окрашиваются клетки всех слоев, но иногда реакция носит несколько неравномерный характер. В мозжечке реагируют тела клеток Пуркинье с коротким основным дендритом, а так>:.е перккарионы и отростки клеток собственных ядер. Особых отличий в реакции нервнах клеток на срезах среднего мозга у кроликов и кошек не наблюдается. На срезах продолговатого мозга и варолиева моста четко реагирую? нейроны большинства ядерных групп, причем в ыетамерных ядрах наблюдается сходство в реакции различных типов нейронов. На срезах спинного мозга постоянно реагируют перикарионы и длинные отростки мотоне¡"фонов, а также перикарионы и короткие отростки клеток заднего и бокового рогов серого вешества.

Как показали проведенные исследования, в отличие от кошек

и кроликов, ка срезах мозга крыс в аналогичных условиях осаждение ортофосфатов в нейронах большинства отделов мозга происходит крайне неравномерно. Исключение составляет кора больших полушарий, где видны тела и короткие отростки нейронов. На срезах среднего мозга окрашиваются тела чувствительных клеток тройничного нерва.

Существенно отличаются также и оптимальные пики осаждения ортофоофатов в нейронах различных отделов мозга у разных млекопитающих. Так, у кошек основная масса нейронов ствола и спинного мозга реагирует при рН 5,9 - с 40 мл, а корковые нейроны окрашиваются с 50 мл буфера в смеси, в то время как нейроны молекулярного слоя и нейроны собственных ядер мозжечка по своей реактивности близко стоят к стеоловым нейронам.

Условия осаждения продукта реакции в корковых нейронах у кроликов, крыс сходны с условиями осаждения в нейронах ядер ствола мозга.

Говоря о скорости образования осадка в нервных клетках, необходимо отметить, что реакция идет медленно и, как это имеет место при других свинцовых методах, первые три дня можно считать латентным периодом, при котором реакция почти полностью отсутствует. С 4-го дня начинается отложение осадка, достигающее максимума на 10-15-й день инкубации. При этих сроках иногда наблюдается наличие осадка и в ядрах нейронов, большей частью отсутствующего при 5-7-дневной инкубации.

Длительная фиксация приводит к четкому выявлению осевых цилиндров нервных волокон и ухудшению реакции других структур.

Полученные нами данные позволяют заключить, что формалиновая фиксация мозга не во всех случаях обеспечивает четкую и постоянную реакцию нейронов различных отделов мозга некоторых ?/лекопитающкх. Как показали проведенные нами исследования, более четкая и равномерная реакция нейронов наблюдается при использовании формалин-кальпиевой фиксации, которая, по всей вероятности, в значительной степени стабилизирует тканевые ор-тофосфаты, уменьшает их потери во время фиксации и других обработок. Особенно это наглядно было видно в последующей серии наших исследований.

2. Улучиенный вариант гистохимического выявления ортойоссватов в клеточных структурах центральной нервной системы на срезах Фиксированного материала.

Полученные данные показывают, что при фэрмалин-кальше-вой фиксации кусочков, обработкой срезов в ацетоне и использованием пониженных концентраций свинца создаются условия для четкой реакции ряда структур, в которых мы не наблюдали образования осадка при использовании умеренных концентраций свинца. В этих условиях осаждение фосфора в клеточных структурах также подвергается закономерности концентрационного взаимоотношения, то есть, понижая концентрацию свинца, мы соответственно уменьшаем и количество буфера. Клеточные структуры здесь выявляются также в строгой последовательности.

При рН 5,6 с 2 мл буфера в смеси во всех отделах мозга наблюдается четкая окраска сосудисто-капиллярной сети. Исключение составляют кролики, у которых при данном пике осаждения ортофосфатов капилляры не реагируют. С 5 мл буфера капиллярная реакция ослабевает, и образование осадка происходит в ядрах глиальних клеток, ' избирательное выявление которых наблюдается с 10 мл буфера. С 15 мл буфера на фоке убывающей ядерной реакции появляются нервные волокна и с 16 мл на срезах заметна слабая реакция единичных клеток. При этом наблюдается довольно смешанная картина: осевые цилиндры нервных волокон, местами слабая реакция ядер глиальних клеток и нечеткие контуры нервных клеток. С 18 мл буфера происходит избирательная реакция нейронов, которые выявляются на чистом фоне препарата за счет мелкозернистого осадка, откладывающегося в порикарионах и довольно длинных отростках. С 25 мл буфера в емзек образование осадка во всех структурах но происходит.

