Структурно-функциональная организация хромосом описторхид

Задесенец, Кира Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональная организация хромосом описторхид
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация хромосом описторхид"

На правах рукописи

005050452

ЗАДЕСЕНЕЦ КИРА СЕРГЕЕВНА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ХРОМОСОМ ОПИСТОРХИД

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

1 4 МАР 2013

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических йаук

Новосибирск 2013

005050452

Работа выполнена в лаборатории морфологии и функции клеточных структур Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Рубцов Николай Борисович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кикнадзе Ия Ивановна, главный научный сотрудник сектора эволюционной геномики хирономид, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук, Трифонов Владимир Александрович, заведущий лабораторией сравнительной геномики, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт молекулярной биологии им.ВЛ. Энгельгардта РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится » ^£^£¿2^^2013 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук, по защите на соискание ученой степени доктора наук в ИЦиГ СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, д. 10, тел. (383) 363-49-06, факс (383) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЦиГ СО РАН.

Автореферат разослан jte/zCtefc20^-г.

Ученый секретарь j

диссертационного совета, Х'Ам

доктор биологических наук ' 1/| (Л Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Исследование организации хромосом описторхид является актуальной фундаментальной задачей. Класс Trematoda (трематоды или сосальщики), к которому относятся исследованные в настоящей работе виды, представляет одну из наиболее эпидемиологически значимых групп паразитических червей. Характерной особенностью трематод является наличие сложного жизненного цикла ди- или триксенного типа, в течение которого происходит чередование бесполого (партеногенетического) и полового поколений. Дефинитивными хозяевами трематод яеляются пресмыкающиеся, птицы, млекопитающие, в том числе человек.

Некоторые виды (Opistorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis), составляющие так называемую «описторхозную триаду», образуют обширные ареалы инвазии, практически сливающиеся друг с другом в один крупный очаг. Самый крупный очаг зараженности О. felineus расположен в Российской Федерации, в Обь-Иртышском бассейне, причем в некоторых его районах уровень инвазии среди местного населения может быть близок к 100%. Ареалы инвазии описторхидами расширяются, возникают новые ареалы, что в последние годы связано с активной миграцией населения в страны Европы. На сегодняшний день О. viverrini и С. sinensis официально внесены в список IARC (International Agency for Research on Cancer) биологических канцерогенов (Bouvard et al., 2009), О. viverrini и С. sinensis относятся к первому классу, О. felineus - к третьему классу канцерогенов (IARC, 2011). В странах, где эти виды широко распространены, самые высокие в мире показатели по возникновению холангиокарциномы (WHO, 1995).

В связи с этим, полноценное и разностороннее изучение описторхид стало актуальной задачей, решение которой будет иметь не только фундаментальное, но и практическое значение, например, при разработке чувствительных и специфичных методов диагностики, а также создания новых лекарственных препаратов.

Полноценное изучение описторхид помимо описания их морфологии, жизненного цикла, ареала зараженности, клинической картины вызываемых ими заболеваний, отношений паразит - хозяин, систем размножения должно включать также детальное изучите их генома Описторхиды, несмотря на сложную программу онтогенеза, имеют небольшой размер генома (300-400 Mb) и кариотип представленный 6-8-ю парами хромосом.

Исследование структурно-функциональной организации хромосом является необходимым элементом при изучении геномов описторхид. Однако на данном этапе существует ряд технических проблем, без решения которых изучение организации генома на хромосомном уровне у описторхид невозможно. Одной из таких проблем является ограниченное количество материала, которое может быть использовано для цитогенетических исследований. Прежде всего, это вызвано небольшим размером описторхид и их сложным онтогенезом.

Основной причиной того, что хромосомы описторхид, как и у всех трематод слабо изучены, является сложный жизненный цикл этих паразитов. На сегодняшний день в

лабораториях мира удавалось лишь частично воспроизвести жизненный цикл трематод (для кровяных сосальщиков полностью). В случае с описторхидами дополнительные проблемы обусловлены микст-инвазией первого промежуточного хозяина трематод -моллюска, и чрезвычайно низкой частотой заражения моллюсков мирацидиями в лабораторных условиях. Поэтому многие исследователи при изучении трематод работают с их дефинитивными стадиями, а именно: маритами. Одним из главных вопросов, которые встают перед исследователем при работе с хромосомами не только описгорхид, но и трематод в целом, является следующий: какую псань или орган мариты следует брать для приготовления хромосомных препаратов и каким образом фиксировать выбранный материал? Для ответа на этот вопрос было целесообразно провести комплексный микроскопический анализ, который предварял исследование непосредственно самих хромосом описгорхид. Главной целью подготовительного этапа являлся поиск тканей или органов мариты описгорхид, которые характеризуются высоким митотическим индексом.

Исследование структурно-функциональной организации хромосом подразумевает обязательное решение ряда вопросов: определение локализации ЯО (ядрышковый организатор) районов, выявление и описание блоков структурного гегерохроматина, анализ распределения в хромосомах кластеров повторенных последовательностей (теломерной ДНК и рДНК). Дня успешного проведения исследований, направленных на детальное описание хромосом, необходимо получение препаратов хромосом, позволяющих выявлять и описывать их линейную дифференциацию. Имеющиеся на сегодняшний день данные, указывают на небольшой размер генома и малый размер хромосом у большинства трематод, что в значительной степени затрудняет использование стандартных методов хромосомного анализа и определяет необходимость поиска новых подходов в получении хромосомных препаратов трематод, обеспечивающих проведение цитогенетического анализа на высоком уровне разрешения.

В связи с высокой значимостью изучения структурно-функциональной организации хромосом описгорхид, были сформулированы следующие цели и задачи настоящего исследования.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось изучение особенностей структурно-функциональной организации хромосом описгорхид.

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать методы приготовления препаратов митотических и мейогических (в том числе пахитенных) хромосом из мариг описгорхид (Opistorchis felineus, Opistorchis viverrini, Metorchis xanthosomus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis);

2. Провести цигогенетический анализ хромосом описгорхид с использованием методов дифференциального окрашивания и гибридизации in situ:

а) выполнить морфометрический анализ хромосом описгорхид;

б) провести дифференциальное окрашивание хромосом исследуемых видов

описгорхид (С- и AgNOR-окрашивание);

в) получить микродиссекционные ДНК-пробы, специфичные хромосомам 1 и 2 О.

feUneus и M. xanthosomns;

г) изучить локализацию кластеров (рДНК, теломерные повторы) и распределение

диспергированных повторенных последовательностей в хромосомах описторхид.

3. Выполнить сравнительный межвидовой анализ хромосом исследуемых видов

описторхид.

Научная новизна

При изучении структурно-функциональной организации хромосом описторхид были использованы морфометрические и молекулярно-цитогенетические методы, в результате которых впервые:

• дано описание кариотипа М. bilis;

• показано, что кариотип С. sinensis из Дальнего Востока РФ содержит 7 пар хромосом;

• проведен морфометрический анализ хромосом М. bilis, M. xanthosomus;

• изучена локализация ЯО районов и С-позитивных блоков в хромосомах описторхид;

• получены микродиссекционные ДНК-пробы для хромосом описторхид;

• показано наличие хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей в хромосомах у плоских червей (у О. felineus и М. xanthosomus);

• определена локализация рДНК в хромосомах описторхид;

• установлено, что кластеры теломерной ДНК у описторхид состоят из повторов (TTAGGG)n и локализованы тольков в теломерных районах хромосом;

• построены идиограммы мелких пахитенных хромосом описторхид.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты, полученные при проведении на современном уровне комплексного микроскопического анализа мариты О. felineus, могут быть использованы в курсе лекций по паразитологии и зоологии беспозвоночных. Данные, полученные при проведении цитогенетического анализа хромосом описторхид, являются весомым вкладом в развитие цитогенетнки трематод. Впервые для плоских червей (для описторхид) были получены пахитенные хромосомы с выраженной хромомерной организацией; результаты сравнения хромомерной организации пахитенных хромосом описторхид являются первыми в сравнительной цитогенетаке трематод. Разработшшый автором метод приготовления препаратов пахитенных хромосом станет мощным инструментом в руках исследователей, как в области сравнительной цитогенетики, так и при проведении полногеномного секвенирования описторхид на этапе финальной сборки генома.

Положения, выносимые на защиту.

1) В ходе кариотипической эволюции представителей семейства Opisthorchiidae (О. felineus, О. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus) имели место внутрихромосомные перестройки.

2) Хромосомы описгорхид имеют единственный кластер рибосомных генов, состоящий из двух GC-богатых субблоков, разделенных АТ-богатым участком.

3) Теломерная ДНК описгорхид представлена мотивом (TTAGGG)n и локализована только на концах плеч всех хромосом. В хромосомах описгорхид интерстициальные кластеры теломерной ДНК отсутствуют.

4) Хромосомы представителей плоских червей (описгорхид) характеризуются наличием хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены иа следующих конференциях и сессиях: на итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" (Москва, Россия, 2009), на Ш Межрегиональной конференции паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященной 80-летию профессора КЛ.Федорова (Новосибирск, Россия, 2009), на 7-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции генома и струк1урной\сисгемной биологии (BGRS/SB'2010) (Новосибирск, Россия, 2010), на V Международной конференции по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V) (Новосибирск, Россия, 2010), на международной научной конференции "Теоретические и практические проблемы паразитологии" (Москва, Россия, 2010), на 18-ой Международной хромосомной конференции (18 ICC) (Манчестер, Великобритания, 2011), на отчетной сессии ИЦИГ СО РАН (Новосибирск, Россия, 2012), на 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции генома и структурной\системной биологии (BGRS/SB'2012) (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции "Хромосома 2012" (Новосибирск, Россия, 2012), на международной конференции "Современные проблемы общей паразитологии" (Москва, Россия, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 4 работы — статьи в отечественной и зарубежной печати, в журналах, входящих в список ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы, приложения. Работа изложена на 169-и страницах, иллюстрирована 32-мя рисунками, содержит 8 таблиц и 8 приложений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Марты были предоставлены сотрудниками лаборатории молекулярных механизмов патологических процессов Института цитологии и генетики СО РАН. Метацеркарии описгорхид были диссектированы из мышц зараженной рыбы, пойманной на территории Российской Федерации (Новосибирская область; Приморский край) и Таиланда (провинция Кхон-Каен) (Таблица 1).

Таблица 1. Источники метацеркарий описгорхид

Вид Источник Район отлова зараженной рыбы

O.felineus Leuciscus idus (язь) р. Обь, нижний бьеф ГЭС г. Новосибирска

O.viverrim рыбы сем. Cyprinidae (Карповые) оз. Лава, провинция Кон Каен (КЬоп Каеп), Таиланд

M.xanthosomus Leucaspius delineatus (верховка) р. Ельцовка, Нижняя Ельцовка, Советский район г. Новосибирска

M. bilis Leucaspius delineatus (верховка) р. Ельцовка, Нижняя Ельцовка, Советский район г. Новосибирска

C.sinensis Rhodens seríceus (горчак), Phoxinusphoxinus (гольян) оз. Магдыковое, р. Большая Уссурка, Дапьнеречинский район, Приморский край

Получение половозрелых особей описгорхид (марит) проводили путем скармливания метацеркарий описгорхид лабораторным животным (хомячок, крыса, цыпленок). Через 1-1,5 месяца после заражения, производили забой животных и выделяли марит описгорхид из гепатобилиарной системы дефинитивного хозяина.

Подготовка материала для микроскопического анализа марит.

Подготовка препаратов для проведения лазерной сканирующей микроскопии (JICM), микроскопии со структурированным освещением (JIMCO). Фиксированные мариты (2 часа в 10% формалине или 4% параформальдегиде) заключали в криогель О.С.Т. и на микротоме готовили замороженные срезы (40-50 мкм). Затем криосрезы окрашивали красителем DAPI, разведенном в антифейде. Для проведения JICM и J1MCO использовали криосрезы и целые мариты O.felineus.

Подготовка препаратов для световой микроскопии. Мариты описгорхид фиксировали в 4% параформальдегиде, проводили дегидратацию материала и образцы заключали в парафин, криогель О.С.Т. или 10 % желатин по стандартным протоколам. Далее готовили криосрезы (5 мкм) и парафиновые срезы (3-7 мкм). Гистологические и гистохимические окрашивания проводили по стандартным протоколам.

