Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Независимость накопления холестерина в стареющих клетках acholeplasma laidlawii от степени окисленности липидов плазматической мембраны

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Независимость накопления холестерина в стареющих клетках acholeplasma laidlawii от степени окисленности липидов плазматической мембраны"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ имени Н. И. ПИРОГОВА

На прагах рукописи УДК 577.119.3

АСКАРОВА Эльвира Айыповна

Независимость накопления холестерина в стареющих клетках ас1ю1ер1а$ма 1а¡(Наши от степени окисленности липидов плазматической

мембраны

03.00.04 — Биохимия 03.00.07 — Микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1990

Работа выполнена в научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РСФСР.

Научные руководители: доктор медицинских наук ХАЛИ-ЛОВ Э. М.; кандидат биологических наук КАПИТАНОВ А. Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук САВИНА М. И.; доктор биологических наук КАРЯКИН А. В.

Ведущая организация — 1-й Московский медицинский институт им. Н. И. Сеченова.

Защита диссертации состоится « //» СрС§р&Л*£ 199'(г. в « » часов на заседании специализированного Ученого совета № 6 К.08414.05 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова по адресу: 117437, Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан «./V » ихл^!^ 199£ г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета кандидат медицинских наук, доцент Савенкова В. Т.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность исследования.

В последние года структурно-функциональным перестройкам биологических мембран в процессе клеточного старения уделяется особое внимание . Авторы, так называемых, свободнорадикальной и мембранной гипотез старения (Нагтап П., 1975, гвгМа^у I., 1978), единодушны в том, что, возрастное нарушение функций клеточных мембран может возникать из-за свободнорадикального окисления составляющих их молекул.

Промежуточные продукты реакций, катализируемых оксидазными ферментами, являются, чаще всего, свободными радикалами. Они обладают высокой реакционной способностью и могут инактивировать путем окислительной модификации ряд ключевых ферментов клеточного метаболизма, (згайлап Е.Я., 1986), сами ферменты, катализирующие их,образование, и являться причиной изменения структуры липидов, входящих в состав биомембрнн (Влз^г^нрсз Ю.А., Арчаков А.И., 1972). В ходе- переноса электрона от НАДН к кислороду, присутствующий в мембране клеток А. 1а1б.1сш>И самоинактиЕирунзйся фермент - НАДН-оксидаза, образует супероксидный радикал и перекись водорода.

Возникновение и развитие ряда заболеваний челоЕека и животных, связанных с пшерхолестеринемией (Лопухин Ю.М. с соавт.. 1983), сопровождается активацией процесса перекиснсго окисления липидов (ПОЛ) клеточных мембран и липопротекдов плазг.щ крови. Можно думать, что между этими фундаментальными явлениям, играющими важную роль в патогенезе заболеваний, а также в старении, существует определенная взаимосвязь. Однако, в

настоящее - время неясно, тго йервйчнв. Шзывавт ли накопление холестерина усиление ПОЛ или же, HööÖopo?, шшщроваше ПОЛ приводит к увеличению содержания этого стврбйда в дшвдшй мембран в качестве защитной реакции, направленной HS ТОрМбЖИШ ПОЛ. Клетки A.latdlawlt, аналогично культурам эукариотйЧесКИХ клеток, подвержены "стационарному" . старению, которое характеризуется накоплением холестерина в их плазматической мембране (Капитанов А.Б. и др., 1983, 1985).

Источником холестерина в мембранах клеток А.latdlcwit явяется холестерин липопротеидов сыворотки, вносимой в питательную среду. Возникновение холестериноза таких клеток может определяться индукцией ПОЛ в мембранах продуктами свободнорадикальных реакций. К тому же культура клеток A.laldlcwtl является одним из объектов, удобных для изучения липидных перестроек плазматической мембраны при адаптации клеток к.изменяющимся внешним условиям (Капитанов A.B. и др., 1985).

Цель и задачи исследования. . Целью данной работы являлось выявление зависимости накопления холестерина в мембранах клеток A.laiülawll от степени окисленности ее лишдного компонента. В работе решались следующие конкретные задачи:

1. На примере НАДН-оксидазы показать возможность окисления липидов мембраны A.laldlatuil продуктами оксидоредуктазных реакций и исследовать изменение их состава.

2. Выявить зависимость уровня активности мембранных ферментов от интенсивности функционирования мембранных оксидоредуктаз.