У кошек на срезах коры больших полушарий в условиях осаждения фосфата свинца в нервных клетках преципитация продукта реакции наблюдается в перккарионах и отростках нейронов всех слоев. Уже на 2-3-кй день инкубации выявляются нейроны верхних сдоев к крупные пирамидные клетки, а на 4-5-ый день - нейроны остальных слоев коры. При этих сроках инкубации заметна разная

степень интенсивности окраски нервных клеток коры больших полушарий. Дендрита пирамидных клеток можно проследить на далеком от тела расстоянии. 7 кроликов и крыс нейроны коры также отличаются постоянством и равномерностью выявления. Значительнее изменения наблюдаются и на срезах мозжечка. 7 кошек и кроликов постоянно выявляются тела клеток Пуркинье с хорошо разветвленным девдритнчм деревом. Местами на дендритах заметны иипики. Четко окрашиваются также перркаргояк и длинные отростки меток Гольджи, пери^арионн клеток-зерен, менее постоянные у.орзикчать'е и звездчатые клетки. В отличие от других отделов мозга, в белом веществе мозяечка отчетливо выявляются глиаль-ные клетки. Реагируют так^е нейроны собственных ядер мозжечка. У крыс равномерно выявляются тела клеток Пуркинье с основным дендритом, единичные клетки 1Ъльда® и нейроны собственных ядер мозжечка. На срезах ствола мозга кошек, кроликов, крыс происходит увеличение количества реагпруемнх структур. Уж на 2-3-ий день инкубации видна реакция основной массы нерзшх клеток, а на 4-5-»й день наблюдается богатая морфологическая картина. При этих сроках инкубации очень наглядна разная степень интенсивности окраски нейронов, которая не зависит от величины нервных клеток. У большинства из них отчетливо можно проследить вторичное и третичные деазриты. У кошек, кроликов и крыс на срезах спинного мозга образование осадка наблпдается в перика-рионях и отрэсткгх нервах клеток как переднего, так и заднего и боковох'о рогов серого вспества. У кошек и кроликов на срезах среднего и продолговатого мозга изредка мояно заметить густое переплетение нервных волокон, которые окг нчиваются в виде пуговок и колечек.

Таким образом, полученные концентрации свинга создают более благоприятные условия, вследствие чего ортофосфатч нейронов различных форма и: Я мозга становятся значительно реакпионно-способньми, что приводит к повышению количества реагируемых нейронов. По вссй вероятности, умеренные концентрации свинга вызывают некоторую ингибицию реакции ортофосфат^в, чем к можно было объяснить сравнительно бедный морТологический эффект.

Интересном является ií-акт значительного отличия прецкпита-

пионных пиков осаждения ортофосфатов в нервных клетках различных формаций мозга. Как показывает анализ полученных данных,-для нейронов ствола мозга и большинства нейронов мозжечка ней-роклеточный прешшитацконныЕ пик соответствует 18-20 мл буфера в смеси, в то время как для нейронов коры больших полушарий -23 мл.

Необходимо отметить, что крупные ретикулярные клетки продолговатого мозга к варолкева моста реагируют в широком диапазоне при заданном значении рН среды, то есть они выявляются как при оптимальных условиях осаждения ортофосфатоз в стволовых нейронах, так и в корковых, в то время как последние реагируют только в узких пределах концентрационного фактора.

При улучшенном варианте реакция значительно ускоряется и клеточные структуры начинают выявляться уке на второй день инкубации. Хотя на срезах большинство крупных нейронов окрашивается в более короткие сроки инкубации, однако это не является правилом. Так, на срезах среднего мозга крупные клетки глубоких слоев четверохолмия окрашиваются значительно позке, чем мелкие. Или же, у крыс на срезах продолговатого мозга нейроны ядра лицевого' нерва вшшляются раньше, чем крупные ретикулярные клетки.

