Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение особенностей пролиферации эмбрилнальных клеток японских ускоренно стареющих мышей (SAM)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Семенова, Ирина Валерьевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. Клеточный цикл 9 1.1 .Состояние пролиферативного покоя

1.2. Факторы роста

1.3. Активация тирозинкиназных рецепторов факторами роста

2. Проблема концевой недорепликации

2.1. Пролиферация клеток in vitro. Ограничение пролиферативного 17 потенциала клеток многоклеточных организмов

2.2. "Теломерная теория старения, или теория маргинотомии" А. Оловникова

2.3. Экспериментальные подтверждения теории A.M. Оловникова

3. Теломеры

3.1. Теломерный повтор

3.2. Функции теломер

4. Теломераза

4.1. РНК - компонент теломеразы

4.2. Теломеразные белки

4.3. Работа теломеразы

4.4. Механизм образования 3' - одноцепочечного фрагмента

4.5. Экзонуклеазная активность теломераз

4.6. Альтернативные механизмы поддержания длины теломер

4.7. Ингибиторы обратных транскриптаз нуклеотидной природы

5. Пролиферация клеток различных видов в культуре

5.1. Морфологические стадии старения фибробластов в культуре

5.2. Фибробласты человека в культуре

5.3. Старение, или Ml

5.4. Состояние "кризиса", или М

5.5. Клетки мыши в культуре

6. Ускоренно стареющие мыши линий SAMP и SAMR

7. Связь между старением клеток в культуре и естественным старением 46 организма

7.1. Корреляция пролиферативного потенциала клеток с видовой 46 продолжительностью жизни

7.2. Зависимость пролиферативного потенциала фибробластов от возраста 46 донора

7.3. Низкий пролиферативный потенциал фибробластов при наследственных 48 болезнях преждевременного старения - прогериях

7.4. Данные об ограниченности потенциала клеточных делений in vivo

Материалы и методы

1. Животные линий SAMP-1, SAMR-1, СВА

2. Получение животных с датированной беременностью

3. Получение эмбриональных фибробластов мыши

4. Условия культивирования клеток

5. Замораживание клеточных культур

6. Размораживание клеточных культур

7. Культивирование клеток в присутствии перекиси водорода

8. Выявление активности эндогенной (5-галактозидазы (рН=6,0)

9. Пролиферативный покой и стимуляция ростовыми факторами

10. Радиоавтография

11. Исследование фосфорилирования тирозина

12. Определение теломеразной активности (ТАК)

13. Ингибиторы обратных транскриптаз

14. Изучение телом ер

15. Гибридизация in situ

16. Приготовление хромосомных препаратов

Результаты

1. Рост эмбриональных фибробластов мышей в культуре

2. Количественные параметры роста и старения культур эмбриональных 63 фибробластов мышей линий SAMP-1, SAMR-1 и СВА

3. Пролиферативный потенциал ЭФМ линий SAMP-1, SAMR-1 и СВА

4. Время переживания клеток в неделящемся состоянии

5. Выявление активности эндогенной Р-галактозидазы (рН=6,0)

6. Пролиферативный ответ эмбриональных фибробластов мышей на стимуляцию 68 факторами роста

7. Уровень фосфорилирования белков по тирозиновым остаткам

8. Спонтанная трансформация

9. Теломеразная активность (ТАК)

10. Подавление функции теломеразы с помощью ингибиторов обратных 74 транскриптаз

11. Изучение телом ер и кариотипа эмбриональных фибробластов мышей линий 76 SAMP-1 и SAMR

Обсуждение

1. Морфологически старение клеток SAM неотличимо от старения нормальных 81 мышиных фибробластов

2. Повышенная активность эндогенной (3-галактозидазы (рН=6,0) отражает 81 ускоренное старение эмбриональных фибробластов мышей SAM

3. Снижение пролиферативного ответа на стимуляцию факторами роста в 81 процессе старения эмбриональных фибробластов мышей в культуре

4. Вызывается ли спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов 83 мышей в культуре повышением (появлением) ТАК?

5. Существует два пути спонтанной трансформации

6. Связь длины телом ер у мышей и пролиферативного потенциала их клеток в 85 культуре

7. Объяснение того, как относительно длинные теломеры мыши могут 86 индуцировать пролиферативное старение

8. Тройственная корреляция между продолжительностью жизни мышей, 88 пролиферативным потенциалом их эмбриональных фибробластов и временем переживания состарившихся фибробластов в неделящемся состоянии

9. Повышенная нестабильность ДНК в клетках SAM может объяснить все 91 наблюдаемые в наших экспериментах явления

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение особенностей пролиферации эмбрилнальных клеток японских ускоренно стареющих мышей (SAM)"

Ежегодно в мире тратятся огромные средства на борьбу со старением. Считается, что половина всех средств, затрачиваемых на медицинское обслуживание, расходуется на поддержание последнего года жизни человека. Многие болезни (такие как болезнь Паркинсона, сердечно - сосудистые заболевания и т.п.), ранее считавшиеся болезнями пожилых людей, заметно "помолодели", что наносит значительный вред мировой экономике. Ухудшение экологической обстановки привело к резкому возрастанию количества онкологических заболеваний в промышленно - развитых странах. Все это делает необходимым изучение процессов, лежащих в основе естественного старения и канцерогенеза.

Процесс естественного старения организмов - одна из самых сложных в изучении проблем. Факторы, влияющие на этот процесс, многочисленны и разнообразны: от условий жизни и рациона питания, до сложных генетических и молекулярных механизмов.

Еще в конце XIX века Август Вейсман высказал предположение о том, что старение организмов связано со старением их клеток. В 1961 году Хэйфлик на основании результатов многолетней работы предположил, что старение клеток в культуре отражает те же самые процессы, которые обуславливают старение организма в целом. Изучение культур клеток, взятых от больных различными формами прогерий (болезни преждевременного старения), подтвердили правоту предположения, сделанного Хэйфликом.

Изучение старения человека ограничено этическими причинами и большой длительностью процесса естественного старения. Поэтому для интенсивных исследований в этой области необходимо создание подходящих животных моделей. Из множества животных моделей сейчас наиболее перспективной, на наш взгляд, являются японские ускоренно стареющие мыши SAM и культуры их клеток.

В 70-х - 80-х годах в Японии доктор Такеда и его коллеги вывели путем инбридинга на базе мышей линии AKR/J группу линий ускоренно стареющих мышей SAM - Senescence Accelerated Mice. Мыши SAM включают две группы линий. Первая из них - группа SAMP -Accelerated-Senescence Prone Mice - мыши, склонные к ускоренному старению и имеющие малую (около одного года) среднюю продолжительность жизни - включает 9 линий. Вторая - группа SAMR - Accelerated-Senescence Resistant Mice - мыши, резистентные к ускоренному старению и имеющие практически нормальную (около полутора лет) среднюю продолжительность жизни - включает 3 линии. Мышей SAM удобно использовать в экспериментах в парах: SAMP - опыт, SAMR - контроль. Наиболее удачной парой линий является пара SAMP-1 - SAMR-1, так как ускоренное старение животных линии SAMP-1 в наибольшей степени схоже с естественным и не сопровождается ярко выраженными патологиями, как в случае других линий мышей SAMP.

В качестве объектов изучения нами были выбраны культуры эмбриональных фибробластов трех линий мышей: SAMP-1, SAMR-1 и СВА (СВА - это линия мышей, имеющая нормальную среднюю продолжительность жизни - 2,5 - 3 года). В нашей работе мы постарались наиболее полно охарактеризовать поведение в культуре эмбриональных клеток мышей указанных линий.

Наиболее часто в литературе в качестве главной характеристики старения клеток в культуре приводится максимальное число удвоений популяции, которое могут проделать клетки in vitro (так называемый пролиферативный потенциал клеток). Поэтому одной из целей нашей работы было измерение и сравнение пролиферативных потенциалов эмбриональных фибробластов мышей всех трех линий.

Поскольку любой многоклеточный организм состоит из делящихся и неделящихся клеток, то, теоретически, на продолжительность жизни организма должны влиять, по меньшей мере, два фактора: пролиферативный потенциал делящихся и время переживания неделящихся клеток. Исходя из этого, представлялось целесообразным изучить на одних и тех же культурах не только пролиферативные потенциалы эмбриональных фибробластов мышей указанных линий, но и время их переживания в неделящемся состоянии после прекращения делений.

Из литературы известно, что пролиферативный ответ клеток на стимуляцию различными факторами роста снижен у старых клеток по сравнению с молодыми. В связи с этим мы решили исследовать пролиферативный ответ эмбриональных фибробластов мышей линий SAMP-1, SAMR-1 и СВА, находящихся на различных стадиях пролиферации в культуре, на стимуляцию несколькими факторами роста и сывороткой.

