Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей репликации ретровирусных векторов и их использование для мечения клеток с целью создания межклеточных гибридов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей репликации ретровирусных векторов и их использование для мечения клеток с целью создания межклеточных гибридов"

?Г6 од

о 3 ФЕЯ Ш7

На пранах ру-к^пт и

ФОМИН Игорь Климептьевнч

ШУЧЕППЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РЕПЛИКАЦИИ РПТРОВИРУСИЫХ шктогов и их ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ МЕЧЕППЯ КЛЕТОК С ЦПЛЫО С СЛ ДАНИЯ МНЖЮПЛ 041 Н-1 \

ГИБРИДОВ

(03.00.03 - молекулярная биология)

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Гиоога выполнена в НИИ гематологии и переливания кропи Министерств Чдравоохранегшя Гсси\6лмк1! Беларусь -

|).|> чтм.те руководители: доктор мод. наук Войтенок Н И.

■шеи корр. РАСХН, профессор, доктор бнол. паук Тихонепко Т.П.

(Мчтиальмые ечнюнежы: доктор мед. наук Ильин К.В.

доктор биол. наук Завриев С.К.

Несущая с|чп|1||)яц|ц: Биологический факультет МГУ.

диссертации состоится "....".............1997г.

к . ..час. па заседании диссертационного совета Д.020.40.01 при ВНИИ С1> РАСХН чо адресу: 127550, г.Москва, ул. Тимирязевская, д.42.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ СБ РАСХН.

Автореферат разослан "...."..............1996г.

Ученый секретарь , /

диссертационного совета . /^ / /'¿и.,

кандидат биологических наук • / СА.Моликона

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Ретровирусы часто вызывают разнообразные неопластические, а также нммупо-дефицитные заболевания у позвоночных, включая человека. Вирусы этой группы в настоящее время широко используются как молекулярные векторы для переноса и экспресош генетического ;атернала в клетках эукариот. Лечение рстровирусных заболеваний и создание рстровирусных векторов основано на знании молекулярной биологии этой группы вирусов. Тем не менее, многие детали молекулярных механизмов репликации все еще остаются неизвестными. Изучите отдельных этапов размножения, а также цис- н транс-действующих факторов, вовлеченных в этот процесс, позволит боле- глубоко понять особенности репликации ретровнрусного генома, идентифицировать удобные мишени для антивирусной терапии, а также создать рстровнрусныс векторы с новыми свойствами.

Отличительной особенностью ретровнрусов является наличие в их жизненном цикле процесса обратной транскрипции, в результате которого на матрице геномной РЫК сшггезируется ДНК-провирус, интегрирующий затем в геном клетки-хозяина. Для репликации "етрошгрусного генома требуется несколько цнс-денствующих последовательностей! длинные концевые повторы (LTR, long terminal repeat), содержащие промотор и знхансер транскрипции, сайг и сигнал полиаденилировашга, а'также шхвер-пгро-ванные повторы на 5' и 3' концах (IR, inverted repeat); последовательность, комплементарная т-РНК затравке для праймирования синтеза минус-цепи ДНК-провируса (PBS, primer binding site); полнпуриновый тракт (PPT, polypurine tract), который является сайтом инициации синтеза плюс-цепи ДНК-провируса; область упаковки-димеризации (у или Е), отвечающая за специфическую упаковку геномных РНК в вириои и их димеризацию (Varmus, 1985).

Последовательность ретровнрусного генома, вовлеченная в специфическую упаковку вирусных РНК, была обнаружена около 5' конца генома у целого ряда ретровирусов (Aronoff and Linial, 1990). Для вируса лейкемии мышей Молони сигнал упаковки или V область вначале бьи обнаружен в районе между доноркым сайтом сплайсинга н гашциирующим кодоном гена gag (Mann et al, 1983). Впоследствии, дополнительные сигналы упаковки MoMuLV были найдены в gag-кодирующей последовательности и 5' участке U5 района LTR (Bender et al, 1987; Murphy and Goff,1989). Взаимодействия между этими тремя сигналами упаковки остаются невыясненными. Oini могут служить независимыми сигналами упаковки или

образовывать общую вторичную структуру, которая я распознается вирусными белками.

Другой особенностью рстровирусов является наличие в га вирнонах двух идентичных копий РНК, которые нековалентно сосдинскы между собой «а 5' концах при помощи структуры, названной DLS (dimer linkage structure). У большинства рстровирусов DLS картируется в районе, который перекрывается с областью упаковки или Vf» областью. Функции DLS в жизненном цикле рстровирусов не известны, но предполагается, что DLS и у область принимают участие в упаковке вирусных РНК, так как DLS и область контролируются одной и той же цис-действующсй последовательностью (Bender et al, 1976; Jvíurti et al, 1981; Prats et al, 1990).