Существенное отличие наблюдается и в степени интенсивности окраски нейронов. К примеру, у кроликов на срезах спинного мозга, начиная с 4-го дня инкубации, выявляются крупные мотонейроны, на 7-8-ой день начинают реагировать клетки задних и боковых рогов, а интенсивность окраски мотонейронов значительно повышается. При этих сроках инкубации довольно наглядна разная степень интенсивности окраски нейронов. Такая разность окраски наблвдается не только у нейронов различных формаций мозга, но и нервных клеток, входящих в одну и ту же ядерную группу.

Исхода из вышеизложенного, мы с достаточной уверенностью можем отметить, что выявление ортофосфатов, помимо гистохимического значения, представляет определенный интерес и в морфологическом отношении, так как при этом получается своеобразная картава, занимающая промежуточное положение мезду методом Ниссля и импрегнацией серебром. Примененный наш метод гасто-

химического выявления ортофосфатов обладает большой избирательностью и позволяет предполагать, что этим путем можно получить сведения о физико-химических особенностях нервных структур.

3. Выявление активности кислой фосфатазы в клеточных структурах мозга кошек по Гомори и согласно закономерности концентрационного взаимоотноше -ния по Чилкнгаряну.

Наши результаты подтверждают литературные данные по выявлению активности кислой фосфатазы стандартным методом Гомори. В этих исследованиях во всех отделах головного и спинного мозга активность кислой фосфатазы проявляется в телах и коротких отростках крупных нейронов, ядрах глкалышх и нервных клеток, а также в нервных волокнах. В телах и отростках мелких нервных клеток активность фермента отсутствует.

Благодаря применению закономерности концентрационного взаимоотношения при выявлении активности кислой фосфатазы создается возможность получить избирательную реакцию нервных структур центральной нераной системы, как и при выявлении ортофосфатов. Кроме того, наблюдается также определенная последовательность в реакции различных структур: одновременное выявление капилляров и нервных клетокизбирательное выявление нервных клеток — одновременная окраска ядер глиальных клеток, осевых цилиндров нервных волокон и крупных нервных клеток.

Исключительно важное значение имеет тот факт, что благодаря применению данной закономерности создается возможность выявления не только крупных нейронов, но и мелких. ■ Эти данные существенно расходятся с описанными в литературе результатами, где активность кислой фосфатазы стандартным методом Гомори выявляется з основном в телах крупных нейронов.

Необходимо отметить, что крупные нервные клетки окрашиваются в широких пределах концентрационного фактора среды, а мелкие - в узких. Наиболее быстро окрашиваются нервные структуры мозжечка, затем - больших полушарий и, наконец, стволовые и спинномозговые нейроны. Мелкие нейроны требуют, как правило,

более длительные сроки инкубации. Следовательно, высказывания ряда авторов (Вольф, Бусыкюк), что кислая фосфатаза в мелких клетках неактивна, не соответствуют действительности. Поэтому применением закономерности концентрационного взакмоотноиения при выявлении активности кислой фосфатазы монно добиться увеличения количества реагируемых нейронов, что представляет определенный интерес в морфологических исследованиях при изучены! нейронов разных отделов центральной нервной системы.

ВЫВОДЫ

1. Применением закономерности концентрационного взаимоотношения по Чилингаряну удалось выбрать соответствующие условия (пики) осаядеяия ортофосфатов, благодаря чему можно говорить о принципиальной возможности четкого и воспроизводимого выявления этих соединений в нервных структурах мозга на срезах фиксированного материала.

2. Исследованиями различных обработок материала било показано, что формалиновая фиксация не полностью обесточивает стабилизация фосфора. Для этих целей наиболее подходяща: является формалин-кальциевая фиксация. Создсккя оптимальных условий дам осаздения ортофосфатов способствует обработке срезов к.лвд:ет;м раствором, аштовом к пргксксн:'.о пошпвзгсшх кон-цектраппй осавдяхкего металла (ионов сьпнпа) в инкубационной смеси.

3. В тех условиях, когда избирательно вшшдяотся поркка-рионы I: отростки нервных клеток, в других клеточных структурах •осавдекио продукта реакции не происходит.

4. На срезах коры больших полушарий преципитация свинца наблюдается в нейронах всех слоев. У крупных пирамидных нейронов отростки прослеживаются до верхних слоев коры.

5. На срезах ыозкечка реагируют тела клеток Пургипье с разветвленным дендритным деревом, клетки Гольдак с длипшги' отростками, клетки-зерна без отростков и пернкариони п отростки клеток собственных ядер мезге41«.

6. На срезах среднего мозга довольно постоянно реагируют: перикарионы и отростки нейронов ядра глазодвигательного и блокового нервов; крупные и мелкие нейроны красного ядра; мелкие нервные клетки верхних слоев двухолмия; перикарионы и длинные отростки крупных нейронов глубоких слоев двухолмия; чувствительные клетки тройничного нерва; мелкие нейроны серого Естества, окруяаюшего Сильвиев водопровод.

7. На срезах варолиева моста и продолговатого мозга наблюдается богатая морфологическая картина. У большинства нейронов отростки прослеживаются на далеком от тела расстоянии.

В. На срезах спинного мозга ортофосфаты выявляются в пери-карионах и отростках мотокейронов, а такте в нейронах заднего и бокового рогов серого вешества.

9. Наблюдаются значительные отличия в условиях осадцения ортофссфатов, скорости образования осадка, интенсивности окраски нейронов различных формаций мозга. По всей вероятности, данное обстоятельство конно связать с различием в функциональном состоянии нервных клеток.

10. Богатая морфологическгя картина, полученная при выявлении ортофосфатов в нейронах центральной нервной системы на срезах фиксированного материала,позволяет предложить данные методические приемы в решении задач морфологического характера. А полученный электронноплотный осадок сульфида свинга монет представлять определенный интерес в ультраструктурных исследованиях.

11. Выявление активности кислой фосфатазы с учетом закономерности концентрационного взаимоотношения позволило установить, что преципитация продукта энзиматической реакции в нервных структурах мозга в действительности происходит согласно этой закономерности, благодаря чему становится возможным разработка новых методических приемов для морфо-гистохимичзско-го изучения перикарионов и отростков нейронов центральной нервной системы.

' СШССК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО КАТЕРКАШ!

ДИССЕРТАЦИИ

1. Гистохимическое выявление фосфора со свинцом в нейронах ствола мозга на срезах фиксированного материала. // 1У Закавказская конференция морфологов: Тезисы докладов. - Батуми, 1985, с. 166-167. / Соавт. А.М.Чкллнгарян, Д?..А.Мартиросян/.

2. Выявление фосфора в нервных структурах различных отделов мозга крыс и морских свинок. // У1 Всесоюзная конференция по физиологии вегетативной нервной системы: Тезисы докладов.-Ереван, 1986, с.196. /Соавт. Дк.А.Мартиросян/.

3. Гистохимическое изучение фосфора в нервных структурах мозга морской свинки. // У конференция молодых физиологов Закавказья: Тезисы докладов. - Еаку, 1986, с.63-64. /Соавт. К.В. Казарян/.

4. Улучшенный вариант гистохимического выявления фосфора на срезах фиксированного материала в различных отделах мозга кошки. //ЗУ съезд Армянского физиологического обшестяа:'Те-.зисы докладов. - Ереван, 1987, с. 63-64. /Соавт. Де.А.Мартаросян/.

5. Гистохимическое изучение клеточных фосфатов в нейронах мозга кошки на срезах формалкн-фиксированного материала. //Доклада АН Арм. ССР. 1987, т. 85, К 2, с.83-86. /Соавт.А.М.Чклин-гарян, Дж.А.Мартиросян/.

6. Гистохимическое выявление фосфора в нервных клетках головного мозга кроликов. // Доклады АН Арм. ССР, 1988, т.86, & 5, с. 228-231. /Соавт. Дк.А,Мартиросян, А.И.Чилингарян/.

7. Гистохимическое выявление ортофосфатов в нерзш-'х ядрах ствола мозга и мозжечка у некоторых видов жвотных. /А'1 симпозиум по проблеме "Структурная и функциональная организация мозжечка": Тезисы докладов. - Ереван, 1988, с. 87. /Соавт. Дк.А.Мартиросян/.