Показано, что эмбриональные фибробласты мыши обладают выраженной способностью к спонтанной трансформации, поэтому мы посчитали необходимым исследовать этот процесс на наших объектах.

Поскольку большинство полученных нами клонов спонтанных трансформантов обладало теломеразной активностью, нами были проведены эксперименты по блокированию функции теломеразы с помощью ингибиторов обратных транскриптаз с целью выяснения роли активации теломеразы при спонтанной трансформации. Следует отметить, что изучение активации теломеразы представляет интерес не только для фундаментальной науки, но и имеет большое прикладное значение, так как активация этого фермента связана с процессами иммортализации и большинством случаев раковых заболеваний.

В соответствии с теломерной теорией A.M. Оловникова клетка стареет из - за потери последовательностей ДНК на концах хромосом вследствие их неполной репликации. Следовательно, телом еры могут играть ключевую роль в преждевременном старении мышей SAM. Для проверки этого предположения нам было необходимо измерить и сравнить между собой теломеры мышей линий SAMP-1, SAMR-1 и СВА.

Принимая во внимание все вышесказанное, мы посчитали, что мыши SAM и культуры их эмбриональных фибробластов представляются удобной моделью для изучения взаимосвязи старения на организменном и клеточном уровнях.

Обзор литературы

1. Клеточный цикл.

Совокупность последовательных событий, происходящих от момента образования клетки в результате митотического деления до окончания ее деления на две дочерние клетки, называют клеточным (митотическим) циклом. Обычно клеточный цикл у эукариот разделяют на четыре временных отрезка: митоз (М), пресинтетическая (01), синтетическая (Б) и постсинтетическая (02) фаза (рис.1 А).

Рис. 1: А - Клеточный цикл. "Точки контроля". Состояния покоя. Б - Остановка клеточного цикла в '^точках контроля" в ответ на стрессы (согласно Копнин, 2000).

Известно, что общая продолжительность, как всего клеточного цикла, так и отдельных его фаз значительно варьируют не только у разных организмов, но и у клеток разных органов и тканей, а также в клеточных популяциях идентичных клеток. Наиболее подвержена изменениям Gl-фаза.

Предполагается, что простейший клеточный цикл может состоять только из двух фаз -S и М (Murray, Kirschner, 1989). Такой гипотетический клеточный цикл имеет место во время раннего эмбриогенеза у организмов с большими яйцеклетками, например, у Xenopus и Drosophila. В этих яйцеклетках все компоненты, необходимые для многочисленных делений, пресинтезированы во время оогенеза и сохраняются в цитоплазме. Поэтому после оплодотворения деления происходят чрезвычайно быстро, и фазы G1 и G2 отсутствуют.

Повреждения ДНК, дефицит нуклеотидов, разрушение микротрубочек, появление микроядер/' '.

G2-noKoii

G2 Z1

G2

1.1. Состояние пролиферативного покоя.

Клетки, которые вышли из митотического цикла на неопределенное время, сохраняя жизнеспособность и пролиферативный потенциал, называют покоящимися клетками (Епифанова и др., 1983). Такие клетки, находящиеся вне митотического цикла ("вышедшие из цикла"), содержат, как правило, пресинтетическое количество ДНК. В отличие от фаз цикла их состояние обозначается как GO-фаза, или состояние пролиферативного покоя. Но поскольку было показано, что в редких случаях, особенно в условиях организма, клетки могут переходить в состояние покоя после завершения синтеза ДНК и содержать соответственно удвоенное постсинтетическое количество ДНК, было предложено определять состояния покоя как GO - покой и G2 - покой, в зависимости от того, из какой фазы клеточного цикла (G1 или G2) клетки вышли в состояние покоя (рис. 1А) (Никольский, 1984). Клетки в культуре можно ввести в состояние пролиферативного покоя за счет снижения содержания сыворотки в культуральной среде, т.е. пониженным содержанием факторов роста - так называемое "сывороточное голодание". Выход клеток из покоя вызывается добавлением в среду сыворотки. Переход клеток в состояние покоя также наблюдается при высокой плотности культуры даже в присутствии факторов роста. Следует отметить, что у многоклеточных организмов клетки многих типов переходят в состояние покоя в результате окончательной дифференцировки и теряют способность делиться независимо от внешних стимулов.

В клеточном цикле постулировано существование так называемых "точек контроля" (checkpoints) (рис.1 А), прохождение которых возможно лишь в случае нормального завершения предыдущих этапов и отсутствия поломок. Выделяют, по меньшей мере, четыре такие точки: в Gl, S, G2 фазах и "точку контроля сборки веретена деления" в митозе (рис.1 А) (Sherr, 1996; Murray, 1995; Elledge, 1996). Остановка клеточного цикла в этих точках происходит при различных повреждениях ДНК, изменениях числа хромосом, образовании микроядер, разрушении микротрубочек, дефиците нуклеотидов и т. д. (Копнин, 2000).

Универсальная теория клеточного цикла предполагает, что клетка как целое в течение клеточного цикла проходит через ряд состояний (Hartwell, 1995). В каждом состоянии критические регуляторные белки претерпевают фосфорилирование или дефосфорилирование, определяющее переход этих белков в активное или неактивное состояние, их взаимосвязи и/или клеточную локализацию. В настоящее время признано, что изменения состояния клетки в определенных точках цикла определяются особыми комплексами циклинзависимых протешдагааз (Cyclin - dependent kinases - Cdk) с белками -циклинами (рис. 2) (Morgan, 1997).

Рис. 2: Регуляция клеточного цикла комплексами циклинзависимых киназ и циклинов (согласно Копнин, 2000).

Циклин В

Циклин Е Cdk4,6

Cdk2

В клетках млекопитающих существует, по меньшей мере, шесть различных Cdk: Cdkl-6. Cdkl ассоциируется с циклинами А и В и участвует в переходе G2 - М. Cdk2 может связываться с циклинами А, В, Е, D2 и D3 (но не с DI) (Sherr, 1995) и является одной из основных киназ, регулирующих переход G1 - S и прохождение через S-фазу (Fang, Newport, 1991; Paris et al., 1991). Cdk3 экспрессируется в большинстве клеток на незначительном уровне, и ее функция пока не выяснена, хотя предполагается, что она, подобно Cdk2, участвует в переходе G1 - S (Van den Heuvell, Harlow, 1994). Данные о роли Cdk5 и о взаимодействующих с ней циклинах противоречивы. Cdk4 и Cdk6 связываются с циклинами типа D и отвечают за прохождение Gl-фазы и переход в S-фазу (Sherr, 1994).

Каждый тип циклинов, обозначенных от А до Н, имеет гомологичный участок ~150 аминокислотных остатков, называемый "циклиновым боксом" (Hunt, 1991). Этот участок отвечает за связывание с Cdk (Kobayashi et. al., 1992, Lees, Harlow, 1993). последовательность после "циклинового бокса", которая повышает их стабильность. Благодаря этому они сохраняются в интерфазе, но подвергаются протеолизу в митозе убиквитин - зависимым путем (Glotzer et. al., 1991).

Основными белками, контролирующими скорость прохождения Gl-фазы в клетках высших эукариотов, являются циклины типа D. Существует три типа циклина D: Dl, D2 и D3, которые не являются взаимозаменяемыми.

Каждая Cdk представляет собой каталитическую субъединицу (серин - треониновую киназу) голоферментного комплекса, для активности которой требуется присутствие активаторной субъединицы - циклина (Morgan, 1995). Регуляция активности Cdk осуществляется за счет изменения уровня определенных циклинов в определенные фазы клеточного цикла. Кроме того, активность Cdk регулируется изменениями фосфорилирования их определенных аминокислотных остатков, а также с помощью ингибиторов Cdk. В активной форме комплексы циклин - Cdk фосфорилируют регуляторные белки, контролирующие протекание данной фазы. Например, основным субстратом комплексов циклин D-Cdk4 и циклин D-Cdk6 являются белок Rb и Rb-подобные белки pi05 и р130. PRb и его гомологи дефосфорилированы в неделящихся клетках, находящихся в ранней Gl-фазе (Mittnacht, 1998). В таком состоянии они связывают и блокируют комплексы транскрипционных факторов E2F-DP (E2F-1, -2, -3, -4, -5 и DP-1, -2, -3), регулирующие активность ряда генов, продукты которых необходимы для начала и прохождения S-фазы. Связывание белков семейства E2F с pRb ингибирует их транскрипционную активность. При митогенных сигналах, вызываемых ростовыми факторами, pRb в середине Gl-фазы фосфорилируется комплексами циклин D-Cdk4 или циклин D-Cdk6, что вызывает высвобождение транскрипционных факторов E2F-DP из комплекса с pRb и их активацию (Mittnacht, 1998). Одним из следствий этого является стимуляция транскрипции гена циклина Е, в результате чего активируются комплексы циклин E-Cdk2, также фосфорилирующие pRb. Таким образом, возникает регуляторная петля, поддерживающая активность транскрипционных факторов E2F-DP и контролируемых ими генов, обеспечивающих репликацию ДНК. После завершения S-фазы pRb переходит в дефосфорилированное состояние, в котором он блокирует активность E2F-DP и вход в следующую S-фазу. Следовательно, pRb играет ключевую роль в регуляции вхождения клетки в S-фазу.

Вообще, сигнальный путь Cdk-pRb-E2F контролируется не только pRb, но и многими другими супрессорными белками. Некоторые из них являются ингибиторными субъединицами Cdk (CKIs - Cdk Inhibitors), опосредующими остановку клеточного цикла в ответ на различные внеклеточные и внутриклеточные сигналы (Morgan, 1997).

Идентифицированы два семейства CKIs: Ink4 и Cip/Kip. Первое включает четыре представителя, в том числе опухолевые супрессоры pl5]NK4b и pl6INK4a. Белки Ink4 обладают достаточно узкой специфичностью: связывая Cdk4 и Cdk6, они препятствуют образованию их комплексов с циклинами D (Morgan, 1997; Sherr, 1996). Семейство Cip/Kip состоит из трех членов: p21WAFi/clpI, р271С1Р1 и р57К1Р2. Эти белки связывают и ингибируют уже полностью сформированные комплексы циклин D-Cdk4,6, циклин E-Cdk2 и циклин A-Cdk2. Кроме того, p2iWAF1/CIPI способен блокировать и комплекс циклин B-Cdkl, ответственный за продвижение по 02-фазе и вход в митоз (Morgan, 1997; Sherr, 1996).

Ген р53 является центральным компонентом механизма, обеспечивающего удаление из организма поврежденных клеток. На нем сходятся многочисленные сигналы, отслеживающие состояние клетки и ее окружения. Р53 способен изменять свои свойства за счет разного рода модификаций молекулы посредством фосфорилирования, ацетилирования и связывания с другими молекулами, регулирующими его активность. Р53 представляет собой полифункциональный белок, основная функция которого осуществляется в ядре. Ген р53 постоянно транскрибируется, однако образующийся белок быстро подвергается убиквитин - зависимой деградации в протеосомах (Chowdary et al., 1994; Ichihara, Tanalca, 1995). Поэтому в клетках большинства тканей уровни белка чрезвычайно низки и могут находиться на пороге детекции. Активация белка р53 в ответ на разнообразные стрессы и повреждения происходит, главным образом, на посттрансляционном уровне за счет замедления его деградации, а также за счет конформационной перестройки молекулы, приводящей к повышению функциональной активности. Р53 приписывается целый ряд функций и активностей, однако основной его функцией является способность служить транскрипционным фактором (Raycroft et al., 1990). Р53 является ключевым компонентом некоторых "точек контроля". Р53 активируется в ответ на повреждения ДНК, недостаток нуклеотидов, разрушение микротрубочек, образование микроядер, гипоксию, потерю контактов клетки с субстратом и т.д. (рис. 1Б) (Копнин, 2000). При этом сенсорами повреждений ДНК, по всей видимости, являются большая субъединица ДНК- зависимой протеинкиназы и/или белок ATM (Ataxia-Teleangioectasia Mutated), обладающие способностью, с одной стороны, распознавать свободные концы ДНК, а с другой, фосфорилировать р53 по Ser-15, препятствуя тем самым его связыванию с белком Mdm2, последующему транспорту из ядра и деградации (Prives, 1998;Giaccia, Kastan, 1998). Кроме того, имеются сообщения о способности С-концевого домена белка р53 непосредственно связываться с участками одноцепочечной ДНК (Bakalkin et al., 1994; Jayaraman, Prives, 1995), участками неспаренных оснований (Lee et al., 1995) и однонитевых разрывов (Reed et al, 1995), что указывает на возможное прямое участие р53 в узнавании повреждений ДНК.

Одним из следствий активации р53 является изменение экспрессии регулируемых им генов, таких как ВАХ, BCL2 и других, контролирующих апоптоз, и p21WAF1, GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage-induced), экспрессия которых приводит к остановке клеточного цикла (Agarwal et al., 1998; Amundson et al., 1998; Ko, Prives, 1996). В результате клетка, в которой уже произошли или только могут произойти генетические изменения, либо гибнет в результате индукции апоптоза, либо останавливается в Gl- или G2-, а иногда в S-фазе клеточного цикла (рис. 1Б).

1.2. Факторы роста.

К ростовым факторам (митогенам) относят вещества, как правило, пептидной природы, обладающие способностью стимулировать синтез ДНК (пролиферацию клеток) непосредственно или в совокупности с другими факторами. Наибольшее количество факторов роста обнаружено в сыворотке крови. Концентрация факторов роста в сыворотке очень мала - порядка Ю~10М.

Факторы роста многочисленны и разнообразны. В настоящее время выделяют семейство инсулиноподобных факторов роста, FGF, PDGF и EGF семейства, семейство трансформирующего фактора ß (TGFß) и некоторые другие. Кроме того, существуют факторы роста, пока не отнесенные к какому - либо семейству. Следует отметить, что одни факторы роста специфичны по отношению к клеткам-мишеням, другие - менее избирательны и действуют на несколько типов клеток. Фактор роста высокомитогенный для одного типа клеток может действовать как ингибитор пролиферации для другого типа клеток.

В процессе пролиферативного старения изменяется способность клеток отвечать на стимуляцию факторами роста. Имеются данные о потере чувствительности к ряду митогенов диплоидными фибробластами, полученными из эмбриональных источников и от взрослых доноров, после их серийного пассирования в культуре (Cristofalo et. al., 1989, Ohno, 1979, Plisco, Gilchrest, 1983, Phillips et. al., 1984). Культуры клеток, полученные из тканей, взятых у пациентов, имеющих синдромы преждевременного старения, такие как прогерия и синдром Вернера, дают значительно более низкий ответ на стимуляцию инсулином, FGF, PDGF и сывороткой, чем клетки здоровых людей (Harley et. al., 1981, Bauer et. al., 1986). Показано также, что белок Rb не фосфорилируется в "старых" фибробластах человека после стимуляции сывороткой, хотя фосфорилируется в "молодых" клетках (Stein et. al., 1990).

Таким образом, по мере старения клеток наблюдается снижение их чувствительности к факторам роста.

Среди митогенных биологических добавок, используемых для культивирования клеток, наибольшее распространение получила сыворотка крови. Сыворотка является сложной смесью множества биологических молекул с различными физиологическими активностями. К основным компонентам сыворотки, необходимым для выживания и роста клеток млекопитающих в культуре относятся: белки плазмы (альбумины, фибронектин, aj-макроглобулин, фетуин, трансферрин); полипептидные факторы роста (инсулин, инсулиноподобные факторы роста I и II (IGF), PDGF, EGF); глютатион; непептидные гормоны (кортизол (гидрокортизон), эстрогены, андрогены, тиреоидные гормоны (ТЗ, Т4)); липиды (линоевая кислота, холестерин, лизофосфатидная кислота, простагландины); метаболиты (аминокислоты, а-кетокислоты (пируват), полиамины); минеральные вещества (Fe2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, Se032", Co2+, V03~ Mo70246") (Maurer, 1986).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Семенова, Ирина Валерьевна

Выводы.

1. Пролиферативный потенциал эмбриональных фибробластов японских ускоренно стареющих мышей линии SAMP-1 меньше такового эмбриональных фибробластов линии SAMR-1, который, в свою очередь, несколько меньше пролиферативного потенциала эмбриональных фибробластов линии СВА. Существует корреляция между пролиферативным потенциалом эмбриональных фибробластов мышей в культуре и средней продолжительностью жизни мышей соответствующих линий.

2. Время переживания эмбриональных фибробластов мышей линий SAM в неделящемся состоянии снижено по сравнению с таковым эмбриональных фибробластов мышей линии СВА и так же, как и их пролиферативный потенциал, коррелирует со средней продолжительностью жизни животных соответствующих линий.

3. Старение эмбриональных фибробластов японских ускоренно стареющих мышей сопровождается ранним появлением в клетках активности эндогенной (3-галактозидазы (рН=6,0), параллельным снижением пролиферативного ответа на отдельные факторы роста и сыворотку и уменьшением уровня фосфорилирования тирозина.

4. Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мыши в большинстве случаев сопровождается увеличением (появлением) теломеразной активности и приводит к появлению иммортальных клеток.

5. Спонтанная трансформация эмбриональных фибробластов мышей линии СВА в присутствии ингибиторов обратных транскриптаз ведет к появлению клонов спонтанных трансформантов, лишенных теломеразной активности. Эти клетки обладают ограниченным пролиферативным потенциалом.

6. Средняя длина теломер в клетках мышей SAM больше, чем в клетках мышей СВА. Теломеры эмбриональных фибробластов SAMP-1 более гетерогенны по длине, чем теломеры эмбриональных фибробластов SAMR-1: имеются как более короткие, так и более длинные.

7. Предложен тест по изучению времени переживания состарившихся неделящихся клеток. Этот тест, в особенности в сочетании с окислительным стрессом, может быть полезным при изучении механизмов старения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Семенова, Ирина Валерьевна, Москва

1. Abuin M., Martinez P., Sanchez L. Localization of repetitive telomeric sequence (TTAGGG)n in four salmonid species. 1996, Genome, v. 39, p. 1035-1038.

2. Agarwal M.L., Taylor W.R., Chernov M.V., Chernova O.B., Stark G.R. The p53 network. 1998, J. Biol. Chem., v. 273, p. 1-4.

3. Allsopp R.C., Chang E., Kashefi-Aazam M., Rogaev E.I., Piatyszek M.A., Shay J.W., Harley C.B. Telomere shortening is associated with cell division in vitro and in vivo. 1995, Exp. Cell Res., v. 220, p. 194-200.

4. Allsopp R.C., Vaziri H., Patterson C., Goldstein S., Younglai E.V., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 89, p. 10114-10118.

5. Amundson S.A., Myers T.G., Fornace A.J., Jr. Roles for p53 in growth arrest and apoptosis: putting on the brakes after genotoxic stress. 1998, Oncogene, v. 17, p. 3287-3299.

6. Aparicio O.M., Billington B.L., Gottschling D.E. Modifiers of position effect are shared between telomeric and silent mating-type loci in S. cerevisiae. 1991, Cell, v. 66, p. 1279-1287.

7. Avilion A.A., Piatyszek M.A., Gupta J., Shay J.W., Bacchetti S., Greider C.W. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. 1996, Cancer Res., v. 56, p. 645-650.

8. Bailey S.M., Cornforth M.N., Kurimasa A., Chen D.J., Goodwin E.H. Strand specific postreplicative processing of mammalian telomeres. 2001, Science, v. 293, p. 2462-2465.

9. Balajee A.S., Dominguez I., Bohr V.A., Natarajan A.T. Immunofluorescent analysis of the organization of telomeric DNA sequences and their involvement in chromosomal aberrations in hamster cells. 1996, Mutat. Res., v. 372, p. 163-172.

10. Bauer E.A., Silverman N., Busiek D.F., Kronberger A., Deuel T.F. Diminished response of Werner's syndrome fibroblasts to growth factors PDGF and FGF. 1986, Science, v. 234, p. 1240-1243.

11. Baur J.A., Zou Y., Shay J.W., Wright W.E. Telomere position effect in human cells. 2001, Science, v. 292, p. 2075-2077.

12. Bayreuther K., Rodemann H.P., Hommel R., Dittmann K., Albiez M., Francz P.I. Human skin fibroblasts in vitro differentiation along a terminal cell lineage. 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), v. 85, p. 5112-5116.

13. Bednenlco J., Melek M., Greene E.C., Shippen D.E. Developmentally regulated initiation of DNA synthesis by telomerase: evidence for factor-assisted de novo telomere formation. 1997, The EMBO Journal, v. 16, p. 2507-2518.

14. Blasco M.A., Funk W., Villeponteau B., Greider C.W. Functional characterization and developmental regulation of mouse telomerase RNA. 1995, Science, v. 269, p. 1267-1270.

15. Blasco M.A., Lee H.W., Hände M.P., Samper E., Lansdorp P.M., DePinho R.A., Greider C.W. Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA. 1997, Cell, v. 91, p. 25-34.

16. Bodnar A.G., Ouellette M., Frolkis M., Holt S.E., Chiu C.P., Morin G.B., Harley C.B., Shay J.W., Lichtsteiner S., Wright W. E. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. 1998, Science, v. 279, p. 349-352.

17. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. 1976, Anal. Biochem., v. 72, p. 248-254.

18. Brown W.R.A., Mackinnon P.J., Villasante A., Spurr N., Buckle V.J., Dobson M.J. Structure and polymorphism of human telomere associated DNA. 1990, Ceil, v. 63, p. 119-132.

19. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., Reddel RR. Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity. 1995, The EMBO Journal, V.14, p. 4240-4248.

20. Busk F.L. The Hutchinson-Gilford progeria syndrome. 1972, Pediatrics, v. 80, p. 697-724.

21. Carrel A. Artificial activation of the growth in vitro of connective tissue. 1913, J. Exp. Medcine, v. 17, p. 14-19.

22. Chen J.L., Blasco M.A., Greider C.W. Secondary structure of vertebrate telomerase RNA. 2000, Cell, v. 100, p. 503-514.

23. Chernov D.N., Yegorov Y.E., Akimov S.S. Telomerase activity of mouse cells as a result of spontaneous transformation. 1996, Doklady Biochemisrtry, v. 349, p. 55- 57.

24. Chowdary D.R., Dermody J.J., Jha K.K., Ozer H.L. Accumulation of p53 in a mutant cell line defective in the ubiquitin pathway. 1994, Mol. Cell. Biol., v. 14, p. 1997-2003.

25. Cohn M., Blackburn E.H. Telomerase in yeast. 1995, Science, v. 269, p. 396-400.

26. Colige A., Nusgens B., Lapiere C.M. Altered response of progeria fibroblasts to epidermal growth factor. 1991, J. Cell Sei., v. 100, p. 649-655.

27. Collins K., Greider C.W. Tetrahymena telomerase catalyzes nucleolytic cleavage and nonprocessive elongation. 1993, Genes & Development, v. 7, p. 1364-1376.

28. Collins K., Kobayashi R., Greider C.W. Purification of Tetrahymena telomerase and cloning of genes encoding the two protein components of the enzyme. 1995, Cell, v. 81, p. 677-686.

29. Cristofalo V.J., Allen R.G., Pignolo R.J., Martin B.G., Beck J.C. Relationship between donor age and the replicative lifespan of human cells in culture: A réévaluation. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 95, p. 10614-10619.

30. Cristofalo V.J., Phillips P.D., Sorger T., Gerhard G. Alterations in the responsiveness of senescent cells to growth factors. 1989, J. Gerontol., v. 44, p. 55-62.

31. Cross S.H., Allshire R.C., McKay S.J., McGill N.I., Cooke H.J. Cloning of human telomeres by complementation in yeast. 1989, Nature, v. 338, p. 771-774.

32. Curatolo L., Erba F., Morasca L. Culture conditions induce the appearance of immortalized C3H mouse cell lines. 1984, In Vitro, v. 20, p. 597- 601.

33. Dimri G.P., Campisi J. Molecular and cell biology of replicative senescence. 1994, Cold Spring Symp. Quant. Biol., v. LIX, p. 67-73.

34. Dyson N. PRb, pl07 and the regulation of the E2F transcription factor. 1994, J. Cell Sci. Suppl., v. 18, p. 81-87.

35. Egan S. E., Weinberg R.A. The pathway to signal achievement. 1993, Nature, v. 365, p. 781783.

36. El-Deiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E., Levy D.B., Parsons R., Trent J.M., Lin D., Merser W.E., Kinzler K.W., Vogelstein B. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression. 1993, Cell, v. 75, p. 817-825.

37. Elledge S.T. Cell cycle checkpoints: preventing an identity crisis. 1996, Science, v. 274, p. 1664-1672.

38. Fang F., Newport J.W. Evidence that the Gl-S and G2-M transitions are controlled by different cdc2 proteins in higher eukaryotes. 1991, Cell, v. 66, p. 731-742.

39. Finch C.E. Longevity, senescence, and the genome. 1990, Chicago: University of Chicago Press.

40. Flint J., Bates G.P., Clark K., Dorman A., Willengham D., Roe B.A., Micklem G., Higgs D.R., Louis E.J. Sequence comparison of human and yeast telomeres identifies structurally distinct subtelomeric domains. 1997, Hum. Mol. Genet., v. 6, p. 1305-1313.

41. Flint J., Craddock C.F., Villegas A., Bentley D.R., Williams H.J., Galanello R., Cao A., Wood W.G., Ayub H., Higgs D.R. Healing of broken human chromosomes by the addition of telomeric repeats. 1994, Amer. J. Hum. Genetics, v. 55, p. 505-512.

42. Giaccia A.J., Kastan M.B. The complexity of p53 modulation: emerging patterns from divergent signals. 1998, Genes. Dev., v. 12, p. 2973-2983.

43. Girardi A J. Prevention of SV40 virus oncogenesis in hamsters. I. Tumor resistance induced by human cells transformed by SV40. 1965, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 54, p. 445-451.

44. Glotzer M., Murray A.W., Kirschner M.W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. 1991, Nature, v. 349, p. 132-138.

45. Goldstein S. Lifespan of cultured cells in progeria. 1969, Lanset, v. 1, p. 424.

46. Gottschling D.E., Aparicio O.M., Billington B.L., Zakian Y.A. Position effect at S. cerevisiae telomeres: Reversible repression of Pol II transcription. 1990, Cell, v. 63, p. 751-762.

47. Greider C.W., Blackburn E.H. A telomeric sequence in RNA of Tetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. 1989, Nature, v. 337, p. 331-337.

48. Greider C.W., Blackburn E.H. Telomeres, telomerase and cancer. 1996, Sci. Amer., v. 274, p. 92-97.

49. Greider C.W., Blackburn E.H. The telomere terminal transferase of Tetrahymena is a ribonucleoprotein enzyme with two kinds of primer specificity. 1987, Cell, v. 51, p. 887-898.

50. Greider C.W., Blackburn F. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in Tetrahymena extracts. 1985, Cell, v. 43, p. 405-413.

51. Griffith J.D., Comeau L., Rosenfield S., Stansel R.M., Bianchi A., Moss H., de Lange T. Mammalian telomeres end in a large duplex loop. 1999, Cell, v. 97, p. 503-514.

52. Haff R.F., Swim H.E. Serial propagation of 3 strains of rabbit fibroblasts, their susceptibility to infection with Vaccinia virus. 1956, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 93, p. 200-204.

53. Hamilton W.D. The moulding of senescence by natural selection. 1966, J. Theor. Biol., v. 12, p. 12-45.

54. Han H., Hurley L.H. G-quadruplex DNA: a potential target for anti-cancer drug design. 2000, TiPS, v. 21, p. 136-142.

55. Hande P., Slijepcevic P., Silver A., Bouffler S., van Buul P., Bryant P., Lansdorp P. Elongated telomeres in scid mice. 1999, Genomics, v. 56, p. 221-223.

56. Hara E., Smith R., Parry D., Tahara H., Stone S., Peters G. Regulation of pl6CDK2 expression and its implications for cell immortalization and senescence. 1996, Mol. Cell Biol., v. 16, p. 859-867.

57. Harley C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb? 1991, Mutat. Res., v. 256, p. 271-282.

58. Harley C.B., Futcher A.B., Greider C.W. Telomeres shorten during ageing of human fibroblasts. 1990, Nature, v. 345, p. 458-460.

59. Harley C.B., Goldstein S., Posner B.I., Guyda H. Decreased sensitivity of old and progenic human fibroblasts to a preparation of factors with insulin activity. 1981, J. Clin. Invest., v. 68, p. 988-994.

60. Harley C.B., Vaziri H., Counter C.M., Allsopp R.C. The telomere hypothesis of cellular aging. 1992, Exp. Gerontol., v. 27, p. 375-382.

61. Harper J.W., Adami G.R., Wei N., Keyomarsi K., Elledge S.J. The p21 Cdk-interacting protein Cipl is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases. 1993, Cell, v. 75, p. 805-816.

62. Harrington L., McPhail T., Mar V., Zhou W., Oulton R., Bass M.B., Arruda I., Robinson M.O. A mammalian telomerase-associated protein. 1997, Science, v. 275, p. 973-977.

63. Hartwell L. Introduction to cell cycle controls. 1995, In: Cell cycle control, Ed. By Hutchison L., Glover D.M., Oxford University Press, p. 1-15.

64. Hastie N.D., Dempster M., Dunlop M.G., Thompson A.M., Green D.K., Allshire R.C. Telomere reduction in human colorectal carcinoma and with ageing. 1990, Nature, v. 346, p. 866-868.

65. Hayflick L. The limited in vitro life time of human diploid cell strains. 1965, Exp. Cell. Res., v. 37, p. 614-636.

66. Hayflick L., Moorhead P.S. The serial cultivation of human diploid cell strains. 1961, Exp. Cell Res., v. 25, p. 585-621.

67. He P., Yasumoto K. Dietary butylated hydroxytoluene counteracts with paraquat to reduse the rate of hepatic DNA single strand breaks in senescence accelerated mice. 1994, Mech. Aging Dev., v. 76, p. 43-48.

68. Henderson E.R., Blackburn E.H. An overhanging 3' terminus is a conserved feature of telomeres. 1989, Mol. Cell. Biol., v. 9, p. 345-348.

69. Higuchi K. Genetic characterization of senescence-accelerated mouse (SAM). 1997, Exp. Gerontol., v. 32, p. 129-138.

70. Hosokawa M., Fujisawa H., Zhu B.H., Jujo H., Higuchi K. In vitro study of the mechanisms of senescence acceleration. 1997b, Exp. Gerontol., v. 32, p. 197-203.

71. Huffman K.E., Levene S.D., Tesmer V.M., Shay J.W., Wright W.E. Telomere shortening is proportional to the size of the G-rich telomeric 3'-overhang. 2000, J. Biol. Chem., v. 275, p. 19719-19722.

72. Hunt T. Cyclins and their partners: from a single idea to complicated reality. 1991, Serin. Cell Biol., v. 2, p. 213-222.

73. Hurley L.H., Wheelhouse R.T., Sun D., Kerwin S.M., Salazar M., Fedoroff O.Y., Han F.X., Han H., Izbicka E., Von Hoff D.D. G-quadruplexs as target for drug design. 2000, Pharmacol. Therapeut., v. 85, p. 141-158.

74. Ichihara A., Tanaka K. Roles of proteasomes in cell growth. 1995, Mol. Biol. Rep., v. 21, p. 49-52.

75. Igarashi H., Sakaguchi N. Telomerase activity is induced by the stimulation to antigen receptor in human peripheral lymphocytes. 1996, Biochem. Biophys. Res. Commun., v. 219, p. 649655.

76. Ijdo J.W., Baldini A., Ward D.C., Reeders S.T., Wells R.A. Origin of human chromosome 2: an ancestral telomere-telomere fusion. 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 88, p. 90519055.

77. Jayaraman J., Prives C. Activation of p53 sequence specific DNA binding by short single strands of DNA requires the p53 C - terminus. 1995, Cell, v. 81, p. 1021-1029.

78. Johnson T.E., Genetic influences on aging. 1997, Exp. Gerontol., v. 32, p. 11-22.

79. Kamnert I., Nielsen L., Edstrom J.E. A concertedly evolving region in Chironomus, unique within the telomere. 1998, J. Mol. Evol., v. 46, p. 562-570.

80. Kerwin S.M. G-quadruplex DNA as a target for drug design. 2000, Current Pharmaceutical Design, v. 6, p. 441-471.

81. Kilian A., Stiff C., Kleinhofs A. Barley telomeres shorten during differentiation but grow in callus culture. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 92, p. 9555-9559.

82. Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L.C., Coviello G.M., Wright W.E., Wewrich S.L., Shay J.W. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. 1994, Science, v. 266, p. 2011-2014.

83. Kipling D., Cooke H.J. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. 1990, Nature, v. 347, p. 400-402.

84. Ko L.J., Prives C. P53: puzzle and paradigm. 1996, Genes. Dev., v. 10, p. 1054-1072.

85. Kobayashi H., Stewart E., Poon R., Adamezewski J.P., Gannon J., Hunt T. Identification of the domains in cyclin A required for binding to, and activation of cdc2 and p32 cdk2 protein kinase subunits. 1992, Mol. Biol. Cell, v. 3, p. 1279-1294.

86. Krauskopf A., Blackburn E.H. Control of telomere growth by interactions of Rap 1 with the most distal telomeric repeats. 1996, Nature, v. 383, p. 354-357.

87. Kuniyasu H., Domen T., Hamamoto T., Yokozaki H., Yasui W., Tahara H., Tahara E. Expression of human telomerase RNA in an early event of stomach carcinogenesis. 1997, Jpn. J. Cancer Res., v. 88, p. 103-107.

88. Kuroki T., Huh N.H. Why are human cells resistant to malignant cell transformation in vitro? 1993, Jpn. J. Cancer Res., V. 84, p. 1091-1100.

89. Kyo S., Takakura M., Ishikawa H., Sasagawa T., Satake S., Tateno M., Inoue M. Application of telomerase assay for the screening of cervical lesions. 1997, Cancer Res., v. 57, p. 18631867.

90. Lee S., Elenbaas B., Levine A., Griffith J. p53 and its 14 kDa C terminal domain recognize primary DNA damage in the form of insertion/deletion mismatches. 1995, Cell, v. 81, p. 10131020.

91. Lees E.M., Harlow E. Sequences within the conserved cyclin box of human cyclin A are sufficient for binding to and activation of cdc2 kinase. 1993, Mol. Cell. Biol., v. 13, p. 11941201.

92. Levis R.W., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L.A., Sheen F. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. 1993, Cell, v.75, p. 1083-1093.

93. Levy M.A., Allsopp R.C., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere end-replication problem and cell aging. 1992, J. Mol. Biol., v. 225, p. 951-960.

94. Lindsey J., McGill N.I., Lindsey L.A., Green D.K., Cooke H.J. In vivo loss of telomeric repeats with age in humans. 1991, Mutat. Res., v. 256, p. 45-48.

95. Liu W.S., Fredga K. Telomeric (TTAGGG)n sequences are associated with nucleous organizer regions (NORs) in the wood lemming. 1999, Chromosome Res., v. 7, p. 235-240.

96. Lodish H., Baltimore D., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnell Z. Molecular cell biology. 1995, Scientific American Books Ink., New York.

97. Louis E.J., Maddison R.L., Pryde F.E., Hickson I.D. Yeast telomeres without telomerase. 2001, In Telomeres & telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., p. 185.

98. Magnenat L., Tobler H., Muller F. Developmentally regulated telomerase activity is correlated with chromosomal healing during chromatin diminution in Ascaris suum. 1999, Mol. Cell Biol., v. 19, p. 3457-3465.

99. Makarov V.L., Hirose Y., Langmore J.P. Long G tails at both ends of human chromosomes suggest a C strand degradation mechanism for telomere shortening. 1997, Cell, v. 88, p. 657666.

100. Marciniak R.A., Johnson F.B., Guarente L. Type I ALT telomere maintenance in a human cell line. 2001, in Telomeres & telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., p. 188.

101. Martin G., Sprague C., Epstein C. Replicative life-span of cultivated human cells; effects of donor age, tissue and genotype. 1970, Lab. Invest., v. 23, p. 86-92.

102. Martin G.M. Genetic syndromes in man with potential relevance to the pathology of aging. 1978, Birth. Defects: Orig. Artie. Ser., v. 14, p. 5-39.

103. Mason J.M., Biessmann H. The unusual telomers of Drosophila. 1995, Trends in Genetics, v. 11, p. 58-62.

104. Matsumura T., Zerrudo Z., Hayflick L. Senescent human diploid cells in culture: survival, DNA dynthesis and morphology. 1979, J. Gerontol, v. 34, p. 328-334.

105. Maurer H.R. Towards chemically-defined, serum-free media for mammalian cells culture. 1986, In: Animal cell culture. A practical approach. Ed. By Freshney R.I., IRL Press Limited, p. 13-31.

106. McClintock B. The stability of broken ends in zea mays. 1941, Genetics, v.26, p. 234-282.

107. McCormick-Graham M., Romero D.P. Ciliate telomerase RNA structural features. 1995, Nucleic Acids Research, v. 23, p. 1091-1097.

108. McEachern M.J., Blackburn H. Runaway telomere elongation caused by telomerase RNA gene mutations. 1995, Nature, v. 376, p. 403-409.

109. McEachern M.J., Natarajan S., Iyer S. DNA circles serve as effective templates for recombinational telomere elongation in K. Lactis. 2001, in Telomeres & telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., p. 187.

110. McEachern M.L., Blackburn E.H. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. 1996, Genes Dev., v. 10, p. 1822-1834.

111. Medawar P.B. The definition and measurement of senescence. 1955, In: Wolstenholme GEW, Cameron M.P., eds. Ciba Foundation colloquia on aging. I. General aspects. London: Churchill, 4-15.

112. Mergny J.L., Mailliet P., Lavelle F., Riou J.F., Laoui A., Helene C. The development of telomerase inhibitors: the G-quartet. 1999, Anti-Cancer Drug Design, v. 14, p. 327-339.

113. Meyne J., Ratliff R.L., Moyzis R.K. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 86, p. 7049-7053.

114. Mittnacht S. Control of pRb phosphorylation. 1998, Curr. Opin. Genet. Dev., v. 8, p. 21-27.

115. Mollenhauer J., Batreuther K. Donor-age-related changes in the morphology, growth potential and collagen biosynthesis in rat fibroblast subpopulations in vitro. 1986, Differentiation, v. 32, p. 165-172.

116. Morales C.P., Holt S.E., Ouellette M„ Kaur K.J., Yan Y„ Wilson K.S., White M.A., Wright W.E., Shay J.W. Absence of cancer associated changes in human fibroblasts immortalized with telomerase. 1999, Nature Genet., v. 21, p. 115-118.

117. Morgan D.O. Cyclin-dependent kinases: engines, clocks, and microprocessors. 1997, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol., v. 13, p. 261-291.

118. Morgan D.O. Principles of CDK regulation. 1995, Nature, v. 374, p. 131-134.

119. Mori S., Kawano M., Kanzaki T., Morisaki N., Saito Y., Yoshida S. Decreased expression of the platelet-derived growth factor beta-receptor in fibroblasts from a patient with Werner's syndrome. 1993, Eur. J. Clin. Invest., v. 23, p. 161-165.

120. Morin G.B. The human telomere terminal transferase enzyme is a ribonucleoprotein that synthesizes TTAGGG repeats. 1989, Cell, v. 59, p. 521-529.

121. Muggleton-Harris A.L., Hayflick L. Cellular aging studied by the reconstruction of replicating cells from nuclei and cytoplasms isolated from normal human diploid cells. 1976, Exp. Cell Res., v. 103, p. 321-330.

122. Murnane J.P., Sabatier L., Marder B.A., Morgan W.F. Telomere dynamics in an immortal human cell line. 1994, The EMBO Journal, v. 13, p. 4953-4962.

123. Murray A.W. The genetics of cell cycle checkpoints. 1995, Curr. Opin. Genet. Dev., v. 5, p. 511.

124. Murray A.W., Kirschner M.W. Dominoes and clock: the union of two views of cell cycle regulation. 1989, Science, v. 246, p. 614-621.

125. Nakamura T.M., Morin G.B., Chapman K.B., Weinrich S.L., Andrews W.H., Lingner J., Harley C.B., Cech T.R. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. 1997, Science, v. 277, p. 955-959.

126. Nakayama J., Tahara H., Tahara E., Saito M., Ito K., Nakamura H., Nakanishi T., Ide T., Ishikawa F. Telomerase activation by hTRT in human normal fibroblasts and hepatocellular carcinomas. 1998, Nature Genet., v. 18, p. 65-68.

127. Nakayama J.I., Saito M., Nakamura H., Matsuura A., Ishikawa F. TLP1: A gene encoding a proteincomponent of mammalian telomerase is a novel member of WD repeats family. 1997, Cell, v. 88, p. 875-884.

128. Naylor M.L., Malkova A., Signon L., Ira G., Haber J. Break-induced replication in yeast: correlation with ALT repair in mammalian cells. 2001, in Telomeres & telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., p. 184.

129. Nevins J.R. Transcriptional regulation. A closer look at E2F. 1992, Nature, v. 358, p. 375-376.

130. Niida H., Matsumoto T., Satoh H., Shiwa M., Tokutake Y., Furuichi Y., Shinkai Y. Severe growth defect in mouse cells lacking the telomerase RNA component. 1998, Nature Genet., v. 19, p. 203-206.

131. Nisitani S., Hosokawa M., Sasaki M.S. et. al. Acceleration of chromosome aberrations in senescence-accelerated strains of mice. 1990, Mutat. Res., v. 237, p. 221-228.

132. Odagiri Y., Uchida H., Hosokawa M., Takemoto K., Morley A.A., Taleda T. Accelerated accumulation of somatic mutations in the senescence accelerated mouse. 1998, Nature Genet., v. 19, p. 116-117.

133. Ohno T. Strict relationship between dialysed serum concentration and cellular lifespan in vitro. 1979, Mech. Ageing Dev., v. 11, p. 179-183.

134. Oka Y., Shiota S., Nakai S., Nishida Y., Okubo S. Inverted terminal repeat sequence in the macronuclear DNA of stylonychia pustulata. 1980, Gene, v. 10, p. 301-306.

135. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. 1973, J. Theor. Biol., v. 41, p. 181-190.

136. Olovnikov A.M. Senescence is the result of shortening of "differotene" in telomere because of underreplication and underrepair of DNA. 1992, Izvestia AN SSSR Seria Biologicheskaya, v. 4, p. 641-643

137. Pao C.C., Tseng C.J., Lin C.Y., Yang F.P., Hor J.J., Yao D.S., Hsueh S. Differential expression of telomerase activity in human cervical cancer and cervical intraepithelial neoplasia lesion. 1997, J. Clin. Oncol., v. 15, p. 1932-1937.

138. Pardue M.L., Danilevskaya O.N., Lowenhaupt K., Slot F., Traverse K.L. Drosophila telomeres: new views on chromosome evolution. 1996, Trends in Genetics, v. 12, p. 48-52.

139. Petersen S., Saretzki G., von Zglinicki T. Preferential accumulation of single-stranded regions in telomeres of human fibroblasts. 1998, Exp. Cell. Res., v. 239, p. 152-160.

140. Phillips P.D., Kaji K., Cristofalo V.J. Progressive loss of the proliferative response of senescing WI-38 cells to PDGF, EGF, insulin, transferrin and DEX. 1984, J. Gerontol., v. 39, p. 11-17.

141. Phillips P.D., Kuhnle E., Cristofalo V.J. EGF binding ability is stable throughout the replicative life-span of WI-38 cells. 1983, J. Cell Physiol., v. 114, p. 311-316.

142. Pich U., Schubert I. Terminal heterochromatin and alternative telomeric sequences in Allium cepa. 1998, Chrom. Res., v. 6, p. 315-321.

143. Plisco A., Gilchrest B.A. Growth factor responsiveness of cultured human fibroblasts declines with age. 1983, J. Gerontol., v. 38, p. 513-518.

144. Prives C. Signaling to p53: breaking the MDM2-p53 circuit. 1998, Cell, v. 95, p. 5-8.

145. Prudovsky I.A., Yegorov Y.E., Zelenin A.V. DNA synthesis in the heterokarions of nondividing differentiated cells and culture cells with various proliferative potentials. 1985, Cell Differentiation, v. 17, p. 239- 246.

146. Raghuraman M.K., Brewer B.J., Fangman W.L. Cell cycle-dependent establishment of a late replication program. 1997, Science, v. 276, p. 806-809.

147. Raycroft L., Wu H.Y., Lozano G. Transcriptional activation by wild-type but not transforming mutants of the p53 anti-oncogene. 1990, Science, v. 249, p. 1049-1051.

148. Reddel R.R., Dunham M.A., Fasching C.L., Neumann A.A., Yeager T.R. Telomeric recombination in telomerase-negative immortalized human cells. 2001, in Telomeres & telomerase, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., p. 189.

149. Reed M., Woelker B., Wang P., Wang Y., Anderson M.E., Tegtmeyer P. The C terminal domain of p53 recognizes DNA damaged by ionizing radiation. 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), v. 92, p. 9455-9459.

150. Riha K., McKnight T.D., Fajkus J., Vyskot B., Shippen D.E. Analysis of the G-overhang structures on plant telomeres: evidence for two distinct telomere architectures. 2000, Plant Journal, v. 23, p. 633-641.

151. Rodeman H.P., Peterson H.P., Schwenke K., von Wangenheim K.H. Terminal differentiation of human fibroblasts is induced by radiation. 1991, Scanning Microscopy, v. 5, p. 1135-1143.

152. Romero D.P., Blackburn E.H. A conserved secondary structure for telomerase RNA. 1991, Cell, v. 67, p. 343-353.

153. Rosen R.S., Cimini R., Coblentz D. Werner's syndrome. 1970, Brit. J. Radiol., v. 43, p. 193199.

154. Salvadori S., Deiana A.M., Elisabetta C., Floridia G., Rossi E., Zuffardi O. Colocalization of (TTAGGG)n telomeric sequences and ribosomal genes in Atlantic eels. 1995, Chromosome Res., v. 3, p. 54-58.

155. Sancar A. DNA excision repair. 1996, Ann. Rev. Biochem., v. 65, p. 43-81.

156. Sandell L.L., Zakian V.A. Loss of a yeast telomere: arrest, recovery and chromosome loss. 1993, Cell, v. 75, p. 729-739.

157. Saretzki G., Sitte N., Merkel U., Wurm R.E., von Zhlincki T. Telomere shortening triggers a p53 dependent cell cycle arrest via accumulation of G - rich single stranded DNA fragments. 1999, Oncogene, v. 18, p. 5148-5158.

158. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis. 1984, Cell, v. 37, p. 67-75.

159. Serakinci N., Koch J. Detection and sizing of telomeric repeat DNA in situ. A performance comparison of PRINS and PNA assays. 1999, Nature Biotechnology, v. 17, p. 200-201.

160. Serrano M., Hannon G.J., Beach D. A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4. 1993, Nature, v. 366, p. 704-707.

161. Shay J.W., Wright W.E. The reactivation of telomerase activity in cancer progression. 1996, Trends in Genetics, v. 12, p. 129.

162. Shay J.W., Wright W.E., Brasiskyte D., Van Der Haegen B.A. E6 of human papillomavirus type 16 can overcome the Ml stage of immortalization in human mammary epithelial cells but not in human fibroblasts. 1993, Oncogene, v. 8, p. 1407-1413.

163. Sherr C.J. Cancer cell cycles. 1996, Science, v. 274, p. 1672-1677.

164. Sherr C.J. D-type cyclins. 1995, Trends Biochem. Sci., v. 20, p. 187-190.

165. Sherr C.J. G1 phase progression: Cycling on cue. 1994, Cell, v. 79, p. 551-555.

166. Shimada Y., Kaji K., Ito H., Noda K., Matsuo M. Growth-inhibiting effect of tumor necrosis factor on human umbilical vein endothelial cells is enhanced with advancing age in vitro. 1990, J. Cell Physiol., V. 142, p. 31-38.

167. Shore D. Different means to common ends. 1997, Nature, v. 385, p. 676-677.

168. Singer M.S., Gottscling D.E. TLC1: Template RNA component of Saccharomyces cerevisiae telomerase. 1994, Science, v. 266, p. 404-409.

169. Slijpcevic P., Hande M.P. Chinese hamster telomeres are comparable in size to mouse telomeres. 1999, Cytogenet. Cell. Genet., v. 85, p. 196-199.

170. Stein G.H., Beeson M., Gordon L. Failure phosphorylate the retinoblastoma gene product in senescent human fibroblasts. 1990, Science, v. 294, p. 666-669.

171. Sun H., Tonks K. The coordinated action of protein tyrosine phosphatases and kinases in cell signaling. 1994, Trends Biochem. Sci., v. 19, p. 480-485.

172. Swim H.E., Parker R.F. Culture characteristics of human fibroblasts propagated serially. 1957, Amer. J. Hyg., v. 66, p. 235-243.

173. Takeda T., Hosokawa M, Takeshita S., Irino M., Huguchi K., Matsuhita T., Tomita Y., Yasuhira K., Hamamoto H., Shimizu K., Ishii M., Yamamuro T. A new murine model of accelerated senescence. 1981, Mech. Aging Dev., v. 17, p. 183-194.

174. Takeda T., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse (SAM). A novel murine model of aging. 1994, in: The SAM model of senescence, ed. Takeda T., Excerpta Medica, Elsevier Science B.V., Amsterdam, p. 15-22.

175. Takeda T., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse: a novel murine model of senescence. 1997a, Exp. Gerontol., v. 32, p. 105-109.

176. Takeda T., Hosokawa M., Higuchi K. Senescence accelerated mouse (SAM): a novel murine model of accelerated senescence. 1991, J. Am. Geriatr. Soc., v. 39, p. 911-919.

177. Takeda T., Matsuhita T., Kurozumi M., Takemura K., Higuchi K., Hosokawa M. Pathobiology of senescence accelerated mouse (SAM). 1997b, Exp. Gerontol., v. 32, p. 117-127.

178. Tam S.W., Shay J.W., Pagano M. Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase 4 inhibitor pl6Inlc4. 1994, Cancer Res., v. 54, p. 5816-5820.

179. Todaro G.J., Green H. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. 1963, J. Cell Biology, v. 17, p. 299-313.

180. Van den Heuvel S., Harlow E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. 1994, Science, v. 262, p. 2050-2054.

181. Van Steensel B., de Lange T. Control of telomere length by the human telomeric protein TRF1. 1997, Nature, v. 385, p. 740-743.

182. Vaziri H., Benchimol S. Reconstitution of telomerase activity in normal human cells leads to elongation of telomeres and extended replicative life span. 1998, Current Biology, v. 8, p. 279282.

183. Vaziri H., Dragowska W., Allsopp R.C., Thomas T.E., Harley C.B., Lansdorp P.M. Evidence for a mitotic clock in human hematopoietic stem cells: loss of telomeric DNA with age. 1994, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 91, p. 9857-9860.

184. Venkatesan R.N., Price C. Telomerase expression in chickens: constitutive activity in somatic tissues and down-regulation in culture. 1998, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), v. 95, p. 1476314768.

185. Vos Dolmans M. Self-renewal of colony forming units (CFU) in serial bone marrow transplantation experiments. 1972, Cell Tissue Kinet., v. 5, p. 371-385.

186. Wang S.S., Zakian V.A. Telomere-telomere recombination provides an express pathway for telomere acquisition. 1990, Nature, v. 345, p. 456-458.

187. Watson J. D. Origin of concatemeric T7 DNA. 1972, Nature, v. 239, p. 197-201.

188. Weismann A. Essays upon heredity and kindred biological problems. 1891, v. 1, Clarendon Press, Oxford.

189. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human T lymphocyte development and activation. 1996, J. Exp. Med., v. 183, p. 2471-2479.

190. Williams G.C. Pleiotrophy, natural selection and the evolution of senescence. 1957, Evolution, v. 11, p. 398-411.

191. Winkles J.A., O'Connor M.L., Friesel R. Altered regulation of platelet-derived growth factor A-chain and c-fos gene expression in senescent progeria fibroblasts. 1990, J. Cell Physiol., v. 144, p. 313-325.

192. Wood R.D. DNA repair in eukaryotes. 1996, Ann. Rev. Biochem., v. 65, p. 135-167.

193. Wright W.E., Pereira-Smith O.M., Shay J.W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. 1989, Mol. Cell. Biol., v. 9, p. 30683092.

194. Wright W.E., Piatyszek M.A., Rainey W.E., Byrd W., Shay J.W. Telomerase activity in human germline and embryonic tissues and cells. 1996a, Dev. Genet., v. 18, p. 173-179.

195. Wright W.E., Shay J.W. Mechanism of escaping senescence in human diploid cells. 1996b, in Cellular Aging and Cell Death, Wiley-Liss, Inc., p. 153-166.

196. Wright W.E., Shay J.W. Telomere positional effects and the regulation of cellular senescence. 1992a, Trends Genet., v. 8, p. 193-197.

197. Wright W.E., Shay J.W. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. 1992b, Exp. Gerontol., v. 27, p. 383-389.

198. Wright W.E., Tesmer V.M., Huffman K.E., Levene S.D., Shay J.W. Normal human chromosomes have long G-rich telomeric overhangs at one end. 1997, Genes & Development, v. 11, p. 2801-2809.

199. Xia C., Higuchi K., Shimizu M., Matsushita T„ Kogishi K., Wang J., Chiba T., Festing M.F., Hosokawa M. Genetic typing of the senescence accelerated mouse (SAM) strains with micro satellite markers. 1999, Mamm. Genome, v. 10, p. 235-238.

200. Yeager T.R., Neumann A.A., Englezou A., Huschtscha L.I., Noble J.R., Reddel R.R. Telomerase-negative immortalized human cells contain a novel type of promyelocytic leukemia (PML) body. 1999, Cancer Res., v.59, p. 4175-4179.

201. Yegorov Y.E., Akimov S.S., Akhmalisheva A.K., Semenova I.V., Smirnova Y.B., Kraevsky A. A., Zelenin A.V. Blockade of telomerase function in various cells. 1999, Anti-Cancer Drug Design, v. 14, p. 305-316.

202. Yegorov Y.E., Akimov S.S., Hass R., Zelenin A.V., Prudovsky I.A. Endogenous (3-galactosidase activity in continuously nonproliferating cells. 1998, Exp. Cell Res., v. 243, p. 207-211.

203. Yegorov Y.E., Chernov D.N., Akimov S.S., Akhmalisheva A.K., Smirnova Y.B., Schinkarev D.B., Semenova I.V., Yegorova I.N., Zelenin A.V. Blockade of telomerase function by nucleoside analogs. 1997, Biochemistry (Moscow), v. 62, p. 1296-1305.

204. Yu G.L., Bradley J.D., Attardi L.D., Blackburn E.H. In vivo alteration of telomere sequences, and senescence caused by mutated Tetrahymena telomerase RNAs. 1990, Nature, v. 344, p. 126-132.

205. Zaitseva V. E., Dyatkina N.B., Krayevsky A.A., SkaptsovaN.V., Turina O.V., Giuichev N.V., Gottikh B.P., Azhaev A.V. Aminonucleosides and their derivatives. Synthesis of 3' amino-2',

206. З'-dideoxynucleoside 5'-triphosphates. 1984, Bioorganic Chemistry (Moscow), v. 10, p. 670 -680.

207. Zakian V.A. Structure and function of telomeres. 1989, Annual Review of Genetics, v. 23, p. 579-604.

208. Zhan X., Ни X., Friesel R., Maciag T. Long term growth factor exposure and differential tyrosine phosphorylation are required for DNA synthesis in BALB/c 3T3 cells. 1993, J. Biol. Chem., v. 268, p. 9611-9620.

209. Zhu L., Hathcock K.S., Hande P., Lansdorp P.M., Seldin M.F., Hodes R.J. Telomere length regulation in mice is linked to a novel chromosome locus. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci (USA), v. 95, p. 8648-8653.

210. Адаме P. Методы культуры клеток для биохимиков. 1983, М.: Мир, с. 69-70.

211. Акимов С.С., Масиаг Т., Зеленин А.В., Капник Е.М., Попов К.В., Прудовский И.А. Взаимозаменяемость факторов роста в раннем G0-G1 периоде клеточного цикла. 1998, Доклады Академии Наук, т. 359, с. 557-560.

212. Байрейтер К., Франц П.И., Родеман Х.П. Фибробласты при нормальной и патологической терминальной дифференцировке, старении, апоптозе и трансформации. 1995, Онтогенез, т. 26, с. 22-37.

213. Дункан Э.Л., Реддел P.P. Генетические изменения, связанные с иммортализацией. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1477-1490.

214. Егоров Е.Е. Вокруг теломеразы. 1999, Молекулярная биология, т. 33, с. 385-392.

215. Егоров Е.Е. Теломеры, теломерная ДНК, хромосомы. 2001, Биологические мембраны, т. 18, с. 249-256.

216. Егоров Е.Е., Чернов Д.Н., Акимов С.С., Ахмалишева А.Х., Смирнова Ю.Б., Шинкарев Д.Б., Семенова И.В., Егорова И.Н., Зеленин А.В. Подавление функции теломеразы аналогами нуклеозидов. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1516-1527.

217. Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А. Покоящиеся клетки. 1983, М., с. 176.

218. Ишикава Ф. Механизмы регуляции теломеразы млекопитающих. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1558-1565.

219. Копнин Б.П. Мишени действия онкогенов и опухолевых супрессоров: ключ к пониманию базовых механизмов канцерогенеза. 2000, Биохимия, т. 65, с. 5-33.

220. Краевский A.A. Модифицированные нуклеозиды и нуклеотиды, подавляющие репродукцию ВИЧ: анализ ситуации и вероятная перспектива. 1992, Молекулярная Биология, т. 26, с. 725-744.

221. Краевский A.A. Пути поиска ингибиторов репродукции HIV среди нуклеотидов. 1994, Молекулярная Биология, т. 28, с. 1245-1257.

222. Михельсон В.М. Старение клеточных культур. 1984, Ленинград, Издательство "Наука", Книга "Биология клетки в культуре" под редакцией Трошина A.C., с. 236-237.

223. Никольский H.H. Пролиферация клеток в культуре. Состояние покоя и стимуляция пролиферации. 1984, Ленинград, Издательство "Наука", Книга "Биология клетки в культуре" под редакцией Трошина A.C.

224. Оловников A.M. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. 1971, Доклады АН СССР, с. 1496-1499.

225. Пономарева Е.Д., Сагайдачных H.A. К клинике прогерий. 1965, Терапевт. Арх., т. 27, с. 77-80.

226. Прайс K.M. Синтез теломерной С-цепи. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1423-1431.

227. Соколов Д.Д. О прогерии. 1955, Пробл. Эндокринологии и Геронтологии, т. 1, с. 11-118.

228. Урываева И.В., Маршак Т.Л., Захидов С.Т., Семенова М.Л., Делоне Г.В. Накопление с возрастом микроядерных аберраций в клетках печени ускоренно стареющих мышей линий SAM. 1999, Доклады Академии Наук, т. 38, с. 703-705.

229. Хейфлик Л. Смертность и бессмертие на клеточном уровне. 1997, Биохимия, т. 62, с. 1380-1393.

230. Чернов Д.Н., Егоров Е.Е., Акимов С.С. Теломеразная активность клеток мыши при спонтанной трансформации. 1996, Доклады Академии Наук, т. 349, с. 121-123.1. Благодарности.

231. Автор благодарит своих научных руководителей д.б.н., профессора A.B. Зеленина и к.б.н. Е.Е. Егорова за предложенную тему диссертации, помощь в проведении экспериментов и ценные замечания по работе.

232. Автор выражает искреннюю благодарность всему коллективу Лаборатории функциональной морфологии хромосом за моральную поддержку и за проявленный к работе интерес.