Приготовление цитологических препаратов хромосом, дифференциальное окрашивание хромосом и флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Хромосомные препараты готовили из задней части тела мариты, содержащей органы репродуктивной системы (яичник, семенники, семяприемник). С-бэндинг и AgNOR-окрашивание проводили по стандартным протоколам с небольшими модификациями (Sumner, 1972; Howell and Black, 1980). FISH проводили по стандартному протоколу (Rubtsov et al., 2000). Для изучения локализации рДНК использовали фрагмент 18S рДНК человека, клонированный в плазмиде рНг13 (Malygin, 1992), и 5,8 S рДНК описгорхид, полученную в ПЦР с праймерами ITS IF (5-GTCGTAACAAGGTTTCCGTA-3') и ITS2R (5'-GGAACGACCTGAACACCA-3').

Выявление локализации теломерных повторов проводили с помощью теломерной ДНК-пробы и теломерной PNA-пробы. Теломерная ДНК-проба была синтезирована в безматричной ПЦР по стандартному протоколу (Ijdo et al., 1990). Метод FISH был проведен по стандартному протоколу без супрессии повторенных последовательностей (Pinkel et al., 1988).

Получение микродиссекционных ДНК-проб. Диссекцию хромосом и последующую амплификацию диссекгированного материала проводили по стандартному протоколу (Rubtsov et al, 2000). Мечение полученных продуктов ПЦР проводили AlexaFluor488, биотином или дигоксигенином в дополнительных циклах ПЦР.

Микроскопический анализ. Микроскопический анализ препаратов марит проводился в Межинститутском центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов (ИЦИГ СО РАН, Новосибирск).

Изображения живых марит были получены с помощью стереомикроскопа Stemi 2000 (Zeiss, Germany), программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany). Широкопольная световая микроскопия проводилась на микроскопе AxioScop 2 Plus (Zeiss, Germany) с CCD-камерой AxioCam HRc (Zeiss, Germany), программным обеспечением AxioVision (Zeiss, Germany). JIMCO была выполнена на микроскопе Axiolmager Z1 (Zeiss, Germany), оснащенном модулем ApoTome (Zeiss, Germany), программное обеспечение AxioVision (Zeiss, Germany). JICM проводилась на конфокальном микроскопе LSM 510 МЕТА (Zeiss, Germany), программное обеспечение LSM (Carl Zeiss). При проведении JICM использовали режим multitrack (последовательное сканирование при раздельном возбуждении флуорохромов лазерами с разной длиной волны). Флуоресценция DAPI регистрировалась в диапазоне эмиссии 420-480 нм при возбуждении лазером 405 нм, собственная флуоресценция материала мариты регистрировалась в диапазоне от 505 нм и выше при возбуждении 488 нм.

Микроскопический анализ препаратов хромосом проводили на микроскопе AxioPlan 2 Imaging microscope (Zeiss, Germany) с набором фильтров 49 (Zeiss, Germany), SP101 FITC (CHROMA, USA) and SP103vl Cy3.5vl (CHROMA, USA), CCD-камерой (CV M300, JAI Corporation, Japan), программное обеспечение ISIS4 (METASystems GmbH).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Комплексный микроскопический анализ. В результате проведения трехмерной конфокальной микроскопии и ЛМСО выполнено описание общей морфологии мариты описторха (Рисунок 1 а, б). Широкопольная микроскопия физических срезов описторха, окрашенных с помощью различных гистологических и гистохимических методов, позволила дать более детальное описание клеточного состава различных органов и тканей мариты описторха (Рисунок 1 в).

Рисунок 1. J1CM O. felineus. a - марита описторха (сборка изображений оптических срезов). Длины волн возбуждения флуоресценции - 405 и 488 нм. Запирающие эмиссионные фильтры: BP 420-480IR (DAPI, синий псевдоцвет), LP 505 (автофлуоресценция, зеленый псевдоцвет). Объективы 20х/0.5. Scale bar 1 тт. 6 - JTMCO О. felineus (трехмерная реконструкция метратерма описторха). Яйца описторха (автофлуоресценция, красный псевдоцвет), зрелые сперматозоиды (DAPI, синий псевдоцвет). Объектив 63х/1.25. в - световая широкопольная микроскопия О. felineus. Срез семенного пузырька и матки описторха. Окрашивание гематоксилин-эозином. Scale bar 20 ткт.

Основная часть мариты содержит матку с большим количеством яиц, которые, несмотря на наличие активно делящихся клеток, не пригодны в качестве источника хромосомного материала из-за твердой и плотной оболочки. Остальные ткани мариты (паренхима, кожно-мускульный мешок и др.) характеризовались крайне низким митотическим индексом. В проведенном исследовании клетки на стадии метафазы в составе этих тканей не были обнаружены. Более того, указанные ткани плохо подвергались мацерации, что не позволяло получать суспензию отдельных клеток. Единственным источником легкодоступных делящихся клеток оказались семенники, яичник и семяприемник мариты описторха. В дальнейших исследованиях они были использованы для приготовления хромосомных препаратов, содержащих хромосомы клеток, находящихся на разных стадиях митоза и мейоза.

Кариотипы описторхид, исследованные в настоящей работе. Анализ хромосом описторхид в настоящей работе был выполнен на препаратах митотических и мейотических хромосом, полученных из семенников, яичника и семяприемника половозрелых марит. Диплоидное число хромосом у трематод варьирует от 12 до 28, причем преобладают виды с 2п=22 (около 20%) и 2п=18 (18%) (Баршене, 1993). Кариотипы, состоящие из от 24 до 28 хромосом, встречаются гораздо реже (около 4 % исследованных видов). У описторхид, вовлеченных в настоящее исследование, ранее были определены следующие хромосомные числа: О. felineus, М. xanthosomus - 2п=14; О. viverrini - 2n=12; C.sinensis - 2п=56; данные о числе хромосом у М. bilis отсутствовали. В результате кариотипирования показано, что число хромосом (2п) у исследованных образцов, О. felineus, М. xanthosomus, С. sinensis и М. bilis равно 14, у О. viverrini - 12 (Рисунок 2). Следует отметить, что число хромосом у С. sinensis из РФ, определенное в настоящей работе как 2п=14, отличается от числа хромосом 2п=56 у С. sinensis из Кореи и Китая (Park et al., 2000).

Рисунок 2. Кариотипы представителей описторхид, исследованных в настоящей работе. Приведены инвертированные изображения хромосом, окрашенных DAPI.

a — O.felineus; б—О. viverríni; в — М. xanthosomus; г-М. bilis; д - С. sinensis. Scale bar 10 ткт.

Возможно, представители С. sinensis из Китая и Кореи являются октаплоидной формой (8п=56). С этим согласуются данные морфометрии хромосом С. sinensis из разных географических ареалов (Китая, Кореи и РФ). Показано, что кариотип С. sinensis из стран Азии образован 8-ю парами крупных хромосом и 20-ю парами мелких хромосом. Кариотип С. sinensis из РФ представлен двумя парами крупных и пятью парами мелких хромосом. Ранее полиплоидия уже была выявлена у некоторых видов трематод (Р. westermani, F. hepático), однако максимальная плоидность у описанных на сегодняшний день трематод не превышает 4п.

Нельзя исключить, что представленные данные о числе хромосом С. sinensis из Китая и Кореи являются следствием методической ошибки, связанной с особенностью приготовления хромосомных препаратов: восемь гаплоидных клеток семенника, представляющих единую группу, содержит 56 хромосом, способных формировать на цитологическом препарате общую пластинку, имитируя мейотические хромосомы одной клетки. Мы часто наблюдали такие общие пластинки у С. sinensis из РФ (Zadesenets et al., 2012). Возможно, представители С. sinensis из юго-восточной Азии и с Дальнего Востока РФ являются разными видами. Решение этого вопроса требует дополнительных исследований.

Сравнительный анализ хромосомных чисел у трематод показал тенденцию к уменьшению количества хромосом в ходе эволюции их кариотипа (Short et al., 1989; Баршене, 1993). В некоторых работах в качестве предкового кариотипа трематод предлагается кариотип с 19-ю парами акроцентрических хромосом. Предполагается, что эволюция предковой формы кариотипа трематод шла по пути робертсоновских слияний (Short et al., 1989).

Как показали результаты сравнения хромосомных наборов описторхид, уже описанные в литературе и полученные в ходе настоящего исследования, они имеют схожую морфологию хромосом, кариотипы у них - асимметричные. Согласно терминологии асимметричным кариотипом называют кариотип, хромосомы которого резко отличаются по своему размеру (Баршене, 1993; Spakulova et al., 2011). Проведение

сравнительного морфометрического анализа хромосом описторхид показало некоторые расхождения между результатами, полученными в настоящей работе и приведенными другими исследователями. Данные различия обусловлены разной степенью конденсации и распластывания хромосомного материала, которые возникают при использовании разных источников делящихся клеток, разных способов фиксации материала и приготовления препаратов. В разных исследованиях использовали партениты или мариты трематод. В данной работе источником хромосомного материала служили мариты. При сравнении данных морфометрии хромосом описторхид, полученных в ходе настоящего исследования, были выявлены лишь небольшие недостоверные различия в относительных размерах как крупных, так и мелких хромосом (Таблица 2).

Таблица 2. Результаты морфометрического анализа хромосом описторхид

N О. fetíneus O. viverríni M. xanthosomus M. bilis C. sinensis

RL,% М RL, % M RL, % M RL, % M RL, % M

1 29.97± 1.31 ш 31.04±1 .17 m 30.13± 1.15 sm 32.61± 1.06 m/sm 31.18± 0.70 m

2 23.41± 1.28 m 23.19±0 .81 m 22.83± 0.76 m 24.45± 0.85 m 25.02± 0.90 m

3 11.35± 0.39 sm 16.04±0 .63 m ll.Oli 0.89 sm 10.30± 0.82 sm 9.76± 0.36 m

4 10.23± 0.67 sm 11.12±0 .64 m 10.22± 0.65 sm 9.19± 0.66 sm 9.31± 0.41 sm/m

5 9.15± 0.62 m 10.07±0 .63 m 9.54± 0.67 sm/m 8.43± 0.62 sm 8.85± 0.26 sm/m

6 8.35± 0.59 sm 8.54± 0.56 sm 8.53± 0.62 m 7.78± 0.65 sm/a 8.34± 0.36 m

7 7.54± 0.76 sm - 7.74± 0.59 m 7.24± 0.43 sm 7.54± 0.42 sm/a

RL (relative length) - относительная длина хромосом; М - морфотип хромосом.

Исключением является значимое отличие относительной длины хромосомы 3 у О. viverrinv. данная хромосома является метацентриком среднего размера, возникшим в результате слияния двух хромосом предкового кариотипа. Результаты сравнительной морфометрии хромосом указывают на высокий консерватизм кариотипов описторхид.

Дифференциальное окрашивание хромосом описторхид. Дифференциальное окрашивание хромосом широко используется при анализе структурно-функциональной организации хромосом (DutriJlaux, 1979; Sumner, 1994). Однако, выполненные на сегодняшний день работы по проведению дифференциального окрашивания хромосом трематод единичны. Проведенные в ходе настоящей работы исследования дали следующие результаты:

1). Для хромосом описторхид характерно наличие С-блоков небольшого размера, в прицентромерных районах и прителомерных районах. У некоторых видов были выявлены также интерстициальные - в плечах хромосом (O.felineus, М. xanthosomus, М. bilis) (Рисунок 3). Для мелких хромосом описторхид дифференцировать прителомерные и интерстициальные С-блоки не представлялось возможным ввиду слишком малых размеров хромосом.

§2 S3 82 ss SS

SS 85

Рисунок 3. Локализация блоков конститутивного гетерохроматина (С-блоков) в хромосомах описторхид. OFE - О. felineus-, OVI-O. viverrini; МХА - М. xanthosomus; MBI -М. bilis; CSI- С. sinensis.

2). Окрашивание азотнокислым серебром (AgNOR-окрашивание) позволило выявить единственный активный ЯО район на одной из мелких хромосом описторхид. Более того, специфичное окрашивание было обнаружено в мейотических хромосомах на стадии профазы (пахитены включительно), в ранних сперматидах и интерфазных ядрах. В метафазных хромосомах мейоза I и II специфичные сигналы не были обнаружены. Ag-позитивные сигналы выявлялись в ранних сперматидах, по всей видимости, после реактивации ЯО районов. Аналогичные результаты уже были ранее получены при AgNOR-окрашивании хромосом на различных стадиях сперматогенеза беспозвоночных и позвоночных, включая человека (Schmid et al., 1982, 1983; de Campos et al., 2005). Известно, что AgNOR-окрашивание может выявлять не только транскрипционно активные ЯО районы, но и кислые белки в других районах, таким образом, не всегда давая верное представление о локализации ЯО района (Dobigny et al., 2002). В таких случаях используют метод гибридизации in situ с ДНК-пробами, специфичными рДНК.

Флуоресцентная гибридизация in situ с хромосомами описторхид Локализация рДНК. У высших эукариот гены рРНК организованы в два мультигенных семейства, состоящих из тандемно повторяющихся единиц. Основной класс рРНК (45S) содержит гены 18S, 5,8S и 28S рРНК, которые участвуют в формировании ядрышка. В настоящей работе для определения локализации кластера рибосомных генов использовали ДНК-пробы: 18 S и 5,8S рДНК. При использовании 18S рДНК-пробы человека было показано наличие кластера рДНК в хромосоме 3 для

всех исследованных видов. Однако зона выявляемого на хромосомах сигнала, занимала очень большой по размеру район хромосомы, что затрудняло интерпретацию полученных результатов и субхромосомную локализацию кластера рДНК (Рисунок 5 а). Использование 5,8S рДНК-пробы позволило уточнить район локализации кластера рибосомных генов в хромосомах описторхид. На конденсированных хромосомах сигнал рДНК был локализован в нехарактерном для кластеров повторов рДНК АТ-богатом (согласно окраске DAPI) районе хромосомы 3 (Рисунок 5 б). Однако при проведении FISH с менее конденсированными пахитенными хромосомами было обнаружено, что этот АТ-богатый район «распадается» на два АТ-богатых района и расположенный между ними GC-богатый район. Кластер рДНК также распадается на два: один локализован в GC-богатом районе, расположенном между АТ-богатыми районами, другой - в прилегающей к АТ-богатому району части соседнего GC-богатого района (Рисунок 5 в, г).

Локализация теломерной ДНК. В хромосомах многих позвоночных «теломерная ДНК» помимо концов хромосом, может быть локализована в виде кластеров в интерстициальных районах хромосом (ITSs, interstitial telomere sequences) (Meyne et al., 1989). К возникновению ITSs могут приводить либо перестройки хромосом, либо репарация или негомологичная рекомбинация ДНК с участием теломеразы. Крупные кластеры теломерной ДНК, выявляемые как ITSs, могут служить своеобразным маркером произошедшего робертсоновского слияния хромосом в ходе эволюции кариотипа (Slijepcevic, 1998).

Поэтому предполагалось наличие ITSs, по крайней мере, в хромосоме 3 О. viverrini (2п=12), возникшей, в результате робертсоновского слияния мелких хромосом предковой формы описторхид.

В ходе настоящего исследования в качестве проб использовали меченую теломерную ДНК и PNA-пробу. Было показано, что теломеры описторхид, так же как и теломеры у позвоночных, образованы мотивом TTAGGG и теломерная ДНК локализована на концах плеч всех хромосом (Рисунок 5 д). Большее увеличение разрешения метода FISH достигнуто при использовании в качестве ДНК-мишени пахитенных хромосом. Однако даже на пахитенных хромосомах интерстициальных сайтов хромосом теломерной ДНК обнаружено не было (Рисунок 5 е, ж). Отсутствие ITSs в хромосоме 3 виверровой двуустки можно интерпретировать следующим образом: или слияние хромосом произошло достаточно давно, и произошла элиминация возникшего в результате слияния ITSs, или размеры ITSs столь малы, что не могут быть выявлены с помощью FISH на мейотических хромосомах. Также возможно, слияние предковых хромосом произошло в результате разрывов, приведших к элиминации теломерных районов обеих исходных хромосом.

« а * ' » » б % е

V г * . • д * • е

/~ ж 3 Ф •у « Г и

.¡Г' *>Г *¿V *• Ч* ♦ К * л 4 м

Рисунок 4. Результаты FISH различных ДНК-проб с хромосомами описторхид: 18S рДНК-проба на хромосомах M. xanthosomus (а)\ 5,8 S рДНК-проба на хромосомах О. viverrini (б), О. felineus (в), M. xanthosomus (г); теломерная ДНК-проба на хромосомах М. bilis (д); теломерная PNA-проба на хромосомах С. sinensis (е) и О. viverrini (ж)\ Ор1-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) и Ор2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах О. felineus (з)\ Metí-ДНК-проба (красный псевдоцвет) и Ме12-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) на хромосомах M xanthosomus (u); Opl-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) и Ор2-ДНК-проба (красный псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus (к)', Metl-ДНК-проба (зеленый псевдоцвет) на хромосомах M. xanthosomus до (л) и после проведения Prep-ISH (м). Стрелками указаны хромосомоспецифичные кластеры повторенных последовательностей.

Сравнительный анализ хромосом. Сравнение данных, полученных после проведения С-дифференциального и AgNOR-окрашивания, анализа распределения повторенных последовательностей, указывают на консервативность кариотипа описторхид.

К сожалению, попытки использования GTG-дифференциального окрашивания хромосом описторхид, показавшие свою высокую эффективность в сравнительной цитогенегике млекопитающих (Richard et al., 2003), не увенчались успехом. Возможно,

одной из причин была высокая степень конденсации хромосомного материала. Ввиду слабой изученности хромосомной организации трематод, идиограмм ранее не было построено ни для одного вида, лишь в работе Hirai (2004) присутствует схематичное изображение хромосом с учетом локализации ЯО районов и С-позитивных блоков для одного вида S. mansoni (Hirai Н. and Hirai Y., 2004).

Iff

a l

б 1

1 JL i §

в i

I t»

ё \i

Рисунок 5. Пахитенные хромосомы описторхид и схематичные изображения их хромомерной организации. Изображения мелких хромосом (3-7) увеличены.

а - О. felineus, б - М. bilis, в - М. xanthosomus, г - О. viverrini (инвертированные изображения хромосом, окрашенных DAPI).

Решением данной проблемы стало получение и анализ препаратов пахитенных хромосом. В ходе работы были подобраны условия для фиксации и приготовления хромосомного материала, позволившие получать препараты, содержащие значительное количество пахитенных хромосом с отчетливой хромомерной организацией.

Окрашивание пахитенных хромосом оиисторхид красителем DAPI сделало возможным проведение идентификации и сравнительного анализа индивидуальных хромосом описторхид. Таким образом, удалось построить схемы всех малых пахитенных хромосом изучаемых видов, но, к сожалению, не удалось провести полную идентификацию всех районов крупных пахитенных хромосом 1 и 2 из-за варьирования уровня конденсации их материала и многочисленных налеганий хромосом друг на друга. В зависимости от продолжительности гипотонической обработки и условий распластывания на предметном стекле уровень конденсации пахитенных хромосом существенно варьировал: в крупных хромосомах описторхид насчитывалось от 80 до 220 хромомеров.

Предварительный сравнительный межвидовой анализ мелких хромосом описторхид позволил выявить наличие внутрихромосомных перестроек, вероятно перицентрических инверсий. При межвидовом сравнении пахитенных хромосом удалось идентифицировать хромосомы, слияние которых привело к возникновению хромосомы 3 в кариотипе виверровой двуустки. При сравнении хромомерной организации мелких хромосом было показано, что данная метацентрическая хромосома возникла в результате слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариогипа описторхид.

Для проведения хромосомного пэйнтинга, который успешно зарекомендовал себя в сравнительной цитогенегике млекопитающих, были созданы микродиссекционные ДНК-пробы (WCPs, Whole Chromosome Paints) из материала крупных хромосом 1 и 2 для двух видов, - О. felineus (Opl и Ор2, соответственно) и М. xanthosomus (Metí и Met2, соответственно). Одним из условий успешного проведения хромосомного пэйнтнга является наличие супрессии повторенных последовательностей с помощью Cotí или Cot2 ДНК. Однако при работе с хромосомами описторхид получение фракции высокоповторенной ДНК оказалось проблематичным ввиду отсутствия достаточного количества исходного материала (марит). Гибридизация in situ ДНК-проб, полученных из индивидуальных хромосом, без супрессии повторов специфически окрашивала исходные хромосомы, но дала достаточно высокий уровень неспецифического сигнала на всех хромосомах (Рисунок 4 з, и). Для разрешения данной проблемы непосредственно перед проведением гибридизации денатурированную ДНК-пробу инкубировали при 37°С для отжига повторенных последовательностей самих на себя, что не привело к решению проблемы. В результате проведения гомологичной гибридизации WCPs хромосом 1 и 2 О. felineus и М. xanthosomus были выявлены хромосомоспецифичные кластеры повторенных последовательностей, локализованные в прицентромерных районах хромосом 1 и 2 и у О. felineus, и у М. xanthosomus (Рисунок 4 з, и). Также был обнаружен дополнительный хромосомоспецифичный кластер в терминальной части р-плеча хромосомы 1 у М. xanthosomus (Рисунок 4 и). Однако попытки проведения хромосомного пэйнтинга с использованием WCPs близкородственных видов, О. felineus и М. xanthosomus, не дали ожидаемых результатов (Рисунок 4 к). Возможно, это обусловлено проведением

гетеролопичной FISH без супрессии гибридизации повторенных последовательностей, что часто является необходимым условием успешного проведения хромосомного пэйнтинга. Полученный результат указывает на то, что, несмотря на небольшой размер генома олисторхид, диспергированные повторенные последовательности представлены в их хромосомах в значительном количестве, и сохранили высокий уровень гомологии у исследованных видов.

Наличие столь большого количества диспергированных повторов существенно затруднило проведение гетерологичного хромосомного пэйнтинга даже между двумя представителями одного рода (М. bilis и М. xanthosomus). Оно оказалось неэффективным, несмотря на использование варианта гибридизации Prep-ISH, позволявшего обогатить ДНК-пробу уникальными последовательностями (Рисунок 4 л, м). Наличие кластеров хромосомоспецифичных повторенных последовательностей в хромосомах 1 и 2 у O.felineus и М. xanthosomus описторхид свидетельствует о том, что, ДНК прицентромерных С-позитивных районов крупных хромосом указанных видов описторхид является наиболее быстро эволюционирующей частью их генома, как и у большинсгва эукариегг (HenikofTet al., 2001).

* * *

Полногеномное секвенирование описторхид позволит решить значительную часть проблем, касающихся эволюции геномов в этом таксоне. Стоит отметить, что проведение секвенирования генома описторха даже с многократным перекрыванием едва ли позволит провести полную сборку секвенированных последовательностей без предварительного построения физических карт хромосом описторха. Для решения этой задачи необходимо получение ВАС-библиотек или космидных библиотек хотя бы одного из видов описторхид. Это позволит с помощью гомологичной и гетерологичной гибридизации in situ индивидуальных клонированных последовательностей построить физические карты хромосом изучаемых видов описторхид и получить необходимые реперные точки для полной сборки их геномов. Для успешного развития этих работ разработка метода получения препаратов пахитенных хромосом, выполненная в настоящем исследовании, имеет огромное значение, так как открывает возможности построения физических карт хромосом описторхид с высоким разрешением и привязкой к их структурно-функциональной организации.

Проведение FISH клонированных в ВАСах или космидах фрагментов ДНК крупных хромосом обеспечит надежное маркирование конкретных районов в пахитенных хромосомах, что тютотпъ построить надежные схемы их хромомерной организации и завершить начатую работу по созданию идиограмм пахитенных хромосом изучаемых видов. Построение физических карт хромосом, также позволит провести детальный анализ хромосомных перестроек, имевших место в эволюции описторхид. В связи с этим создание ВАС-библиотеки или космидной библиотеки одного из видов описторхид с последующим ее использованием для построения

физических карт на базе пахитенных хромосом описторхид является естественным и необходимым продолжением настоящей работы.

ВЫВОДЫ

1. В результате проведения цитогенетическош анализа хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и флуоресцентной гибридизации in situ было показано:

- кариотип С. sinensis (2п=14) из Дальнего Востока РФ представлен, образован двумя

парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами мелких хромосом (субмета-, мета- и акроцентрических);

- кариотип М. bilis (2п=14) представлен, двумя парами крупных метацентрических

хромосом и пятью парами субмета- и акроцентрических хромосом;

- наличие узких С-позитивных блоков в прицентромерных районах всех хромосом

исследованных видов описторхид, интерсгициальные (у О. felineus, M. xanthosomus) и прителомерные (у всех видов) С-позитивные блоки; обнаружено наличие одного транскрипционно активного ЯО района в одной из мелких хромосом у всех изученных видов описторхид;

- кластер рДНК расположен в терминальной части q-плеча хромосомы 3 у

исследованных видов описторхид и представлен двумя субблоками, локализованными в GC-богатых районах; показано, что теломерная ДНК описторхид (TTAGGG)n локализована только в теломерных районах их хромосом;

- наличие кластеров хромосомоспецифичных повторов для хромосом 1 и 2 О. felineus

и M. xanthosomus-, показано, что хромосомы описторхид, несмотря на небольшой размер их генома, содержат большое количество диспергированных повторов;

2. Проведение морфометрического анализа хромосом описторхид позволило установить, что их кариотипы обладают схожей морфологией и имеют одинаковое хромосомное число (2п=14) за исключением виверровой двуустки О. viverrini (2п=12), в кариотипе которой присутствует метацентрическая хромосома средних размеров;

3. . Разработанный метод приготовления препаратов пахитенных хромосом позволил впервые предложить номенклатуру хромосом для описторхид (О. felineus, О. viverrini, M. xanthosomus, M. bilis). Сравнительный анализ хромомерной организации мелких хромосом описторхид (О. felineus, О. viverrini, M. bilis, M. xanthosomus) выявил наличие видоспецифических внутрихромосомных перестроек (преимущественно перицентрических инверсий). Установлено, что хромосома 3 виверровой двуустки О. viverrini возникла в ходе слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа описторхид.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Telomeric DNA in chromosomes of five opisthorchid species. // Parasitology International. 2012. 61(1). P.81-83.

2. Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species (Trematoda, Platyhelminthes). // Parasitology International. 2012.61(1). P. 84-86.

3. Zadesenets K.S.. Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Comparative cytogenetics of op.sthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae). /7 Parasitology

International. 2012.61(1). P. 87-89. iaiiMioiogy

4. Богомолов А.Г., Задесенец K.C., Карамышева T.B., Подколодный Н.Л., Рубцов Н Б Визуализация хромоспецифичных последовательностей ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с мегафазными хромосомами. // Вавилонский журнал генетики и селекции. - 2012. - 16(2). - С. 202-211

5. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Брусенцов И.И., Романов К.В., Шеховцов С В Татьков С.И.. Фурман Д.П., Сивков А.Ю., Помазной М.Ю., Львова М.Н., Шамашша М.Ю., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б. Исследование генетического разнообразия возбудителен биогельминплоп человека, передающихся через рыбу, ракообразных и продукты их переработки. // Итоговая конференция по приоритетному направлению

Живые системы". Москва, 2009.

t 3адССС"ец КС< Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В А Молекулярно-щггогенетический анализ хромосом видов Opistorchis Шсш' и Metorchis xanthosomus. Н III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-лстию проф. К.П.Федорова. Новосибирск, 2009 п- Т\ Ь Zadesenets K.S. Chromosome organization in the Opisthorchiidae (1 rematoda). // 7 International conference on bioinforniatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2010). Novosibirsk, 2010

8. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Рубцов Н.Б., Катохин А.В.. Мордвинов В А Хромосомы ониегорхид (Trematoda, Opisthorchiidae). // V Международная конферешия по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). Новосибирск 2010

9. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов НБ Анализ распределения повторенных последовательностей в хромосомах О felineus и М. xanthosomus. // Международная научная конференция "Теоретические и практические проблемы паразитологии". Москва, 2010.

10. Zadesenets K.S., Karamycheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A Rubtsov NB Chromosomes of five species of liver flukes (Platyhelminthes, Trematoda). // 18th International Chromosome Conference 2011. Manchester, UK, 2011.

11. Pakhamkova M.Y., Ershov N.I., Vavilin'V.A.i Zadesenets K.S., Katokhin AV Merkulova T.I., Mordvinov V.A. Organization of xenobiotic-metabolizing system phase 1 in Opistorchis felineus (Trematoda, Platyhelminthes). // 12th International Symposium on Flatworm Biology. Stockholm, Sweden, 2012.

12. Bogomolov A.G., Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Podkolodny N.L., Rubtsov N В Fluorescence in situ hybridization with chromosome-derived DNA probes on Opistorchis felineus and Metorchis xanthosomus chromosomes without suppression of repetitive DNA sequences. // 8 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2012). Novosibirsk, 2012.

13. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Катохин A.B., Мордвинов В.А., Рубцов НБ Структурно-функциональная организация хромосом описторхид (Platyhelminthes Trematoda). // Хромосома - 2012.11овосибирск, 2012.

14. Задесенец К.С., Дюкалова М.Б., Виноградова М.С., Катохин А.В., Мордвинов В А Рубцов Н.Б. Комплексный микроскопический подход в изучении морфологии кошачьей двуустки Opistorchis felineus (Rivolta, 1884). // "Современные проблемы оощей паразитологии". Москва, 2012.

Подписано к печати 30.11.2012 г. Формат бумаги 60 х 90 1/16 Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7 Тираж 110 экз. Заказ № 88

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. акад. Лаврентьева, 10

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Задесенец, Кира Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Семейство Opisthorchiidae (Platyhelminthes, Trematoda).

1.1 Систематическое положение исследованных видов описторхид.

1.1.1 Подсемейство Opisthorchiinae Looss, 1899.

1.1.2 Подсемейство Metorchiinae Lühe, 1909.

1.2. Географическое распространение видов, вовлеченных в исследование.

1.3.1 Яйцо.

1.3.2 Мирацидий.

1.3.4 Церкария.

1.3.5 Метацеркария.

1.3.6 Марита.

1.5. Культивирование трематод.

1.6Хромосомы описторхид.

1.6.1 Методы приготовления хромосомных препаратов описторхид.

1.6.1.1. Приготовление препаратов метафазных хромосом из соматических клеток

1.6.2. Методы дифференциального окрашивания хромосом трематод.

1.6.2.1. С-дифференциальное окрашивание хромосом

1.6.2.2 Окрашивание азотнокислым серебром (AgNOR-бэндинг)

1.6.3 Гибридизация нуклеиновых кислот in situ.

1.6.3.1 Д1 IK-пробы, специфичные повторенным последовательностям

1.6.3.2 Хромосомоспецифичные ДНК-пробы

1.6.3.3 Физическое картирование хромосом трематод с помощью FISH 47 1.7 Кариотипы трематод.

1.7.1 Число хромосом и плоидность генома трематод.

1.7.2 Определение пола у трематод.

1.7.3 В-хромосомы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация хромосом описторхид"

Актуальность работы. Исследование хромосомной организации описторхид является актуальной фундаментальной задачей. Класс трематод, к которому относятся исследованные в настоящей работе виды описторхид, представляет одну из наиболее эпидемиологически значимых групп паразитических червей. В состав данного таксона входит более 16 ООО видов (свыше 140 семейств) паразитов беспозвоночных и позвоночных животных, включая человека (Скрябин, 1950; Gibson et al., 2002). Характерной особенностью трематод является наличие сложного жизненного цикла ди- или триксенного типа, в течение которого происходит чередование бесполого (партеногенетического) и полового поколений. Дефинитивными хозяевами трематод являются пресмыкающиеся, птицы, млекопитающие, в том числе человек.

Особенно стоит выделить виды, образующие так называемую «описторхозную триаду» (О. felineus, О. viverrini, С. sinensis), ареалы инвазии этими паразитами обширны и практически сливаются друг с другом в один крупный очаг. Также паразитозы, вызываемые видами «описторхозной триады», имеют схожую клиническую картину. Кроме того, указанные виды описторхид внесены в список биологических канцерогенов. Самый крупный очаг зараженности О. felineus расположен в Российской Федерации, в Обь-Иртышском бассейне, причем в некоторых его районах уровень инвазии среди местного населения может достигать 100%. Также немаловажно отметить, что ареалы инвазии описторхидами расширяются, возникают новые, что связано преимущественно с миграцией населения.

В связи с этим, описторхиды являются важным и актуальным объектом, полноценное и разностороннее изучение которых будет иметь не только фундаментальное, но и практическое значение, например, при разработке чувствительных и специфичных методов диагностики, а также создания новых лекарственных препаратов.

Кроме того, полноценное изучение описторхид помимо описания их морфологии, жизненного цикла, ареала зараженности, клинической картины вызываемых ими заболеваний, взаимоотношений паразит - хозяин, систем размножения должно включать также детальное изучение их генома. Известно, что геномы не только описторхид, но и трематод в целом, несмотря на сложную программу онтогенеза, относятся к малоразмерным (300-400 МЬ).

Исследование генома описторхид может быть проведено как на хромосомном уровне (цитогенетические методы), так и на молекулярном уровне (полногеномное секвенирование). Стоит отметить, что трематоды до сих пор остаются малоизученным таксоном с точки зрения цитогенетики, а семейство описторхиды является практически неизученным. На сегодняшний день опубликовано большое количество работ, посвященных разностороннему изучению трематод за исключением цитогенетического анализа их хромосом: работ, посвященных цитогенетике трематод крайне мало, для описторхид они и вовсе единичны.

Основной причиной того, что описторхиды, как и все трематоды, не являются малоизученным объектом с точки зрения цитогенетики, является наличие сложного жизненного цикла. На сегодняшний день в лабораториях мира удавалось лишь частично воспроизвести жизненный цикл трематод. В случае с описторхидами это связано с микст-инвазией первого промежуточного хозяина трематод - моллюска, и чрезвычайно низкой частотой заражения моллюсков мирацидиями в лабораторных условиях. Поэтому многие исследователи при изучении трематод работают с их дефинитивными стадиями, а именно маритами. Однако, одним из главных вопросов, которые встают перед исследователем при работе с хромосомами не только описторхид, но и трематод в целом, является следующий: какую ткань или орган мариты следует брать для приготовления хромосомных препаратов и каким образом фиксировать выбранный материал? Для ответа на этот вопрос было целесообразно провести комплексный микроскопический анализ, который предварял исследование непосредственно самих хромосом описторхид. Главной целью подготовительного этапа является поиск тканей или органов мариты описторхид, которые характеризуются высоким митотическим или мейотическим индексом.

Традиционно изучение кариотипа любого биологического объекта начинается с применения классических методов цитогенетики, таких как С-дифференциалыюе окрашивание, А§>Ю11-бэндинг и др. С помощью данных методов возможно выполнить изучение общей организации кариотипа исследуемых видов, а именно: описать морфологию и число хромосом в кариотипе, выявить полиморфизм хромосом внутри популяции или между ними, определить локализацию и размер блоков конститутивного гетерохроматина, ЯО районов. Цитогенетический анализ более высокого уровня разрешения проводится на пахитенных хромосомах или фибриллах ДНК с привлечением молекулярно-цитогенетических методов, таких как FISH. Следующим этапом является проведение сравнительного анализа описанных кариотипов исследуемых видов. Важно отметить, что сравнительный анализ хромосом не только у описторхид, но и у трематод в целом, проводился в единичных работах и включал в себя лишь сравнение хромосомных чисел и морфологии хромосом. Цитогенетика трематод является слабо изученной областью: в истории цитогенетики данного таксона больше всего исследований было посвящено изучению хромосом шистосоматид. До проведения настоящей работы для описторхид были известны лишь хромосомные числа для нескольких видов и проведено дифференциальное окрашивание хромосом только одного из них (О. viverrini).

Таким образом, в связи с высокой значимостью изучения цитогенетики описторхид, были сформулированы цели и задачи настоящего исследования. Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы является изучение особенностей структурно-функциональной организации хромосом описторхид. В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1 Разработать методы приготовления препаратов митотических и мейотических (в том числе пахитенных) хромосом из марит описторхид (Opisthorchis felineus, Opisthorchis viverrini, Metorchis xanthosomus, Metorchis bilis, Clonorchis sinensis);

2 Провести цитогенетический анализ хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и гибридизации in situ: а) выполнить морфометрический анализ хромосом описторхид; б) провести дифференциальное окрашивание хромосом исследуемых видов описторхид (С- и AgNOR-окрашивание); в) получить микродиссекционные ДНК-пробы, специфичные хромосомам 1 и 2 О. felineus и М. xanthosomus; г) изучить локализацию кластеров (рДНК, теломерные повторы) и распределение диспергированных последовательностей в хромосомах описторхид.

3 Выполнить сравнительный межвидовой анализ хромосом исследуемых видов описторхид.

Научная новизна

• дано описание кариотипа М. bilis;

• показано, что кариотип С. sinensis из Дальнего Востока РФ содержит 7 пар хромосом;

• проведен морфометрический анализ хромосом М. bilis, М. xanthosomus;

• изучена локализация ЯО районов и С-позитивных блоков в хромосомах описторхид;

• получены микродиссекционные ДНК-пробы для хромосом описторхид;

• определена локализация рДНК в хромосомах описторхид;

• построены идиограммы мелких пахитенных хромосом описторхид.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты, полученные при проведении комплексного микроскопического анализа мариты кошачьей двуустки, дополняют уже имеющиеся данные по морфологии трематод и могут быть использованы в курсе лекций по паразитологии. Данные, полученные при проведении цитогенетического анализа хромосом описторхид, являются весомым вкладом в столь мало изученную область и паразитологии как цитогенетика трематод. Впервые полученные в настоящей работе пахитенные хромосомы не только для описторхид, но и для трематод в целом, позволили провести сравнение хромосомной организации у описторхид на высоком уровне разрешения; полученные при этом данные являются не только оригинальными, но и одними из первых в сравнительной цитогенетике трематод. Разработка метода приготовления пахитенных хромосом станет мощным инструментом в руках исследователей, как в области сравнительной цитогенетики, так и при проведении полногеномного секвенирования описторхид на этапе финальной сборки генома. Положения, выносимые на защиту

1) В ходе кариотипической эволюции внутри семейства Opisthorchiidae (О. felineus,

О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus) имели место внутрихромосомные перестройки.

2) Хромосомы описторхид имеют единственный кластер рибосомных генов, состоящий из двух GC-богатых субблоков, разделенных АТ-богатым участком.

3) Теломерная ДНК описторхид представлена мотивом (TTAGGG)n и локализована только на концах плеч всех хромосом. В хромосомах описторхид интерстициальные кластеры теломерной ДНК отсуствуют.

4) У представителей плоских червей (описторхид), впервые было показано наличие хромосомоспецифичных кластеров повторенных последовательностей.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях и сессиях:

1. Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления "Живые системы" 25-27 ноября 2009г. Москва.

2. III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора К.П.Федорова. // 15-20 сентября 2009 г. Новосибирск; th

3. 7 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure/system biology (BGRS/SB'2010). // 20-27 июня 2010 г. Новосибирск;

4. V Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). // 16-20 августа 2010 г. Новосибирск;

5. Международная научная конференция "Теоретические и практические проблемы паразитологии"// 30 ноября - 3 декабря 2010 г. Москва; th

6. 18 International Chromosome Conference (18 ICC)// 29 августа - 2 сентября 2011 г. Манчестер, Великобритания;

7. Отчетная сессия ИЦИГ СО РАН, 26 марта - 3 апреля 2012 г, Новосибирск; th

8. 8 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2012). // 25-29 июня 2012 г. Новосибирск;

9. Международная конференция "Хромосома 2012" // 2-7 сентября 2012 г. Новосибирск.

10. Международная конференция "Современные проблемы общей паразитологии". // 30 октября - 1 ноября 2012 г. Москва.

Публикации

1. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Telomeric DNA in chromosomes of five opisthorchid species. // Parasitology International. 2012. 61(1). P.81-83.

3. Zadesenets K.S., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Comparative cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae). // Parasitology International. 2012. 61(1). P. 87-89.

4. Богомолов А.Г., Задесенец K.C., Карамышева T.B., Подколодный H.JI., Рубцов Н.Б. Визуализация хромосомоспецифичных последовательностей ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами. // Вавиловский журнал генетики и селекции. - 2012. - 16(2). -С. 202-211.

Тезисы конференций

1. Мордвинов В.А., Катохин А.В., Брусенцов И.И., Романов К.В., Шеховцов С.В., Татьков С.И., Фурман Д.П., Сивков А.Ю., Помазной М.Ю., Львова М.Н., Шаманина М.Ю., Задесенец К.С., Рубцов Н.Б. Исследование генетического разнообразия возбудителей биогельминтозов человека, передающихся через рыбу, ракообразных и продукты их переработки. // Итоговая конференция по приоритетному направлению "Живые системы". Москва, 2009.

2. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Молекулярно-цитогенетический анализ хромосом видов Opistorchis felineus и Metorchis xanthosomus. II III Межрегиональная конференция паразитологов Сибири и Дальнего Востока, посвященная 80-летию профессора К.П.Федорова. Новосибирск, 2009.

3. Rubtsov N.B., Zadesenets K.S. Chromosome organization in the Opisthorchiidae tVi

Trematoda). // 7 International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2010). Novosibirsk, 2010.

4. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Рубцов Н.Б., Катохин А.В., Мордвинов В.А. Хромосомы описторхид (Trematoda, Opisthorchiidae). // V Международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных (KARYO V). Новосибирск, 2010.

5. Задесенец К.С., Карамышева Т.В., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Анализ распределения повторенных последовательностей в хромосомах О. felineus и М. xanthosomus. II Международная научная конференция "Теоретические и практические проблемы паразитологии". Москва, 2010.

6. Zadesenets K.S., Karamycheva T.V., Katokhin A.V., Mordvinov V.A., Rubtsov N.B. Chromosomes of five species of liver flukes (Platyhelminthes, Trematoda). // Manchester, UK, 2011.

7. Pakharukova M.Y., Ershov N.I., Vavilin V.A., Zadesenets K.S., Katokhin A.V.,

Merkulova T.I., Mordvinov V.A. Organization of xenobiotic-metabolizing system h phase 1 in Opisthorchis felineus (Trematoda, Platyhelminthes). //12 International Symposium on Flatworm Biology. Stockholm, Sweden, 2012.

8. Bogomolov A.G., Zadesenets K.S., Karamysheva T.V., Podkolodyy N.L., Rubtsov N.B. Fluorescence in situ hybridization with chromosome-derived DNA probes on Opisthorchis felineus and Metorchis xanthosomus chromosomes without suppression of repetitive DNA sequences. // 8th International conference on bioinformatics of genome regulation and structure\system biology (BGRS/SB'2012). Novosibirsk, 2012.

9. Задесенец K.C., Карамышева T.B., Катохин A.B., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Структурно-функциональная организация хромосом описторхид (Platyhelminthes, Trematoda). // Хромосома - 2012. Новосибирск, 2012.

10. Задесенец К.С., Дюкалова М.Б., Виноградова М.С., Катохин А.В., Мордвинов В.А., Рубцов Н.Б. Комплексный микроскопический подход в изучении морфологии кошачьей двуустки Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884). // Современные проблемы общей паразитологии. Москва, 2012. t

По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 10 работ - в виде тезисов и материалов к конференциям, и 4 статьи, из которых 3 в зарубежной печати.

Вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в планировании и проведении всех экспериментов, получении и интерпретации результатов.

Работа, посвященная комплексному микроскопическому анализу мариты описторха выполнялась совместно с: д.б.н. М.С. Виноградовой и студенткой 5-го курса НГУ М.Б. Дюкаловой (гистологическое и гистохимическое изучение описторха), к.б.н. С.И. Байбородиным (лазерная сканирующая микроскопия).

Получение микродиссекционных ДНК-проб проводилось совместно с к.б.н. Т.В. Карамышевой и д.б.н. Н.Б. Рубцовым.

Большая часть экспериментов проведена автором самостоятельно.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Задесенец, Кира Сергеевна

выводы

1. В результате проведения цитогенетичеекого анализа хромосом описторхид с использованием методов дифференциального окрашивания и флуоресцентной гибридизации in situ было показано:

- кариотип С. sinensis из Дальнего Востока РФ представлен 2п=14, образован двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами мелких хромосом (субмета-, мета- и акроцентрических);

- кариотип М. bilis (2п=14) представлен, двумя парами крупных метацентрических хромосом и пятью парами субмета- и акроцентрических хромосом;

- наличие узких С-позитивных блоков в прицентромерных районах всех хромосом исследованных видов описторхид, интерстициальные (у О. felineus, M. xanthosomus) и прителомерные (у всех видов) С-позитивные блоки; обнаружено наличие одного транскрипционно активного ЯО района в одной из мелких хромосом у всех изученных видов описторхид;

- кластер рДНК расположен в терминальной части q-плеча хромосомы 3 у исследованных видов описторхид и представлен двумя субблоками, локализованными в GC-богатых районах; показано, что теломерная ДНК описторхид (TTAGGG)n локализована только в теломерных районах их хромосом;

- наличие кластеров хромосомоспецифичных повторов для хромосом 1 и 2 О. felineus и М. xanthosomus; показано, что хромосомы описторхид, несмотря на небольшой размер их генома, содержат большое количество диспергированных повторов;

3. Разработанный метод приготовления препаратов пахитенных хромосом позволил впервые предложить номенклатуру хромосом для описторхид (О. felineus, О. viverrini, М. xanthosomus, М. bilis). Сравнительный анализ хромомерной организации мелких хромосом описторхид (О. felineus, О. viverrini, М. bilis, М. xanthosomus) выявил наличие видоспецифических внутрихромосомных перестроек (преимущественно перицентрических инверсий). Установлено, что хромосома 3 виверровой двуустки О. viverrini возникла в ходе слияния хромосом 3 и 7 возможного предкового кариотипа описторхид.

115

Заключение

Плоские черви являются примитивными беспозвоночными животными с билатеральной симметрией тела. Среди представителей данного типа встречаются как свободноживущие, так и паразитирующие черви. В состав типа Плоские черви входят трематоды, или дигенетические сосальщики. Их сложный жизненный цикл протекает со сменой хозяев и жизненных стадий, каждая из которых имеет выраженные адаптативные особенности, позволяющие выживать в различных условиях окружающей среды. При этом размер генома, в котором зашифрована сложная программа онтогенеза трематод, невелик (около 300-400 м.п.н.). Перед исследователями давно стоял вопрос: каким образом организован геном у плоских червей? Первые попытки разобраться с этим вопросом были начаты при проведении классических описаний кариотипов у трематод. На сегодняшний день общее описание кариотипа, включающее определение числа хромосом, их морфологии, выполнено примерно для 230 видов, в то время как класс трематод включает в себя около 16 тыс. видов дигенетических сосальщиков. Особого внимания заслуживают представители семейства Ор1вИюгс1ш(1ае, которые занимают среди трематод особое положение, так как являются эпидемиологически значимыми видами и отличаются высокой экологической пластичностью. В связи с этим изучение жизненного цикла, ареала распространения, морфологии, патофизиологических процессов, протекающих при заражении хозяина, посвящены многочисленные исследования. Однако виды данной таксономической группы с точки зрения цитогенетики изучены слабо: классические описания кариотипа были проведены лишь для пяти видов. Причин, по которым трематоды не являются распространенным объектом для изучения в цитогенетике, несколько: ограниченное количество материала для приготовления хромосомных препаратов, отсутствие клеточных культур, малый размер хромосом. До сих пор во всех работах источником хромосомного материала служили преимущественно партениты, ткани которых характеризовались высоким митотическим индексом. В случае с описторхидами использование данного подхода проблематично: у моллюсков, в которых развиваются партениты, часто встречается микст-инвазия. Решением проблемы приготовления хромосомных препаратов описторхид остается лишь оптимизация метода приготовления хромосомных препаратов из марит. Для того чтобы определить какую ткань или орган следует взять при приготовлении препаратов митотических и мейотических хромосом, необходимо провести микроскопический анализ морфологии мариты, ее отдельных органов и тканей.

Соответственно, изучение морфологии и структурно-функциональной организации хромосом описторхид должно включать в себя следующие этапы:

• оптимизация методов приготовления препаратов митотических и мейотических хромосом;

• описание кариотипа исследуемого вида, включающее определение числа хромосом, описание их морфологии и проведение их морфометрии;

• проведение и анализ дифференциального окрашивания хромосом, а именно: определение локализации районов, содержащих кластеры повторенных последовательностей (рДНК, кластеры повторов, формирующих С-позитивные блоки);

• проведение сравнительного анализа хромосом близкородственных видов описторхид;

• анализ распределения в хромосомах кластеров эволюционно значимых повторенных последовательностей, таких как теломерные повторы, рДНК, с использованием гибридизации in situ;

• получение и использование хромосомоспецифичных и районоспецифичных ДНК-проб в гетерологичной гибридизации для выявления внутри- и межхромосомных перестроек;

• построение физических карт хромосом описторхид с помощью гибридизации клонированных последовательностей и последующее проведение сравнительного анализа физических карт хромосом разных видов описторхид;

• секвенирование геномов описторхид с дальнейшей сборкой их геномов с привлечением данных по локализации их уникальных последовательностей;

• проведение сравнительного геномного анализа описторхид с использованием данных по секвенированию их геномов.

Следует отметить, что при выполнении перечисленных выше работ может возникнуть ряд серьезных проблем, связанных с особенностями изучаемого объекта. До сих пор не было получено положительных результатов при использовании методов дифференциального окрашивания С-негативных районов хромосом трематод (G-, R-, Q-бэндинг) и хромосом других видов, имеющих близкие по размеру геномы. Также не были разработаны: методы получения клеточных культур трематод; методы получения препаратов хромосом, позволяющие проводить цитогенетический анализ на высоком уровне разрешения; способы наработки достаточного количества геномной ДНК трематод для получения Cotl/2-ДНК, которая необходима для подавления гибридизации повторенных последовательностей при проведении CISS-гибридизации. Альтернативой использованию G-, R-, Q-бэндинга может быть получение и анализ пахитенных хромосом изучаемых видов. К сожалению, на сегодняшний день не существует разработанных методов получения пахитенных хромосом не только для описторхид, но и для Плоских червей в целом. Разработка методов приготовления препаратов пахитенных хромосом описторхид позволила бы единовременно решить проблему проведения цитогенетического анализа на высоком уровне разрешения. Кроме того, на сегодняшний день отсутствуют библиотеки космид, фосмид и ВАС-клонов, содержащие фрагменты ДНК описторхид.

В то же время отсутствие большого количества делящихся клеток не только у описторхид, но и трематод в целом, является ограничением использования хромосомного сортинга для получения хромосомоспецифичных ДНК-проб; единственной возможностью получения таких ДНК-проб является проведение микродиссекции с последующей амплификацией ДНК собранного материала индивидуальных хромосом. Также необходим подбор условий проведения FISH хромосомоспецифичных ДНК-проб с хромосомами описторхид без супрессии повторяющихся последовательностей ДНК избытком Cot 1/2-ДНК.

В настоящей работе, посвященной изучению хромосомной организации у описторхид, найдены решения проблем, связанных с получением хромосомных препаратов из марит описторхид; особенностями проведения методов дифференциального окрашивания; получения хромосомоспецифичных ДНК-проб, проведения FISH с ними. Полученные данные обеспечат базу для проведения дальнейших исследований по построению физических карт хромосом описторхид, необходимых для успешного завершения полного секвенирования их геномов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы 2.1.1 Реактивы

AgN03 - «Реахим» Ва(ОН)2 - «Реахим»

BSA (бычий сывороточный альбумин )— «Fluka» СС14 - «Реахим» DAPI — «Sigma»

О.С.Т. médium (Optimal Cutting Temperature médium) - «Sakura»

PB S (фосфатный буфер) - «Amresco»

SDS (додецил сульфат натрия) — «Serva»

Tween 20 (полиоксиэтиленсорбитан монолаурат) — «Amresco»

Амберлитовая смола для деионизации формамида — «Sigma»

Антифейд - «VECTASHIELD, Vector Laboratories »

Глицерин - «Fluka»

Декстран сульфат - «Pharmacia»

Диметилдихлорсилан - «Fluka»

Желатин - «Serva»

Колхицин — «Sigma»

Краситель Гимза — «Sigma»

Культуральная среда RPMI - «Sigma»

Метанол 100% - «Вектон»

Муравьиная кислота - «Реахим»

Набор реактивов для проведения ПЦР — «Fermentas»

Пентоксирезоруфин - «Sigma»

Уксусная кислота - «Реахим»

Формальдегид - «Amresco»

Формамид - «Sigma»

ЭДТА (динатриевая соль этилендиаминтетрауксуной кислоты) — «Amresco» Этанол 100% - перегнанный Этидиум бромид — «Sigma»

Реактивы для проведения гистологических и гистохимических окрашиваний -«Реахим»

2.1.2 Ферменты и коныогаты

Биотинилированный дезоксиуридинтрифосфат (биотин-16-дУТФ) — «Медиген» Биотинилированная (CCCTAA)3-PNA-npo6a - «Applied Biosystems» Дигоксигенин-11-дУТФ — «Roche»

ChromaTide®Alcxa Пиог488-5-дУТФ - «Molecular Probes»; авидин-А1еха488 -«Molecular Probes»

Антитела овцы к дигоксигенину, коньюгированные с родамином (Rho) - «Roche» Панкреатическая РНКаза А - «Fluka»; пепсин — «Sigma»

2.1.3 Растворы и буферы

3 M ацетат натрия

ГС (гибридизационная смесь): 50 % формамид, 2XSSC, 1 % Tween 20, 10 % декстран сульфат

Гипотонический раствор 1 - 0,05 М; гипотонический раствор 2 - 0,075 M KCl lxPBS (фосфатный буфер): 137 мМ NaCl, 2 мМ KCl, 10 мМ Na2HP04, pH 7,4 20xSSC: 3 M NaCl, 0,3 M C6H5Na307 (цитрат натрия), pH 7,0 50xTAE: 2 M Трис, 0,5 мМ ЭДТА, pH 8,0

2.1.4 Мариты описторхид

В настоящей работе проводилось изучение хромосомной организации пяти видов описторхид: О. felineus, О. viverrini, M. xanthosomus, M. bilis, С. sinensis (Таблица 2.1; Приложение 1 Рисунок 1).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Задесенец, Кира Сергеевна, Новосибирск

1. Ахметов, К.К. Функциональная морфология кожно-мускульного мешка и пищеварительной системы трематод различных таксономических и экологических групп: автореф. дис.докт. биол. наук. / К.К. Ахметов -Алматы, 2004. 53 с.

2. Баршене, Я.В. Кариотипы трематод / Я.В. Баршене. Вильнюс: "Academia", 1992.-371 с.

3. Беэр, С.А. Биология возбудителя описторхоза / CA. Беэр. М. : Товарищество научных изданий КМК. - 2005. - 336 стр.

4. Близнюк, И.Д. Экспериментальное заражение рыб свободноплавающими церкариями кошачьей двуустки / И.Д. Близнюк // Вестник зоологии. 1969. -№3. - С.76-79.

5. Богомолов, А.Г. Визуализация хромосомоспецифичных ДНК при проведении FISH микродиссекционных ДНК-проб с метафазными хромосомами / А.Г. Богомолов и др. // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2012. - 16(2). -С. 202-211

6. Брусенцов, И.И. ДНК-диагностика микст-инвазий Opisthorchis felineus и Metorchis bilis с помощью метода ПЦР. / И.И. Брусенцов и др. // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. 2010. - №2. - С. 10-13.

7. Гинецинская, Т.А. Трематоды их жизненные циклы, биология и эволюция / Т.А. Гинецинская. JI.: Наука, 1968. - 411 с.

8. Гребенщиков, В.М. Микроморфологические и гистохимические исследования половой системы и гаметогенеза некоторых трематод в норме и при действииантгельминтиков: дис. канд.биол. наук. / В.М. Гребенщиков. Кемерово,1984. 190 с.

9. Дроздов, В.Н. О способах проникновения личинок описторхиса в рыб / В.Н. Дроздов // Зоологический журнал. 1965. - Т.44. Вып.9. - С. 1405-1406.

10. Жданова, Н.С. Картирование хромосом свиньи (Sus scrofa Dom.L.) на основе межвидовых гибридов соматических клеток: дисс. .докт. биол. наук. / Н.С. Жданова. Новосибирск, 2002. - 245 с.

11. Звягина, В.В. Начева J1.B. Состояние гликогена в органах и тканях метацеркарий Opistorchis felineus. / B.B. Звягина, JI.B. Начева // Мед паразитология. 1993. - №5. - С.23-26.

12. Ильинских, E.H. Актуальные вопросы изучения проблемы описторхоза в Сибири / E.H. Ильинских // Бюллетень сибирской медицины. 2002. - № 1. - С. 63-70.

13. Ильинских, И.Н. Инфекционная кариопатология / И.Н. Ильинских и др. -Томск : Издательство Томского университета, 2005. 168 с.

14. Куперман, Б.И. Ультраструктура взрослых трематод Opisthorchis felineus / Б.И. Куперман, А.Г. Гиновкер, A.B. Володин, Л.Г. Поддубная, В.В. Кривенко // Доклады Академии наук СССР. 1991. - Т.317. №2. - С. 462-464.

15. Лилли, Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия / Р. Лилли // М.: Издательство "Мир", 1969. 645 с.

16. Маниковская, Н.С. Морфофункциональные особенности пищеварительной системы трематод при формировании системы "паразит-хозяин": автореф. дис. . канд. биол. наук/ Н.С. Маниковская. М., 2005. - 169 с.

17. Мясоедов, B.C. Эпидемиология описторхоза / B.C. Мясоедов. Томск, 1960. -100 с.

18. Начева, Л.В. Морфоэкологический анализ и эволюционная динамика тканевых систем трематод, реактивность органов и тканей при действии антигельминтиков: автореф. дис. . докт. биол. наук / Л.В. Начева. М., 1993. -57 с.

19. Прокофьева-Бельговская, A.A. Гетерохроматические районы хромосом / A.A. Прокофьева-Бельговская. М.: Наука, 1986. 430 с.

20. Размашкин, Д.А. О видовой принадлежности метацеркарий рода Metorchis (Trematoda, Opisthorchidae) из рыб Западной Сибири / Д.А. Размашкин // Паразитология. 1978. - Вып. 12. № 1. - С. 68-78.

21. Романенко, J1.H., Морфология хромосом Opisthorchis felineus (Rivolta, 1884) / JI.H. Романенко // материалы научной конференции Всес. общества гельминтологов. Москва, 1973. - Вып. 25. - С. 183-188.

22. Трехмерная организация интерфазных ядер фибробластов у двух близкородственных видов бурозубок, различающихся структурой терминальных районов хромосом / Н.Б. Рубцов, Т.В. Карамышева, Ю.М. Минина, Н.С. Жданова. // Цитология. 2008. - 50(5). - С. 430-438.

23. Скрябин, К.И. Трематоды животных и человека / К.И. Скрябин. М. : Изд-во академии наук СССР, 1950. - Т.4. - Стр. 81-329.

24. Шульман, Е.С. Материалы по изучению метацеркариев О. felineus / Е.С. Шульман, Г.М. Старобинец, А.А. Лапина // Проблемы паразитологии: тез. докл. 4-ой научн. конф. паразитологов УССР. Киев, 1997.- С.297-298.

25. Шустов, А.И. Необычная локализация метацеркариев описторхиса / А.И. Шустов, Т.А. Середина. // Мед. паразитология. 1977. - Т.46. №2. - С. 233-234.

26. Юрлова, Н.И. Обская болезнь / Н.И. Юрлова // Наука из первых рук. 2008. -№2.-С. 12-21.

27. Adiyodi, K.G. Accessory sex glands / K.G. Adiyodi, R.G. Adiyodi // Reproductive biology of invertebrates. Vol. 3. 1988. - 542 p.

28. Armignacco, O. Human illnesses caused by Opisthorchis felineus flukes, Italy / O. Armignacco et al. // Emerging Infectious Diseases. 2008. - Vol. 14. No. 12. - P. 1902-1905.

29. Beukeboom, L.W. Reproductive modes, ploidy distribution, and supernumerary chromosome frequencies of the flatworm Polycelis nigra (Platyhelminthes:

30. Tricladida) / L.W. Beukeboom, T.F. Sharbel, N.K. Michiels // Hydrobiologia. 1998. - 383.-P. 277-285.

31. Blair, D. Paragonimiasis and the genus Paragonimus / D. Blair, Z.-B. Xu, T. Agatsuma // Adv. Parasitol. 1998. - 42. - P. 113-222.

32. Bouvard, V. A review of human carcinogens Part B: biological agents / V. Bouvard et al. // Lancet Oncol. - 2009. - 10(4). - P.321-322.

33. Breen, M. Reciprocal chromosome painting reveals detailed regions of conserved synteny between the karyotypes of the domestic dog (Canis familiaris) and human / M. Breen et al. // Genomics. 1999. - 61(2). - P. 145-155.

34. Britt, H.B. Chromosomes of digenetic trematodes / H.B. Britt // The American Naturalist. 1947. - Vol. 81. No. 799 - P. 276-296.

35. Brooks, D.R. Phylogenetic analysis of the Digenea (Platyhelminthes: Cercomeria) with comments on their adaptive radiation / D.R. Brooks, R.T. O'Grady, D.R. Glen // Can J Zool. 1985.- 63.-P. 411-443.

36. Burt, D.W. Origin of avian microchromosomes / D.W. Burt // Cytogenet Genome Res. 2002. - 96. - P.97-112.

37. Cabrero, J. Multiregional origin of B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans / J. Cabrero et al. // Chromosoma. 2003. - 112. - P. 207211.

38. Cameron, T.W.M. Parasites carried by fresh-water fish / T.W.M. Cameron // Canadian Journal of Comparative Medicine. 1945. - 9(11). - P. 302-312.

39. Cernyavsky, F.B., Kozlovsky A.I. Species status and history of the arctic lemmings (Dicrostonyx, Rodentia) of the Wrangel Island / F.B. Cernyavsky, A.I. Kozlovsky // Zool Zh. 1980. - 59. - P. 266-273.

40. Chai, J-Y. Fish-borne parasitic zoonoses: status and issues / J-Y Chai, K.D. Murrell, A.J. Lymbery // International Journal Parasitology. 2005. - 35. - P.1233-1254.

41. Cho, H. Studies on the chromosomes of parasitic helminthes. (1). Chromosomes in meiocytes, spermiogenesis and fertilization observed by means of a squash method in

42. Clonorchis sinensis (Trematoda: Opisthorchiidae) / H. Cho // Jpn J Parasitol. 1978. -27.-P. 399-410.

43. Chowdhary, B.P. Mapping genomes at the chromosome level / B.P. Chowdhary, T. Raudsepp // Mammalian genomics. Edit, by A. Ruvinsky and J.A. Graves . CABI International. UK. 2005. Chapter 2. - P. 23-67.

44. Cox, D.R. Radiation hybrid mapping: a somatic cell genetic method for constructing high-resolution maps of mammalian chromosomes / D.R. Cox et al. // Science. -1990. Vol. 250. - P. 246-250.

45. Criscione, C.D. Genomic linkage map of the human blood fluke Schistosoma mansoni / C.D. Criscione et al. // Genome Biology. 2009. - 10: R71.

46. Ditrich, O. Species determination of eggs of opisthorchiid and heterophyid flukes using scanning electron microscopy / O. Ditrich, M. Giboda, J. Sterba. // Angew Parasitol. 1990.-31.-P. 3-9.

47. Dobigny, G. "AgNORs" are not always true NORs: new evidence in mammals / G. Dobigny, C. Ozouf-Costaz, C. Bonillo, V. Volobuev //Cytogenet Genome Res. -2002. 98. - P. 75-77.

48. Dong, H. Studies on the silver-stained nucleolar organizer region associated protein cultured cells from Schistosoma japonicum / H. Dong et al. // Chinese Journal of Zoonoses. 2004-06.

49. Dudits, D. Fusion of human cells with carrot protoplasts induced by polyethylene glycol / D. Dudits, I. Rasko, GY. Hadlaczky, A. Lima-De-Faria. // Hereditas. 1976. -82.-P. 121-124.

50. Dutrillaux, B. Very large analogy of chromosome banding between Cebus capucinus (Platyrrhini) and man / B. Dutrillaux // Cytogenet Cell Genet. 1979. - 24(2). - P. 8494.

51. Ersfeld, K. Fiber-FISH: fluorescence in situ hybridization on stretched DNA / K. Ersfeld // Methods in Molecular Biology. 2004. - 270. - P. 395-402.

52. Ferguson-Smith, M.A. Mammalian karyotype evolution / M.A. Ferguson-Smith, V. Trifonov // Nat Rev Genet. 2007. - 8(12). - P. 950-962.

53. Fillon, V. The chicken as a model to study microchromosomes in birds: a review / V. Fillon // Genet Sel Evol. 1998. - 30. - P. 209-219.

54. Gibson, D.I. Keys to the Trematoda / D.I. Gibson, A. Jones, R.A. Bray. CAB International, Wallingford. 2002. - Vol. 1. - 521 pp.

55. Goss, S.J. New methods for mapping genes in human chromosomes / S.J. Goss, H. Harris //Nature. 1975. -255. - P. 680-684.

56. Goodpasture, C. Visualization of nuclear organizer regions in mammalian chromosomes using silver staining / C. Goodpasture, S.E. Bloom // Chromosoma (Berl.).- 1975.- 53.-P. 37-50.

57. Graphodatsky, A.S. The genome diversity and karyotype evolution of mammals / A.S. Graphodatsky, V.A. Trifonov, R. Stanyon // Molecular Cytogenetics. 2011. -4:22.

58. Gregory, R.T. The evolution of the genome / R.T. Gregory // Elsevier Academic Press.-2005.-740 p.

59. Grossman, A.I. Karyotype evolution and sex chromosome differentiation in Schistosomes (Trematoda, Schistosomatidae) / A.I. Grossman, R.B. Short, G.D. Cain // Chromosoma (Berl.). 1981. - 84. - P. 413-430.

60. Guan, X.-Y. Generation of band-specific painting probes from a single microdissected chromosome / X.-Y. Guan, J.M. Trent, P.S. Meltzer // Human Molecular Genetics. -1993. Vol.2. No.8. - P.l 117-1121.

61. Hackett, F. The culture of Schistosoma mansoni and production of life cycle stages / F. Hackett // Methods in Parasitology: Protocols in Molecular Parasitology. 1993. -Vol. 2. - P. 89-99.

62. Henikoff, S. The centromere paradox: stable inheritance with rapidly evolving DNA / S. Henikoff, K. Ahmad, H.S. Malik // Science. 2001. - 293. - P. 1098-1102.

63. Hinz, E. Current status of food-borne zoonoses in West Germany / E. Hinz // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1991. - P. 78-84.

64. Hirai, H. Paragonimus ohirai: identification of nucleolar organizer regions (NORs) and silver nitrate staining pattern in spermatogenesis / H. Hirai // Experimental Parasitology. 1988. - Vol. 67. No 2. - P. 281-286.

65. Hirai, H. FISH mapping for helminth genome / H. Hirai, Y. Hirai. // Parasite Genomics Protocols. Methods in Molecular Biology. 2004. - Vol.270. - P.379-394.

66. Hirai, H. FISH techniques for constructing physical maps on Schistosoma chromosomes / H. Hirai, P.T. LoVerde // Parasitology Today. 1995. - 11(8). - P.310-314.

67. Hirai, H. Identification of the telomeres on Schistosoma mansoni chromosomes by FISH / H. Hirai, P.T. LoVerde // J Parasitol. 1996. - 82. - P. 511-512.

68. Hirai, H. C-banding analysis of six species of lung flukes, Paragonimus spp. (Trematoda: Platyhelminthes), from Japan and Korea / H. Hirai, Y. Sakaguchi, S. Habe, H.T. Imai // Z. Parasitenkd. 1985. - 71 - P.617-629.

69. Hirai, H. C-band polymorphism in a Japanese lung fluke Paragonimus ohirai (Trematoda; Platyhelminthes) / H. Hirai, Y. Sakaguchi, H.T. Imai // Heredity. 1981. - 47(2). - P. 249-252.

70. Hirai, H. Schistosoma mansoni: chromosomal localization of DNA repeat elements by in situ hybridization using biotinylated DNA probes / H. Hirai, L.D. Spotilla, P.T. LoVerde // Exp. Parasitol. 1989. - 69(2). - P. 175-188.

71. Hirai, H. Schistosoma mansoni: Chromosomal localization of female-specific genes and a female-specific DNA element / H. Hirai, M. Tanaka, P.T. LoVerde // Exp. Parasitol. 1993. - 76. - P. 175-181.

72. Hortvath, J.E. Lessons from the human genome transitions between euchromatin and heterochromatin / J.E. Hortvath, J.A. Bailey, D.P. Locke, E.E. Eichler // Human Molecular Genetics. 2011. - Vol. 10. No.20. - P. 2215-2223.

73. Howell, W.M. Visualization of ribosomal gene activity: silver stains proteins associated with rRNA transcribed from oocyte chromosomes / W.M. Howell // Chromosoma (Berl.). 1977. - 62. - P. 361-367.

74. Howell, W.M. Controlled silver staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method / W.M. Howell, D.A. Black // Experientia. 1980. 36. P. 1014-1015.

75. Hozier, J. Preparative in situ hybridization: selection of chromosome region-specific libraries on mitotic chromosomes / J. Hozier et al. // Genomics. 1994. - 19. - P. 441-447.

76. Ijdo, J.W. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR / J.W. Ijdo, R.A. Wells, A. Baldini, S.T. Reeders // Nucleic Acids Res. 1991. - 19(17): 4780.

77. International Agency for Research on Cancer. Biological agents (Opisthorchis viverrini and Clonorchis sinensis). IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. 2011. - 100B. - P. 342-370.

78. International Agency for Research on Cancer. Infection with liver flukes {Opisthorchis viverrini, Opisthorchis felineus and Clonorchis sinensis). IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans. 1994. - Vol. 61. - P. 121-175.

79. Janes, D.E. Genome evolution in Reptilia, the sister group of Mammals / D.E. Janes et al. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010. - 11. - P.239-264.

80. Jankun, M. Ribosomal genes in Coregonid fishes (Coregonus lavaretus, C. albula and C. peled) (Salmonidae): single and multiple nucleolus organizer regions / M. Jankun et al. // Heredity. 2001. - 87, - P. 672-679.

81. Jauch, A. Reconstruction of genomic rearrangements in great apes and gibbons by chromosome painting / A. Jauch, J. Wienberg, R. Stanyon, N. Arnold, S. Tofaneli, T. Ishida, T. Cremer // Proc Natl Acad Sci USA. 1992. - Vol. 89. - P. 8611-8615.

82. Joffe, B.I. Ordered arrangement and rearrangement of chromosomes during spermatogenesis in two species of planarians (Platyhelminthes) / B.I. Joffe, I.V. Solovei, H.C.Macgregor // Chromosoma. 1998. - 107. - P. 173-183.

83. Johnson, D.A. Genomes and genomics of parasitic flatworms / D.A. Johnson // Parasitic flatworms: molecular biology, biochemistry, immunology and physiology (edit. By Maule A.G. and Marks N.J.). CAB International. 2006. - P.37-81.

84. Kaewkes, S. Taxonomy and biology of liver flukes / S. Kaewkes // Acta Tropica. 2003.- 88. -P.177-186.

85. Kaewkong, W. Chromosomes and karyotype analysis of a liver fluke, Opistorchis viverrini, by scanning electron microscopy / W. Kaewkong et al. // Parasitol Int. -2012.-61(3).-P. 504-507.

86. Kang, S. Molecular identification and phylogenetic analysis of nuclear rDNA sequences among three opisthorchiid liver fluke species (Opisthorchiidae: Trematoda) / S. Kang et al. // Parasitol Int. 2008. - 57. - P. 191-197.

87. Karpenko, S.V. Characteristics of opisthorchiasis foci in southern West Siberia / S.V. Karpenko et al. // Contemporary Problems of Ecology. 2008. - Vol. 1, No 5. - P. 517-521.

88. Katokhin, A.V. Assessment of the genetic distinctions of Opisthorchis felineus from O.viverrini and Clonorchis sinensis by ITS2 and COI sequences / A.V. Katokhin et al. // Dokl Biochem Biophys. 2008. - 421. - P.214-217.

89. Keiser, J. Emerging food-borne trematodiases / J. Keiser, J. Utzinger // Emerg Infect Dis. 2005. - 11. - P.1507-1514.

90. Keiser, J. Food-borne Trematodiasis / J. Keiser, J. Utzinger // Clinical Microbiology Reviews. 2009. - Vol. 22, No. 3. - P. 466-483.

91. King, M. Regularities and restrictions governing C-band variation in acridoid grasshoppers / M. King, B. John // Chromosoma (Berlin). 1980. - 76(2). - P. 123150.

92. King, S. Trematodes of the family Opisthorchiidae / S. King, T. Scholz // The Korean Journal of Parasitology. 2001. - 39(3). - P.209-221.

93. Komalamisra, C. Chromosomes and C-banding of Opisthorchis viverrini / C. Komalamisra // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1999. - 30(3). - P.576-579.

94. Komalamisra, C. Chromosomes and chromosome breakage in the lung fluke, Paragonimus heterotremus / C. Komalamisra // J Trop Med Parasitol. 2005. - 28. -P. 69-72.

95. La Rue, G.R. Host-parasitic relations among the digenetic trematodes / G.R. La Rue // J Parasitol. 1951. - 37(4). - P.333-342.

96. Leksomboon, R. Organization of the nervous system in Opisthorchis viverrini investigated by histochemical and immunohistochemical study / R. Leksomboon et al. // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 107-11.

97. Levan, A. Nomenclature for centromeric position on chromosomes / A. Levan, K. Fredga, A.A. Sandberg // Hereditas. 1964. - 52(2). - P.

98. Lichter, P. Delineation of individual human chromosomes in metaphase and interphase cells by in situ suppression hybridization using recombinant DNA libraries / P. Lichter et al. // Hun Genet. 1988. - 80. - P. 224-234.

99. Lim, J.H. Liver flukes: the malady neglected / J.H. Lim // Korean J Radiol. 2011. - 12(3). - P. 269-279.

100. Lim, J.H. Biliary parasitic diseases including Clonorchiasis, opisthorchiasis and fascioliasis / J.H. Lim, E. Mairiang, G.H. Ahn // Abdom Imaging. 2008. - 33. - P. 157-165.

101. LoVerde, P,T. Chromosomes of two species of Paragonimus / P.T. LoVerde // Trans. Amer. Micr. Soc. 1979. - Vol.98. No 2. - P.280-285.

102. Lum, Z.-R. Clonorchiasis: a key foodborne zoonosis in China / Z.-R. Lum et al. // THE LANCET Infectious Diseases. 2005. - Vol. 5. Issue 1. - P. 31-41.

103. Matsui, S. Differential staining of nucleolus organizers in mammalian chromosomes / S. Matsui, M. Sasaki // Nature. 1973. - 246. - P. 148-150.

104. Meyne, J. Conservation of the human telomere sequence (TTAGGG)n among vertebrates / J. Meyne, R.L. Ratliff, R.K. Moyzis // Proc Natl Acad Sei USA. 1989. -86. - P. 7049-7053.

105. Mordvinov, V.A. Opisthorchis felineus and Metorchis bilis are the main agents of liver fluke infection of humans in Russia / V.A. Mordvinov, N.I. Yurlova, L.M. Ogorodova, AN. Katokhin // Parasitology International. 2012. - 61(1). - P. 25-31.

106. Multani, A.S. Heterochromatin and interstitial telomeric DNA homology / A.S. Multani et al. // Chromosoma. 2001. - 110. - P. 214-230.

107. Murphy, M.J. Phylogenetic relationships of African killiflshes in the genera Aphylosemion and Fundulopanchax inferred from mitochondrial DNA segments / M.J. Murphy, G.E. Collier // Mol Phylogenetics and Evolution. 1999. - 11(3). - P. 351-360.

108. Murrel, K.D. Food-borne zoonoses: fish and plant-borne parasites / K.D. Murrel, B. Fried // Springer. 2007. - Vol. 11. - 429 p.

109. Mutafova, T. Karyological studies on some species of the families Echinostomatidae and Plagiorchiidae and aspects of chromosome evolution in trematodes / T. Mutafova // Systematic Parasitology. 1994. - 28. - P. 229-238.

110. Nanda, I. Distribution of telomeric (TTAGGG)n sequences in avian chromosomes /1. Nanda et al. // Chromosoma. 2002. - 111. - P. 215-227.

111. Nerurkar, P.V. Methoxyresorufin and benzyloxyresorufin: substrates preferentially metabolizaed by cytochromes P4501A2 and 2B, respectively, in the rat and mouse / P.V. Nerurkar et al. // Biochem Pharmacol. 1993. - 46(5). - P. 933-943.

112. Olson, P.D. Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda) / P.D. Olson, T.H. Cribb, V.V. Tkach, R.A. Bray, D.T.J. Littlewood // Int J of Parasitology. 2003. - 33. - P.733-755.

113. Paddock, S. Optical sectioning slices of life / S. Paddock // Science. - 2002. -295.-P. 1319-1321.

114. Paddock, S. Over the rainbow: 25 years of confocal imaging / S. Paddock // BioTechnologies. 2008. - 44. P. 643-648.

115. Park, G.-M. Chromosomes of the liver fluke, Clonorchis sinensis. / G.-M. Park, K. Im, S. Huh, T.-S. Yong // The Korean J Parasitology. 2000. - Vol. 38. No. 3. - P. 201-206.

116. Park, G.-B. Geographical variation of the liver fluke, Clonorchis sinensis, from Korea and Chine based on the karyotypes, zymodeme and DNA sequences / G.-B. Park, T.-S. Yong // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 2001. - 32(2). - P. 12-17.

117. Pinkel, D. Cytogenetic analysis using quantitative high sensitivity fluorescence hybridization / D. Pinkel, T. Straume, J.W. Gray // Proc Natl Acad Sci USA. 1986. -V.83. - P.2934-2938.

118. Polyakov, A.V. Comparative analysis of karyotypes of Opisthorchis felineus from West Siberia / A.V. Polyakov et al. // Contemporary Problems of Ecology. 2010. -Vol.3, Nol. - P. 1-3.

119. Popescu, N.C. Heterogeneity of constitutive heterochromatin in somatic Syrian hamster chromosomes / N.C. Popescu, J.A. DiPaolo // Cytogenet Cell Genet. 1979. -24(1).-P. 53-60.

120. Preuksaraj, S. Public health aspects of opisthorchiasis in Thailand / S. Preuksaraj // Drugs Res. 1984.-34.-P.l 119-1120.

121. Reeves, A. MicroMeasure: a new computer program for the collection and analysis of cytogenetic data / A. Reeves // Genome. 2001. - 44(3). - P. 439-443.

122. Richard, F. Reconstruction of the ancestral karyotype of eutherian mammals / F. Richard, M. Lombard, B. Dutrillaux // Chromosome Research. 2003. - 11(6). - P. 605-618.

123. Rim, H.J. The current pathobiology and chemotherapy of clonorchiasis / H.J. Rim Kisaengchunghak Chapchi 24 (suppl). 1986. - 1-141.

124. Rim, H.J. Clonorchiasis: an update / H.J. Rim // J Helminthol. 2005. - 79(3). - P. 269-281.

125. Roosen-Rung, E. C. The process of spermatogenesis in animals / E. C. Roosen-Rung // Cambridge University Press. USA. 1977. - 217 p.

126. Rubtsov, N.B. Zoo-FISH with region-specific paints for mink chromosome 5q: delineation of inter- and intrachromosomal rearrangements in human, pig, and fox / N.B. Rubtsov et al. // Cytogenet Cell Genet. 2000. - 90(3-4). - P. 268-70.

127. Rubtsov, N. A new simple version of chromosome microdissection tested by probe generation for 24-multi-color FISH, multi-color banding (MCB), ZOO-FISH and in clinical diagnostics /N. Rubtsov et al. // Medgen. 2000. - V. 12. - 65.

128. Ruvinsky, A. Mammalian Genomics / A. Ruvinsky, J.A.M. Graves // CAB International UK. 2005. - P. 23-67.

129. Sato, H. Functional visualization of the excretory system of adult Schistosoma mansoni by fluorescent marker resofurin / H. Sato, J.R. Kusel, J. Thornhill // Parasitology. 2002. - 125(6). - P. 527-535.

130. Schell, J.J. Fish chromosome and their evolution / J.J. Schell // Interval Report of Denmark Akavarium Charlottenlund, Denmark. 1973.

131. Scherthan, H. Comparative chromosome painting discloses homologous segments in distantly related mammals / H. Scherthan et al. // Nature Genetics. 1994. - Vol. 6. - P. 342-347.

132. Schmid, M. Evolutionary conservation of a common pattern of activity of nucleolus organizers during spermatogenesis in vertebrates / M. Schmid, C. Loser, J. Schmidtke, W. Engel // Chromosoma (Berl). 1982. - 86. - P. 149-179.

133. Schmid, M. Silver staining of nucleolus organizer regions during human spermatogenesis / M. Schmid, Hj. Muller, S. Stasch, W. Engel // Hum Genet. 1983. -64.-P. 363-370.

134. Scholz, T. Family Opisthorchiidae Looss, 1899 / T. Scholz // Keys to the Trematoda (edit, by R.A. Bray et al). Natural History Museum. London. 2008. -Vol.3.-P. 9-51.

135. Senger, G. Multicolor-FISH the identification of chromosome aberrations by 24 colors / G. Senger, I. Chudoba, A. Plesch // Bioforum. - 1998. -N 9. - P.499-503.

136. Shekhovtsov, S.V. A novel nuclear marker, Pm-int9, for phylogenetic studies of Opistorchis felineus, Opisthorchis viverrini, and Clonorchis sinensis (Opisthorchiidae, Trematoda) / S.V. Shekhovtsov et al. // Parasitol Res. 2009. -106. -P.293-297.

137. Short, R.B. Conventional Giemsa and C-banded karyotypes of Schistosoma mansoni and S. rodhaini / R.B. Short, A.I. Grossman // J Parasitol. 1981. - 67. - P. 661-671.

138. Short, R.B. Conventional Giemsa-stained and C-banded chromosomes of seven strains of Schistosoma mansoni / R.B. Short, J.D. Liberatos, W.H. Teehant, J.I. Bruce //J Parasitol. 1989. - 75(6). - P.920-926.

139. Sithithaworn, P. C. Liver Flukes / P. Sithithaworn, P. Yongvanit, S. Tesana, C. Pairojkul // Food-borne parasitic zoonoses: fish and plant-borne parasites. Springer. -2007. -P.3-53.

140. Slijepcevic, P. Telomeres and mechanisms of Robertsonian fusion / P. Slijepcevic // Chromosoma. 1998. - 107. - P. 136-140.

141. Smyth, J.D. The physiology of trematodes / J.D. Smyth, D.W. Halton // Cambridge University Press. 2d edition. 1986. - 446 p.

142. Spakulova, M. Current knowledge on B chromosomes in natural populations of helminth parasites: a review / M. Spakulova, J.C. Casanova // Cytogenet Genome Res. 2004. - 106. - P. 222-229.

143. Spakulova, M. Cytogenetics and chromosomes of tapeworms (Platyhelminthes, Cestoda) / M. Spakulova, M. Orosova, J.S. Mackiewicz // Adv. Parasitol. 2011. -74.-P. 177-230.

144. Sripa, B. Liver fluke induces cholangiocarcinoma / B. Sripa et al. // PLoS Med. -2007.-4(7): e201.

145. Sripa, B. Cholangiocarcinoma: lesssons from Thailand / B. Sripa, C. Pairojkul // Opin Gastroenterol. 2008. - 24. - P. 349-356.

146. Sugiyama, H. Karyotypic findings of the lung fluke, Paragonimus westermani (Kerbert, 1878), in the Uda area of Nara Prefecture, Japan / H. Sugiyama et al. // Jpn J Vet Sci. 1985. - 47(6). - P.889-893.

147. Sumner, A.T. A simple technique for demonstrating centromeric heterochromatin / A.T. Sumner // Exp. Cell. Res. 1972. - 75. - P. 304-306.

148. Sumner, A.T. Chromosome banding and identification absorption staining / A.T. Sumner // Methods in Molecular Biology: Chromosome Analysis Protocols. 1994. -Vol. 29. - P.59-81.

149. Sumner, A.T. Chromosomes: organization and function / A.T. Sumner. Blackwell Science Ltd. 2003. - 287 p.

150. Taguchi, T. DNA probes for identifying chromosomes 5, 6, and 7 of Schistosoma mansoni / T. Taguchi et al. // J Parasitol. 2007. - 93(3). - P. 724-726.

151. Terasaki, K. Morphological comparisons and hypotheses on the origin of polyploids in parthenogenetic Fasciola sp. / K. Terasaki, Y. Noda, T. Shibahara, T. Itagaki // J of Parasitology. 2000. - Vol. 86. No. 4. - P. 724-729

152. Trask, B. Human cytogenetics: 46 chromosomes, 46 years and counting / B. Trask // Nature Reviews. 2002. - 3. - P. 769-778.

153. Tselepatiotis, E. A case of Opisthorchis felineus infestation in a pilot from Greece / E. Tselepatiotis et al. // Infection. 2003. - Vol. 31. No. 6. - P. 430-432.

154. Volobujev, V.T. B-chromosomes system of the mammals / V.T. Volobujev // Caryologia. 1981. - 34. - P. 1-23.

155. Voltolin, T. Origin and molecular organization of supernumerary chromosomes of Prochilodus lineatus (Characiformes, Prochilodontidae) obtained by DNA probes / T. Voltolin et al. // Genetica. 2010. - 138. - P.l 133-1139.

156. Voss, S.R. Origin of amphibian and avian chromosomes by fission, fusion, and retention of ancestral chromosomes / S.R. Voss et al. // Genome Research. 2011. -21. -P.1306-1312.

157. Wannaprapo, S. Morphological features of the testes of the adult liver fluke, Opisthorchis viverrini. / S. Wannaprapo et al. // Srinagarind Med J. 2008. - 23(4). -P. 346-352.

158. Weise, A. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions / A. Weise et al. //European Journal of Human Genetics. 2010. - 18. - P.457-462.

159. WHO. Control of foodborne trematode infections. Report of a WHO study group. WHO Tech. Rep. Ser. 1995. - 849. - P. 1-157.

160. Wienberg, J. The origin of human chromosome 2 analyzed by comparative chromosome mapping with a DNA microlibrary / J. Wienberg et al. // Chromosome Research. 1994. - 2. - P.405-410.

161. Wienberg, J. Molecular cytotaxonomy of primates by chromosomal in situ suppression hybridization / J. Wienberg, A. Jauch, R. Stanyon, T. Cremer // Genomics. 1990. - 8. - P. 347-350.

162. Wienberg, J. Homologies in human and Macaca fuscata chromosomes revealed by in situ suppression hybridization with human chromosome specific DNA libraries / J. Wienberg, R. Stanyon, A. Jauch, T. Cremer // Chromosoma. 1992. - 101. - P. 265270.

163. Wykoff, D.E. Opisthorchis viverrini in Thailand the life cycle and comparison with O. felineus / D.E. Wykoff, C. Harinasuta, P. Juttijudata, M.M. Winn // J Parasitology. - 1965. - Vol. 51. No. 2. - P. 207-214.

164. Zadesenets, K.S. Distribution of repetitive DNA sequences in chromosomes of five opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae) / K.S. Zadesenets et al. // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 84-86.

165. Zadesenets, K.S. Comparative cytogenetics of opisthorchid species (Trematoda, Opisthorchiidae) / K.S. Zadesenets, A.V. Katokhin, V.A. Mordvinov, N.B. Rubtsov // Parasitol Int. 2012. - 61(1). - P. 87-89.

Информация о работе

Задесенец, Кира Сергеевна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Структурно-функциональная организация хромосом описторхид - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы