Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Моделирование старения на стационарных клеточных культурах

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохоров, Леонид Юрьевич, Москва

<39-3/30?"«

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В.ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи УДК 576.533

ПРОХОРОВ Леонид Юрьевич

МОДЕЛИРОВАНИЕ СТАРЕНИЯ НА СТАЦИОНАРНЫХ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУРАХ

специальность - клеточная биология (03.00.25)

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель д.б.н. А.Н. Хохлов

Москва - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.........................................................5

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................9

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................10

1.1. Использование стационарных клеточных культур для изучения

старения...................................................12

1.1.1. Сходство изменений параметров "стационарно стареющих"

клеток с изменениями аналогичных параметров, происходящих при старении in vivo, а также при старении in vitro "по Хейфлику"......................................................12

1.2. Клеточно - кинетическая модель ............................. 13

1.3 Изучение причин ограничения пролиферации клеток в культуре.15

1.4. Клональный анализ как метод исследования в клеточной геронтологии...............................................18

1.5. Эксперименты по влиянию антиоксидантов на культивируемые клетки .................................................... 22

1.5.1. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием "модели Хейфлика"............................22

1.5.2. Изучение влияния антиоксидантов на клетки, находящиеся в стационарной стадии..............................2 3

1.5.3. Изучение влияния антиоксидантов на клетки с использованием клеточно-кинетической модели.................25

1.6. Исследование содержания и активности цитохромов Р-450 (в том числе 0-деалкилаз) в организме и в культивируемых клетках..26

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Используемые клетки и препараты.......................2 9

2.2. Культивирование клеток.......4.........................29

2.3. Примененные способы клонирования клеток...............30

2.4. Определение времени клонирования клеток ..............31

2.5. Математическое обеспечение работы.....................3 3

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Исследование некоторых закономерностей роста и "стационарного старения" клеток, а также происходящих при этом изменений их

свойств и характеристик...................................3 3

3.1.1. Изменение числа живых трансформированных клеток ки тайского хомячка, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стацио нарном старении" и последующей гибели этих клеток

- з -

в культуре ..........................................34

3.1.2. Изменение числа живых эмбриональных диплоидных фиброб-ластов человека, а также их пролиферативной способности и уровня синтеза ДНК в них при росте, "стационарном старении" и последующей гибели этих клеток в культуре ............................................ 40

3.1.3. Сравнение "стационарного старения" нормальных и транс формированных клеток.....................................43

3.1.4. Влияние периодической замены среды на рост и "стацио нарное старение" клеток .............................46

3.1.5. Влияние "возраста" среды на рост клеток ............50

3.1.6. Корреляция некоторых параметров, связанных с пролифе ративной активностью клеток, с продолжительностью жиз ни "стационарно стареющих культур" и с максимальной продолжительностью жизни млекопитающих..............56

3.1.7. Некоторые дополнения к данным о связи пролиферации с продолжительностью жизни организмов и "стационарно стареющих" культур ..................................69

3.1.8. Связь скорости пролиферации клеток с "общей и "стационарной " продолжительностью жизни культур трансформированных клеток китайского хомячка..................70

3.1.9. Исследование параметров, связанных с ограничением пролиферации клеток....................................74

3.1.10. Математическая модель роста и "стационарного старения" .............................................. . 76

3.1.11. Распределение клеток по митотической активности и по фазам клеточного цикла после посева, при росте, переходе из логарифмической стадии в стационарную и на разных этапах стационарной стадии ("стационарного старения" )........................................ 78

3.2. Влияние буферной емкости среды на кинетику роста и "стацио нарного старения" трансформированных клеток китайского хомяч ка.........................................................87

3.3. Исследование 0-деалкилазной активности некоторых цитохромов Р-450 с использованием модели "стационарного старения".....90

3.4. Влияние различных веществ и препаратов (в том числе геропро-текторов и геропромоторов) на эффективность клонирования, а также на рост и "стационарное старение" трансформированных клеток китайского хомячка и диплоидных фибробластов человека...................................................98

3.4.1. Влияние эпигида (хлоргидрата 2-этил-6-метил-3-оксипи-

ридина).............................................98

3.4.2. Влияние дибунола (4-метил-2,6-дитретбутилфенола, или бутилокситолуола)..................................115

3.4.3. Влияние анфена и глутатиона........................120

3.4.4. Влияние Т-активина.................................124

3.4.5. Влияние холестерина и 7-кетохолестерина............126

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. ...............................130

ГЛАВА 5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................132

ВЫВОДЫ......................................................................135

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................138

ВВЕДЕНИЕ

К настоящему моменту уже проведено значительное количество исследований на различных биологических объектах как in vivo так и in vitro, направленных на изучение процесса старения живых организмов. Однако природа этого феномена до сих пор не выяснена и не найдено реальных способов существенного увеличения активной продолжительности жизни.

В этом направлении изучение старения на культурах клеток занимает свое соответствующее место. Спустя некоторое время после получения возможности культивирования клеток на искусственных средах были созданы модели, которые могли применяться для указанных целей и позволяли как изучать процесс старения, так и исследовать влияние на него различных факторов.

Одна из таких моделей была разработана Хейфликом (Hayflick, Moorhead, 1961; Hayflick, 1965; 1992). В ней за основу принимается следующее экспериментальное открытие: многие нормальные клетки in vitro (в частности диплоидные фибробласты животных и человека ) имеют ограниченный потенциал удвоения, т.е. клетки в таких культурах могут поделиться только определенное ограниченное число раз. Причем, выяснилось, что максимально возможное число удвоений клеточной популяции (диплоидных фибробластов) пропорционально продолжительности жизни вида животного, от которого получены данные клетки. Кроме того когда клетки длительное время пересеваются в них происходят изменения, сходные с изменениями, происходящими в клетках стареющего организма. Это послужило основанием целесообразности использования модели для изучения старения на клеточном уровне. Недостатком этой модели является относительная длительность получения экпериментальных результатов, - как правило, от нескольких месяцев до года и более.

Большие возможности для изучения процесса старения предоставляют модель "стационарного старения" (Гринберг, 1971; Хохлов и др., 1983; Хохлов, 1988) и "клеточно-кинетическая" модель (Чиркова и др., 1984; Хохлов, 1988). Первая базируется на положении о ведущей роли ограничения пролиферации в накоплении в организме с возрастом дефектов на разных уровнях (Гринберг, 1971; Walton, 1982; Хохлов, 1988). Согласно модели, в находящихся в стационарной фазе роста культивируемых клетках должны накапливаться повреждения, сходные с повреждениями клеток стареющего организма. Пусковым механизмом на-

копления повреждений ДНК является уменьшение средней скорости пролиферации клеток организма или клеточной популяции ниже некоторого критического уровня. Процесс накопления таких повреждений в культивируемых клетках с увеличением времени после пересева (то есть при снижении скорости пролиферации клеток и в процессе дальнейшего их пребывания в стационарной фазе) и называется "стационарным старением" (Хохлов и др., 1983). Вторая модель основывается на существовании обратной корреляции между возрастом организма и насыщающей плотностью его клеток в культуре, растущей без пересева.

Эти модели позволяют получить экспериментальные результаты при изучении механизма старения in vitro максимально быстро, буквально за несколько недель. Многочисленные эксперименты, выполненные на модели "стационарного старения" и клеточно-кинетической модели подтвердили возможность использования этих моделей (Хохлов, 1988; Khokhlov, 1992).

В частности, на модели "стационарного старения" было показано, что в течение стационарной стадии в клетках происходит накопление повреждений ДНК и сшивок ДНК-белок, деметилирование ДНК, увеличение частоты спонтанных сестринских хроматидных обменов (Хохлов, 1988 а, б).

В то же время на модели "стационарного старения" было получено мало данных о закономерностях старения и гибели клеток в поздней стационарной стадии, об изменениях активности ферментов и колони-еобразующей способности клеток. Хотя кривые уменьшения числа живых клеток разных культур при "стационарном старении" могут отличаться между собой, не было создано математическое обеспечение, позволяющее учесть или предсказать эти различия. Отсутствовали данные о распределении клеток в культуре по их пролиферативному статусу: находящихся в цикле деления или в состоянии покоя, в том числе пролиферативно "живых" или пролиферативно "мертвых". Не были ис-ледованы соотношения между параметрами роста и "старения" культуры и параметрами роста и старения многоклеточных организмов, а также корреляционные связи пролиферативных параметров (число, скорость деления клеток, время роста) с продолжительностью жизни культур и организмов. В клеточно-кинетической модели не учитывалось реальное уменьшение числа живых клеток в течение стационарной стадии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы являлось совершенствование модели "стационарного старения" для того, чтобы расширить возможные сферы ее применения при изучении механизмов старения, в том числе для оценки связи

процессов развития и старения.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В связи с поставленными целями требовалось решить следующие, важные с точки зрения использования указанных моделей для раскрытия механизма старения, задачи: выяснить особенности "старения" культур нормальных и трансформированных клеток в поздней стационарной стадии; определить, от чего зависит продолжительность жизни "стационарно стареющих" культур; сопоставить периоды роста культур с этапами роста целого организма; оценить влияние некоторых анти-оксидантов и других веществ на рост и "стационарное старение" культур, а также на эффективность клонирования "молодых" и "стационарно старых" клеток; определить активность некоторых цитохром Р-450 - зависимых О-деалкилаз в "стационарно стареющих" культурах; разработать математический аппарат для модели "стационарного старения" с целью оценки кинетики роста культуры и ее гибели при "стационарном старении".

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Установлена зависимость эффективности клонирования клеток, размера (среднего и максимального) колоний и их распределения по классам, а также уровня синтеза ДНК клеток от времени их роста и "стационарного старения". Разработана новая методика точного посева клеток на чашки Петри для определения эффективности их клонирования. Впервые выявлены корреляционные зависимости между "общей" и "стационарной" продолжительностью жизни (время до гибели культуры от посева или от момента достижения насыщающей плотности, соответственно) культуры и параметрами ее роста: временем роста от посева до насыщающей плотности, а также числом и скоростью удвоений клеточной популяции за тот же период. Обнаружены корреляционные зависимости между максимальной продолжительностью жизни млекопитающих и некоторыми параметрами их роста, связанными с пролифератив-ной активностью клеток: средним числом удвоений в эмбриональный период и за все время роста организма от оплодотворения до завершения его формирования, а также средней скоростью этих удвоении за те же периоды. Впервые выявлены аналогии между периодами роста и старения организма с периодами роста и "стационарного старения" клеточной культуры, оценены с использованием доработанной клеточ-но-кинетической модели и модели "стационарного старения" геропро-текторные и геропромоторные свойства некоторых препаратов,* исследована активность некоторых цитохром Р-450 - зависимых О-деалкилаз в трансформированных клетках китайского хомячка и эмбриональных

диплоидных фибробластах человека на разных стадиях "стационарного старения" этих клеток. Разработан математический аппарат, аппроксимирующий кривую числа живых клеток в популяции не только в период роста и в раннем периоде "стационарного старения", но также в позднем периоде "стационарного старения" и во время гибели клеточной популяции. Разработаны формулы, позволяющие оценивать процент делящихся и покоящихся клеток (в том числе способных и неспособных к пролиферации) в культуре в период ее роста, на разных этапах "стационарного старения" и при ее гибели.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты исследования будут способствовать открытию фундаментальных механизмов старения и разработке теории старения организмов; помогут в оценке геропротекторных или геропромоторных свойств различных препаратов; позволят ускорить внедрение в практику различных методов и препаратов, способствующих реальному улучшению здоровья людей и увеличению их активной жизни.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы обсуждались на 14 Всероссийских и международных конференциях, конгрессах, съездах, заседаниях, в частности на 5-м Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси, 1988), конференции по механизмам процесса старения (Москва, 1988), заседаниях (1988, 1989) Московского общества испытателей природы, ежегодных конференциях Американской ассоциации по изучению старения (США, 1992, 1993, 1994), 14 Европейском симпозиуме по метаболизму лекарств (Франция, 1994), II Национальном конгрессе геронтологов и гериатров Украины (Киев, 1994), международных симпозиумах "Биологические механизмы старения" (Харьков, 1996, 1998), "Геронтологические аспекты пептидной регуляции функций организма" (Санкт-Петербург, 1996), "Старение и долголетие: системный и междисциплинарный подходы" (Москва, 1997), 1-м Европейском конгрессе по биогеронтологии (Дания, 1998). ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликована 31 работа в отечественных и зарубежных изданиях.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БРОД - 7-бензилоксирезоруфин-0-дебензилаза; ДФЧ - диплоидные фибробласты человека; ДМСО - диметилсульфоксид;

МДСИ - модифицированная Дульбекко среда Игла; МКМД - 7-метоксикумарин 0-деалкилазы; МПЖ - максимальная продолжительность жизни; НАДФН - никотинамидадениндинуклеотидфосфат. ОПЖ - "общая" продолжительность жизни; ПЖ - продолжительность жизни; ПРОД - 7-пентоксирезоруфин деалкилазы; СИ - среда Игла;

СКРС - сыворотка крупного рогатого скота; СтПЖ - "стационарная" продолжительность жизни; ТККХ - трансформированные клетки китайского хомячка; УКП - удвоение клеточной популяции;

ЭДФЧ - эмбриональные диплоидные фибробласты человека;

ЭК - эффективность клонирования;

ЭКМД - 7-этоксикумарин О-деалкилазы;

ЭРОД - 7-этоксирезоруфин деалкилазы;

ФСБ - фосфатно солевой буфер;

7-БРР - 7-бензилоксирезоруфин;

7-МКМ - 7-метоксикумарин;

7-ПРР - 7-пентоксирезоруфин;

7-ЭКМ - 7-этоксикумарин;

7-ЭРР - 7-этоксирезоруфин.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Поскольку работа над диссертацией была связана с использованием моделей, разработанных на основе наличия у клеточных культур стационарной стадии, то нам показалось целесообразным уделить внимание таким широко используемым в настоящее время понятиям, как "состояние покоя" клетки и "стационарное старение".

Состояние покоя наблюдается у клеток многих типов. Ранее было установлено, что в клеточном цикле длительность периодов S (синтез ДНК) и М (митоз) наименее всего подвержены изменению. Тогда как периоды G-L (пресинтетический период) и G2 (постсинтетический период) могут сильно варьировать по длительности. При дальнейшем изучении вопроса выяснилось, что клетки в определенные моменты могут выходить из периодов G] и G2 в состояние, которое и было названо "состоянием покоя". Покоящимися стали называть "такие клетки, которые выходят из митотического цикла на неограниченное время, сохраняя жизнеспособность и пролиферативный потенциал" (Епифанова, Терских, 1968; Epifanova, Terskikh, 1969).

В дальнейшем было обнаружено, что в покоящихся клетках со временем происходит множество изменений которые впоследствии влияют на функциональное состояние клеток и их жизнеспособность. В частности установлено, что увеличивается время выхода из этого состояния диплоидных фибробластов человека (ДФЧ) WI-38 (Augerilicht, Baserga 1974) и трасформированных клеток китайского хомячка (ТККХ) (Терских, 1979), меняется чувствительность к повреждающим агентам у клеток опухоли мышей (Twentyman, Bleehen, 1975), в ДНК ТККХ и нормальных эмбрион