3. Оценить интенсивность свободнорадикальных процессов, ПОЛ мембраны и изменение ее физического состояния в зависимости от

возраста культури.

4. Выявить влнфше продуктов ПОЛ мембран клеток A.laialQ¡vii на скорость развитая культуры.

5.Оценить изменение относительного содержания ' ходе стещда в клетках и их жизнеспособности при действии- фосфолимдного препарата.

Научная новизна работы. Решение поставленных задач позволило установить, что НАДН-оксидаза клеток A.laldlawlt при рэкете генерирует продукты, индуцирующие ПОЛ мвмбрщф ещшещив ненасыщенность жирных кислот фосфолипидов и снижающие активность мембранных ферментов. Впервые обнаружено, что стецщадрное старение клеток A.laidlavíl сопровоздается подадедаем генерации свободнорадикальных продуктов окислительного метаболизма и усилением их антиокислительной защиты. Текучее?^ плазматической мембраны при этом . не . изменяется, Уведардевие содержания мембранного холестерина клеток в стационарной фазе развития культуры не зависит от протекающих в .логарифмической -фазе процессов окислительной модификации фосфолипидов. Делящиеся клетки характеризуются максшальной интенсивностью свободнорадикальных процессов. Увеличение окисленности мембран« клеток A.laldlcwll 3 латентной фазе развития культуру сопровождается накоплением холестерина, аналогично клеткам в стационарной фазе. Фосфатидилхолин'овый препарат ггролилл^т холестеринэкстрагирувдую активность по отношению к старекцим клеткам A.laldla&lt in vitro и увеличивает их жизнеспособность in vivo. В мембране клеток A.laldlawii обнаружены сигнал ЭПР Мп и сулероксиддасмутаза, активность которой зависит от возраста

культуры. Кромз того обнаружен сигнал ЭПР с £=2,005, шириной 40Э, который, предположительно, обусловлен присутствием в мембране флавопротеида.

Научная и практическая ценность. Полученные данные указывают на схожесть закономерностей протекания свободнорадикальных процессов при развитии прокариотичэских клеток Л.1аШ1шИ и клеток эукариот. Обнаружено, что уменьшение активности Н+-АТФ-азы при старении культуры может быть результатом ее повреждения продуктами НАДН-оксидазной реакции. Продемонстрирована возможность повреждения липидной фазы мембраны при работе оксидоредуктазы. Показана возможность направленным изменением липидного компонента плазматической мембраны снижать скорость старения культуры клеток.

Апробация.работы. Результаты исследования, были доложены на конференции Московского общества испытателей природа (1988г.), 5 Всесоюзном съезде геронтологов и гериатров (Тбилиси, 1988г.), конференции молодых ученых • НИИ физико-химической ; медицины (1989г.), на Всесоюзном симпозиуме "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических мембран" (Благовещенск, 1989г). Апробация диссертации состоялась 25 сентября 1990 г на научной конференции кафедры биохимии медико-биологического факультета 2-го МОЛГМИ им.Н.И.Пирогова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на .¿¡¡^страницах машинописного текста, включая 14 таблиц и 13 рисунков, состоит из "Введения", 4 глав и "Выводов". Библиография

составляет ¿¿^наименований работ отечественных з-фубегаых авторов,

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТУ.

I.Материалы и методы исследования,

В качестве объекта исследования использовали культуру клеток Acholeplaama laldlatvil, штамм ИЭМ—I. Культивировать клеток, юс концентрирование и получение мембран проводил:-; как описано в (Капитанов A.B. и др., 1983). Жизнеспособность клетск в ходе развития культуры оценивали путем подсчета числа колониеобразукижх единиц как описано э psSoss (Капитанов A.B. п др., 1985).

При определении концентрации öo.jgta в образцах использовал! мгтктк>лт'ур2?сгг£ :.:отод (Кочетов Г,Д., 1930). Для солюбилизации клеток и мембран использовали 0,2% дэзоксихолат натрия.

При измерэнин скорости образования суперсксидного радикала в .мембране клеток использовали метод (Жуков A.A., Арчаков А.И., 1983). Сукцкщшфовзние цитохромз-0 проводили no (Kuthan н. et al., 1982). Определение активности супероксиддисмутази проводили в препаратах мембран по методу (!ic. Cord J.is., 1969). Активность НАДН-оксидазы измеряли как описано у (Jinks D.c at ai., I97R) Самоинактивапию фермента оценивали з соответствии с (Аксенов М.Ю. и др., 1938). Активность Н+-АТФ-азы определял! по количеству образующегося неорганического фосфата (Kasbek L. et al., 1977).

Для оценки физического состояния плазматической мембраны клеток использовали спиновые зондьг на основе кетостепртюй

кислоты с ши-рокси-выда пгрЁмагаитшм фрагментом яри 6-м, 12-м или 16-м атоме углерода _«ирнокислотной цэгш (5HG, IZHG, I6HG) фирмы "ByVâ öo." (США). Сигналы SUP спиновых зондов регистрировали на спектрометре "Е-104и фирмы "Varian" (США), а сигналы ЭПР плазматических мембран - на спектрометре "Рубин".

Для определения липвдного состава мембран использовали тонкослойную хроматографию нз стеклянных пластинках размером 10x15 см. Экстракции липидов из лиофильно выеденных мембран проводили смесью хлороформ: метанол /2:1/. Определение ;г;гриокислоткого состава липидов в мембранах проводили методом жидкостной хроматографии на хроматографах "Цвет-106" (ЛХМ-8, модель 10) и "Iniersmat" с пламенно-ионизационным детектором. Метилирование . липидов проводили по методу (Ланкин В.З. и Садовникова И.П., 1971). Содержание холестерина определяли по методу (Rudel Ii. J., Morris M.D., 1973).

Желэзо-индуцируемую хемилюминесценцию мембран оценивали согласно (Владимиров Ю.А., 1983). Определение ' концентрации ТБК-активных продуктов в препарате проводили по цветной реакции с йгабарбитуровой кислотой (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972).

Для получения . моноламеллярных фосфолипидных липосом использовали метод (Arnhold J., Deev P.J., 1995). Донорные моноламеллярные холестерин-фософолипидных липосомы готовили согласно (Wanghan A.D., 1967). Донорые моноламеллярные липосомы в супернатанте содержали холестерин и фосфолипид в молярном соотношении близком к единице. О переносе холестерина судили по накоплению [3Н]-холестерина в акцепторных лилосомах.

С целью окисления сыворотку и акцепторные липосомы подвергали

облучэнир ультрафиолетовым светом. Другой способ окисления акцепторных • фосфолипидных л1шосом - Бездействие продуктами НАДН-оксидазной реакции.

Результаты ■ обрабатывали статистически с использованием параметрического ^критерия Стьюдента.

2. Основные результаты исследования. 2.1. Исследование изменения лихшдного состава плазматической мембраны А,1аШ1аю11 в ходе функциональной самоинактивации ¡ОДН-ОКСИДВ8Ы.

НАДН-оксидаза валяется ключевым ферментом энергетического метаболизма в клетках мшюшшзмы и практически единственным генератором в них активных фэрм кислорода. В ходе НАДН-оксидазной реакции происходит восстановление молекулы кислорода и образование перекиси водорода (Аксенов М.Ю. и др., 1988). Теоретически, продукты таких реакций могут инактивировать ферменты, ИХ генерирующие,, и могут быть причиной нарушений структуры липидов в составе клеточных мембран. Поэтому важно было установить, успевает ли за время полной самоинактивации НАДН-оксидазы фермент изменить свое липидное окружение, и влияют ли эти изменения 'на работу других ферментов. На рис.! представлены результаты экспериментов по выявлению зависимости активности НАДН-оксидазы от • продолжительности реакции и накопления при этом ТБК-активных продуктов. Как следует из полученных данных, происходит накопление ТБК-активных продуктов и увеличение интенсивности хемилшинесценшш в ходе реакции, что

свидетельствует об увеличении предрасположенности мембраны к ПОЛ. Обнаружено также, что в ходе реакции снижается количество двойных связей каротиноидов, играющих роль антиоксидантов. Об этом свидетельствует снижение характеристических максимумов светопоглощения хромофора, особенно при 448 нм.' В ходе инактивации НАДН-окскдазы также происходит значительное снижение индекса ненасыщенности лилидов (табл.1).

Таблица Л1. Изменения интенсивности максимума поглощения каротиноидов при 448 нм и зависимость степени ненасыщенностк кпрнокислотных остатков лилидов мембраны клеток А.1а1й1аша в ходт НАДН-оксидазноЛ реакции.

Время реакции, час

0 ' 4 4

(-НАДН) (+НАДН)

А448 "2,21 2,21 1,49

ненасыщ.ж ' 0,91 0,90 0,47

насыщ.аж

Таким образом ' можно заключить, что НАДН-оксидзза при длительном функционировании 1п иМго активирует в мембранах микоплазмы процессы ПОЛ. Происходящие при этом изменения липидного состава сводятся к снижению индекса ненасыщенности жирнокислотных цепей фосфолипидов и деструкции двойных связей каротиноидов.

В экспериментах по переносу холестерина из холестерпн-донорных в холестерин-акцепторные липосомы показано,

0.3

о О 1

Время реакции, час Рис. 1. Параметры самоинактивации НАДН-оаевдаэной реакции п процесса ПОЛ мембран клеток Л. 1а,ъ<11ам)И (1-ВДА (+Ге2Ч> 2-МДА ( -Ре21); 3-МДА (контроль), 4-актив-ность НАДН—оксидапы^ 5—интенсивность ХЛ опыт 6—контроль)

что акцепторные липосомн, окисленные УФ-облучвнвем или продуктами НАДН-оксидазной раакции хуже встраивают холестерин (на 50% и 2Ъ%, соответственно). Можно предположить, что появившиеся в результате окисления гидрофильные участки препятствуют встраиванию гидрофобной молекулы холестерина в лигаадщй Оислой.

Все перечисленные . выше процессы оказывают влияние на функционирование ферментов мембраны. Так, выявлена зависимость работы протонной Н+-АТФ-азы мккоплазмы от степени инактивации НАДК-оксидазы. Обнаружено, что активность этого фермента в ходе НАДН-оксидазной' реакции уменьшается на 50%. Таким образом, инактивация некоторых мембранных ферментов микоплазш связана с работвй НАДН-оксидазы, модифицирующей посредством генерации овободнорадакалышх продуктов липидный бислой.

2.2. Зависимость интенсивности свободнорадикальных процессов и активности внутриклеточных актиоксидантных систем от возраста

культуры.

Обнаружение ТБК-активных продуктов в любой реакционной системе всегда рассматривается как указание на протеканио б ноя реакций ПОЛ. Одним из реакционноспособных продуктов свободнорадикальных процессов в нашем случае явл.ются супероксидный радикал. Поэтому (наш были проведены опыты по оценке накопления ТБК-активных продуктов, скорости образования 0^ и активности СОД в зависимости от возраста культуры (см. рис.3). Культура клеток A.latälawtl при своем развитии проходит 3 фазы роста: латентную (до 8 часов от момента посева), логарифмическую

+0-1

5

о

et о

U20H

л ь

о о

Я ш X

5 104 <

а х

р 4' о

Я

\ •Ö1

к о

.1

—Г" 10

—I-1-<—

20 30 40 50 Возраст культуры час

■0.3

2 в

4

ь.

0.2 *

Й

о

0.1

Рис. 2. Зависимость скорости образованна радикалов СЁ ( активность СОД в содержания ЦДЛ в ыенбранах клеток А. laidlawii в зависимости от возраста культуры О-Ио 2-актнвность СОД, 3-МДА," J, II, III-фазы роста культуры).

(до 24 ч).и стационарную (с 24 часов). В работе (Капитанов A.B.. и др., 1985) показано, что именно в стационарной фазе развития культуры закономерность снижения жизнеспособности jeneток л.laidlau)it аналогична снижению жизнеспособности животных в популяции.

. Из полученных данных следует, что накопление ТБК-активных продуктов при старении не присходит. Активность ■свободнорадикальных процессов максимальна в логарифмической фазе роста, а пик активности СОД наступает позже. В мембране был

5

Возраст культуры чао

Рис. 3. Возрастные изменения надежности электронного транспорта (Ч) и надежности супероксиддои защиты клеточной мембраны (по отношению £ значениям этих параметров 11—ти часовой культуру).

обнаружен сигнал ЭПР Мп2+, интенсивность которого коррелировала с активностью СОД. Поскольку известно, что СОД прокариот как правило Мп2+-зависимая, то можно предположить, что СОД А.1аЫ1аюИ тоже является Мп -зависимой. Так же обнаружен сигнал ЭЛБ с ^2,005, ширгаой 40 Э, интенсивность которого падает с возрастом культуры. Т^с как дыхательная цепь у микоплззмы редуцироащм., вероятно, этот сигнал обусловлен флавопротеидом.

Парамея^ш надежности электронного транспорта (0) для микоплаэ^ы определяется как величина отношения скорости генерации

радикалов ггрч окисленшг НАДН к активности НАДН-оксидазы, а надежность супероксиддисмутазной защиты клеточных мембран Ш) как отношение скорости генерации радикалов к активности СОД. На рис. 3. представлены графики возрастных изменений параметров а и к. Из этих данных следует, что к началу стационарной фазы снижается а - вероятность возникновения радикала 0^, Л-вероятность "просачивания" радикала через СОД-защиту и уровень малонового диальдегида в клетках (характеризующий надежность полной защиты от активных форм кислорода (см. рис.2)). "Старение" культуры в стационарной фазе происходит без существенных изменений параметров надежности, подобно старению животных.

Функциональная активность ферментов электронного транспорта и Н+-АТФ-азы определяется физико-химическими свойствами двойного липидного слоя. Ранее (Капитанов А.Б. и др., 1983) было показано, что при увеличении возраста культуры степень эксимеризации пирена в мембранах резко уменьшается в поздней логарифмической фаза роста АЛаШХашП. Это может быть связано с увеличением мембранной микровязкости. Но так как степень эксимеризации пирена определяется вероятностью.столкновений и перехода его из мономера в димер (место локализации зонда - вся гидрофобная часть мембраны), то о микровязкости по этому параметру можно' судить только косвенно. Поэтому, для оценки зависимости микровязкости мембран клеток от возраста культуры, в следующей части работы были использованы спиновые зонды на основе нитроксильных производных кетостеариновых кислот 5НС, 12НС и 16НС, которые локализуются в области жирнокислотных цепей фосфолипидов. Таким образом мембрана была прозондирована по всей глубине. Параметры

5.2

Н

и

ы о

4.4

4.0

-1-1-1-1

О 10 20 30 40

Возраст культуры час

Рис. 4. Изменения времени корреляции ^ вращательной подвижности спиновой метки 5НС в плазматической мембране клеток А.]а1<11атш в зависимости от возраста культуры.

спектров ■ ЭПР .спиновых. меток дают информацию о полярности окружения метки и ее вращательной подвижности, которые отражают полярность липидов и подвижность соответствующего участка "средней" фосфолшидной молекулы в данном Сислое. На рис.4, представлены возрастные изменения параметра х^-времени корреляции вращательной подвижности спиновой метки 5НС при 37°с. Аналогичные результаты получены для Амах при 37°с, а также параметра упорядочности Эти данные подтверждают эксперименты со

спиновыми метками 12НС и 16НС.

Из полученных значений следует, что в конце логарифмической фазы роста микоплазмы снижается подвижность спиновой метки в мембранных липидах. Старение культуры АЛаШХаюИ в стационарной фазе, подобно старению животных (Кольтовер В.К., 1987), происходит без существенных изменений текучести :{лвмбрашщх липидов. Различия между температурным? «рдаради яодащцности меж® особенно сильно проявляются .в -коорявдатах Аррециуоа, 5 обл&стя 20-26°С в плазматических меадЗргщах.» гшмданнух да «латок, находившихся в стационарной фезе а дакоодввда холестерин, происходит фазоЕий -я&реход.

Таким обраэ&у., с помощью сдано здос меток доказано, что к центру двойного слоя увеличивается подвшщост> жирнокисло^щх цепей фосфодапидов, а старение клеток в стационарной, фазе не сопровождается снижением вращательной подвижности сегменте® углеводородные «ерей мембранных липидов.

2.3. Исследование зависимости относительного накопления холестерина зз стареющих клетках АЛа1й1аш11 от степени окисленное®! лдаидов их плазматической мембраны.

Изп^сгно, что наряду с другие причинами, ПОЛ зависит от 'структуры и количества яенасыщещдас жирную кислот в мембране. Количество же ненасыщенных жирных кислот фосфодапидов в мембранах клеток АЛаШХшИ определяется услощущи з>рста. Поэтому н^£езинтересшм яьляежея вопрос о том, к аде -условия развития культуры и ПОЛ их мембраны влияют на ее г^зкеспособно^здь.. ¿¡ля

Рис. 5. Зависимость роста культуры - А(640) ( - )

и величины НОЕ (— - -) от продолжительности облучения сыворотка УФ-светом { 1 — контрольная культура 2 -4-х часовое облучение).

решения этого вопроса выращивали . клетки на сыворотке, предварительно облученной УФ-светом. О степени окисленности сыворотки судили по накоплению ТБК-актиЕных продуктов и диеновых коньюгатбв. Оказалось, что облученная сыворотка оказывает стимулирующее действие на культуру, проявляющееся в более быстром ее росте и более, быстром достижении ею стационарной фазы. Пр:т этом наблюдается и большее накопление биомассы к этому времени

(рис.5). Клетки в опытной культуре более жизнеспособны, о чем свидетельствуют результаты зксперимзктов * по оценке колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис.6).

Как следует из представленных на рис.6, данных, росшая на облученной сыворотке культура микоплазмы в латентной фазе развития характеризуется максимальной интенсивностью

ХЛ, усл.ед.

40

30

20

10

I

I !

14

1 1

I

Я 1

I

Л

24

40

Р %

1

I

14

24

хс/фл, усл.ед, 0,8

- 0,6

I

I

I

- 0.4

0,2

40

Возраст культуры, чао

Рис.е. Зависимость интенсивности хемилюминисценции (ХЛ) мембран микоплазмы и отношения холестерин/фосфолипид (ХС/ФЛ) от возраста культуры (0 -контрольная культуоа, ^-культура, выросшая на сыворотке, облученной 4 часа УФ-светом").

хемилдаинесценции. В логарифмической фазе этот параметр снижается, а б стационарной фазе - даже ниже, чем в культуре, росшей на обычной сыворотке- Изменения отношения холестерин/фос-фолипид (ХС/СД) носят анологичный характер. То есть культура в этом случае не углубляется в состояние покоя настолько, что в клеточных мембранах начинает накапливаться холестерин. Вероятно, в латентной и ранней логарифмической фазе развития культуры накопление холестерина•является неспецифической реакцией клеток на неблагоприятные условия внешней среды, так как такая ситуация наблюдается и при посеве клеток в среду, содержащую трихлорфенол, р-нафтофлавон, толуол или сыворотку в концентрации больше или меньше оптимальной (Говорун и др., 1990). При изучении

зшрнокислотного состава плазматических ме.мйрэн (табл.2) получены данные, свидетельствующие о том, что в латентной фазе развития отношение ненасыщенных к насыщенным кирнокислотным цепям лмпидов в мембранах клеток, выросших на облученной сыворотке, ниже чем в мембранах контрольной культуры. Но в клетках логарифмической и

Таблица Зависимость степени ненасыщенности жирнокислотнкх

остатков мембран клеток АЛа1(Иаш11 от продолжительности облучения сыворотки, добавляемой в сведу роста. ( Различия достоверны по отношению к начальной величине * при Р<0,05Ь

Возраст культуры, Время облучения сыворотки, ч

0 4

14 1,1+0,06* 0,7+0,04

24 0,3+0,03 0,3+0,04

40 0,3+0,03 0.3+0,03

стационарной фаз эти различия нивелируются.

Таким образом, в работе показано, .что при роме культуры но среде с окисленной' сывороткой наблюдается увеличение содержания холестерина в клеточных мембранах в ранней логарифмической фазе вследствие адаптивной неспецифической реакции клеток. Такое накопление холестерина при оптимальных условиях роста ш стационарной фазе не зависит от протекающих в клэтках ранее (в логарифмической фазе) свободнорадикальных процессов. Об этом свидетельствует неизменность жирнокислотного состава мембранных фосфэлипидов в этот период.

2.4, Изменение относительного содержания холестерина в клетках A.laldlawtl и ее жизнеспособность при действии фосфолигаадого

препарата.

Известно (Shinitzky М., 1978), что фосфолипидыэ мицеллы способны солюбилизировать из биологических мембран холестерин. Поэтому можно использовать это их свойство для изменения липидного состава- мембран. Препарат на. основе фосфотидилхолина, содержащий дотрргент растительного происхождения и этвяол, был любезно предоставлен с.н.с. лаборатории биохимии автоонализэ' НИИ ФХМ Т.И.Торховской. При добавлении его в момент пересева'культуры эффекта не было обнаружено. Но так как холестерин начинает накапливаться в мембранах в стационарной фазе роста, то при инкубации клеток из этой фазы роста с препаратом in vitro обнаружено снижение индекса ХС/ФЛ уже в перше часы инкубации. Добавление фосфолипидного прегтзрзта в начале стационарной фазы

роста (по анологии с их действием на эукариотические клетки) приводит к увеличению величины КОЕ, что свидетельствует об увеличении жизнеспособности культуры. При одновременном добавлении препарата и пересеве культуры из стационарной фазы в свежую питательную среду в том жз титре так же прис-ходило увеличение жизнеспособности, но индекс ХС/ФЛ не менялся. Фаза препарата без фосфотидилхолина увеличивала показатель жизнеспособности больше чем в 4 раза, но при этом значение отношения ХС/ФЛ было выше чем в контрольных пробах.

В целом, из представленных данных можно заключить, что во-первых, препарат на основе фосфатидилхолипа проявляет холестеринэкстрагирующую активность по отношению к стареющим клеткам A.lnldJci'll в условиях In vitro. Путем изменения липидного состава плазматических мембран можно снижать скорость старения клеток. . ..

■Выводы.

1.НАДК-оксидаза меток A.latdlasvli при своей работе генерирует продукты, индуцирующие перекиское окисление мембранных .тапидов к снижающие активность мембранных ферментов.

2. Интенсивность свободнорадикальных процессов максимальна в делядихся клетках. Стационарное старение клеток A.laidlavli сопровождается понижением генерации токсичных свободнорадикальных продуктов окислительного метаболизма, усилением мо:цности антиокислигельной защиты и неизменностью текучести липидного оислоя их плазматической мембраны.

3. Увеличение окксленности мембраны клеток A.laidlcuill в латентной фазе развития культуры сопровождается накоплением холестерина аналогично накоплению его ■ в недэлящюсся клетках стационарной фазы развития. Накопление хольстерина в мембране клеток в стационарной фазе развития культуры не зависит от протекающих в логарифмической фазе процоссов окислительной модификации фосфолкпидов.

4. Препарат на основе фосфатидилхолина проявляет холестаринэкстрагирущую активность по отношению к стареющим клеткам Д.1 aldlczvtl In vitra и увеличивает их жизнеспособность.

Список публикаций по теме диссертации:

I. Генерация супероксидных радикалов и текучесть мембранных липидов Acholeplasma laldlawll при старении культуры клеток. Биофизика. Вып.1. Т.XXXII. 1987. С.95-99.(совместно с Каштановым

A.Б., Кольтовером В.К., Татищевым О.С.).

2. Образование свободных радикалов при развитии культуры клеток ахолеплазмы. Доклады МОИП. Общая биология. Москва. Наука. 1988» С.79-82. (совместно с Каштановым А.Б.).

3. Факторы, определяющие накопление холестерина в мембранах клеток стареющей культуры Actwleplasma laidlcwil. 5 Всесоюзный съезд геронтологов и гериатров. 22-25 ноября 1988, Тбилиси. Тезисы и рефераты докладов. 4.1.0.280-281. Киев. 1988,(совместно с Каштановым А.Б., Аксеновым М.Ю., Клебановым Г.И.)

4.0 возможности регуляции скорости развития и старения культуры "клеток направленным изменением липидного комипонента их плазматических мембран. Деп.в ВИНИТИ 18.10.1989. * 63II-B89. С.54-77.(совместно с Аношкиной И.Н.).

5. Полиненасыщенные фосфатидилхолины как регуляторы свойств мембран атеросклеротически измененых и стареющих клеток. Всесоюзный симпозиум "Реконструкция, стабилизация и репарация биологических, мембран". Тезисы докладов. Благовещенск. Сентябрь. 1989.. С. 86. (совместно с. Торховской Т.И., Каштановым А.Б., Аношкиной И.Н.,.Халиловым Э.М.).

6. Зависимость ■ изменения относительного содержания холестерина в плазматической мембране клеток растущей культуры Acholeplasma ' laidlcwil от окисленности липидов сыворотки питательной среды. Биологические мембраны. Т. 7. & 5. 19Э0. С.506-513.(совместно с Капитаровым А.Б., Клебановым Г.И., Говорун

B.М., Погода Т.В., Зайцевым И.Ф., Муханкиным А.И., Кулаковой

C.Н., Тесёлкиным Ю.О.).

7. Изменение липидного состава плазматической мембраны клеток Acholeplasma laldlawlt в ходе НАДН-оксидазной реакции. Биологические мембраны. Т 7. » 6. 1990. С.619-625.(совместно с Каштановым.А.Б., Грибановым Г.А., Говорун В.М., Артюшиной Л.А., Чагиной Н.С., Бондаревой Е.В.,' Калиман И.М.).