Хотя ретровирусный вирион содержит две геномные молекулы РНК, он продуцирует только один провирус (Panganiban and Fiorc, 1983; Hu and Tcmiii, 1990). Эта данные позволяют предполагать, что, либо обе геномные молекулы РНК вовлечены в синтез одного ДНК-провируса, либо инициация обратной транскрипции может происходить только на одной из двух молекул РНК. В настоящее время существуют достаточно противоречивые данные, полученные in vivo, и опюшенни того, сколько молекул РНК вовлечено в синтез ДНК-провнруса (Panganiban and Fiore, 19S8; Jones et al, 1994). Однако, в экспериментах in vitro было показано, что, как это теоретически и предпологалось, синтез провируса как на одной, так и двух РНК-матрицах происходит с равной вероягностью (Allain et al, 1994). Исхода из этого можно предположить, что в условиях in vivo существует механизм, который шшривлис! emuej :ipoBnpyca на двух матрицах РНК.

В течение последних десяти лет ретровирусы пшроко применяются как векторы для введения и экспрессии генов, меченая клеток, получения кДНК-овых копий генов, создания трансгенных животных, а также целей генной терашш позвоночных, включая человека. Преимущественное использование ретровнрусных векторов связано с особенностями их жизненного цикла и организацией генома: 1) рстровирусы способны стабильно интегрировать в геном клетки-хозяина; 2) относительно небольшие размеры генома позволяют легко с шш манипулировать in vitro; 3) внутренние последовательности рстровирусного гепома могут быть удалены таким способом, что все функции, необходимые для реплик шиш, будут предоставлены in trans; 4) используя пакующие клеточные линии с широким спектром хозяев, гибридными рстровирускыми вирионами можно инфицировать практически любой вид и тип клеток позвоночных. В представляемой, работе ретровирусныс векторы использовались для маркирования гибридомкых клеточных Л1шии с целью получения гибрида гибридом (хвздром),

продуцирующих биспецифические а1гпггела.

Целью исследования являлось пэученепе влияния рстровирусных последовательностей, расположенных между длинными кош(евыми повторами, на репликацию н упаковку ретровирусных вягторов и их исполыование для переноса доминантных селективных генов с целью получения межклеточных гибридов.

Задачи работы:

1.Получить "минимальные" ретровирусные векторы на основе вируса лейкемии мышей Молони (МоМиЬУ), у которых отсутствуют внутренние последовательности генома.

2.Изуч1ггь способность этих векторов принимать участие в репликации.

3.Исследовать структуру провируса, синтезированного на матрице РНК "минимального" ретровирусного вектора.

4.0пределить, какое количество ировирусс » продуцирует один инфекционный вирнон, содержащий "мииимальные" ретровнрусные геномы .

5.Изучить возможность конкуренции между у* и у " геномами за белки внрноно» в г^кующей клеточной лгаши ц/2.

6. Исследовать влияние и5 района ЬТЯ на упаковку и репликацию ретровирусного генома.

7.Изучить эффективность маркирования клеток гибридом при помощи ретровирусных векторов, кодирующих различные дошшантные сслекпппшс маркеры.

Научная но»>пиа

Полученные результаты показывают, что ретровнрусные векторы, у которых отсутствуют внярешше последовательности генома, способны принимать участие в репликации и продуцируют провирусы, имеющие корректную структуру. '>га донные позволяют сделать заключите, что внутрстше последовательности ретровирусного генома являются не обязательными для репликации, так как "мттмяльный" ретрови-русный геном может использоваться как естественная матрица для обратной транскрипции. Внутрешше последовательности рст/.гнчрусов, вероятно, не контролируют сшггез пров!груса на двух матрицах РНК, поскольку каждый инфекпноншш вириои, содержащий "минимальные" геномы, продуцирует только один провнрус.

и5 район ЬТЯ и gag-rIocяeдoвaтeлънocтъ прнтшлют участие в упаковке только в присутствии «V области. Это показываег, что 5!^-последовпте_и,иостъ и и5 район

повлечены в образовште общих вторичных структур с областью, которые распознаются вирусными С.-иами как дополшгтсльные сигналы упаковки.

В экотропной пакующей линии и V " геномы не конкурируют за белки

вириомов. Отсутствие конкуренции, вероятно, связано с тем, что упаковка геномных молекул РНК не лимитирована количеством вирусных белков, вовлеченных в специфическое связывание нуклеиновых кислот и формирование вирионов.

Сравнительный анализ показал, что перенос доминантных селективных генов при помощи ретровирусных векторов позволяет быстро и эффективно осущсстплхп, мечение клеток с целью их дальнейшего использования для получешш межклеточных гибридов.

Пргкпгоескяа значимость

В этой работе получены новые сведения о цис-действующих последовательностях ретровирусного генома, вовлеченных в репликацию и упаковку вирусных РНК. "Минимальные" векторы могут быть использованы как модельная система для дальнейшего изучения цис-действующих элементов ретровирусного генома, которые являются важными для репликации, экспрессии, интеграции, формирования дйплоидности и других этапов жизненного цикла ретровнрусов.

Предложенный в настоящей работе метод мечения клеток при помощи ретровирусных векторов, кодирующих доминантные селективные гены, может использоваться для мархировкн широкого спектра клеток позвоночных, включая клетки человека, что позволит быстро и эффективно получать межклеточные гибриды.

Положения, выносимые на защиту

"Минимальные" ретровирусные векторы, не содержащие внутренних последовательностей генома, способны реплицироваться. Каждый инфекционный вирион, содержащий "минимальные" ретровирусные геномы, продуцирует только один провирус, который имеет корректную структуру.

и 5 район ЬТЯ и gag-пocлeдoвaгeлънocть не являются автономными сигналами упаковки.

у* и ч/ - геномы вируса лейкемии мышей Молони не конкурируют за белки вирионов в экотропной пакующей линии

Перенос доминантных селективных генов при помощи ретровирусиых векторов является простым и быстрым методом мечения клеток с целью создания межклеточных гибридов.

Апроблци* jwtttjnaitmi

Мтсриалы pnOonj били доложены на Международной конференции "Спид, рак и рпрошгруси человека" (Санкт-Петербург, Россия, 1992), а также IV съезде иммунологов к аллергологов Республики Беларусь (Гродно, 1995),

Публика нин

Материал!,i дггсссрт». <ш опубликованы в б научных работах.

ОСгьем и структура диссертации

Диссертация включает введение, главы "обзор литературы", "материалы и методы", "результаты", "обсуждение", выводи. Работа изложена на 77 страницах машинописного текста, содержит 9 рисунков, 4 таблицы я список нспользопанных источников m 100 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ВНУТРЕННИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНОМА ВИРУСА ЛГЧКЕМИИ МЫШЕЙ МОЛОНИ НА РЕПЛИКАЦИЮ

Для изучения влияния внутренних последовательностей генома MóMuLV на репликацию нами сконструированы рсгровирусные векторы, названные "минимальными", у которых отсутствуют последовательности генома, расположенные между длинными концевыми повторами. Структура векторов представлена на рис. 1. От векторы содержат, левый и правый LTR; 60 пн на 5' конце генома, где расположен PBS; 140 пн на 3' конце генома, содержащие РРТ; ген neo,или puro, которые находятся под контролем промотора MoMuLV, расположенного в U3 районе LTR и служат для селективного введения векторных конструкций » пакующую клеточную линию. Таким образом, исключая область упаковки-димеризации, "минимальные" векторы имеют все цис-действуюпше последовательности генома необходимые для репликации. "Минимальные" векторы характеризовались на основании следующих критериев: 1) способность реплицироваться; 2) репликагшя в присутсгвии вектора "дгпсого типа"; 3) формирование корректной структуры провируса; 4) какое количество ировирусов продуцирует один вирнон; 5) влияние инсерции в U5 район LTR на репликацию и специфичность упаковки.

Рсшшк&ини "мшшммыюго" ретрооирусного вектора

Вскггор pZ\y - Neo был введен в экотропную пакующую лшшю ц/2 посредством кальций-фосфатной преципитации. После селекции в присутствии G418 устойчивые к антибиотику клоны клеток изолировались и размножались.Титр вируса, продуцируемый кдк отдельными, так и тотально-собранными клопами, определялся на клетк&х NIIÍ3T3. В параллельном эксперименте для сравнения определялся титр вектора pDNco, названного вектором "дикого nina", который содержит область упаковкп-дн,\<еризации (у) и часть gag-последовательности. Как видно из таблицы 1, титр вектор- pZv}< - Neo .варьировал для различных клонов от 2x10' до 2х102 КОЕ/'мл (колониеобразующих единиц) и в среднем составлял 1х102. Результаты этих экспериментов показывают способность вектору pZ<y " Neo принимать участие в репликации. Однако, этот лектор продуцирует титр, который примерно в 1500 роз ниже, чем вектор "дикого Tima", pDNeo. Полу.еншлс результаты согласуются с ранним шучешкм МоМиЬУ-производных векторов, где деления if области приводила к 3000-крашому паде!шю тигра векторов (Mann et al, 1985) Однако, эта векторы содержали p.'ig-последоватсльлость, которая вовлечена в специфичность упаковки геномных молекул РНК (Adam and Miller, -198S; Armentsno et al, 1987; Bender and Davidson, 1937). Сходное различие в титре между векторами, полученное в нашей работе н работе Mana л 1'altLmore (1985), позволяет предположить, что gag-no следу оате/и-иосп. не является автономным сигналом упаковки, а вовлечена в формирование общей вторичной структуры с ч' областью, которая, вероятно, служит дополшггеяьным сигналом для распознавания вирусными белками. Удаление у области из векторной конструкции пирушлст эту вторичную структуру, поэтому присутствие иди отсутствие gag-поелсдовагелыгосш далее не может повлиять на эффективность упаковки. Интересно огметтггь, wo перенос у области с 5' на 3' конец генома существенно не влияет на специфичность упаковки. В соответствии с этим наблюдением, возможная вторичная структура между областью и gag-последоватеяъностыо должна обладать достаточной гибкостью, чтобы обеспечить взаимодействие между двумя различными последовательностями на таком большом расстоянии (примерно б тан).

pDINco ( LTR )

g»l!

XII p

~1 И 1

г se в

pZv|/ " Neo LTR

3_ppt

h p

Л

p se

pDSVi'iiro ( LTR j nbs

» a g sv

puro

X II s

.ЯР»!

ГГтГГ

pDSVl'uroBam^ LTR nbs ц/ _

7Г

81111 I" p

gag sv

puro

-í-1--Г

X II s

ppt

[LTR]

¡>Z>¡r Puro LTR

Ay

líljsj

II s

Ду

])7лj/"PuroBain( LTR ) [lbJ

Í;ih

puro

1

—1 ni> t

( L1R

Рисунок I. Структура MoMuLV-иропзводных векторов. Векторы pDNeo и pDSVPuro содержа!: i'ITi начиная с EcoRV- сайта; PBS (primer binding site); часть gag-последовагелыюсти до позиции /5£1 бактериальный ген neo или puro; 140' нуклеотидов с 3' кош'а генома MoMuLV и 3' I.TR. Векторы pZy/Jíi и pZy ' I'iiîo отЛнчаются от pDNeo и pDSVPuro отсутствием MoMuLV-последовательности меж) нолщнямн 212 и 15Ó0. pDSVPuvoBám и pZ7 " PuroBam несут иисерцию в средней части U5 района 5'¿'Г/ размером в 8 нуклеотидов (позиция 95). На рисунке показаны некоторые, сайты ресгрннуи использованные в конструнроаммн. Символы и сокращения: CD , LTR; ^ ' ^ , последс^ тельиссп. ДЦК MoMuLV, ГТГЗ , reii neo; Е1ГЭ , ген puro: В , pai.wnft промотор вир>са S¡\M<J.f деления (у область); А , инсерция (БатШ сайт); pbs, сайг связывания г-РГХ затравки (primer binding sit ppt, лолипуриноиыЛ тракт (polypurine tract); В, ЗашШ; С, Clal; H, HindíII; P, Psrl; S, Salí; X, XI10I.

Тпблкнл1

Продукция вируса клетками пакующей линии, содержащей "минимальные" или (н) "дикого тши" МоМиЬУ-протводные ретровирусные векторы

Вектор Клеточный К Л О 11 Титр (КОЕ/мл)1

Ыео Р и г о Ысо + Риг о

рОИм> "отолите клоны 1,5 х 10'

Тотальные клоны 1,0 х 101 -

1 2,0x101 -

2 1,2 х 103 -

3 1,6 х 102 -

1)7« 2,0 х 10' -

ОН 2,6 х 10' -

рг^-ЫеофТ)6 +

рЭЗУРиго 1 1,8 х 102 1,0 х 10' -

2 1,6 х 101 4,0 х 10'

р2у • Ыео +

р7у" Рнго 1 1,0 X 102 1,0 х 10' 0

2 1,2 хЮ3 0,9x103 0

•КОЕ - колоннеобразуюпщх единиц.

6Кяон В7 всаольэовался для трансфскции вектора рОйУРиго.

Il

\r* и Ц/- геномы ne конкурируют зя Ge.Tiai oiipiiouoD

Для вируса ретикулоэндотедиоза птиц (REV) ранее был описан очень интересный эффект конкуренции между Е* и Е' геномамн за белки вирионов, Однако, насколько этот эффект характерен для других групп вирусов в настоящее время неизвестно. В связи с этим, для нас представляло интерес изучить эту возможность у MoMuLV-производш.гх вст -ороо. С этой целью был выбран хлоп клеток v(/2Zvy - Neo с определеганлм TirrpoM вируса (клон В7) для введения вектора "дикого типа" pDSVPuro, который содержит V/ область, часть gag-последовательности и ген устойчивости к пуромнцнну (Рис. 1). После введешм вектора pDSVPuro посредством трансфекции в клетки клона В7 и селекщш на пуромицине устойчтшых клонов титр "минимального" вектора был перепроверен (Таблица 1). Однако, изменение титра для "мгапшального" вектора не наблюдалось, что говорит об о.сутствии конхурешцо! между <4/* и у -геномами за белки вирионов. В пакующей линии >у2 упаковка РНК-геномов, вероятно, не лимитирована производимым количеством вирусных белков, тогда как для вируса регихулоэндотелиоза ппщ наблюдался противоположный эффект. Нельзя также исключить влияние на эффект конкуренции эндогенных, MoMuLV-родстпсшгых транскргап , которые присутствуют во всех мьпщпшх пакующих линиях, полученных на основе клеток NIH3T3 (Scadden et al, 1990).

Структура и количество нровирусоо

Для изучения роли внутренних последовательностей генома MoMuLV в формировании провируса нами была проанализирована структура провирусов, которые образуются после инфицирования клеток вириоиами, содержащими геномы "минимального" ретровирусного вектора. Для этой цел)! NIH3T3 были инфицированы вирусом, продуцируемым клетками \y2Z\y - Neo. После селекции на G418 отдельные клоны клеток изолировались и размножались. Из этих клонов была выделена ДНК и использована как матрица для PCR. Провирускые геномы амшшфицировались с праймерами, один го которых специфичен к 3' концу U5 района (с позиции 116 до позиции 132, праймер ЗТ), другой - к 5' концу U3 района LTR (с позиции 7845 до позиции 7829, праймер 51). Таким образом, используя эти праймеры можно амплифицировать провирусную последовательность, расположенную между левым и правым LTR. Амллифицированные фрагменты анализировались при помощи гель-электрофореза и гибридизации с пео-пробой. Во всех проверенных клонах провнрусы

имели ожидаемую структуру и не содержали любых перестроек или деяецкй (рис. 2). Ого позволяет сделать заключение, что цис-действующие, MoMuLV-производные последовательности, такие как: левый и правый LTR, сайг связывания тРНК затравки (PBS) и полилуршювый тракт (РРТ) являются достаточными для корректной обратной транскрипции ретровирусного генома.

Ретровирусньш вирион содержит два РЫК генома, но каждый инфекционный вирион продуцирует только один провирус (Hu and Temin, 1990; Panganiban and Fiore, 1988). Panganiban н Fiore (1988) показали, что в течение первой стадии обратной транскрипции обычно происходит межмолекулярный перенос сгаггеза минус-цепи ДНК-провнруса и, таким образом, обе молекулы РНК повлечены в формирование одного провируса. В этой работе мы изучали возможное участие внутренних последовательностей генома MoMuLV, включая область димериззщш, в контроле сшпеза провируса на двух матрицах РНК. Для этой цели в одни и те же клетки пакующей линии \р2 последовательно были введены два "минимальных" рстрошфуспых вектора, pZvy - Neo и pZvp • Puro, содержаиуи различные дошшздггные селективные маркеры, и вирусы, продуцируемые двойными траисфсктантьми, были испытаны на их способность транедуцировать двойную устойчшюсп. в клетки NIH3T3. Поскольку ретровнрусный геном является диплоидным, часть внрнонов, продуцируемая двойными трянсфектантамн \j/2Z*(/ ■ Neo + Z'j/ • Puro, вероятно, будет гсгероднплоцднымн. Если каждый инфекционный вириол продуцирует более одного провируса, инфицирование гетеродиллоидным вирионом, содержащим два генома, которые кодируют различные доминантные селективные маркеры будет прнвод1Пъ к появлению клона с двойной устойчивостью. Однако, как показали наши эксперименты, такое событие не происходит даже с частотой 1 х 10 J (Таблица 1), Эгот результат свидетельству«' о том, что, подобно вирусу "дикого типа", вирионы, содержащие геномы "минимальных" векторов, продуцируют только один провирус, и внутренние последовательности MoMuLV, вероятно, не коипролируют синтез провируса на двух матрицах РНК. Тем не менее, нельзя исключить участие области диыеризации в формировании дныяоидности, так кок в этой случае в ее отсутствие только одна молекула РНК будет упаковываться в вирусную частицу.

Влияние инсерцци D US район LTR на эффективность упаковки и репликацию ретравнрусных векторов

Murphy н Goff (1989) ранее показали, что US район LTR MoMuLV вовлечен в

Пр

К î

I sf!

0.97 та Oilm«

Е' 1 2 3 4 5 б Т

О

Рисунок 2. Анализ Tmj - Neo-процзводных провирусов в хлопах клеток NIH3T3 Ксоя. ГГропирусные геномы амплифицировали с праймерамн, комплементарными к US (с га^шлш 116 до по-лпкш 132, прзймер 5Т) и U3 (с позиции 7845 до позиции 7329, np:u'ÍMep ЗТ) рплоням LTR. Продукты PCR прямо или после обработки ферментом рестрикции Sphî подвергали гель-электрофорезу в 1% агзрозном геле, переносили на нейлоновую мембрану и торцятовали с 3*Р-меченной пео-ггробой. А. Схематическая структура Zy ■ Neo провирусной ДНК, coaiiyrai пранмеров п Sphî салта, ожидаемый размер фрагмента и проба, используемая доя гибридизации. Б. 1,2,3,4 - продукты PCR, полученные из ДНК четырех NIH3T3 Neo4 клонов; 5,6,7,8 - продукты PCR пз тех же клонов после обработки рестриктаэой Sphî. Размеры соответствующих фрагментов показаны справа в тли (тысячах пар иуклеотццов).

Таблица 2

П. i;mnie 1гасерцтш в U5 район LTR на решппсашао ¡ровируешлх векторов

,0'

- 1.9

/0.97

44; .. =v

\>.9г

Вектор Клеточный Титр

клон (КОЕ/мл)

pDSVPuro 1 1,4x105

2 0,8 х 105

pDSVPuroBam 1 2,0 х 10'

2 4,0 х 105

pZy ■ Puro 1 1,5 х 10^

2 0,9 х 102

pZxy -PuroBam 1 1,0x105

2 1,2x102

ипкалсидацию геномных молекул РНК в внрлон. Для нзучеши влияння U5 района на упаковку и репликацию "минимального" вектора мы ввели в среднюю часть U5 района ниссрцкю размером в 8 нуклеотидов (нозтри 95)- Для сравнения в этих экспериментах мы использовали "минимальные" векторы pZip - PuroBara и pZy - Puro, которые различаются только наличием или отсутствием инсерции, а также аналогичные им Ecwropbt "дикого типа", pDSVPuroBam и pDSVPuro (Рис. !)• Эти векторы вводились посредством трансфекц1ш в пакующую лини» ц/2. После изолирования отдельных клонов, устойчивых к пуромнцину, Tirrp вируса определялся на клетках NIH3T3 (Таблица 2). Как видно из таблицы 2, кнеерцня в V5 район вектора "дикого rana" pDSVPuroBam понижала nrrp вируса примерно в 40 раз, тогда как сходная инсерция не изменяла тигр "мшпгыального" вектора pZy - РигоВаи». Этот результат показывает, что инеерция в среднюю часть V5 района LTR не влияет на транскрипцию и синтез проьпрус-а, по, вероятно, вызывает изменение вторичной структуры РНК между vp областью и U5 районом, которая является важной для упаковки. Такая же структура не может сип образована в геноме "минимального" вектора, так как его геном не содержит у области, поэтому »шеерцня в U5 район этого вектора далее не изменяет эффективность его утаковхи. Таким образом, US район LTR не является независимым еш чазюи упаковка и, подобно ^я^-носясдоватсльносп:, вовлечен в нес только через общую вторичную структуру с у областью.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РЕТРОВИРУСНЫХ ВЕКТОРОВ ДЛЯ МЕЧЕШ1Я КЛЕТОК С ЦПЛЫО СОЗДАНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ГИБРИДОВ

Ангшсла, содержащие в структуре молекулы два различных антигенсвязьшаю-Щ!« участка (бнспецифическне акпггела) и способные к перекрестному связьгввшоо молекул и клеток, могут быть использованы в иммуногистохишт, индукции клеточной цигтотоксичности, разработке иммунодиагносппсумов (de Lau et al, 1939). Впервые бнепецифические антитела были получены химическим путем (NisonoiT and К iters, 1961)- Более технологичным подходом является получение клеточных линий, продуцирующих такие антитела. Принципиально они могут быть созданы путем слияния даух гибрндомных линий. С целью выделения гибридов гибридом (квадром) после процедуры слияния применяются различные методы .селекции. Исходным гибри-домным линиям придаются различные фенотипическне маркеры . Таковыми могут служить дефект по пшидгадашазс в одной из линий-партнеров и дефект по гипоксан-тингумшнфосфорибозллтрансфераэе в другой, обеспечивающие чувствительность к

ГЛТ (nmoicnirniii, пиипогперии, тимидил) среде. При слиянии происходит комплементации ферментных дефектов (Wong and Cclvin, 1987). Возможно сочетание ГАТ чувствительности с устойчивостью х аналогу неомнцина G418 или ингибитору мембранной ЛТФязм уабшшу о одной из линий-партнеров, При таком подходе п качестве второго партнера используется ГАТ устойчивая гпбридомная линия "дикого типа* н селекция проводится на ГАТ среде, содержащей G418 или укбаин {de Lau et at, 1989).

В данной работе описывается два подхода к слиянию гибридом, продуцирующая МКА (моноклональные анпггела) к фактору некроза опухолей а (ФНО-а) и неоргяьи-чгской ннрофосфятазе (НПФ) E«chcrichia coli. Первый метод, описанный ранее, включал получение двойных муганпгых клеток, устойчивых к 8-i, iryaimriy н G-118, и сличиие и* с гнбридомой дикого типе (de Leu et al, 1989). Дтя получения 8-Аэа11 мугантов, клетки культивировали в присутствии токсичного аналога азотистых осноияшш в-азагуянния. Как видно из таблицы 3, эффективность образования таких нук-шгов была достаточно висогой и различалась у четырех различных гибридом, Одтко, при проверке мугантних клоноа на чувствительность к ГАТ среде, оказалось, •пк клетки шбркдомы PFB1 с аномально высокой частотой рсвертирорали к исходному фенотипу (таблица 3), как было показано в трех независимых экспериментах. Данная гибридома не могла быть использована в качестве партнера ли сличим. ?-Рпагуан1шусгойчивые мушпи трех других гибридом (10F11, ERG1, IIR21) имели стабильный фенотип. Гибридом» 10Г11 была использовала для введения гена устойчивости к нсомшушу в составе ретровирусного вектора pPS3neo путем инфекции, через пакующую клеточную лгапио у2.

В другом случае, для придаю«» гибридомам селективных маркеров в их клетки билн введены гены устойчивости к различным антибиотикам в составе рстровирусггых векторов pPS3neo н pPSHm2 (Рис. 3). Так как регровирусиые векторы при введении их и пакующую линию у2 эффективно инжапсидируются в вирионм, вся процедура введения генов устойчивости к антибиотикам в гибридомы сводилась к инкубированию клеток гибридом в супсрнатантс соответствующей пакующей линии и высеву их на подходящую селективную среду. Клоны гибридом, которые приобрели устойчивость к антибиотикам, сохраняли стабильный фенотип в течение длительного культивирования даже в отсутствие сел».кции. Эффективность инфицирования клеток гибридом рскомбинагггнымн регровирусными вирнонамц составляла от 0,1% до 1%.

pl»S2iico ( LTR )

II с о

nbs viz

Tir

ppt

LTR

pPS2IIm

P и в E P Sp P - s v h y g г о

Н^П ы,, „,

р 11 в Е

inpt

LTR

Рисунок 3. Генетические и рестрикщюнпие карты векторов pPS3neo и pPS2Htn. LTR terminal repeat) - длинные концевые повторы; vj/ - область, ответственная за упа геномной РНК в вирион; PBS (primer binding site) - сайт связывания пролиноьой т-РИК (poiypurine tract) - сайт праймиронания синтеза шиос-цспи ДНК провнруса; SV - р область вируса SV10, содержащая энхансер/промотор транскрипции; пео -неомниинфосфотран^^/еразы; hygro - ген гигромицннфосфогрансферазы; сайты рестри B-Bamlll, C-Clal. E-EcoRl, H-lIindlU, I'-Pstl, Sp-Splil.

Та5л

Часина образования 8-Азак мутантов в культуре клеток гибридом

i Линии

*К'ол-во клеток,

! гибридом I подвергнутых селекции

j 5х 105 j 5 х 104 i 5 х 103

Подсчитанная Кол-во клонов, частота | проверенных j на ГАТ-чувст-! вительность

Кол-в ГА1лкл

PI Ы

>96

>96

52

1 х 10

64

: mm

1 х 10 s

25

ERG1'

76

2 х 10

25

: ;f.R2T 47 6 0 1 X Ï04 , ;

♦Клепси-гибридом культивировали h 96-луночных пчаншетах s грис> тсдам 23 M

токсичного aaa;ioia азотистых оснований 8-азагуанииа.

* "Клоны клеток гибридо.мы PFB1 утрачивали чувствительность к ГАТ^еде ft теленке нескольких дней культивирования без селекции по 8-азагуапииу.

2

4

5

Маркированная гибридома 10F1 lA3aRNeoR была использована в качестве icpa для слияния с гибридомой дикого типа PFB1, а маркированные клетки NeoR в качестве партнера для гнбрвдомц PFBlHmR. После слияния смесь клггох осилась на селекппшу»о среду, способную элиминировать каждого партнера в тост и позволяющую выжить только гибридам двух гибридом. В таблице 4 ана эффективность образования фенотипически гибридных клонов, а также нх бность продуцирова- биспсцифпчсские антитела. Так как гибридами 10F11 и продуцируют моноклональпые антитела, различающиеся по изотппу (IgG2a и соозиетствсгаго), а также по специфичности к антшену (10F11 синтезирует 'ела к фактору некроза опухолей a, PFB1 - к пцрофосфатазе Escherichia coli), me биспецифических антител в супернатантах гибридных клонов было ровано в нммуноферментном анализе как по антигену, так и по изотипу. Как ано в табтще 4, в псрЕом варианте слияния более 50% клопов со смешанным гппом синтезировали бнспецнфнческне антнтеяа. Во втором случае оценить ститшость образования клонов со смешанным фенотипом не представлялось >жным, из-за того, что селекция по гнгромшцшу Б, как показал конгроль, не была точ1,о жссгкой. Видимо концентрация пп-ромшцша Б, выбранная для рнмептч, была не оптимальной для полного подавлетш роста клеток партнера, ко, 2 клона из 13 тестированных продуцировали биепецифическис антитела. На «пин этого мы сделали заключение, что эффективность образования гпбрэдои адом п обоих вариаш'ах слияния была сходной (таблица 4).

Таким образом, нами бшн получены квадромы, продуцирующие Пифические антитела, при помощи двух различных методов. Эффективность овация хвадром в обоих случаях была сходной. Однако, использование ■вирусных векторов было более простой и быстрой процедурой мечення клеток, ак получение Азак NeoR мутантов требовало два этапа клонировзнпя клеток н ■рку клонов на чувствительность к ГАТ среде. Кроме того, 8-Азаа мутанты адомы PFB1 реверпфовали к дикому фенотипу с очень высокой частотой н ■ыу не могли быть использованы в качссгвс партнера для слияния, что также гея ограничением применения этого методз для мечетш клеток. Описанный нами ( маркирования клеток гибридом при помощи ретроБнрусних векторов, несущих rainiriie селективные гены устойчивости к гнгромтршу Б и женещггнпу (G-418), ичсски не имеет ограничения. Используя пакующие линии, продуцирующие ■вирусные вирионы с широким спектром хозяев, аналогичный метод может был» сиги к любому виду и типу клеток позвоночных, включая человека.

'Гашшил ■)

4»<лсп;1 получения гибридных клетох, продуцирующих биспсцнфичсскис анпгтела

Лншш гибридом Кол-во Ю1СТОЖ, подвергнутых слиянию (млн.) Кол-во клонов со смешанным фенотипом Пропет клопо», продуцирующих биспсцнфичсскис

ГАТКИеок] ЫеоВДт* анпггела

IV» 1 + ЮШГЛ'Г^с,)« 3 + 3 22 50%

П-1Я 3 0 -

ЮГШ'ЛТ'Ко^ 3 0 -

РРВ1Нтл + ЮРИЫео* 3 + 3 - . 221 »

РРВШш» 3 0 -

ЮРПКсо* 3 197

"Как показал контроль, селекция по гогроыицину Б ве была достаточно жестгой, поэтому процигг клонов, продуцирующих биспецифпческие антупеля, не мог быть точно подсчитан. Но, поскольку 2 клона из 18 тестированных продуцировали бислецнфичеехие антитела, можно заключить, что частота образования гибридных клонов в этом варианте слшишя была приблизительно такой же, как и в первом.

выводы

1. "Мшшмалыпле" рстровирусные векторы, lie содержащие внутренних п о сл ед о в ате л и i о сте ft генома вируса лейхемш! мышей Молони, способны реплицироваться.

2. Цнс-дсйствуюп{ис последовательности, такне как: длинные концевые повторы (Т.ТК), сайт связывания т-РНК загравки (PQS) п полнпуриновьш тракт (PIT) являются достаточными для корректной обратной транскрнпшш рстровнрусиого генома.

3. Одни инфекционный внрион, содержащий "минимальные" рстровирусные геномы, продуцирует только один провнрус.

4. Gag-послсдоватслыюсть вовлечена в специфическое распознавание геномных молекул РНК только через образование общей вторичной структуры с областъю.

5. U5 район вирусного LTR не является независимым сигналом упаковки. Эта последовательность, вероятно, образует общую вторичную структуру с у областью, которая и распознается вирусными белками как сигнал упаковки.

6. у * н ц) геномы не конкурируют за белки вирионов в пакующей гшшш *у2.

7. Использование рс:, овнруспых векторов, кодирующих различные доминантные селективный маркеры, является простым и быстрым методом мечення клеток с целью получения межклеточных гибридов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории клеточной молекулярной иммунологии НИИ ГПК МЗ РБ г.Минск: Тихонову И.И. н Лобановой Л Г», за непосредственную помощь, оказанную при выполнении работы.

Особую благодарность автор выражает своему научному руководителю, доктору медицинских наук Войтенку H.H., сделавшему возможным выполнение этой работы, за научное руководство и большую помощь при выполнении работы.

Автор также выражает глубокую благодарность своему научному руководителю, профессору, доктору оологических наук Тихоненко Т.И. за общее научное руководство и постоянную поддержку при выполнении работы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фомин И.К., Тихонов И.И., Прасолов B.C., Войтснок H.H. Перенос доминантных сслыгтивимх гепов при помощи ретровирусных векторов - простой и быстрый метод получения гибридов гибридом// Молекуляр. генетика, мнкробиол. и внрусол. -1993. -NM. -С.31-34.

2. Фомип П.К., Лобанова A.D., Войтснок H.H. Влияние внутренних последовательностей генома вируса лейхемш! мышей Молода на репликацию// Генетика. -1995. -T.31.-N11. -С. ¡490-1497.

3. Тихонов И.Н., Фоши U.K., Дорошенко Т.М., Чальш Ю.В., Войтснок Pi.H. Экспрессия к-ДНК рецептора первого типа шггерлейкшт 8 человека в фибробластах BALB ЗТЗ и характеристика продуктов экспрессии// Мол. биол. -1996, -Т.30. - С. 1014-

io:i.

4. Фомин U.K., Петевка Н.В., Палютнч A.B. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus - продуцент моноклонзльпого антитела к пнрофосфатазс Escherichia coli;'/ Авторское свидетельство СССР, N1712412, 1992.

5. Fomm I., Tkithonov I., Prasolov V., and Voitenok N. Tbc use of retroviral vectors combining Uie selectable markers for »ht generation of hybrid hybridomasII International Conference on AIDS, Caacer and Human Retroviruses, 18-22 November, 1992, St.Peterburg, Abstr. -P.71.

6. Фомин U.K., Лобанова А.Б. Влияние внутренних последовательностей гсиома вируса лейкемии мышей Молоки на репликацию// III съезд Белорусского научного общество иммунологов н аллергологов, 7-9 нюня, 1995, Гродно, Тезисы докладов. -С.189-190.