Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Trematoda: Schistosomatidae)

Лопаткин, Антон Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Trematoda: Schistosomatidae)
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Trematoda: Schistosomatidae)"

На правах рукописи

ЛОПАТКИН АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ

Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Тгета1ос1а: всЫв^ота^ае)

Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

484711

1 9 МАЙ 2011

Москва-2011

4847114

Работа выполнена в лаборатории организации генома Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАН

Рысков Алексей Петрович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Защита состоится «23» мая 2011 г. в 11-00 час. на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334 Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 Москва, ул. Вавилова, д.32.

Автореферат разослан «22» апреля 2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Официальные оппоненты:

Семенова Серафима Константиновна

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук

Евгеньев Михаил Борисович Потапов Сергей Георгиевич

кандидат фармацевтических п

Грабовская Л. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Эволюционные преобразования макромолекулярных структур клеток, таких как нуклеиновые кислоты и белки, составляют одну из актуальных проблем современной молекулярной генетики. Последние достижения в области геномики и биоинформатпки привели к резкому увеличению числа фундаментальных исследований, направленных на выяснение механизмов молекулярной эволюции и реконструкцию эволюционной истории генов у организмов различного таксономического ранга. Ядерные и митохондриальные ДНК широко используются для выявления родственных взаимосвязей между отдельными особями или группами особей, для изучения динамики генетических процессов в популяциях, описания структуры вида и истории его возникновения [Avise, 2003].

С этой точки зрения особый интерес представляют сложные биологические системы, состоящие из двух или нескольких коэволюционирующих организмов, например паразитов и их хозяев. Среди паразитических организмов одну из наиболее многочисленных групп составляют плоские черви - трематоды, или сосальщики (Platylielmintlies: Trematoda), объединяющие более 18000 видов паразитов беспозвоночных и позвоночных животных. Трематоды отличаются от остальных эукариот наличием сложного жизненного цикла, связанного со сменой животных-хозяев и чередованием нескольких последовательных партеногенетических и одного гермафродитного поколения. Все трематоды -эндопаразиты, обитающие во взрослом состоянии во внутренних органах позвоночных животных и человека, которые являются их дефинитивными (окончательными) хозяевами, а роль первого промежуточного хозяина всегда выполняют различные виды моллюсков [Скрябин, 1948; Гинецинская 1968; Gibson et al., 2002]. Общебиологический интерес представляют проблемы систематики и филогении трематод, процессы взаимодействия паразита с окружающей средой, в качестве которой выступает не только комплекс природных абиотических факторов, но, в первую очередь, сам организм животного-хозяина. Молекулярно-генетические исследования являются весьма перспективными для выяснения механизмов адаптации, возникающих при разных способах размножения и смены животных-хозяев.

Различные факторы влияют на эволюционную динамику нуклеотидных изменений ядерного и митохондриалыюго генома, и это отражается .на уровне отдельных особей, популяций и видов в процессе филогенеза [Ballard, 2000]. К их числу можно отнести различия в скоростях геномной репликации и репарации, смещения в соотношении

нуклеотидных замен, различную скорость возникновения внутривидовой гетерогенности за счет неполной сортировки геномов и адаптивную эволюцию.

Помимо фундаментального значения исследование молекулярной филогении трематод может иметь практическое приложение в медицине и сельском хозяйстве при разработке методов генотипирования возбудителей заболеваний человека и животных, а также для экологического мониторинга, создания нового поколения лекарств и усовершенствования вакцин.

Среди трематод одну из древних и высокоспециализированных групп представляют кровяные сосальщики птиц и млекопитающих из семейства Schistosomatidae. Структурная организация и эволюция генома этой группы до сих пор слабо изучена. К 2007 г. получены полные последовательности белок-кодирующих генов мт генома шистосом млекопитающих из рода Schislosoma [Zarowiecki et al., 2007]. Полные последовательности ядерных геномов расшифрованы лишь в 2009 г. для двух представителей этого рода - S. mansoni и S. japonicum, вызывающих тяжелые поражения мочеполовой системы и органов пищеварения человека [Berriman et al, 2009; Liu et al., 2009]. Различные виды и штаммы шистосом подробно изучены с помощью маркеров ядерного и митохондриального генома, что позволило подтвердить выделение внутри рода четырех основных морфо-экологических групп, а также выявить ряд новых закономерностей в распределении и происхождении латино-американских и афро-азиатских видов и популяций [Rollinsonö 1996; Locker et al., 2003].

Менее изучены повсеместно распространенные кровяные сосальщики птиц, а именно сосальщики из рода Trichobilharzia, личинки которых являются возбудителями церкариального дерматита человека (бильгарциоза или "лихорадки купальщика"). Их объединяют в большой род, содержащий около 40 видов, для которых основным дефинитивным хозяином являются птицы из отряда Anseriformes. В Европе известны три вида висцеральных (т. е. паразитирующих в кровеносных сосудах внутренних органов птицы) вида - Т. szidati, Т. franki, Т. salmaticensis, и один назальный вид Т. regenti, паразитирующий в носовой полости и центральной нервной системе птиц. При экспериментальном заражении показан более высокий патогенный эффект для млекопитающих церкарий назальной формы [Horak et al., 1999; 2002]. В настоящее время известен полный мт геном лишь для Т. regenli, имеющий около 60% сходства с азиатским видом S. japonicum в структуре белок-кодирующих генов и их аранжировке [Webster et al., 2007].

Ввиду высокого морфологического сходства шистосом из рода Trichobilharzia только применение молекулярных маркеров позволяет идентифицировать видовую

принадлежность церкариальных изолятов. Одними из наиболее эффективных маркеров оказались последовательности двух внутренних транскрибируемых спенсеров рДНК (ITS1 и ITS2) [Dvorak et al., 2002]. С их помощью удалось провести видовую диагностику европейских шистосом и показать различия в структуре консервативных и вариабельных участков рДНК. Изучено распространение трех видов шистосом (T. szidaii, T. franki, Т. regenti) в водоемах Чехии, Польши, Франции, Исландии [Rudolfovâ et al., 2005, 2007; Aldhoun et al., 2009; Jouet et al., 2009, 2010]. В некоторых сообщениях использованы последовательности мт гена сох! для демонстрации межвидовых отличий птичьих шистосом с территории Франции и Исландии [Jouet et al., 2009, 2010]. Практически неизученным остается представитель другого широко распространенного в Евразии монотипного рода птичьих шистосом - Bilharziella polonica. Считается, что в отдельных случаях церкарнн этого вида, наряду с трихобильгарцнямн, могут вызывать "лихорадку купальщика" [Szidat, 1938; Horak and Kolarova 2000; Zbikowska, 2003].

Цель н задачи исследования. Цель работы - с помощью молекулярно-генетических маркеров (методов) изучить особенности структурной организации и дивергенции ядерных и митохондриальных генов птичьих шистосом разных видов из родов Trichobilharzia и Bilharziella, обитающих на территории России и Беларуси.

Основные задачи:

1. Оценить особенности структурного полиморфизма последовательностей рДНК (28S, ITS 1, ITS2) и генов мтДНК (coxl, сохЗ) птичьих шистосом из двух родов.

2. На основании сравнения с известными последовательностями ядерных и митохондриальных генов провести видовую дифференциацию изученных изолятов шистосом.

3. Разработать молекулярно-генетическую систему видовой идентификации шистосом рода Trichobilharzia.

4. На основании полиморфизма ITS2 рДНК провести видовую молекулярно-генетическую идентификацию промежуточных хозяев-моллюсков из семейства Lymnaeidae и оценить уровни гостальнои специфичности в группе видов птичьих шистосом из рода Trichobilharzia.

5. Реконструировать возможную историю происхождения и филогенетические связи птичьих шистосом, распространенных на территории Евразии.

Научная новизна и практическое значение работы. Впервые выделены и охарактеризованы последовательности ядерного и митохондриального генома неизвестного ранее вида птичьих шистосом из рода Trichobilharzia - T. sp. var. narochanica. У пяти видов птичьих шистосом рода Trichobilharzia u Bilharziella, обитающих на

территории России и Беларуси, обнаружена сложная филогеографическая структура, отражающая незавершенные процессы сортировки мтДНК и рДНК при расселении и адаптации паразита к разным видам промежуточных хозяев-моллюсков. Впервые для птичьих шистосом показана внутригеномная и межпопуляционная изменчивость ITS1 рДНК на примере одного из четырех видов, а именно у Т. frctnki. На основе последовательностей 28S рДНК разработана новая молекулярно-диагностическая система для детекции птичьих шистосом рода Trichobilharzia на стадии промежуточного хозяина -моллюска. Данная система пригодна для мониторинга природных очагов возбудителен церкариального дерматита человека.

Полученные результаты имеют практическое значение для быстрой детекции и видовой идентификации возбудителей бильгарциозов, что значительно повышает эффективность санитарно-эпидемиологических мероприятий, направленных на выявление природных очагов бильгарциозов и разработку методов борьбы с ними. Они могут найти применение при разработке медико-ветеринарных программ в соответствующих учреждениях РАН и РАСХН, таких как Центр Паразитологии ИПЭЭ РАН, Всероссийский Институт Гельминтологии им. К. И. Скрябина, в ветеринарных академиях, институтах, факультетах и других учреждениях медико-ветеринарного профиля.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на 10-ом европейском мультиколлоквиуме по паразитологии (France, Paris, 24-28 августа 2008 г.), IV Всероссийском Съезде Паразитологического общества при Российской академии наук «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения» (Санкт-Петербург, Россия, 20 - 25 октября 2008 г.), Ill международной школе молодых учёных, (Звенигород (Московская обл.), 1-5 декабря 2008 г.), международной конференции «Биоразнообразие и экология паразитов наземных и водных ценозов» (Москва, 9-11 декабря 2008 г.), V съезде Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (Москва, 2128 июня 2009 г.), III межрегиональной научной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора Константина Петровича Фёдорова (1520 сентября 2009 г.), 8-ой национальной конференции по паразитологии (Варна, Болгария 23-26 сентября 2009 г.), 2-ой международной конференции «Молекулярная филогенетика» (Москва, 18-21мая 2010 г.), международной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (Москва, 30 ноября - 3 декабря 2010 г.), а также межлабораторном семинаре ИБГ РАН (31 марта 2011 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе, 3 статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на _ страницах и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения

результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего _

наименований. Работа содержит 17 таблиц и 23 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы церкарии и мариты птичьих шистосом родов Trichobilharzia и Bilharziella, собранные в 2005-2010 г.г. из моллюсков (церкарии) или утиных птиц (мариты), обитающих в 7 пресноводных водоемах России (г. Москва, Московская и Новосибирская области) и 5 водоемах Белоруссии (озера Нарочь, Мястро, Большие Швакшты, Полоневичи и р. Скема). Для построения дендрограмм использованы последовательности шистосом и их промежуточных хозяев-моллюсков семейства Lymnaeidae, аннотированные в GeneBank (N=35). Всего исследовано 142 церкариальных изолята и 6 половозрелых марит, получено около 400 новых последовательностей генома шистосом и 30 последовательностей ITS2 рДНК моллюсков из родов Radix, Lymnaea.

Для амплификации и секвенирования последовательностей ITS 1, 1TS2, 28S рДНК, мт coxl, сохЗ генов шистосом, а также ITS2 рДНК моллюсков применяли опубликованные ранее известные [Dvorak et al., 2002; Itagaki et al., 1998; Lockyer et al., 2002; Bargues et al., 2003] и разработанные нами специфичные праймеры. Определение нуклеотидного и аминокислотного состава, оценку нуклеотидного (я) и гаилотипического (Ii) разнообразия, D- и Z- тесты на нейтральность нуклеотидных замен осуществляли с помощью программ MEGA ver. 4.1 и ARLEQUIN ver 3.11. Выбор модели нуклеотидных и аминокислотных замен проводили с помощью иерархического теста альтернативных моделей в программе Modeltest v. 3.06 (PAUP 4.0b). Программы PhyML ver. 3.0 и MEGA ver. 4.1 применяли для реконструкции филогенетических деревьев методами «ближайшего соседа» (NJ), максимальной парсимонии (MP) и максимального правдоподобия (ML). Для построения парсимониальных сетей использовали программы TCS ver. 1.3 и SplitsTree v.4.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Полиморфизм ITS2 рДНК птичьих шистосом из родов Trichobilharzia и

Bilharziella.

Для видовой идентификации птичьих шистосом использован второй внутренний транскрибируемый спейсер рДНК (ITS2), успешно применяемый ранее для дифференциации трех европейских видов рода Trichobilharzia -Т. szidati, Т. regenti, T.franki [Dvorak et al., 2002]. Все три вида обнаружены на российской и белорусской части

исследованного ареала. Они с высокой достоверностью (ИБ=61-99%) образуют отдельные кластеры на дендрограмме генетических различий (Рис. 1). Кроме известных последовательностей 1ТЭ2 рДНК Т. ^егШ, Т. и Т. /гап!а у шистосом с территории

Беларуси найдены 35 ранее неизвестных ранее последовательностей нового вида, названного нами Т. зр. \>аг, пагоскапка (Т. пагосЬатса). Они не отличаются по длине (322 п.н.) от последовательностей Т. /гапк1 и Т. ге§епН и формируют базальную видовую кладу внутри рода ТНсИоЬННата.

Длина последовательностей 1Т82 рДНК всех изолятов В. ро1отса из белорусской, чешской и французской популяций составила 338 п.н. В составе всех последовательностей обнаружен только один вариабельный сайт (транзиция А—»0) в положении 267. Гомо- и гетерозиготы по аплелю О найдены в белорусских популяциях, а на территории Чехии н Франции (по данным вепБапк) найдены лишь гомозиготы АА. Соотношение генотипов в суммарной выборке составило 20 (АА): 6 (Ав): 2 (Ой) т.е. 71.4%: 21.4%: 0.7% при частотах аллелей рА=0.84 и рС=0.16.

Табл.1. Характеристика полиморфизма ядерных (1Т82 рДНК) и митохондриальных (сох], сохЗ) генов птичьих шистосом из российских и белорусских популяций.

Вид Линии ITS2 рДНК (L=318-324 п.н.) coxl (L=l 125п.н.) сохЗ (L=651)

N V,% N V,% Jt.% h N V,% it,% h

Т. szidati 19 0.6 15 4.2 0.008 1.0 12 3.4 0.008 0.9

Т. regain 5 0 5 0.09 0.004 1.0 5 1.5 0.007 1.0

7\ narochunicii А 32 0.3 6 1.2 0.006 1.0 3 1.4 0.009 1.0

В 3 0 3 1.4 0.01 1.0 3 0.9 0.006 1.0

X 35 0.3 9 2.0 0.007 1.0 6 20.2 0.117 1.0

T.franki ПА 9 0 9 3.6 0.009 0.98 8 2.5 0.007 1.0

ПВ 6 0 7 2.7 0.009 1.0 6 4.3 0.009 1.0

I (Москва) 5 0 5 0.6 0.002 1.0 5 1.7 0.009 1.0

III (Сибирь) 3 0 3 0.7 0.005 1.0 3 0.6 0.004 1.0

L 23 1.2 24 19.2 0.07 1.0 22 22.1 0.07 1.0

В. polonica 18 0.3 18 1.9 0.004 0.85 - - - -

Обозначения: >)-число последовательностей; Ь- длина последовательностей; У-число вариабельных сайтов; л и Ь - среднее нуклеотидное и гаплотипическое разнообразие.

y= luí

I AOTFS3.5 I

IТ Iranki 1523 I

—4 Т. tanki Isa JV

•^L,—»,« Г

1. regenli HAN9

Uldall RBtW NVLSI31

— N9LSI24

N9Ram76 N9Rain582 NLau5

1+161 A с») B

T. franki

T. regenti

T. szidciti

T. narochanica

tí. polo nica

Рис. 1. Полиморфизм 1Т82 рДНК в суммарной выборке птичьих шистосом рода ТпсИоЬШюЫа из европейских, российских и белорусских популяций. Модель замещений -Т1М+1 (- 1п1_,= 755.225, А1С= 1806.376). В узлах ветвления обозначены индексы бутстрепа (>50%), полученные при использовании методов МЬ/МР/Ш.

Мутационные изменения в последовательностях рДНК вызваны преимущественно транзитами. Среди четырех видов наибольшее число вариабельных сайтов обнаружено в 1Т82 у Т. ьгШап (4) и Т./гапМ (7) (Табл.1). Последовательности всех известных изолятов Т. l^egenti - трех российских, двух белорусских и изолятов с территории Франции и Чехии (п=21), оказались идентичными, и формируют неразветвленную кладу. Более гетерогенной оказалась выборка Т. $:1с!аИ, в которой можно выделить 2 или 3 дифференцированные

группы. Однако статистическая поддержка этих групп составила лишь 46-67%. Две дивергировавшие группы последовательностей, А и В (ИБ> 87%), найдены среди изолятов Т. narochanica. Шистосомы группы А найдены также в Исландии (п=9) и Франции (изолят EAN17).

Последовательности Т. franki объединены, по меньшей мере, в четыре группы. Две линии формирует основная масса европейских изолятов из московской популяции, Франции, Чехии (N=12) (линия I), а также идентичные между собой последовательности Т. franki из Белоруссии (линия II). Уникальные последовательности обнаружены у трех марит, паразитирующих на A. querqaediila из Новосибирской области (ИБ>56%) (линия III), а также для трех церкариальных изолятов из Исландии (ИБ>78%) (линия IV).

2. Полиморфизм 28S рДНК.

Для подтверждения видового статуса Т. sp. var. narochanica и внутривидовой неоднородности Т. franki нами определена нуклеотидная последовательность гена 28S рРНК. Ранее эти последовательности опубликованы для видов T.szidati, Т. regenti и В. polonica, D. pulverulenta, G. huronensis [Lockyer et al., 2002].

RAM2 ROM4 AQTFS3.2 -AQTFS3 5

NLau12

N9Schisl12

-T. regenü

T ocellala - T. szidatj

I-N9Schist9

T. franki

j T. regenti ] T. szidaíi

T. nurochimica

- NVLaul

— D. pul\erulenla

-G. huronensis

-B. polonica

Рис. 2. Полиморфизм 28Б рДНК в российских, белорусских и европейских изолятах шистосом из рода ТпсИоЫШата. Модель замещений - НКУ+в (- 1пЬ= 7094.917, А1С= 14249.869). В узлах ветвления обозначены индексы бутстрепа (>50%), полученные при использовании трех методов МЬ/МР/Ш.

Для секвенирования выбраны по одному изоляту из линий А и В Т. пагосИапка (МУЬаи1 и ШБсЬ^Э) и по два изолята из трех линий Т./гапШ (Кат2, Яот4, АОТБ83.2, АОТБ53.5, ЫЬаи12 и Ы98сЫ5П2). Длина последовательностей 28Б рДНК у всех видов птичьих шистосом рода ТгкИоЫШата составила 3870 п.н. Данный локус является достаточно консервативным, о чем свидетельствует низкое значение показателя V. Так, число

вариабельных сайтов у T. franki составило 43 (1% от общей длины последовательности), а для T. narochanica оказалось еще меньше - 1 I (0.26%). На дендрограмме (Рис. 2) предполагаемый новый вид T. sp. var. narochanica выделяется в отдельную группу. Шесть изолятов Т. franki разделены, как и по ITS2 рДНК, на три подкластера (ИБ>50%). Один подкластер образован последовательностями церкариальных изолятов из Москвы (Ram2 и Rom4), второй - последовательностями двух мариг из Новосибирской области (AQTFS3.2 и AQTFS3.5), а третий кластер содержит последовательности двух белорусских церкариальных изолятов (NLaul2 и N9Schistl2).

3. Разработка молекулярно-генегической системы для видовой диагностики птичьих шистосом рода Trichobilharzia на основании полиморфных рДНК.

На Рис. 3. представлены результаты выравнивания наиболее полиморфного участка гена 28S рДНК - 02-домена четырех видов птичьих шистосом из рода Trichobilharzia - Т. szidati, Т. franki, T. regenti и Т. var. narochanica. На основании этого выравнивания мы подобрали четыре праймера к четырем консервативным участкам последовательности 02-домена 28S рДНК и опробовали их для разработки системы видовой диагностики птичьих шистосом рода Trichobilharzia (Рис. 3, 4).

T.szi'hiii ; Ц //

Т. sp. var г narochantcal

Т. regenti -T. franki

Рис. 3. Выравнивание последовательностей 02-домена 288 рДНК четырех видов птичьих шистосом рода ТпсИвЫШапш. Последовательности четырех диагностических праймеров представлены на отдельных строчках, участки гомологии выделены затемненной рамкой.

На первом этапе проводится ПЦР, позволяющая дифференцировать три из четырех видов трихобильгарций. Особенность этого этапа состоит в использовании трех праймеров - одного прямого Р1-Тг и двух обратиых(Я 1-паг, Я4-паг). Прямой праймер (Р1Тг) является универсальным, так как комплементарен консервативному у всех четырех видов 5' - участку 28Б рДНК. Первый обратный праймер К1-паг подобран к участку гомологии для пары видов Г. sz¡dati и Т. гаг. пагос/иниса. Второй обратный праймер (Я4-

паг) отжигатся вместе с праймером Р1-Тг только на ДНК двух видов - Т. \ш. пагоскатса и Т. ге^епИ. Таким образом, набор из одного прямого универсального и двух обратных праймеров в зависимости от последовательности матричной ДНК на первом этапе в одной реакции может давать один (для Т. шёай и Т. ^епН), два (для Т. ^епа), или ни одного (на ДНК Т./гапк/') ампликона.

й/) ¡5 в/,

V и 2 чЬ ^ »?

^ ^ «П

ЗООЬр > „ ы —» —* __ <ЗООЬр

200Ьр > <200Ьр

1 2 3 4 п1 2 3 4,

I этап II этап Р1-Тг Р1-Тг

Ш-паг БЫ-паг К2-Гг

Рис. 4. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации с диагностическими праймерами для четырех видов шистосом: Т. ге%епй (ге$, Т. 5г'к1а1'1 (я:), Т. пагоскатса (паг), Т./гапИ ([г). I этап - три праймера (Р1Тг, Я1 паг, Я4паг), II этап- два праймера (Р1Тг, Я2й).

Если в качестве матрицы будет использована ДНК Т. зг'иЯай, то на фореграмме ожидается один фрагмент длиной 316 п.н. В результате амплификации ДНК Т. ге^ея/г также образуется только один ПЦР-продукт, но длиной 255 п.н. Амплификация с использованием ДНК Т. чаг. пагоскатса должна приводить к образованию двух продуктов - длиной 316 и 255 п.н.

Амплификация ДНК Т. ].гапк/' с тремя вышеуказанными праймерами не приводит к образованию ампликонов. Поэтому для подтверждения видовой принадлежности Т./гапк! проводится второй, дополнительный этап ПЦР, где в качестве прямого используется все тот же универсальный праймер Р1-Тг, а в качестве обратного - праймер К.2-1т, комплементарный специфичному участку 02-домена 288 рДНК Т. /гапк'!. Ожидаемый единичный ампликон имеет размер 258 п.н. (Рис. 4). Фрагменты, полученные в результате

двух амплификации, элюировали из геля и секвенировали. Нуклеотидные последовательности пяти продуктов имели предсказанный нами размер (316 п.н., 255 п.и., 258 п.н.) и содержали участки последовательностей 02-домена 28S рДНК соответствующих видов рода Trichobilharzia. Этот простой и дешевый способ пригоден не только для мониторинга природных очагов возбудителей церкарнального дерматита человека. Он позволяет сразу, без секвенирования сортировать для дальнейшего исследования определенные виды шистосом из рода Trichobilharzia.

4. Полиморфизм ITS1 рДНК птичьих шистосом рода Trichobilharzia.

Для более детального изучения филогенетических взаимосвязей проанализирован

состав последовательностей ITS1 рДНК у 89 изолятов трихобцльгарций из белорусской и российской популяций, а также шистосом из Франции, Исландии, Чехии и Польши. Нуклеотидные последовательности 1TS1 у разных видов сильно отличались по длине. Так, самая короткая последовательность обнаружена у вида T. szidati - 746 п.н., а самая длинная - у T. regenti (1325 п. н.). Длина ITS1 у T. sp. var. narochanica составляет 964 п.н, а у Т. franki варьирует у разных изолятов от 788 п.н. до 1090 п.н.

Все четыре вида содержат на 5' и З'-концах консервативные области размером 82 и 350 нуклеотидов, соответственно. 5'- Участки у T. szidati и T. sp. var. narochanica содержат по 2 вариабельных сайта. T. regenti содержит в 5'-консервативной области 3, а T. franki - 9 полиморфных сайтов, обусловленных единичными точечными мутациями. 3'-Консервативная область ITS1 идентична у всех изученных изолятов T. regenti. Изоляты T. szidati отличаются между собой тремя точковыми мутациями и инсерцией одного нуклеотида, встречающейся только у трех московских изолятов (Lsm4, Lsm7, Lsm20). Вид T. sp. var. narochanica содержит в 3'-консервативном участке 6, а T. franki -17 полиморфных сайтов.

Кроме мутационного полиморфизма консервативных участков для каждого вида показань! различия по числу и структуре повторяющихся звеньев в составе ITS1 (Рис. 5). В последовательностях T. regenti содержится блок из шести тандемно организованных повторов. Длина первых пяти повторов одинакова и составляет 111 п.н. за исключением некоторых европейских изолятов, у которых найдены укороченные копни второго и пятого повтора за счет инсерции одного нуклеотида. По сравнению с пятью основными звеньями, последний, шестой повтор во всех образцах укорочен с 3'-конца и его длина составляет 83 п.н. Количество полиморфных сайтов внутри повторов варьирует от шести до 16.

ощ т. szidati

-> (964) т. narochcinica

"(1376) т. regenti

2 t-t,ш—а»»!, I —-, (986-990)

3 V-.-, (893)

4 >-с.п.........п.—-, (788)

6 [д!

(990)

(890)

_--, (990)

■(1090) J

Т. franki

Рис. 5. Структура последовательностей ITS1 рДНК четырех видов птичьих шистосом in рода Trichobilharzia. Прямоугольниками обозначены повторы, гомологичные участки в повторах отмечены одним и тем же цветом, цифрами от 1 до 6 - генотипы ITS 1. В скобках указаны размеры последовательностей в п. н.

Последовательность ITS1 Т. szidati содержит два повторяющихся звена длиной по 45 п.н., разделенных между собой длинным участком 53 п.н. Два звена отличаются между собой одной заменой и двумя инсерциями. Все изоляты данного вида практически идентичны по структуре первого повтора и отличаются только двумя точковыми мутациями, одна из которых найдена у шистосом из Сибири, вторая встречается у двух церкариальных изолятов из белорусской и московской популяции (Lsm20 и NLst4). Последовательности второго повторяющегося звена также отличались только по двум сайтам, характерным для одного изолята из Польши.

Для Т. sp. var. narochanica в составе ITS1 показано наличие трех повторов длиной по 44 п.н. Все три повтора отличаются между собой по 13 полиморфным сайтам. Расстояние между первым и вторым повтором составляет 91 п.н., а между вторым и третьим - 50 п.н. Структура первого повторяющегося звена идентична для всех изученных изолятов. Второе звено имеет в составе один полиморфный сайт, а третий повтор содержит две толковые мутации в последовательностях двух изолятов.

Высокая внутривидовая гетерогенность последовательностей ITS 1 рДНК наблюдается у Т. franki. Для большинства изученных изолятов данного вида характерна последовательность ITS1 длиной 986-990 п.н., в состав которой входят три повторяющихся звена, разделенных между собой короткой последовательностью 9 п. н. (Рис. 5, генотип 1, 2),

Длина последовательностей ITS1 шистосом из исландских (линия IV) и сибирских (линия III) популяций составляет 893 и 788 п.н., соответственно, и это вызвано отсутствием одного или двух последних звенев (Рис. 5, варианты 3 и 4).

Наиболее распространены варианты, у которых длина первого повторяющегося звена -126 или 102 п.н. Повтор длиной 126 нуклеотидов найден у шистосом из Исландии (Is25), Франции (DOUC1) и у всех белорусских изолятов Т. franki из линии II. У других исландских изолятов были найдены похожие варианты звена длиной от 127 до 129 п.н, имеющие одно- и динуклеотидные вставки в поли-А участках. У московских изолятов Т. franki (линия I, генотип 1 на рис. 5) длина первого звена укорочена за счет мнсерции 26 нуклеотидов. Но наиболее сильно отличаются по составу последовательность единственного повтора у трех марит из Сибири (линия Ш, генотип 4). Второе звено ITS1 Т. franki менее вариабельно и представлено в изученных нами популяциях только одним вариантом длиной 91 п.н. Этот повтор отличается от первого звена делецией первых 11 п.н. Третье повторяющееся звено в составе ITS1 рДНК Т. franki у большинства изученных изолятов состоит из 92 нуклеотидов. Такой вариант повтора встречается в московской, белорусской, французской популяциях.

Помимо межвидовой и популяционной изменчивости у четырех белорусских изолятов Т. franki обнаружен индивидуальный геномный полиморфизм ITS1 рДНК. При электрофоретическом разделении ПЦР-продуктов трех изолятов NLaul2, N10Sch4 и N10v7 (линия II по ITS2 на Рис.1) было выявлено два генотипа, представленных двумя фрагментами разной длины (Рис.6, дор. 1 и 2). Сравнение структуры шести ПЦР-продуктов (по два фрагмента от изолята) показало, что все они представляют собой различные варианты ITS1 рДНК и различаются между собой в основном за счет числа повторяющихся звеньев и некоторых точковых мутаций в консервативных областях.

М 1 2 3 4 М

1031bp

Чм-....."rf

Рис. 6. Индивидуальная (внутригеномная) и популяционная изменчивость ITS 1 рДНК, обнаруженная в церкариальных изолятах Т. frartki из Беларуси (дорожки I, 2, 4), Московского региона (дор. 4) и Новосибирской области (дор.З). М - маркер молекулярных масс 100 bp (Fermentas) с указанием мажорного фрагмента длиной 1031 п.н.

Изолят NLaul2 содержит в геноме два варианта последовательностей или две копии ITS1 (Рис. 6 дор.1, Рис. 5, генотип 5), одна из которых (5а) идентична 1TS1 длля большинства белорусских изолятов (Рис.5 , генотип 2). Вторая копия ITS1 NLaul2 (56) отличается по длине от первой за счет делеции третьего повторяющегося звена и имеет высокое сходство (99%) с последовательностью 1TS1 исландских шистосом (Рис. 5, генотип 3). Одна из копий ITS1 изолятов N10Sch4 и N10v7 (Рис.6, дор. 2, Рис. 5, генотип 6) представляет наиболее распространенный вариант ITS1 размером 990 п.н. (Рис. 5, генотип 6а). Вторая копия большей длины (1090 п.н., рис. 5, генотип 66), имела в своем составе дополнительный четвертый повтор, который полностью идентичен по составу третьему повторяющемуся звену.

5. Полиморфизм митохондриальных генов (coxl, со.хЗ) и генеалогические линии

Для более детального изучения межвидовой дифференциации и выявления генеалогическиой структуры у видов рода Trichobilharzia в качестве маркеров использовали два митохондриальных гена - coxl и сохЗ, а для В. polonica - только ген coxl.

С помощью праймеров, предложенных ранее для дифференциации видов шистосом млекопитающих [Lockyer et al., 2002] получены 53 последовательности гена coxl (1125 п.н.) для церкариальных изолятов из белорусской (п=29) и российской (Москва, Московская и Новосибирская области, п=17) популяций, а также трех марит T.franki из новосибирской популяции. Большинство обнаруженных замен вызваны транзициями, и

птичьих шистосом из рода Trichobilharzia и В. polonica.

преобладание транзиций над трансверсиями наиболее очевидно у Т. szidali (5.7), тогда как для трех других видов характерны более низкие значения этого показателя: 2.5, 2.1 и 1.5 у Т. narochanica, T.frankiu Т. regenti, соответственно.

Обнаружено весьма низкое нуклеотндное разнообразие у видов Т. regenti и Т. szidali (0.004 и 0.008), в трех линиях (I-III), выделенных в группе Т. franki на основании полиморфных ITS2 рДНК (0.002-0.009), а также в линии А у Г. sp. var. narochanica (0.004). Для линии В этого же вида характерно максимальное значение к (0.01). Гаплотппическое разнообразие оказалось одинаково высоким для всех видов (h=98-100%), что свидетельствует о генетической уникальности практически каждой из последовательностей гена coxl в изученной выборке шистосом (Табл.1). Подавляющее большинство мутаций затрагивают третье основание в кодонах и не приводят к изменению аминокислотной последовательности COI каждого из видов. Отношение несинонимичных и синонимичных замен для каждой из выборок не превышает 1. На нейтральность обнаруженных замен в последовательностях coxl указывают результаты сравнения средних значений числа нуклеотидных различий (D-статистика) или отношения синонимичных и несинонимичных замен (Z-статистика) между парами последовательностей. По этим показателям мы не обнаружили значимых отличий между последовательностями каждого из четырех видов.

Низкое нуклеотидное и высокое гаплотипическое разнообразие характерны и для церкариальных изолятов В. polonica (Табл.1). Как и у трихобильгарций, длина исследованного фрагмента coxl для 18 церкариальных изолятов В. polonica, инфицирующих моллюсков Planorbarius corneus (сем. Planorbidae) из трех белорусских водоемов, а также одной мариты с территории Украины (AY157186) составила 1125 п.н. (375 аминокислот). В последовательностях coxl обнаружен 21 полиморфный сайт, что составляет 1.9 % от общей длины анализируемого локуса (Табл. 1). Большая часть замен вызвана трашициями в третьем положении кодонов (соотношение транзиции/трансверсии составляет 4.92) и приводят к синонимичным заменам. Общее число гаплотипов составляет 11, а величина нуклеотидного и гаплотипического разнообразия ж достигает значения 0.004 % и 85.6 %, соответственно. Мы не обнаружили среди гаплотипов пяти видов инсерций, делеций л «стоп»-кодонов, что свидетельствует об отсутствии среди изученных последовательностей ядерных копий coxl.

В нуклеотидной последовательности гена сохЗ, как и гена coxl, у четырех видов птичьих шистосом из рода Trichobilharzia преобладали АТ-основания (69.9%-71.2%). Наименее вариабельные последовательности сохЗ характерны для видов Т. regenti и Т. szidali, у которых доля вариабельных сайтов (V) составила 1.5% и 3.4%, соответственно. Вариации этого показателя между линиями А и В у Г. sp. var. narochanica составили 0,9-

1.4%, а между линиями T. franki 0.6-4.3% (Табл.1). Четыре вида отличаются по соотношению числа транзиций и трансверсий. Так у T. regenti, T. franki и T. szidati число транзиций существенно преобладает над числом трансверсий, а у T. sp. var. narochanica это отношение равно единице. Число синонимичных замен значительно выше по сравнению с несинонимичными у T. franki и T. narochanica (42/102=0.4 и 46/84=0.55, соответственно). У вида T. szidati это соотношение равно 10/12=0.83, а у Г. regenti число несинонимичных и синонимичных замен одинаково (5/5). Как и в случае coxl, гаплотипическое разнообразие оказалось одинаково высоким для всех видов (h=100%) а нуклеотидное разнообразие в последовательностях гена сохЗ варьирует в пределах 0.0040.009 у видов и линий, выделенных на основании полиморфизма 1TS2 рДНК. Одна интересная особенность в структуре последовательностей сохЗ отмечена во всех трех изолятах T. narochanica, формирующих линию В - они заканчиваются нетрадиционным триплетом AGT вместо типичного для мт генома птичьих шистосом стоп-кодона ААТ.

Последовательности мт гена сох! и с охЗ использованы для построения филогенетических деревьев (эти громоздкие данные приведены в основной рукописи). В дополнение к ним построены парсимониальные сети двух типов, более наглядно и более детально представляющие взаимосвязи между отдельными гаплотипами, линиями в пределах видов, а также между отдельными видами (Рис. 7 и 8).

Топология дендрограмм и структура сетей, отражающих дивергенцию четырех видов рода Trichobilharzia, трех линий T. franki (I-III) по сох! и ITS2, практически совпадает (Рис. 1,2 и Рис. 7А). Дивергенция двух линий А и В Г. sp. var. narochanica менее выражена при использовании мт гена coxl по сравнению с геном сохЗ и ITS2, 28S рДНК. Сравнение мт генома позволяет разделить линию II у T.franki на две дополнительные сублинии (НА и 11В на Рис. 7).

Наиболее простая филогеографическая структура характерна для T.regenti, сходная при сравнении гаплотипов coxl и сохЗ изолятов этого вида из российских, белорусских и чешских популяций (Рис.8). Более сложные взаимосвязи между гаплотипами сох! обнаружены в небольшой выборке белорусских изолятов у В. potonica. Среди них можно выделить, по крайней мере, две группы последовательностей, уровень дивергенции между которыми достигает 0.55 %. Напомним, что исследованные выборки T.regenti и В. polonica практически однородны по последовательностям 1TS2 рДНК. Относительно несложную структуру с неявной дифференциацией формируют гаплотипы сох, сохЗ и ITS2 рДНК в выборке российских и белорусских изолятов T. szidati.

Рис. 7. Парсимониальные сети, или сплитграфы, характеризующие внутри- и межвидовую дифференциацию четырех видов птичьих шистосом рода Trichobilharzia, построенные на основании полиморфизма мт генов co.xl (А) и сохЗ (Б). Обозначение трех основных генеалогических линий T.franki (I, II, III) и двух линий Т. narochaniica (А и В) соответствует рис. I.

пнрснмопиальнмс сети, построенные ни оснонипнн полиморфными ГОНИ СОх1

• • • « -

I I

ф" • •

ш • • у,. • • •

Г. оЛ»/

- •

>, ■'

I Г. /гапМ

\ • й /> •••• &

Л г\

шфсимоппильные СПИ. ПОП роенные ни осношншп полиморфными геш| сохЗ

• • • 5 .

- •.....• •

• • • •

Т./тЫ • •

•

• • ( •

»" «-/в/ ®

• .......—......—...............Г.гвдгап Г.геМ»!

Рис. 8. Внутривидовая генеалогическая структура пяти видов птичьих шистосом, выявленная на основании полиморфизма мт генов сох1 (А) и сох5 (Б). Генотипы двух линии Т. паюсИапюа обозначены черным (линия А) и белым цветом (линия В). Предполагаемых промежуточные генотипы обозначены маленькими кружками, а их число (п) указано над ребрами.

Интерпретация расхождения генеалогических линий двух других видов - Т./гапк1 и Т. пагосИатса весьма неоднозначна и имеет в настоящее время предварительный характер. Дивергенция ядерных генов и митохондриального гена сох! генов в этой группе носит согласованный характер (Рис.1, 2, 7А). Использование сохЗ демонстрирует иную дифференциацию четырех видов ТпскоЬИЪап'ю (Рис. 7Б). Совершенно неожиданно линии А и В нового вида Т. пагосИапюа расщепляются и обнаруживают сходство либо с геномом Т. згШаЛ, либо с геномом линии II Т. /гапк1 Изменяется при этом и относительное

взаиморасположение последовательностей мт генома Т. regenti и двух других линий -1, III Т. franki. Такое несоответствие в топологии дендрограмм или сетей может отражать незавершенные процессы сортировки предковых генеалогических линий, известные для организмов разного таксономического ранга. Об этом же свидетельствуют различия в структурах двух сетей, представленные на Рис. 8. Еще одним объяснением данного явления может являться наличие интрогрессивной гибридизации, последствия которой трудно разграничить с неполной сортировкой и требуют специального подтверждения.

6. Молекулярная дивергенция н гостальная специфичность птичьих шистосом рода Trichohilharzia.

На заключительном этапе исследования мы провели оценку гостальной специфичности исследованных видов шистосом рода Trichibilharzia. С этой целью с помощью ITS2 рДНК проведена видовая идентификация промежуточных хозяев - пресноводных моллюсков. Для сравнения использовали известные ранее последовательности ITS2 моллюсков из водоемов нескольких стран Европы, принадлежащие к пяти видам рода Radix (R. auricidaria, R. peregra, R. lagotis, R. labiata, R. ampia) и пяти видам (L. stagnalis, L. palustris, L. turricula, L.fiiscus, L. corvus) из рода Lymnaea [Bargues et al., 2003].

Дифференциация 34 инфицированных шистосомами моллюсков из рода Radix и 15 моллюсков из рода Lymnaea показана на двух дендрограммах (данные не приведены) и схематически представлена на Рис. 9. Исследованные нами моллюски объединились в три кластера, соответствующих трем видам рода Radix (R. auricularia, R. lagotis, R. ampia) и два кластера, соответствующих двум видам рода Lymnaea (L. stagnalis, L. palustris) .

Среди представителей рода Lymnaea к виду L. palustris можно отнести трех моллюсков из сибирских водоемов и двух моллюсков из оз. Нарочь. Последовательности ITS2 у них не отличаются от единственной известной последовательности L. palustris, характерной для моллюсков на территории Франции, Нидерландов и Германии. Моллюски L. stagnalis из московских и белорусских водоемов образуют единую группу с представителями данного вида из Франции, Германии и Италии с генотипами G1-G4. В обособленную от них группу (вероятно, с пятым по счету генотипом - G5) объединились три последовательности L. stagnalis из сибирских водоемов. 34 исследованных моллюска из группы Radix относятся к трем видам: R. auricidaria, R. lagotis, R. ampia.

Сравнивая распределение разных видов Trichobllharzia на разных видах моллюсков из пресноводных водоемов Москвы, Западной Сибири, Беларуси и стран Европы (Рис. 9), можно сделать следующие выводы.

В водоемах Москвы мы обнаружили 9 моллюсков L. stagnalis, инфицированных Т. szidati. В сибирских водоемах церкарии T. szidati паразитировали не только на L. stagnalis, но и на моллюсках L. palustris. Аналогичное распределение Т. szidati среди двух видов моллюсков из рода Lymnaea характерно для озера Нарочь в Беларуси. Известны аналогичные ассоциации Т. szidati и L. stagnalis в водоемах Франции [Jouet et al., 2005].

Как в водоемах Москвы, так и в реке Каргат все обнаруженные изоляты линии I Т. franki паразитировали исключительно на моллюсках R. aiiricularia. Аналогичные взаимосвязи найдены для шистосом из Франции [Jouet et al., 2005,2010] и Италии [Cipriani et al., 2011]. На оз. Нарочь представители линии II Т. franki обнаружены нами на моллюсках R.ampla и R. lagotis. Показано, что сходные с линией II по ITS2, D-2 домену 28S рДНК, сохI генотипы некоторых изолятов Т. franki инфицировали во Франции и Исландии моллюсков R. peregra [Jouet et al., 2011].

Изоляты T.regenti паразитируют как в московских водоемах, так и на оз. Нарочь иа R. lagotis, тогда как в озерах Франции - на R. peregra [Jouet et al., 2009, 2010].

Новый вид T. sp. var narochanica инфицирует только один вид моллюска из группы Radix, а именно R. ampia.

Рис. 9. Гостальная специфичность птичьих шистосом рода Trichobilharzia. Слева-реконструкция филогенетических связей между четырьмя видами паразита, справа -между соответствующими видами моллюсков из родов Radix и Lymnaeae, построенная на основании полиморфизма ITS2 рДНК.

Несмотря на неполный охват ареала обитания птичьих шистосом, его ограничением преимущественно европейской частью, мы можем определить в изученной группе основные направления дивергенции предкового генома шистосом рода Trichobilharzia.

Вероятно, что наиболее древнюю группу составляют изоляты шистосом Т. franki, для которых характерно не только удивительно высокое разнообразие митохондриальных генеалогических линий, но и значительный уровень межпопуляционной и индивидуальной вариабельности рДНК, а также широкий спектр видов промежуточных хозяев-моллюсков

R.ampla

рода Radix. Очевидно, что наряду с процессами гомогенизации линий, между отдельными линиями Т. franki может происходить обмен генетического материала, приводящий к появлению индивидуальной и популяционной изменчивости генов рДНК. На возможность обмена между отдельными линиями указывают особенности распределения вариантов копий ITS1 рДНК, обнаруженных в географически разобщенных популяциях паразита, например, в Белоруссии и Исландии. Еще одним подтверждением рекомбинационной активности рДНК можно рассматривать присутствие в последовательностях рДНК гипотетических х-сайтов, способных инициировать межгенную рекомбинацию. Филогеографическая структура позволяют нам рассматривать группу изолятов, определяемую на основании полиморфных ITS2 рДНК как один вид Т. franki, в виде более сложного комплекса, состоящего из нескольких (по крайней мере, двух) критических видов или видов-двойников и, вероятно, нескольких единиц более низкого таксономического ранга. Наиболее близким к группе Т. franki и, вероятно, более молодым нужно рассматривать назальный вид Т. regenti, инфицирующий, как и T.franki, моллюсков рода Radix. Одновременно или несколько позже от предкового генома дивергировала линия шистосом, использующая в качестве промежуточных хозяев моллюсков рода Lymnaea и послужившая исходной для формирования генома современных Т. szidati. Что же касается нового вида Т. sp. var narochanica, его происхождение и статус пока остаются неопределенными и требуют дополнительной информации о генетической вариабельности и особенностях географического распределения.

выводы

1. На изученной части ареала наряду с тремя ранее известными в Европе видами птичьих шистосом из рода Tríchobilharzia (T. szidati, T.regenti, T. frankï) показано существование нового вида, названного нами Tríchobilharzia sp. var. narochanica. Он характеризуется уникальными последовательностями рДНК (28S, ITS 1, ITS2) и мт ДНК (сох/, сохЗ) , а также жесткой приуроченностью к определенному виду хозяина-моллюска (Radix ampia).

2. Впервые у птичьих шистосом обнаружена индивидуальная изменчивость рДНК, которая заключается в появлении копий ITS1 рДНК разного размера. Они обнаружены в составе генома у четырех изолятов T. franki из Беларуси и связаны с появлением одного дополнительного или редукцией одного из трех основных повторяющихся звеньев, характерных для большинства изолятов этого вида.

3. Для исследованных популяцияй птичьих шистосом трех видов, Т. szidati, T.regenti, В. polonica, характерно отсутствие четко выраженной внутривидовой структуры по ядерным и митохондриальным генам. У видов Т. franki и Т. sp. var. narochanica выявлены несколько генеалогических линий, конкордантных по мт гену coxl, гену 28S и ITS2 рДНК.

4. Особенности дивергенции митохондриальных и ядерных генов в отдельных популяциях Т. franki позволяют рассматривать этот вид как сборный, состоящий из нескольких криптических видов с выраженной приуроченностью к разным видам промежуточных хозяев-моллюсков рода Radix.

5. Для видов рода Tríchobilharzia обнаружены несоответствия в топологии дендрограмм, построенных на основании вариабельности участков ядерного и митохондриального геномов, вызванные неполной сортировкой предкового полиморфизма и/ или возможной интрогрессией геномов в процессе адаптации к моллюскам из родов Radix и Ьутпаеа.

6. На основании полиморфизма 28S рДНК разработана молекулярно-генетическая система видовой идентификации четырех видов шистосом рода Tríchobilharzia.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи:

1. Хрисанфова Г.Г., Лопаткин А.А, Мищенков В.В., Хейдорова Е.Э., Дороженкова Т.Е., Жукова Т.В., Рысков А.П., Семёнова С.К.. Генетическая изменчивость птичьих шистосом (класс Trematoda, сем. Schistosomatidae) озера Нарочь: идентификация нового вида в группе Trichobilharzia ocellata ДАН, 2009,428 (5): 698-702.

2. Лопаткин А.А., Хрисанфова Г.Г., Воронин М.В., Зазорнова О.П., Беэр С.А., Семенова С.К. Полиморфизм гена сох1 церкариальных изолятов птичьих шистосом (Класс Trematoda, сем. Schistosomatidae), собранных в водоемах Москвы и Московской области. Генетика 2010, том 46 (7): 981-989.

3. Хрисанфова Г.Г., Лопаткин А.А, Шестак А.Г., Мищенков В.А., Жукова Т.В., Акимова Л.Н., Семенова С.К. Полиморфизм гена сох 1 мт ДНК церкариальных изолятов птичьей шистосомы Billiarziella polonica (Класс Trematoda: Сем. Schistosomatidae) из водоемов Беларуси. Генетика 2011, том 47 (5): 684-690.

Тезисы конференций:

1. Семенова С.К., Лопаткин А.А., Васильев В.А., Корчагина Е.В., Корсуненко А.В., Хрисанфова Г.Г., Рысков А.П. Филогеномика и молекулярная эволюция на примере дигенетических сосальщиков (класс Trematoda).Meждyнapoднaя научная конференция «Вычислительная Филогенетика и Геносистематика». Москва, 16-19 ноября 2007г., с.293-296.

2. Хрисанфова Г.Г., Лопаткин А.А., Васильев В.А., Шестак А.Г., Малинкина Т.Ю., Семенова С.К. «Генетический полиморфизм и видовое разнообразие птичьих шистосом озера Нарочь (республика Беларусь)». IV Всероссийский Съезд Паразитологического общества при Российской академии наук «Паразитология в XXI веке - проблемы, методы, решения», Санкт-Петербург, Россия, 20 - 25 октября 2008г., С. 202-204.

3. Chrisanfova G., A. Korsunenko, A. Lopatkin, М. Voronin, S. Be'er, О. Zazornova, S. Vodyanitskaya, Т. Dorozhenkova, E. Heydorova, V. Mishakov, T.Zhukova, E. Bychkova, S. Semyenova. «Diversity of DNA sequences and species identification of cercariae of bird schistosomes obtained from Russian and Belarusian water ponds». Xth European Multicolloquium of Parasitology. Paris, 24-28 August 2008. pp. 110-111;

4. Chrisanfova G. G., Lopatkin A. A., Vasyliev V. A., Mischenkov V. V., Zhukova T. V., Voronin M. V., Be'er S. A., Zazornova O. P., Vodyanitskaya S. N., Yurlova N. I., Semyenova S. K. "Sequence analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacer (ITS2) from cercariae of bird schistosomes ad snail hosts obtained in Ryssian and Belorussian water ponds". 3rd

Workshop on Bird Schistosomes and Cercarial Dermatitis: Rejckov 20, Ledec nad Sazavou, Czech Republic. 6th- 10th July 2009., p. 16.

5. Lopatkin A. A., Chrisanfova G. G., Mischenkov V. V., Zhukova Т. V., Ryskov A. P., Semyenova S. K. "Genetic identification and species diversity of bird schistosome cercariae obtained from Naroch lake (Belorussia)". Eighth National Conference of Parasitology (with International Participation), Varna. 23 -26 September 2009., p. 13 - 14.

6. Семенова С. К., Хрисанфова Г. Г., Васильев В. А., Лопаткин А. А., Корсуненко А. В., Корчагина Е. В., Рысков А. П. «Молекулярная филогения и филогеография паразитических червей - трематод». V съезд Всероссийского общества генетиков и селекционеров. Москва. 25 - 27 июня 2009 г. 21-28 июня 2009, с. 301

7. А.А. Lopatkin, G.G. Chrisanfova, V.A. Vasilyev, M.V. Voronin, V.A. Mischenkov, O.P. Zazornova, S.A. Beer, T.V. Zhukova, A.P. Ryskov, S.K. Semyenova. Molecular phytogeny of cercarial isolates of Russian and Belorussian bird schistosomes (Schistosomatidae, Trematoda) and its intermediate snail hosts as inferred the Its2 rDNA sequences. Molecular Phylogenetics: Contributions to the 2nd Moscow International Conference "Molecular Phylogenetics" (Moscow, Russia, May 18-21, 2010). P. 52-53.

8. S. Semyenova, A. Lopatkin, E. Kheidorova, V. Vasyliev, M. Voronin, S. Be'er, A. Shestak, S. Vodyanitskaya, N. Yurlova, V. Mischenkov, L. Akimova, O. Zazornova, T. Zhukova, A. Ryskov, G. Chrisanfova. Molecular coevolution of bird schistosomes and ITS intermediarte snail hosts. Proceedings of the Seventh International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure Systems Biology (Yune 20-27, 2010, Novosibirsk, Russia). P. 257.

9. Лопаткин A.A., Хрисанфова Г.Г, Воронин М.В., Зазорнова О.П., Беер С.А., Водяницкая С.Н., Юрлова Н.И., Рысков А.П., Семенова С.К. Генетическая дифференциация российских изолятов птичьих шистосом рода Trichobilharzia на основании последовательностей ядерных и митохондриальных локусов. Материалы Международной научной конференции "Теоретические и практические проблемы паразитологии". Москва, 30 ноября-3 декабря 2010 г. с. 206-210.

10. Васильев В.А., Малиикииа Т.Ю., Суходольская Е. М., Водяницкая С. Н., Лопаткин А. А., Рысков А. П., Семёнова С.К. Молекулярная систематика пресноводных моллюсков семейства Lymnaeidae на основании полиморфизма второго внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS2) рДНК. Материалы Международной научной конференции "Теоретические и практические проблемы паразитологии". Москва, 30 ноября-3 декабря 2010 г. Сборник тезисов. С. 81-83.

11. Семенова С.К., Хрисанфова Г.Г, Лопаткин А.А., Мищенков В.В. Жукова Т.А., Рысков А.П., Видовое и генетическое разнообразие церкарий птичьих шистосом (род

rrichobilharzia) из озер Нарочанского Национального парка в Беларуси. Материалы еждународной научной конференции "Теоретические и практические проблемы иразитологии". Москва, 30 ноября - 3 декабря 2010 г. с. 344-347.

12. Хрисанфова Г.Г, Хейдорова Е.Э.,Шестак А.Г., Лопаткии A.A., Бычкова Е.И., еменова С.К. Генетическая изменчивость птичьих шистосом Bilharziella polonica Trematoda: Schistosomatidae) озера Нарочь: первые данные о популяционной структуре.

атериалы Международной научной конференции "Теоретические и практические фоблемы паразитологии". Москва, 30 ноября - 3 декабря 2010 г. с. 398-402.

Заказ № 151-А/04/2011 Подписано в печать 20.04.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,3

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-Ю-ЗО www.cfr.ru; e-mai!:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лопаткин, Антон Александрович

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности жизненного цикла, биологии и систематики птичьих шистосом

1.2. Особенности организации ядерного генома шистосоматид

1.2.1. Геном шистосом млекопитающих Schistosoma mansoni и S.japonicum. Уникальные и повторяющиеся последовательности генома шистосом

1.2.2. Мобильные элементы трематод

1.3. Геномная вариабельность и эволюция рДНК трематод

1.3.1. Кроссинговер, рекомбинация и %-сайты

1.4. Особенности организации митохондриального генома трематод

1.5. Молекулярная филогения и филогеография трематод

1.5.1. Филогеография

1.5.2. Интрогрессивная гибридизация

1.5.3. Рекомбинация мтДНК

1.5.4. Молекулярная филогения и филогеография шистосом птиц и млекопитающих

1.5.4.1. Шистосомы млекопитающих и человека

1.5.4.2. Межвидовая гибридизация шистосом

1.5.4.3. Шистосомы птиц из рода Trichobilharzia и Bilharziella

1.6. Молекулярная филогения промежуточных хозяев птичьих шистосом -пресноводных моллюсков семейства Lymnaeidae

1.7. Использование молекулярно-генетических маркеров для видовой диагностики и детекции трематод

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 48 II. 1. Матер иалы 48 II.2. Методы

11.2.1. Фиксация образцов и выделение ДНК

11.2.2. Полимеразная цепная реакция

11.2.3. Элюция и секвенирование

11.2.4. Клонирование

II.2.5. Статистическая обработка результатов

III. РЕЗУЛЬТАТЫ 61 III. 1. Полиморфизм рДНК птичьих шистосом из родов Trichobilharzia и Bilharziella

III. 1.1. Полиморфизм ITS2 рДНК птичьих шистосом из рода Trichobilharzia 61 III. 1.2. Полиморфизм 28S рДНК птичьих шистосом из рода Trichobilharzia 68 III. 1.3. Разработка молекулярно-генетической системы для видовой диагностики Trichobilharzia на основании полиморфных рДНК 69 III. 1.4. Полиморфизм ITS 1 рДНК птичьих шистосом из рода Trichobilharzia 73 HI. 1.5. Полиморфизм ITS2 рДНК Bilharziella polonica

111.2. Молекулярная идентификация видов промежуточных хозяев - пресноводных моллюсков. Гостальная специфичность птичьих шистосом России и Беларуси

111.3. Полиморфизм митохондриальных генов птичьих шистосом из родов Trichobilharzia и Bilharziella

111.3.1. Полиморфизм митохондриальных генов {coxl, сохЗ) у птичьих шистосом из рода Trichobilharzia

111.3.2. Полиморфизм гена coxl в популяциях птичьей шистосомы В. polonica

IV. ОБСУЖДЕНИЕ 96 IV Л. Сравнительный анализ генетической дифференциации и гостальной специфичности птичьих шистосом рода Trichobilharzia

V. ВЫВОДЫ 103 БЛАГОДАРНОСТИ 104 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

ГДФ - гуанозиндифосфат

МГЭ - мобильный генетический элемент

Мт- митохондриальный п.н. - нуклеотидные пары

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ЭДТА - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты сох - ген цитохромоксидазы dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate) - дезоксирибонуклеотидтрифосфат

EST (Expressed Sequence Tags) — концы экспрессирующихся последовательностей

ILS (incomplete lineage sorting)- неполная сортировка предковых линий

ITS (Internal Transcribed Spacers) - внутренние транскрибируемые спейсеры рДНК

LINE (Long Interspersed Nuclear Elements) - длинные диспергированные последовательности

IsrDNA (large subunit) - ДНК малой субъединицы рибосомы LTR (Long Terminal Repeat) - длинный концевой повтор nad- ген NADH-дегидрогеназы

ORF (Open Reading Frame) - открытая рамка считывания

PCR (Polymerase Chain Reaction), ПЦР - полимеразная цепная реакция

RAPDs (Random Amplified Polymorphic DNA) - полиморфные ДНК, амплифицированные с помощью случайных прймеров

RT (Reverse Transcriptase) - обратная транскриптаза (ревертаза) SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) - додецилсульфат натрия

SINE (Short Interspersed Nuclear Elements) - короткие диспергированные последовательности ssrDNA (small subunit) - ДНК большой субъединицы рибосомы

VNR (long variable noncoding regions) - длинные вариабельные некодирующие районы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Trematoda: Schistosomatidae)"

Актуальность проблемы. Эволюционные преобразования макромолекулярных структур клеток, таких как нуклеиновые кислоты и белки, составляют одну из актуальных проблем современной молекулярной генетики. Последние достижения в области геномики и биоинформатики привели к резкому увеличению числа фундаментальных исследований, направленных на выяснение механизмов молекулярной эволюции и реконструкцию эволюционной истории генов у организмов различного таксономического ранга. Ядерные и митохондриальные ДНК широко используются для выявления родственных взаимосвязей между отдельными особями или группами особей, для изучения динамики генетических процессов в популяциях, описания структуры вида и истории его возникновения [Avise, 2003].

С этой точки зрения особый интерес представляют сложные биологические системы, состоящие из двух или нескольких коэволюционирующих организмов, например паразитов и их хозяев. Среди паразитических организмов одну из наиболее многочисленных групп составляют плоские черви - трематоды, или сосальщики (Platyhelminthes: Trematoda), объединяющие более 18000 видов паразитов беспозвоночных и позвоночных животных. Трематоды отличаются от остальных эукариот наличием сложного жизненного цикла, связанного со сменой животных-хозяев и чередованием нескольких последовательных партеногенетических и одного гермафродитного поколения. Все трематоды - эндопаразиты, обитающие во взрослом состоянии во внутренних органах позвоночных животных и человека, которые являются их дефинитивными (окончательными) хозяевами, а роль первого промежуточного хозяина всегда выполняют различные виды моллюсков [Скрябин, 1948; Гинецинская 1968; Gibson et al., 2002]. Общебиологический интерес представляют проблемы систематики и филогении трематод, процессы взаимодействия паразита с окружающей средой, в качестве которой выступает не только комплекс природных абиотических факторов, но, в первую очередь, сам организм животного-хозяина. Молекулярно-генетические исследования являются весьма перспективными для выяснения механизмов адаптаций, возникающих при разных способах размножения и смены животных-хозяев.

Различные факторы влияют на эволюционную динамику нуклеотидных изменений ядерного и митохондриального генома, и это отражается на уровне отдельных особей, популяций и видов в процессе филогенеза [Ballard, 2000]. К их числу можно отнести 5 различия в скоростях геномной репликации и репарации, смещения в соотношении нуклеотидных замен, различную скорость возникновения внутривидовой гетерогенности за счет неполной сортировки геномов и адаптивную эволюцию.

Среди трематод одну из древних и высокоспециализированных групп представляют кровяные сосальщики птиц и млекопитающих из семейства Schistosomatidae. Структурная организация и эволюция генома этой группы до сих пор слабо изучена. К 2007 г. получены полные последовательности белок-кодирующих генов мт генома шистосом млекопитающих из рода Schistosoma [Zarowiecki et al., 2007]. Полные последовательности ядерных геномов расшифрованы лишь в 2009 г. для двух представителей этого рода - S. mansoni и S. japonicum, вызывающих тяжелые поражения мочеполовой системы и органов пищеварения человека [Berriman et al., 2009; Liu et al., 2009]. Различные виды и штаммы шистосом подробно изучены с помощью маркеров ядерного и митохондриального генома, что позволило подтвердить выделение внутри рода четырех основных морфо-экологических групп, а также выявить ряд новых закономерностей в распределении и происхождении латино-американских и афро-азиатских видов и популяций [Rollinson, 1996; Lockeretal., 2003].

Менее изучены повсеместно распространенные кровяные сосальщики птиц, а именно сосальщики из рода Trichobilharzia, личинки которых являются возбудителями церкариального дерматита человека (бильгарциоза или "лихорадки купальщика")- Их объединяют в большой род, содержащий около 40 видов, для которых основным дефинитивным хозяином являются птицы из отряда Anseriformes. В Европе известны три вида висцеральных (т. е. паразитирующих в кровеносных сосудах внутренних органов птицы) вида - Т. szidati, Т. franki, Т. salmaticensis, и один назальный вид Т. regenti, паразитирующий в носовой полости и центральной нервной системе птиц. При экспериментальном заражении показан более высокий патогенный эффект для млекопитающих церкарий назальной формы [Horak et al., 1999; 2002]. В настоящее время известен полный мт геном лишь для Т. regenti, имеющий около 60% сходства с азиатским видом S. japonicum в структуре белок-кодирующих генов и их аранжировке [Webster et al., 2007].

Ввиду высокого морфологического сходства шистосом из рода Trichobilharzia только применение молекулярных маркеров позволяет идентифицировать видовую принадлежность церкариальных изолятов. Одними из наиболее эффективных маркеров оказались последовательности двух внутренних транскрибируемых спенсеров рДНК (ITS1 и ITS2) [Dvorak et al., 2002]. С их помощью удалось провести видовую диагностику европейских шистосом и показать различия в структуре консервативных и вариабельных участков рДНК. Изучено распространение трех видов шистосом (T. szidati, T. franki, Т. regenti) в водоемах Чехии, Польши, Франции, Исландии [Rudolfovâ et al., 2005, 2007; Aldhoun et al., 2009; Jouet et al., 2009, 2010]. В некоторых сообщениях использованы последовательности мт гена coxl для демонстрации межвидовых отличий птичьих шистосом с территории Франции и Исландии [Jouet et al., 2009, 2010]. Практически неизученным остается представитель другого широко распространенного в Евразии монотипного рода птичьих шистосом — Bilharziella polonica. Считается, что в отдельных случаях церкарии этого вида, наряду с трихобильгарциями, могут вызывать "лихорадку купальщика" [Szidat, 1938; Horak and Kolarova 2000; Zbikowska, 2003].

Цель и задачи исследования. Цель работы - с помощью молекулярно-генетических маркеров (методов) изучить особенности структурной организации и дивергенции ядерных и митохондриальных генов птичьих шистосом разных видов из родов Trichobilharzia и Bilharziella, обитающих на территории России и Беларуси.

Основные задачи:

1. Оценить особенности структурного полиморфизма последовательностей рДНК (28S, ITS1, ITS2) и генов мтДНК (coxl, сохЗ) птичьих шистосом из двух родов.

3. Разработать молекулярно-генетическую систему видовой идентификации шистосом рода Trichobilharzia.

4. На основании полиморфизма ITS2 рДНК провести видовую молекулярно-генетическую идентификацию промежуточных хозяев-моллюсков из семейства

Ьутпае1с1ае и оценить уровни гостальной специфичности в группе видов птичьих шистосом из рода ТпсИоЬИИата.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Лопаткин, Антон Александрович

V. выводы

1. На изученной части ареала наряду с тремя ранее известными в Европе видами птичьих шистосом из рода Trichobilharzia (T. szidati, T.regenti, T. frankï) показано существование нового вида, названного нами Trichobilharzia sp. var. narochanica. Он характеризуется уникальными последовательностями рДНК (28S, ITS1, ITS2) и мт ДНК (coxl, сохЗ) , а также жесткой приуроченностью к определенному виду хозяина-моллюска (Radix ampia).

4. Особенности дивергенции митохондриальных и ядерных генов в отдельных популяциях T. franki позволяют рассматривать этот вид как сборный, состоящий из нескольких критических видов с выраженной приуроченностью к разным видам промежуточных хозяев-моллюсков рода Radix.

5. Для видов рода Trichobilharzia обнаружены несоответствия в топологии дендрограмм, построенных на основании вариабельности участков ядерного и митохондриального геномов, вызванные неполной сортировкой предкового полиморфизма и/ или возможной интрогрессией геномов в процессе адаптации к моллюскам из родов Radix и Lymnaea.

6. На основании полиморфизма 28S рДНК разработана молекулярно-генетическая система видовой идентификации четырех видов шистосом рода Trichobilharzia.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я благодарен руководителю лаборатории организации генома, моему научному руководителю, Алексею Петровичу Рыскову за интерес к работе и научную поддержку.

Я выражаю искреннюю благодарность моему научному руководителю Серафиме Константиновне Семёновой за неоценимый вклад в создание данной работы, за ее терпение и всестороннюю поддержку.

В особенности хочу поблагодарить Галину Григорьевну Хрисанфова за постоянное активное участие в работе, а также Василия Александровича Васильева за обучение основным методам и большой вклад в практическую часть работы.

Я благодарен всем сотрудникам лаборатории организации генома за помощь в работе.

Благодарим за помошь в сборе материала сотрудников ИСЭЖ СО РАН (г.

Новосибирск): Юрлову Н.И., Водяницкую С.Н, Сербину Е.А., а также сотрудников

Центра Паразитологии ИПЭЭ им А.Н. Северцева РАН: Воронина М.В., Зазорнову О.П., Беэра С.А., Теренину Н.Б., Толстенкова О.О. Наши исследования выполнены совместно с сотрудниками УНЦ «Нарочанская биологическая станция им. Г.Г. Винберга» БГУ (Минская область, Республика Беларусь): Жуковой Т.В., Мищенковым В.А., Акимовой Л.Н.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лопаткин, Антон Александрович, Москва

1. Абрамсон Н.И. 2007. Филогеография:, итоги, проблемы, перспективы. Вестник ВОГиС 11 (2):307-331.

2. Беэр С. А., Воронин М. В. 2007. Церкариозы в урбанизированных экосистемах. // М.:Наука, с.240

3. Галактионов К.В., Добровольский А.А Происхождение и эволюция жизненных циклов трематод. СПб.: Наука. 1998. - 404 с

4. Гинецинская Т.А. 1968.Трематоды- их жизненные циклы, биология и эволюция. Л.: Наука. 411 с

5. Гинецинская Т. А., Добровольский A.A. 1978 Частная паразитология. Паразитические простейшие и плоские черви: Учеб. Пособие для биолог, спец. ВУЗов // Под ред. Ю.И. Полянского. М.: Высш. школа. 303 с.

6. Круглов Н. Д. 1975. К анализу современных методов систематики моллюсков и границ их применения на примере лимнеид// Проблемы биологии и систематики животных смоленской и сопредельных областей. Смоленск: СГПИ. С. 12 28.

7. Кушев В. В. Механизмы генетической рекомбинации. 1971. Л.с 246

8. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж., Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М.: Мир, 1984. 477 с.

9. Скрябин К. И. 1948. Трематоды животных и человека. Основы трематодологии // М., Л.: Изд-во Академии наук СССР. Т. 2. 600 с.

10. Яроцкий Л.С. Шистосомозы. М.: Медицина, 1982. - 279с.

11. Adlard,R. D., Barker S. С., Blair D., CribbT. H. 1993. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea) // Int J Parasitology. V. 23. № 3. P. 423-425

12. Aldhoun J. A., Faltynkova A., Karvonen A. and Horak P. 2009a. Schistosomes in the north: a unique finding from a prosobranch snail using molecular tools // Parasitol Int. V. 58. №3. P. 314-317.11024.

13. Aldhoun J. A., Kolarova L., Horak P. and Skirnisson K. 2009b. Bird schistosome diversity in Iceland: molecular evidence // J Helminthol. Y. 83. № 2. P. 173-180.

14. Amor M, Parker KL, Globerman H, New MI, White PC. 1988. Mutation in the CYP21B gene causes steroid 21-hydroxylase deficiency. Proc Natl Acad Sci USA 85: 16001604

15. Anderson, G.R. & Barker, S.C. 1993. Species differentiation in the Didymozoidae (Digenea): restriction fragment length differences in internal transcribed spacer and 5.8S ribosomal DNA. International Journal for Parasitology, 23, 133-136.

16. Arbogast B.S., Kenagy G.J. 2001. Comparative phylogeography as an integrative approach to historical biogeography. J Biogeography. 28: 819-825.

17. Arnheim N., M. Krystal R. Shmickel G. Wilson O. Ryder, E. Zimmer. 1980. Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on nonhomologous chromosomes in man and apes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:7323-7327.

18. Attwood S. W., Fatih F. A., Campbell I., Upatham E. S. 2008. The distribution of Mekong schistosomiasis, past and future; Preliminary indications from an analysis of genetic variation in the intermediate host. Parasitol. Int. 57: 226-270.

19. Attwood S. W., Upatham E. S., Meng X. H., Qiu D. C. and Southgate V. R. 2002. The phylogeography of Asian Schistosoma (Trematoda: Schistosomatidae) // Parasitology. V.125. № Pt 2. P. 99-112.

20. Attwood S.W. 2001. Schistosomiasis in the Mekong region: epidemiology and phylogeography. Adv. Parasitol. 50: 87-152.

21. Avise J., Arnold J., Ball R., Bermingham E., Lamb T., Neigel J., Reeb C., Saunders N. 1987. Intraspecific phylogeography: the mitochondrial DNA bridge between population genetics and systematics // Ann Rev Ecol Syst. V. 18. P. 489-522.

22. Avise J.C. 1989. Gene trees and organismal histories: a phylogenetic approach to the population biology. Evolution. 43: 1192-1208.

23. Avise J.C. 2000. Phylogeography: The History and Formation of Species. Harvard University Press, Cambridge, MA. (447 pp.).

24. Awadalla P., Walker A. E., Smith M. J. 1999. Linkage disequilibrium and recombination in hominid mitochondria DNA. Science 286:2524-2525.

25. Ballard J. W. O., Dean M.D. 2001. The mitochondrial genome: mutation, selection and recombination. Current Opinion in Genetics & Development 11: 667-672.

26. Ballard, J.W.O., 2000a. Comparative genomics of mitochondrial DNA in members of the Drosophila melanogaster subgroup. J. Mol. Evol. 51,48-63.

27. Ballard, J.W.O., 2000b. Comparative genomics of mitochondrial DNA in Drosophila simulans. J. Mol. Evol. 51, 64-75.

28. Ballard, J.W.O., Whitlock, M.C., 2004. The incomplete natural history of mitochondria. Mol. Ecol. 13, 729-744.

29. Barber K. E., Mkoji G. M. and Loker E. S. 2000. PCR-RFLP analysis of the ITS2 region to identify Schistosoma haematobium and S. bovis from Kenya // Am J Trop Med Hyg. V. 62. № 4. P. 434-440.

30. Bargues M. D., Mas-Coma S. 1997. Phylogenetic analisis of lymnaeid snails based on, 18S DNA sequences // Mol. Biol. Evol. 14, N 5. P. 569-577.

31. Bargues M. D., Vigo M., Horak P. et al. 2001. European Lymnaeidae (Mollusca: Gastropoda), intermediate hosts of trematodiasis, based on nuclear ribosomal DNA ITS — 2 sequences // Infection, Genetics and Evolution. 1. P. 85-107.

32. BarkerS., Blair D. 1996. Molecular phylogeny of Schistosoma species supports traditional groupings within the genus // Journal of Parasitology. V. 82. P. 292-298.

33. Barton N. H. 2001. The role of hybridization in evolution. Mol Ecol 10: 551-568.

34. Bayssade-Dufour C., Jouet D., Rudolfova J.A 2006. Seasonal1 morphological variations in bird schistosomes. Parasite. 13 (3): 205-214.

35. Beagley C., Macfarlane J., Pont-Kingdon G., Okimoto R., Okada N., Wolstenholme D. 1995. Mitochondrial genomes of Anthozoa (Cnidaria) // In Palmieri, F. (ed.). Progress in Cell Research. V. 5. P. 149-153.

36. Beagley C., Okimoto R., Wolstenholme D. 1998. The mitochondrial genome of the sea anemone Metridium senile (Cnidaria): Introns, a paucity of tRNA, genes and a near-standard genetic code // Genetics. V. 148. P. 1091-1108.

37. Bell A. S., Sommerville C., Telervo Yaltonen E. 2001. A molecular phylogeny of the genus Ichthyocotylurus (Diginea, Strigeidae) // Int. J Parasitology. V. 31. P. 833-842.

38. Bermingham E., Moritz C. 1998. Comparative phylogeography: concepts and applications. Mol. Ecol. 7: 367-369.

39. Beträn E. and M. Long. 2002. Expansion of genome coding regions by acquisition of new genes. Genetica. May;l 15(l):65-80.

40. Biemont C. and Vieira C. 2006. Genetics: junk DNA as an evolutionary force // Nature. V. 443. № 7111. P. 521-524.

41. Birky, C. William, Jr., 1995 Uniparental inheritance of mitochondria and chloroplast genes: mechanisms and evolution. Proc. Nat. Acad. Sei. UISA 92:11331-11338.

42. Biswas I., Maguin E., Ehrlich S.D. and Gruss A.1995. A 7-base-pair sequences protects DNA from exonucleolytic degradation in Lactococcus lactis. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92,2244-2248.

43. Blair D. 2000. Genomes of Paragonimus westermani and related species: current state of knoledge // Int. J Parasitology. V. 30. P. 421-426.

44. Blair D., Davis G. M., Wu B. 2001. Evolutionary relationships between trematodes and snails emphasizing schistosomes and paragonimids. Parasitology 123: 229-243.

45. Blair, D. 2006. Ribosomal DNA variation in parasitic flatworms. In (A. Maule, Ed.) Parasitic Flatworms: Molecular Biology, Biochemistry, Immunology and Control CABI. pages 96-123.

46. Boor J. 1999. Survey and summary Animal mitoghondrial genomes // Nucl Acids Res. V. 27. № 8. P. 1767-1780.

47. Boore J., Brown W. M. 1994. Complete DNA sequence of the mitochondrial genome of the black chiton, Katharina tunicata II Genetics. V. 138. № 2. P. 423-443.

48. Boyce T., Zwick M., Aquardo C. 1989. Mitochondrial DNA in the bark weevils: size, structure and heteroplasmy // Genetics. V. 123. № 4. P. 825-836.

49. Brant S.V., Loker E. S. 2005. Can specialized pathogens colonize distantly related hosts? Schistosome evolution as a case study. PLoS Pathogens. 1: 167-169.

50. Brindley P. J., Laha T., McManus D. P. and Loukas A. 2003. Mobile genetic elements colonizing the genomes of metazoan parasites // Trends Parasitol. V. 19. № 2. P. 79-87.

51. Brown W. 1985. The mitochondrial genome of animals // In Molecular Evolutionary Genetics, ed. R. J. Maclntyre, New York, London: Plenum. P. 95-130.

52. Buckler E. S., IV, Ippolito A., Holtsford T. P. 1997. The evolution of ribosomal DNA: divergent paralogues and phylogenetic implications. Genetics. 145 : 821—832.

53. Butlin R. K. 2005. Recombination and speciation. Mol Ecol. 14: 2621-2635.

54. Cheng, K.C. and Smith G.R. 1987. Cutting of Chi-like sequences by RecBCD enzyme. J. Mol. Biol. 194:747-750.

55. Cheng, K.C. and Smith, G.R. 1984. Recombinational hotspot activity of Chi-like sequences. J. Mol. Biol. 180:371-377.

56. Clayton D. 1992. Transcription and replication of animal mitochondrial DNAs // Int. Rev. Cytology V. 141. P. 217-232.

57. Clement M., Posada D., Crandall K.A. 2000. TCS: a computer program to estimate gene genealogies // Mol. Ecol. N. 9. P. 1657-1659.coevolution going anywhere? BMC Evol. Biol. 7: 91.

58. Coleman A.W. 2009 Is there a molecular key to the level of "biological species" in eukaryotes? A DNA guide. Molecular Phylogenet. and Evol. 50: 197-203.

59. Coleman, A.W. 2003. ITS2 is a double-edged tool for eukaryote evolutionary comparisons. Trends in Genetics 19: 370-375.

60. Copeland C. S., Brindley P. J., Heyers O., Michael S. F., Johnston D. A., Williams D. L., Ivens A. C. and Kalinna B. H. 2003. Boudicca, a Retrovirus-Like Long Terminal Repeat

61. Retrotransposon from the Genome of the Human Blood Fluke Schistosoma mansoni //Journal of Virology. V. 77. № 11. P. 6153-6166.

62. Cribb T.H Bray R.A., Olson P.D. and Littlewood D.T. 2003. Life cycle evolution in the digenea: a new perspective from phylogeny // Adv Parasitol. V. 54. P. 197-254

63. Crozier R., Crozier Y. 1993. The mitochondrial genome of the honeybee Apis mellifera: complete sequence and genome organization // Genetics. V. 133. № l.P. 97-117.

64. Davis N. E. 2006. Identification of an avian schistosome recovered from Aythya novaeseelandia and infectivity of its miracidia to Lymnaea tomentosa snails. J. Helminthol. 80(3): 225-233.

65. DeMarco R., Machado A. A., Bisson-Filho A. W. and Verjovski-Almeida S. 2005. Identification of 18 new transcribed retrotransposons in Schistosoma mansoni // Biochem Biophys Res Commun. V. 333. № 1. P. 230-240.

66. DeMarco R., Venancio T. M. and Verjovski-Almeida S. 2006. SmTRCl, a novel Schistosoma mansoni DNA transposon, discloses new families of animal and fungi transposons belonging to the CACTA superfamily // BMC Evol Biol. V. 6. P. 89.

67. Desjardins P., Morais R. 1991. Nucleotide sequence and evolution of coding and noncoding regions of a quail mitochondrial genome // J. Mol. Evol. V. 32. № 2. P. 153-161.

68. Despres L., Imbert-Establet D., Combes G., Bonhomme F., Monnerot M. 1991. Isolation and polymorphism in mitochondrial DNA from Schistosoma mansoni // Mol. Biochem. Parasitol. V. 47. № 1. P. 139-41.

69. Despres L., Imbert-Establet D., Monnerot M. 1993. Molecular characterization of mitochondrial DNA provides evidence for the recent introduction of Schistosoma mansoni into America // Mol. Biochem. Parasitol. V. 60. P. 221-230.

70. Detwiler J. T., Criscione C. D. 2010. An infectious topic in reticulate evolution: introgression and hybridization in animal parasites. Genes 1: 102-123.

71. Differentiation of Schistosoma haematobium from related schistosomes by PCR amplifying an inter-repeat sequence // Am J Trop Med Hyg. V. 76. № 5. P. 950-955.

72. Dover G. 1982. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution. Nature. 299:111-117.

73. Doyle J. J. 1992. Gene trees and species trees: molecular systematics as one-character taxonomy. Syst. Bot. 17:144-163.

74. Drew A. C., Brindley P. J. 1995. Female-specific sequences isolated from Schistosoma mansoni by representational difference analysis // Mol Biochem. Parasitol. V. 71. P. 173—181.

75. Drew A. C., Brindley P. J., Lewis F. A., Liang Y. S., Minchella D. J. 1998. Tandemly repeated genomic sequence demonstrates inter- and intra-strain genetic variation in Schistosoma japonicum fl Trop. Med. Int. Health. V. 3(5). P. 373-380.

76. Driscoll A. J., Kyle J. L. and Remais J. 2005. Development of a novel PCR assay capable of detecting a single Schistosoma japonicum cercaria recovered from Oncomelania hupensis // Parasitology. V. 131. № Pt 4. P. 497-500.

77. Durica D. S., Krider H. M. 1977. Studies on the ribosomal RNA cistrons in interspecific Drosophila hybrids. I. Nucleolar dominance. Dev. Biol. 59:62-74.

78. Dvorak J., Vanacova S., Hampl V., Flegr J., Horak P. 2002. Comparison of European Trichobilharzia species based on ITS1 and ITS2 sequences // Parasitology. V. 124. P. 307313.

79. Dybdahl M. F., Lively C. M. 1996. The geography of coevolution: comparative population structures for a snail and its trematode parasite // Evolution. V. 50. P. 2264-2275.

80. Eberhard J. R., Wright T. F. and Bermingham E. 2001. Duplication and concerted evolution of the mitochondrial control region in the parrot genus Amazona. Mol. Biol. Evol. 18:1330-1342.

81. Eickbush T.H., Eickbush D.G. 2007. Finely orchestrated movements: evolution of the ribosomal RNA genes. Genetics 175:477-485.

82. Excoffier L., Laval G. And Schneider S. 2005. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis // Evol Bioinform Online. V. 1. P. 4750.

83. Faulds D., Dower N., Stahl M. M., Stahl F. W. 1979. Orientation-dependent recombination hotspot activity in bacteriophage. J. Mol. Biol. 131: 681-695.

84. Fauron C., Wolstenholme D. 1976. Structural heterogeneity of mitochondrial DNA molecules within the genus Drosophila // Proc. Natl Acad. Sci. V. 73. № 10. P. 3623-3627.

85. Ferte H., Depaquit J., Carre S., Villena I. and Leger N. 2005. Presence of Trichobilharzia szidati in Lymnaea stagnalis and T. franki in Radix auricularia in northeastern France: molecular evidence // Parasitol Res. Y. 95. № 2. P. 150-154.

86. Feschotte C. 2004. Merlin, a New Superfamily of DNA Transposons Identified in Diverse Animal Genomes and Related to Bacterial IS 1016 Insertion Sequences // Molecular Biology and Evolution. Y. 21. № 9. P. 1769-1780.

87. Flemming, and C. Schlotterer. 2001. Three divergent rDNA clusters predate the species divergence in Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus robur L. Mol. Biol. Evol. 18:112-119.

88. Fraser RD, Furlong DB, Trus BL, Nibert ML, Fields BN and Steven AC. 1990. Molecular structure of the cell-attachment protein of reovirus: correlation of computer-processed electron micrographs with sequence-based predictions. J Virol, 64, 2990-3000.

89. Friedman-Ohana R., Karunker I., Cohen A. 1998. Chi-dependent intramolecular recombination in Esherichia coli. Genetics. 148:545-557.

90. Gazave E., Marques-Bonet T., Fernando O., Charlesworth B. and Navarro A. 2007. Patterns and rates of intron divergence between humans and chimpanzees // Genome Biol. V. 8. № 2. P. R21.

91. Gibson D. I., Jones A. and Bray R. A. 2002. Keys to the Trematoda. // Wallingford: CAB International, Wallingford, 521 pp.

92. Grevelding C. G. 1995. The female-specific W1 sequence of the Puerto Rican strain of Schistosoma mansoni occurs in both genders of a Liberian strain // Mol. Biochem. Parasitol. V.71.P. 269-72.

93. Grossman A. I., CainG. D., Liang S. Y. 1980a. Karyotype and karyosystematics of Schistosoma mekongi //Malacological Review (Suppl.: The Mekong Schistosome). V. 2. P. 105-112.

94. Grossman A. I., McKenzie R., Cain G. D. 1980b. Sex heterochromatin in Schistosoma mansoni // J Parasitology. V. 66. P. 368-370.

95. Guindon S. and O. Gascuel. 2003. A simple, fast and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood // Syst. Biol. V. 52. N. 5. P. 696-704.

96. Hamburger J., Xu Y. X., Ramzy R. M., Jourdane J. and Ruppel A. 1998b. Development and laboratory evaluation of a polymerase chain reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water // Am J Trop Med Hyg. V. 59. № 3. P. 468-473.

97. Hamburger J., Turetzki T., KapellerL, Deresiewicz R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe // Mol. Biochem. Parasitol. V. 67. P. 269-72.

98. Hanelt B., Adema C. M., Mansour M. H. and Loker E. S. 1997. Detection of Schistosoma mansoni in Biomphalaria using nested PCR // J Parasitol. V. 83. № 3. P. 387394.

99. Hashimoto K., Watanobe T., Liu C. X. 1997. Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species is F. gigantica II Parasit. Res. V. 83. P. 220-225.

100. Hassouna N., Michot B., Bachellerie J.-P. 1984. The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes. Nucleic Acids Res. 12: 3563-83.

101. Hertel J., Hamburger J., Haberl B. and Haas W. 2002. Detection of bird schistosomes in lakes by PCR and filter-hybridization // Exp Parasitol. V. 101. № 1. P. 57-63.

102. Hertel L. A., Barbosa C. S., Santos R. A. and Loker E. S. 2004. Molecular identification of symbionts from the pulmonate snail Biomphalaria glabrata in Brazil // J Parasitol. V. 90. № 4. P. 759-763.

103. Hertel J., Haberl B., Hamburger J., Haas W. 2003. Description of a tandem repeated DNA sequence of Echinostoma caproni and methods for its detection in snail and plankton samples // Parasitology. V. 126 (Pt 5). P. 443^149.

104. Heussler V., Kaufmann H., Glaser I., Ducommun D., Muller C. and Dobbelaere D. 1998. A DNA probe for the detection of Dicrocoelium dendriticum in ants of Formica spp. And Lasius spp // Parasitol Res. V. 84. № 6. P. 505-508.

105. Heussler V., Kaufmann H., Strahm D., Liz J. and Dobbelaere D. 1993. DNA probes for the detection of Fasciola hepatica in snails // Mol Cell Probes. V. 7. № 4. P. 261-267.

106. Hewitt G. M. 1996. Some genetic consequences of ice ages and their role in divergence and speciation. Biol. J. Linn. Soc. 58: 247-276.

107. Hewitt G. M. 1999. Post-glacial recolonization of European biota // Biol. J. Linn. Soc. 68: 87-112.

108. Hillis D. M. and Dixon M. T. 1991. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Q. Rev. Biol. 66: 411^153.

109. Hoelzel A., Lopez J., Dover G., O'Brien S. 1995. Rapid evolution of a heteroplasmic repetitive sequence in the mitochondrial DNA control region of carnivores // J. Mol. Evol. V. 39. P. 191-199.

110. Honjo T., Reeder R. H. 1973. Preferential transcription of Xenopus laevis ribosomal RNA in interspecific hybrids between Xenopus laevis and Xenopus mulleri. J. Mol. Biol. 80: 217-228.

111. Horak P., Dvorak J., Kolarova L. and Trefil L. 1999. Trichobilharzia regenti, a pathogen of the avian and mammalian central nervous systems // Parasitology. V. 119 (Pt 6). P. 577-581.

112. Horak P., Kolarova L. 2000. Survival of bird schistosomes in mammalian lungs // Int. J. Parasitol. V. 30. P. 65-68.

113. Horak P., Kolarova L. and Adema C. M. 2002. Biology of the schistosome genus Trichobilharzia // Adv Parasitol. V. 52. P. 155-233.

114. Horak P., Kovar L., Kolarova L. and Nebesarova J. 1998. Cercaria-schistosomulum surface transformation of Trichobilharzia szidati and its putative immunological impact // Parasitology. V. 116 (Pt 2). P. 139-147.

115. Huang C-H., Blumenfeld O.O 1991. Multiple origins of the human glycophorm Sta gene. Identification of hot spots for independent unequal homologous recombinations. J. Biol. Chem. 266 (34):23306-23314.

116. Hubendick, B., 1951. Recent Lymnaeidae. Their variation, morphology, taxonomy, nomenclature, and distribution. Kungliga Svenska Vetenskapsakademiens Handlingar. Fjarde Serien 3, 1-223.

117. Huson D.H. and Bryant D. 2006. Application of Phylogenetic Networks in Evolutionary Studies. Mol Biol Evol. 23 (2): 254-267.

118. Irwin, D.E. 2002. Phylogeographic breaks without geographic barriers to gene flow. Evolution 56: 2383-2394.

119. Itagaki T. and Tsutsumi K. 1998. Triploid form of Fasciola in Japan: genetic, relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by ITS-2 sequence of nuclear rDNA // Int J Parasitology. V. 28. P. 777-781.

120. Iwagami M., Ho L.Y., Su K.,. Lai P.F., Fukushima M., Nakano M., Blair D., Kawashima K. and Agatsuma T. 2000. Molecular phylogeographic studies on Paragonimus westermani in Asia // J Helminthol. V. 74. № 4. P. 315-322.

121. Jarne P., Theron A. 2001. Genetic structure in natural populations of flukes and snails: a practical approach and review // Parasitology. V. 123. P. 27-40.

122. Johnston D. A. 2006. Genomes and Genomics of Parasitic Flatforms. // Parasitic flatworms: molecular biology, biochemistry, immunology and physiology. A. G. Maule and N. J. Marks. London, UK: CAB International. C. 37-80.

123. Johnston D. A., Kane R. A., Rollinson D. 1993. Small subunit (18S) ribosomal RNA gene divergence in the genus Schistosoma // Parasitology. V. 107. P. 147-156.

124. Jouet D., Ferte H., Depaquit J., Rudolfova J., Latour P., Zanella D., Kaltenbach M. L. and Leger N. 2008. Trichobilharzia spp. in natural conditions in Annecy Lake, France // Parasitol Res. V. 103. № 1. P. 51-58

125. Jouet D., Ferte H., Hologne C., Kaltenbach M. L. and Depaquit J. 2009. Avian schistosomes in French aquatic birds: a molecular approach // J Helminthol. V. 83. № 2. 181189.

126. Jouet D., Skiraisson K., Kolarova L., Ferte H. 2010. Molecular diversity of Trichobilharzia franki in two intermediate hosts (Radix auricularia and Radix peregra): a complex of species. Infection, Genetics and Evolution 817: 1218-27

127. Jourdane J., Southgate V. 1992. Genetic exchanges and sexual interactions between species of the genus Schistosoma. Res. Rev. Parasitol. 52: 21-26.

128. Jousson O. and Bartoli P. 2001. Molecules, morphology and morphometries of Cainocreadium labracis and Cainocreadium dentecis n. sp. (Digenea: Opecoelidae) parasitic in marine fishes // Int J Parasitol. V. 31. № 7. P. 706-714.

129. Jousson O., Bartoli P. and Pawlowski J. 1998a. Molecular phylogeny of Mesometridae (Trematoda, Digenea) with its relation to morphological changes in parasites // Parasite- V. 5. № 4. P. 365-369.

130. Jousson O., Bartoli P., Zaninetti L. and Pawlowski J. 1998b. Use of the ITS rDNA for elucidation of some life-cycles of Mesometridae (Trematoda, Digenea) // Int J Parasitol. V. 28. №9. P. 1403-1411.

131. Kane R. A. and Rollinson D. 1994. Repetitive sequences in the ribosomal E>NA internal transcribed spacer of Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum and Schistosoma mattheei // Mol Biochem Parasitol. V. 63. № 1. P. 153-156.

132. Kane R. A., Ridgers I. L., Johnston D. A., Rollinson D. 1996. Repetitive sequences within the first internal transcribed spacer of ribosomal DNA in schistosomes contain a Chilike site. Mol. Biochem Parasitol. 75: 265-269.

133. Kazazian H. H., Jr. 2004. Mobile elements: drivers of genome evolution // Science. V. 303. №5664. P. 1626-1632.

134. Keddie E., Higazi T., Unnasch T. 1998. The mitochondrial genome of Onchocerca volvulus: sequence, structure, and phylogenetic analysis // Mol. Biochem. Parasitol. V. 95. P. 111-127.

135. Khalil L.F. 2002. Family Schistosomatidae Stiles and Hassall, 1898. In Keys to Trematoda (ed. Gibson D.I., Jones A. and Bray R.A.), pp. 419-432 CABI Publishing, Wallingford, UK.

136. Kolarova L., Rudolfova J., Hampl V., Skirnisson K. 2006: Allobilharzia visceralis gen. nov., sp. nov. Schistosomatidae-Trematoda) from Cygnus cygnus (L.) (Anatidae). Parasitol. Int. 55: 179-186.

137. Kruger F. J., Evans A. C. 1990. Do all human urinary infections with Schistosoma mattheei represent hybridization between Schistosoma haematobium and Schistosoma mattheef! J. Helminthol. 64: 330-332.

138. Ladoukakis E. D., Zouros E. 2001. Recombination in animal mitochondrial DNA: evidence from published sequences. Mol. Biol. Evol. 18:2127-2131.

139. Laha T., Kewgrai N., Loukas A. and Brindley P. J. 2005. Characterization of SR3 reveals abundance of non-LTR retrotransposons of the RTE clade in the genome of the human blood fluke, Schistosoma mansoni // BMC Genomics. V. 6. P. 154.

140. Laha T., Brindley P. J., Verity C. K., McManus D. P., Loukas A. 2002. pido, a non-long terminal repeat retrotransposon of the chicken repeat 1 family from the genome of the Oriental blood fluke, Schistosoma japonicum H Gene. V. 284. P. 149-159.

141. Larsson N-G., Clayton D. 1995. Molecular genetic aspects of human mitochondrial disorders. //Annu. Rev. Genet. V. 29. P. 151-178.

142. Le T. H., Humair P. F., Blair D., Agatsuma T., Litllwood D. T. J., McManus D. P. 2001a. Mitochodrial gene content, arrangement and composition compared in African and Asian schistosomes // Mol. Bioch. Parasitol. V. 117. P. 61-67.

143. Le T., Blair D., McManus D. 2002. Mitochondrial genomes of parasitic flatworms // TRENDS in Parasitology. V. 18. № 5. P. 206-213.

144. LeT. H., Blair D., McManus D. P. 2000b. Mitochondrial genomes of human helminthes and their use as markers in population genetics and phylogeny // Acta Tropica. V. 77. P. 243-256.

145. LeT.H., BlairD., McManusD. P. 2001b. Complete DNA sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the liverfluke, Fasciola hepatica L. (Platyhelminthes; Trematoda) //Parasitology. V. 123. P. 609-621.

146. LeBlancq S.M, Swinkels B. W., Gibson W. C., Borst P. 1988. Evidence for gene conversion between the phosphoglycerate kinase genes of Trypanosoma hrucei. J Mol Biol 200(3):439-47.

147. LeRoux P. L. 1954. Hybridization of Schistosoma mansoni and S. rodhaini. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 48: 3-4.

148. Liao A. 1999. Concerted evolution: molecular mechanism and biological implications. Am J Hum Genet 64:24-30.

149. Lightowlers R., Chinnery P., Turnbull D., Howell N. 1997. Mammalian mitochondrial genetics: heredity, heteroplasmy and disease // Trends genet. V. 13. P. 450-455.

150. Littlewood D. T., Rohde K„ Bray R. A. and Herniou E. A. 1999. Phylogeny of Platyhelminthes and the evolution of parasitism // Biological Journal of the Linnean Society. V. 68. P. 20.

151. Lo C.M., Morgan J.A., Galzin R., and Cribb T.H. 2001. Identical digeneans in coral reef fishes from French Polynesia and the Great Barrier Reef (Australia) demonstrated by morphology and molecules // Int J Parasitol. V. 31. №14. P. 1573-1578

152. Luton K., Walker D. and Blair D. 1992. Comparisons of ribosomal internal transcribed spacers from two congeneric species of flukes (Platyhelminthes: Trematoda: Digenea) // Mol Biochem Parasitol. V. 56. № 2. P. 323-327.

153. Marquez L. M., Miller D. J., MacKenzie J. B., van Oppen M. J. H. 2003. Pseudogenes contribute to the extreme diversity of nuclear ribosomal DNA in the hard coral Acropora. Mol. Biol. Evol. 20 (7): 1077-1086.

154. Mayer M. S., Soltis P. S. 1999. Intraspecific phylogeny analysis using ITS sequences: insights from studies of the Streptanthus glandulosus complex (Cruciferae). Syst. Bot. 24:4761.

155. McCracken, K. G., and M. D. Sorenson. 2001. Is homoplasy or lineage sorting the source of incongruent mtDNA and nuclear gene trees in the stiff-tailed ducks (Nomonyx-Oxyura)? Systematic Biology 54:35-55.

156. McCracken, K. G., W. P. Johnson, and F. H. Sheldon. 2001. Molecular population genetics, phylogeography, and conservation biology of the Mottled Duck (Anas fulvigula). Conservation Genetics 2:87-102.

157. McVean G. A. T. 2000. Polymorphisms suggest mitochondrial recombination. Genome Biology 1: reports 014 / doi:10.1186/gb-2000-1-1-reports 014.

158. McVean G. A. T. 2001. What do patterns of genetic variability reveal about mitochondrial recombination? Heredity V. 87 (6): 613-620.

159. Modrich P, and R. Lahue. 1996. Mismatch repair in replication fidelity, genetic recombination and cancer biology. Ann. Rev. Biochem. 65:101-133.

160. Mollaret I., Jamieson B.G.M., Justine J.-L. 2000. Phylogeny of the Monopisthocotylea and Polyopisthocotylea (Platyhelminthes) inferred from 28S rDNA sequences. Int. J. Parasitol. 30: 171-85.

161. Morgan J. A. and Blair D. 1995. Nuclear rDNA ITS sequence variation in the trematode genus Echinostoma: an aid to establishing relationships within the 37-collar-spine group // Parasitology. V. 111 ( Pt 5). P: 609-615.

162. Morgan J. A. and Blair D. 1998. Trematode and' monogenean rRNA ITS2 secondary structures support a four-domain model // J Mol Evol. V. 47. № 4. P. 406-419.

163. Morgan J.A.T., Dejong R.J., Kazibwe F., Mkoji G.M., Loker E.S. 2003. A newly identified lineage of Schistosoma. Int. J.Parasitol. 33: 977-985.

164. Moritz C., Dowling T., Brown W. 1987. Evolution of animal mitochondrial DNA: relevance for population biology and systematics // Ann. Rev. Ecol. Syst. V. 18. P. 269-292.

165. Muir G, C. C. Fleming and C. Schlotterer. 2001. Three divergent rDNA clusters predate the species divergence in Ouercus petrea (Matt.) Liebl. and Quercus rohur L. Mol. Biol. Evol. 18:112-119.

166. Niewiadomska K. and Laskowski K. 2002. Systematic relationships among six species of Diplostomum Nordmann, 1832 (Digenea) based on morphological and molecular data // Acta Parasitológica. V. 47. P. 20-28.

167. Okimoto R., Macfarlane J., Clary D., Wolstenholme D. 1992. The mitochondrial genomes of two nematodes, Caenorhabditis elegans and Ascaris suum II Genetics. V. 130. P. 471-498.

168. Oliver K. R. and Greene W. K. 2009. Transposable elements: powerful facilitators of evolution // BioEssays. V. 31. № 7. P. 703-714.

169. Olson P. D., Cribb T. H., Tkach V. V., Bray R. A. and Littlewood D. T. 2003. Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda) // Int J Parasitol. V. 33. №7. P. 733-755.

170. Otto E., Young J. E., Maroni G. 1986. Structure and origin of a tandem duplication of a Drosophila metallothionein gene PNAS 83: 6025-6029.

171. Pena H. B., de Souza C. P., Simpson A. J., Pena S. D. 1995. Intracellular promiscuity in Schistosoma mansoni: nuclear transcribed DNA sequences are part of a mitochondrial minisatellite region I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 92 (3). P. 915-9.

172. Picard D, Jousson O. 2001. Genetic variability among cercariae of the Schistosomatidae (Trematoda: Digenea) causing swimmer's itch in Europe. Parasite; 8, 237242.

173. Piganeau G, Gardner M. and A. Eyre-Walker. 2004. A broad survey of recombination in animal mitochondria. Mol. Biol. Evol. 21(12): 2319-2325.

174. Pontes L. A., Dias-Neto E. and Rabello A. 2002. Detection by polymerase chain reaction of Schistosoma mansoni DNA in human serum and feces // Am J Trop Med Hyg. V. 66. №2. P. 157-162.

175. Pont-Kingdon G., Okada N., Macfarlane J., Beagley C., Watkins-Sims C., Cavlier-Smith T., Clark-Walker G., Wolstenholme D. 1998. Mitochondrial DNA of the coral

176. Sarcophyton glaucum contains a gene for a homolog of bacterial MutS: a possible of gene transfer from the nucleus to the mitochondrion // J. Mol. Evol. V. 46. P. 419-431.

177. Prljic J., Veljicovic N., Veljicovic V. 2004. Recombination property of the HIV-1 gp 120 gene. Int. Rev. Immunol. 23:447-454.

178. Prugnolle F., Liu H., de Meeus T. and Balloux F. 2005. Population genetics of complex life-cycle parasites: an illustration with trematodes // Int J Parasitol. V. 35. №3. P. 255-263.

179. Quack T., Doenhoff M., Kunz W., Grevelding C. G. 1998. Schistosoma mansoni: The varying occurrence of repetitive elements in different strains shows gender-specific polymorphisms // Exp. Parasitol. V. 89. P. 222-7.

180. Remigio E, A. 2002. Molecular phylogenetic relationships in the aquatic snail genus Lymnaea, the intermediate host of the causative agent of fascioliasis: insights from broader taxon sampling. Parasitol Res. 88: 687-696

181. Remigio, E.A., Blair, D., 1997a. Molecular systematics of the freshwater snail family Lymnaeidae (Pulmonata: Basommatophora) utilizing mitochondrial ribosomal' DNA sequences. J. Moll. Stud. 63, 173-185.

182. Remigio, E.A., Blair, D., 1997b. Relationships among problematic North-American stagnicoline snails (Pulmonata: Lymnaeidae) reinvestigated using nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences. Can. J. Zool. 75, 1540-1545.

183. Rokas A., Ladoukakis E., Zouros E. 2003. Animal mitochondrial DNA recombination revisited // TRENDS in Ecology and Evolution. V. 18. P. 411 -417.

184. Rollinson D., Southgate V.R., Vercruysse J., Moore P.J. 1990. Observations on natural and experimental interactions between S. bovis and S. currasoni from west Africa. Acta Trop. 47: 101-114.

185. Rosenberg N.A. 2003. The shapes of neutral gene genealogies in two species: probabilities of monophyly, paraphyly, and polyphyly in a coalescent model. Evolution. 57 (7): 1465-1477.

186. Rudolfova J., Hampl V., Bayssade-Dufour C., Lockyer A.E., Littlewood D.T.J., Horak P. 2005. Validity reassessment of Trichobilharzia species using Lymnaea stagnalis as the intermediate host. Parasitol. Res. 95: 79-89.

187. Rudolfova J., Littlewood D. T., Sitko J. and Horak P. 2007. Bird schistosomes of wildfowl in the Czech Republic and Poland // Folia Parasitol (Praha). V. 54. № 2. P. 88-93.

188. Schulenburg J. H. G., Englisch U. and Wägel J.-W. 1999. Evolution of ITS1 rDNA in the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda): 3' end sequence conservation and its phylogenetic utility // J Mol Evol. V. 48. P. 2-12.

189. Schwenk K., Breede N., Streit B. 2008 Introduction, extent, processes and evolutionary impact of interspecific hybridization in animals. Phil. Trans. R. Soc B. doi: 10.1098/rstb.2008.0055.

190. Seehausen O. Hybridazation and adaptive radiation. Trends in Ecology and Evolution 2004. 19 (4): 198-207.

191. Sermswan R., Mongkolsuk S., Panyim S. and Sirisinha S. 1991. Isolation and characterization of Opisthorchis viverrini specific DNA probe // Mol Cell Probes. V. 5. № 6. P. 399-407.

192. Sezutsu H., Yukuhiro K. 2000. Dynamic rearrangement within the Antheraca pernyl silk fibroin gene is associated with four types of repetitive units. J. Mol. Evol. 51 (4): 329-38.

193. Shiff C., Brouwer K.C. and Clow L. 2000. Schistosoma haematobium: population genetics of S. haematobium by direct measurement of parasite diversity using RAPD-PCR // Exp Parasitol V. 96. №1. P. 47-51.

194. Skrjabin KI, Zakharov NP. 1920. Zwei neue Trematodengattungen aus den Blutgefässen der Vogel. (Beitrag zur Kenntnis der Helminthenfauna der Vogel Russlands) (in Russian). Izv Donskovo Vet Inst 2:1-6

195. Smith J. M and N. H. Smith. 2002. Recombination in Animal Mitochondrial DNA. Mol Biol Evol. 19 (12): 2330-2332.

196. Snyder S., Loker E. 2000. Evolutionary relationships among the schistosomatidae (Platyhelminthes: Digenea) and an Asian origin for Schistosoma. J. Parasitol. 86: 283-288.

197. Sonnenberg R., Nolte A. W., Tautz D. 2007. An evaluation of LSU rDNA D1-D2 sequences for their use in species identification. Frontiers in Zoology 4: 6 doi:10.1186/1742-9994-4-6.

198. Sourice S., Biaudet V., El. Karoui M., Ehrlich S. D., Gruss A. 1998. Identification of the Chi site of Haemophilus influenzae as several sequences related to the Escherichia coli Chi site. Mol. Microbiol. 27: 1021-1029.

199. Southgate V.R., Jourdane J., Tchuem Tchuenter L.A. 1998. Recent studies on the reproductive biology of the schistosomes and their relevance to speciation in the Digenea. Int. J. Parasitol. 28: 1159-1172.

200. Southgate VR, Rollinson D, Ross GC, Knowles RJ (1982). Mating behaviour in mixed infections of Schistosoma haematobium and S. intercalatum. J Nat Hist 16:491-496.

201. Spakulova M., Horak P. and Dvorak J. 2001. The karyotype of Trichobilharzia regenti Horak, Kolarova et Dvorak, 1998 (Digenea: Schistosomatidae), a nasal avian schistosome in Central Europe // Parasitol Res. V. 87. №6 P. 479-483.

202. Spotila L. D., HiraiH., RekoshD. M., LoVerde P. T. 1989. A retroposon-like short repetitive DNA element in the genome of the human blood fluke, Schistosoma mansoni II Choromosoma (Berl).V. 96. P. 421-428.

203. Spotila L. D., Lo Verde P. T., RekoshD. M. 1987. Analysis of two repeated DNA sequences of Schistosoma mansoni II In: Maclnnis A. (ed) Molecular paradigms for eradicating helminthic parasites. Alan R. Liss. New York. P. 159-168.

204. Spotila L. D., RekoshD. M., Lo Verde P. T. 1991. Polymorphic repeated DNA element in the genome of Schistosoma mansoni // Mol. Biochem. Parasitol. V. 48 (1). P. 117-20.

205. Steinauer M. L., Blouin M. S., Criscione C. D. 2010. Applying evolutionary genetics to schistosome epidemiology. Infection, Genetics and Evolution 10: 433-443.

206. Swofford D.L. 2002. PAUP*. Phylogenetic analysis using parsimony (*and other methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts.

207. Szidat L. 1938. Pseudobilharziella filiformis n. sp., eine neue Vogelbilharzie aus dem Höckerschwan, Cygnus olor L. Parasitol Res. 10 (5): 535-544.

208. T. F. Smith & M. S. Waterman. 1981. Identification of common molecular subsequences. JMol Biol, 147, 195-197

209. Taberlet P. 1998. Biodiversity at the intraspecific level: The comparative phylogeographic approach. J Biotechnology 64: 91-100

210. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. 2007. MEGA 4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. // Mol. Biol. Evol. V. 24. N. 8. P. 1596-1599.

211. Tatarenkov A., Avise J.C. 2007. Rapid concerted evolution in animal mitochondrial DNA. Proc Biol Sei. 274(1619):1795-1798.

212. Taylor M. G. 1970. Hybridization experiments on five species of African schistosomes. J. Helminthol. 44: 253-314.

213. Tchuenter T. L.A., Southgate V. R., Jourdane J., Webster B. L., Vercruysse J. 2003.Schistosoma intercalatum: an endangered species in Cameroon. Trends Parasitol. 19: 389-393.

214. Thaenkham U., Dekumyoy P., Komalamisra C., Sato M., Dung D. T., Waikagul J. 2010. Systematics of the subfamily Haplorchiinae (Trematoda: Heterphyidae), based on nuclear ribosomal DNA genes and ITS2 region. Paras. Intern. 59 (3): 460-465.

215. Tracy R. B., Chedin F., Kowalczykowski S. C. 1997. The recombination hot spot Chi is embedded within islands of preferred DNA pairing sequences in the E. coli genome. Cell 90: 205-205.

216. Ujvari B., Dowton M., Madsen T. 2007. Mitochondrial DNA recombination in a freeranging Australian lizard. Biol. Lett. 3: 189-192.

217. Van Herwerden L., Blair D., Agatsuma T. 1998. Itra- and inter-specific variation in nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1 of the Schistosoma japonicum species complex // Parasitology. V. 116. P. 311-317.

218. Van Herwerden L., Blair D., Agatsuma T. 1999. Itra- and inter-specific variation in in ITS1 of Paragonimus westermani (Trematoda: Diginea) and related species: implications for phylogenetic studies // Mol Phylogenet Evol. V. 12. P. 67-73.

219. Venancio T. M., Wilson R. A., Verjovski-Almeida S. and DeMarco R. 2010. Bursts of transposition from non-long terminal repeat retrotransposon families of the RTE clade in Schistosoma mansoni // Int J Parasitoi. V. 40. № 6. P. 743-749.

220. Walker T. K., Rollinson D. and Simpson A. J. 1989. A DNA probe from Schistosoma mansoni allows rapid determination of the sex of larval parasites // Mol Biochem Parasitoi. V. 33. № l.P. 93-100.

221. Walsh P.S., Metzger D.A. and Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // Biotechniques. V. 10. №4. P. 506-513.

222. Wang Y., Zhang Z., N. Ramanan. 1997. The actinomycete Thermobispora bispora contains two distinct types of transcriptionally active 16S rRNA genes. J. Bacteriol. 179 (10): 3270-3276.

223. Warberg R., Jensen K.T., Frydenber J. 2005. Repetitive Sequences in the ITS1 region of ribosomal DNA in congeneric mierophallid species (Trematoda; Digenea). Par. Res. 97(5): 420-423.

224. Ward P. I., Goater C. P., Mikos M. (1997). "Shell variation in sympatric freshwater Lymnaea peregra and Lymnaea ovata (Gastropoda; Lymnaeidae)". Biological Journal of the Linnean Society 61(1): 139-149.

225. Webster B. L., Southgate V. R., Littlewood D. T. J. 2006. A revision of the interrelationships of Schistosoma including the recently described Schistosoma guineensis. Int. J. Parasitoi. 36: 947-955.

226. Webster B.L., Southgate V.R., Tchuem Tchuenter L.A. 2003. Isoenzyme analysis of Schistosoma haematobium, S. intercalatum and their hybrids and occurrences of natural hybridization in Cameroon. J. Helminthol. 77: 269-274.

227. Webster J. P., Shrivastava J., Johnson P. J., Blair L. 2007. Is host-schistosome

228. Webster P., Mansour T. E. and Bieber D. 1989. Isolation of a female-specific, highly repeated Schistosoma mansoni DNA probe and its use in an assay of cercarial sex // Mol Biochem Parasitol. V. 36. № 3. P. 217-222.

229. WHO 2001. Prevention and control of schistosomiasis and soiltransmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee // World Health Organ Tech Rep Ser V. 912. P. 2-3.

230. Wilkinson G., Mayer F., Kerth G., Petri B. 1997. Evolution of repeated sequence arrays in the D-loop region of bat mitochondrial DNA // Genetics. V. 146. P. 1035-1048.

231. Wilson W. D., Johnson P. T., Sutherland D. R., Mone H. and Loker E. S. 2005. A molecular phylogenetic study of the genus Ribeiroia (Digenea): trematodes known to cause limb malformations in amphibians // J Parasitol. V. 91. № 5. P. 1040-1045.

232. Wolstenholme D., Macfarlane J., Okimoto R., Clary D., Wahleithner J. 1987. Bizarre tRNAs inferred from DNA sequences of mitochondrial genomes of nematode worms // Proc. Natl. Acad. Sci. V. 84. P. 1324-1328.

233. Wright C. A., Ross G. C. 1980. Hybrids between Schistosoma haematobium and S. mattheei and their identification by isoelectric-focusing of enzymes. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 74: 326-332.

234. Wyatt R. T., Rudders R. A., Zelenetz A., Delillis R. A., Krontiris T. G. 1992. BCL2 oncogene translocation is mediated by a x-Hke consensus. J. Exp. Med. 175:1575-1588;

235. Xu J., Rong R., Zhang H.Q., Shi C.J., Zhu X.Q. and Xia C.M. 2010. Sensitive and rapid detection of Schistosoma japonicum DNA by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) // Int J Parasitol. V. 40. № 3. P. 327-331.

236. Zarlenga D.S. and Higgins J. 2001. PCR as diagnostic and quantative technicue in veterinary parasitology // Vet Parasitol. V. 101. №3-4 P. 215-230.

237. Zarowiecki M. Z., Huyse T., Littlewood D. T. J. 2007. Making the most of mitochondrial genomes- markers for phylogeny, molecular ecologoy and barcodes in. Schistosoma (Platyhelminthes: Digenea). International Journal of Parasitology 37 (12):1401-18.

238. Zbikowska E. 2003. Is there a potential danger of swimmer's itch in Poland? Parasitol. Res. 89: 59-62.

239. Zhang G.J., Verneau O., Qiu C.P., Jourdane J., Xia M.Y. 2001. An African or Asian evolutionary origin for human schistosomes? Comptes Rendus Acad. Sci. Ser. Ill Sci. Vie Life Sci. 324:1001-1010.

240. Zhou Q, Yu XM, Lin HB, Wang L, Yun QZ Hu SN, Wang DM. 2009. Genetic polymorphism, linkage disequilibrium, haplotype structure and novel allele analysis of CYP2C19 and CYP2D6 in Han Chinese. Pharmacogenomics J.9(6):380-94.

241. Zhou H., Hickford J.G.H. 2000. Novel fibrial subunit genes of Dichelobacter nodosus: recombination in vivo or in vitro. Veterinary microbiology 76 (2): 163-174.

Информация о работе

Лопаткин, Антон Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.07

Диссертация

Изучение особенностей молекулярной эволюции птичьих шистосом (Trematoda: Schistosomatidae) - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы