Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Геномная вариабельность трематод (Trematoda) на стадии промежуточного хозяина - моллюска

ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Геномная вариабельность трематод (Trematoda) на стадии промежуточного хозяина - моллюска"

На правах рукописи УДК 577.21

КОРСУНЕНКО АННА ВЛАДИМИРОВНА

ГЕНОМНАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ТРЕМАТОД (ТКЕМЛ ГООА) НА СТАДИИ ПРОМЕЖУТОЧНОГО ХОЗЯИНА - МОЛЛЮСКА

03.01.07 - молекулярная генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

-3 ДЕКМ

Москва 2010

004616235

Работа выполнена в лаборатории организации генома Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Семенова Серафима Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чуриков Николай Андреевич кандидат биологических наук Симонова Ольга Борисовна

Ведущая организация: кафедра молекулярной биологии Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова

Зашита диссертации состоится «$/» декабря 2010 года, в часов на заседании диссертационного совета Д 002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН по адресу: 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991 Москва, ул. Вавилова, д. 32.

Автореферат разослан «¡¿Р» ноября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук ^^^^^ .С. Грабовская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Совершенствование молскулярно-биологических и генио-иижеиерных методов, а такх<с наличие вычислительных алгоритмов, позволяющих обрабатывать объемные базы данных, определяет интенсивное развитие одного из современных направлений биологии, а именно геномики. Она изучает общие принципы построения геномов, а также особенности их структурно-функциональной организации в группах различного таксономического ранга. Эволюционный подход постепенно становится основным приемом для определения функций отдельных генов и их взаимодействия в пределах генома. Он позволяет предсказывать и идентифицировать функционально важные области генов, а также проследить за формированием элементов «непостоянства» генома. Методы геномики и биоинформатики все чаще используют для выяснения общих закономерностей эволюции организмов, происхождения генетического полиморфизма и биоразнообразия.

Изучение геномов паразитических червей представляет актуальную фундаментальную задачу. Класс Трематоды, или Дигенетичсскис сосальщики (Platyhclminthes: Trcmatoda) является одной из наиболее интересных групп паразитических червей. Она объединяет более 18000 видов (свыше 140 семейств) паразитов беспозвоночных и позвоночных животных, населяющих наземные и водные экосистемы [Скрябин, 1948; Gibson et al., 2002]. Трематоды отличаются от остальных червей наличием сложного жизненного цикла, связанного со сменой животных-хозяев и чередованием нескольких последовательных партеногенетичсских и одного гермафродитного поколения. Все трематоды - эндопаразиты, обитающие во взрослом состоянии во внутренних органах позвоночных животных и человека, которые являются их дефинитивными (окончательными) хозяевами. Роль первого промежуточного хозяина всегда выполняют разные виды моллюсков, в теле которых сформировавшийся из оплодотворенной яйцеклетки мирацидий претерпевает регрессивный метаморфоз и даст начало первому партсногснстическому поколению - материнской спороциете. В результате диплоидного партеногенеза в материнской спороцисте формируется следующее партсногенетическое поколение (партениты) - дочерние спороцисты или редин. Партеииты дают начало церкариям -свободноплавающим личинкам, которые выполняют рассслительную функцию. В конечном итоге, цикл завершается в организме окончательного хозяина, где развиваются половозрелые черви-мариты [Скрябин, 1948; Гинсцинская и Галактионов, 1978].

Ранее считалось, что партсногенетическое потомство трематод (церкарии), представляет собой совокупность генетически однородных особей (клон). Однако с

помощью различных молскулярно-генетических маркеров у некоторых представителей трематод зарегистрировано наличие клональной генетической изменчивости. Так, например, в результате экспериментального заражения моллюсков Biomphalaria glabrata единичными мирацидиями Schistosoma mansoni обнаружена генетическая неоднородность церкарий из одной и той же спороцисты, а также различия между дочерними спороцистами, связанные с неравномерным распределением повторов W1 и W2. Предполагается, что в основе выявленной клональной изменчивости лежит механизм митотичсской рекомбинации [Grevelding, 1999; Bayne and Grcvelding, 2003].

Трематоды до сих пор остаются малоизученными с точки зрения структурной организации и эволюции генома. Только в 2009 г. были расшифрованы полные последовательности ядерных геномов двух представителей данного класса - возбудителей шистосоматоза человека S. mansoni и S. japonicum [Bcrriman et al., 2009; Liu et al., 2009]. Показано, что геномы этих паразитов имеют ряд особенностей. Например, по сравнению с геномами других беспозвоночных они имеют относительно большой размер и низкую частоту генов, а длина интронов может значительно варьировать в пределах одного гена. Кроме того, показано, что в протсоме S. japonicum отсутствует около 4000 белковых доменов, характерных для других многоклеточных организмов. Предполагается, что утрата около 1000 из этих доменов может быть отчасти обусловлена приспособлением к паразитическому образу жизни. Свыше трети генома шистосом млекопитающих составляют повторяющиеся последовательности, представленные тандемными и рассеянными повторами, а также мобильными элементами, преимущественно ретротранспозонами.

Помимо фундаментального значения исследование структурной организации генома трематод может иметь практическое приложение в медицине и сельском хозяйстве при разработке экспресс-методов генотипирования возбудителей заболеваний человека и животных, а также для создания нового поколения лекарств и усовершенствования вакцин.

Целью данной работы является исследование геномной вариабельности партеногенетического потомства (церкарий) различных видов трематод, выявленной с помощью RAPD-маркеров.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить клональную RAPD-изменчивость церкарий отдельных видов в группах спороцистоидных и редиоидных трематод;

2. На примере двух видов трематод (Bucephalus polymorphic и Trichobilharzia szidati) оценить уровни и распределение внутривидовой RAPD-изменчивости церкарий;

3. С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировать, затем клонировать и ееквенировать RAPDs отдельных представителей спороцистоидных и редиоидных трематод;

4. На основании полученных последовательностей разработать локус-спсцифичные праймеры и использовать наборы этих пранмеров для амплификации новых последовательностей генома трематод;

5. Выявить структурные особенности полученных последовательностей: определить AT/GC-содержанпе, провести поиск повторов, а также поиск гомологии с известными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями шистосом млекопитающих mansoni, S. japonicum) из GenBank;

6. Разработать молскулярно-диагностичсскую систему, пригодную для детекции птичьих шистосом (возбудителей церкариалыюго дерматита человека) на стадии промежуточного хозяина - моллюска.

Научная новизна и практическое значение работы. С помощью мультнлокуспых маркеров (RAPDs) впервые выявлено наличие клональной генетической изменчивости церкарий 10 видов трематод, относящихся к 9 семействам (Notocotylidae, Halipegidae, Echinostomatidac, Schistosomatidae, Strigeidae, Gorgodcridac, Bucephalidac, Diplostomatidae, Plagiorchiidae). На примере двух видов (Bucephalus polymorphus, Trichobilharzia szidati) впервые показана пригодность предложенных RAPD-маркеров для выявления популяционной структуры на уровне партеногенетического потомства трематод. Впервые выделены неизвестные ранее последовательности ядерного генома четырех видов трематод (Trichobilharzia franki, Т. szidati, Bilharziella polonica, Echinoparyphium aconiatum), гомологичные ретроэлементам шистосом млекопитающих (S. mansoni, S. japonicum). Ha основе одной из полученных последовательностей разработана новая молекулярно-диагностическая система для детекции птичьих шистосом из рода Trichobilharzia на стадии промежуточного хозяина - моллюска. Данная система пригодна для мониторинга природных очагов возбудителей церкариального дерматита человека.

Результаты работы могут быть использованы при создании новых генных тест-систем для видовой диагностики трематод, а также поиска генов устойчивости к действию антигсльминтных препаратов. Они могут найти свое применение при разработке медико-ветеринарных программ в соответствующих учреждениях РАН и РАСХН, таких как Центр паразитологии ИПЭЭ РАН, Всероссийский Институт гельминтологии им. К.И. Скрябина, ветеринарных академиях, институтах, факультетах и других учреждениях медико-ветеринарного профиля.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на II межрегиональной конференции «Паразитологичсские исследования в Сибири и на Дальнем Востоке» (Новосибирск, 15-20 сентября 2005 г.), международной конференции «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» (Москва, 19-21 апреля 2006 г.), международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 28 июня-2 июля 2006 г.), 11-ом международном конгрессе по паразитологии (Scotland, Glasgow, 6-11 августа 2006 г.), международной конференции «The Biology of Genomes» (USA, Cold Spring Harbor, 8-12 мая 2007 г.), международной конференции «Вычислительная филогенетика и систематика» (Москва, 16-19 ноября 2007 г.), 10-ом европейском мультиколлоквиуме по паразитологии (France, Paris, 24-28 августа 2008 г.), международной конференции «Биоразнообразис и экология паразитов наземных и водных ценозов» (Москва, 9-11 декабря

2008 г.), V съезде Вавиловского Общества генетиков и селекционеров (Москва, 21-28 июня

2009 г.), международной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии» (Москва, 30 ноября-3 декабря 2010 г.), а также межлабораторном семинаре ИБГ РАН (25 октября 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 работ, в том числе, 3

статьи.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах и

состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, включающего

¿Of

наименований, а также приложения ( страниц). Работа содержит <j таблиц и fj рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы препараты ДНК зрелых свободноплавающих церкарий трематод, а также церкарий из спороцист и редий, паразитирующих в природных популяциях моллюсков из водоемов г. Москвы, Ярославской и Новосибирской обл., а также Белоруссии. Всего исследовано свыше 1000 церкарий 13 видов из 9 семейств трематод, собранных из 33 инфицированных пресноводных моллюсков 9 видов из 4 семейств.

Основными методами, использованными в работе, являются ПЦР со случайными (RAPD-фингерпринтинг) и локус-специфичными праймерами, клонирование и секвенирование ДНК, а также биоинформатический анализ данных с помощью алгоритмов поиска гомологии BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.pov). Поиск повторов в последовательностях проводили с использованием программ Tandem Repeat Finder, Inverted

Repeat Finder и Spectral Repeat Finder. Построение дендрограмм генетических различий (GD.y), расчет стандартных индексов популяционно-гснстичсского разнообразия (Р и Г), иерархическое разложение дисперсии (AMOVA) выполняли с помощью программ TREECON for Windows, POPGENE ver. 1.32 и ARLEQUIN ver 3.11 соответственно.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследование RAPD-изменчивости партеногенетичсского потомства у представителей различных семейств трематод 1.1. Клональная изменчивость спороцистоидных и редиоидных трематод

Метод мультилокусного RAPD-фингсрпринтинга применяли для выявления генетической изменчивости партсногснстичсского потомства (церкарий) трематод. Для каждого из изученных видов исследовали отдельных, единичных церкарий, выделенных из партснит - дочерних спороцист или родий, паразитирующих в организме одного моллюска-хозяина. При сравнении церкарий внутри отдельных партснит мы использовали термин «клональная изменчивость». Совокупность свободноплавающих или незрелых церкарий из всех партснит моллюска-хозяина мы называли инфрапопуляцией.

Шесть случайных дссятичлснных праймеров (OPAOl, OPAÜ9, ОРАЮ, ОРАН, ОРА17, Р29) были использованы для выявления вариабельности партеногенетичсского потомства 10 видов трематод, объединенных на основании морфологии партснит (спороцисты или редии) в две группы: спороцистоидныс (семейства Schistosomatidac, Strigeidae, Gorgodcridae, Buccphalidac, Diplostomatidae, Plagiorchiidae) и редиоидные (семейства Notocotylidae, Halipcgidae, Echinostomatidae). Примеры RAPD-спсктров церкарий спороцистоидных (Т. szidatí) и редиоидных (Halipegus sp.) трематод, полученные с помощью праймеров Р29 и ОРА17, представлены на рис. 1.

В табл. 1 приведены обобщенные оценки клональной изменчивости церкарий 6 видов спороцистоидных и 4 видов редиоидных трематод, полученные на основании анализа 397 церкарий из 36 спороцист и 40 редий. Показателем изменчивости трематод каждого вида являлось среднее значение доли полиморфных локусов, выявляемых при использовании одного праймера для церкарий из одной партениты (спороцисты или редии) - Р. Оказалось, что наибольшие значения данного показателя (24.5-29.4%) характерны для спороцистоидных трематод из 4 семейств: Schistosomatidae, Buccphalidac, Diplostomatidae, Plagiorchiidae. Для представителей семейств Gorgoderidae и Strigeidae выявлен более низкий уровень клональной изменчивости (17.8% и 7.5% соответственно). Несмотря на использование большого числа праймеров между церкариями редиоидных трематод (Notocotylidae,

Halipcgidac и ЕсЫпс^отайёае) зарегистрирована незначительная изменчивость, варьировавшая в пределах 5.2-6.5%. При сравнении двух групп трематод оказалось, что уровень клональной изменчивости у спороцистоидных форм (22.5%) почти в 4 раза выше, чем у редиоидных трематод (6.2%).

спц 2 спц3

~7 8 9 1041 12 13 14 15 16 17

ред 1 рей 2 рея 3

!л -т---: ---- WO»

tr- ч* W ШШ

a) Trichobilharzia szidati (Schistosomatidae). Праймср P29

6) Halipegiis sp. (Halipegidae). Праймср OPA 17

Рисунок 1. Примеры RAPD-спсктров церкарий спороцистоидных (а) и редиоидных (б) трематод. Обозначения: спц - спороциста; ред - редия; М - маркер молекулярных масс (100 bp Ladder).

Таблица 1. Оценки клональной генетической изменчивости церкарий редиоидных и спороцистоидных трематод.

Семейство: вид трематод Вид моллюска-хозяина Тип и число партенит Число исследованных церкарий Число прайме-ров Р, (%)

Schistosomatidae: Trichobilharzia szidati Lymnaea stagnalis 9 спц 43 2 29.4

Diplostomatidae: Dipiostomum chromatophorum Lymnaea stagnalis 5 спц 32 3 27.9

Bucephalidae: Bucephalus polymorphus Dreissena polymorpha 4 спц 30 3 27.6

Plagiorchiidae: Plaqiorchis mutationis Lymnaea palustris 6 спц 31 3 24.5

Gorgoderidae: Phyllodistomum folium Dreissena polymorpha 5 спц 31 3 17.8

Strigeidae: Apatemon sp. Lymnaea stagnalis 7 спц 34 3 7.5

Halipegidae: Halipegus sp. Planorbis planorbis 7 ред 41 4 6.5

Notocotylidae: Notocotylus imbricatus Opistorchophorus troscheli 9 ред 51 6 6.5

Echinostomatidae: Echinoparyphium recurvatum, Echinoparyphium aconiatum Lymnaea tumida Lymnaea palustris 12 ред 12 ред 52 52 8 8 6.4 5.2

Морфотипы: Спороцистоидные Редиоидные 36 спц 40 ред 201 196 2-3 4-8 22.5 6.2

Обозначения: спц - спороциста; ред - редия; Р - среднее значение доли полиморфных локусов, выявляемых при использовании одного праймера для церкарий из одной партениты.

1.2. Клепальная и популяционная изменчивость церкарий трематод Bucephalus polymorphus и Trichobilharzia szidati

Для двух представителей спороцистоидных трематод мы оценили уровни и распределение внутривидовой RAPD-изменчивости церкарий. С этой целью были исследованы 37 церкарий из 9 спороцист Bucephalus polymorphus (Bucephalidae), выделенных из трех моллюсков Dreissena polvmorpha, собранных в двух водохранилищах Волжского бассейна: Рыбинском (плесы Коприно, Молога) и Горьковском. Кроме того, мы исследовали 7 инфрапопуляций зрелых свободноплавающих церкарий (п=39) птичьей шистосомы Т. szidati из трех популяций: московские пруды в Алтуфьево и Олимпийской деревне, а также бассейн р. Каргат в Новосибирской области.

Для выявления изменчивости каждого из видов использовали по три случайных праймера: ОРА09, OPAOl, Р29 (для В. polymorphus) и ОРА09, OPAIO, Р29 (для Т. szidati). На основании суммарных RAPD-спектров для каждого вида была построена UPGMA-дендрограмма генетических различий (GDX)•), свидетельствующая о высокой внутривидовой изменчивости. Значения минимальных и максимальных различий для церкарий В. polymorphus из одной и той же спороцисты варьируют от 0.14 до 0.28, тогда как различия между церкариями в пределах моллюска составили 0.14-0.39 (РК), 0.15-0.36 (РМ) и 0.12-0.38 (Г) (рис. 2). Внутрипопуляционные вариации показателя GD„. у Т. szidati оказались значительно выше (рис. 3). Так, различия между церкариями в пределах инфрапопуляций варьировали от 0.03 (Lsk2) до 0.62 (Lsm7). Между инфрапопуляциями РК и РМ выявлен практически такой же уровень различий (0.43), как и между популяциями церкарий В. polymorphus из Рыбинского и Горьковского водохранилищ (0.48). Различия между инфрапопуляциями Т. szidati в пределах популяций из Алтуфьево и Олимпийской деревни составили 0.21-0.64 и 0.14-0.69 соответственно. В то же время, различия между двумя популяциями (0.74) оказались сопоставимыми с различиями между московской и сибирской (Каргат) выборками (0.80).

На дендрограммах отдельные подкластеры, соответствующие инфрапопуляциям, образованы церкариями В. polymorphus из трех исследованных моллюсков - РК, РМ и Г (рис. 2), а также церкариями Т. szidati из инфрапопуляций Lsml, Lsm20, Lsm2, Lsm3, Lsm4, Lsk2 (рис. 3). Цсркарии из инфрапопуляции Lsm7 разделились на две группы и объединились с подкластером Lsml. Для трех изученных популяций Т. szidati из Алтуфьево (Lsml, Lsm7, Lsm20), Олимпийской деревни (Lsm2, Lsm3, Lsm4) и p. Каргат (Lsk2), а также рыбинской (РК, РМ) и горьковской (Г) популяций В. polymorphus выявлена надежная дифференциация.

0.5 0.1 0-7 U J о.)

Рисунок 2. Дендрограмма гснстичсских различий (GDмежду церкариями из 9 спороцист Bucephalus polymorphic, выделенных из трех моллюсков DreLisena polymorpha, собранных в Рыбинском (Молога - РМ, Коприно - РК) и Горьковском (Г) водохранилищах. Церкарии из одних и тех же спороцист обозначены одинаковыми цифрами (от 1 до 9). Цифрами в точках ветвления отмечены значения (>50%) индекса бутстрепа (1000 реплик).

Численные значения коэффициентов генетической изменчивости (Р - доля полиморфных локусов; I — среднее генетическое разнообразие), полученные для церкарий двух видов, подтверждают наличие высокой внутривидовой гетерогенности и подразделенное™, выявленной в результате кластеризации на разных уровнях иерархии: внугри спороцист (В. polymorphus), внутри инфрапопуляций (В. polymorphic, Т. szidati), в пределах водоемов или популяций (В. polymorphus, Т. szidati), в суммарной выборке из нескольких популяций (В. polymorphus, Т. szidati).

ОЛ 0.7 0,6 05 14 03 0.2 0.1

ит20 Ьэтг

итз

Алтуфьево

Олимпийская деревня

Каргат

Рисунок 3. Дендрограмма генетических различий между зрелыми церкариями ТпсИоЬНИаша ¿гк/а«' из трех популяций: пруды Алтуфьево, Олимпийской деревни, бассейн р. Каргат. Обозначения: ЬвиЛ, 1лт7, Ь5т20, Ь5ш2, ЬэтЗ, Ь$т4, 1^к2 - инфрапопуляции церкарий; цифрами в точках ветвления обозначены значения (>50%) индекса бутстрспа (1000 реплик).

Анализ разложения генетического разнообразия (АМОУА), выполненный для церкарий двух видов, позволил получить статистически значимые оценки вклада в общее разнообразие каждого из соответствующих компонентов исследуемой иерархической системы. Анализ церкарий В. ро^тогрИш показал, что различия между тремя моллюсками (инфрапопуляциями) составляют 23.5% от общего разнообразия, а остальные 76.5% распределены между церкариями внутри отдельных спороцист (53.0%) и между спороцистами в пределах моллюсков (23.5%). Наибольший вклад в общее разнообразие Т. $г1с1аИ вносит изменчивость церкарий внутри инфрапопуляций (48.9%). При переходе на следующие уровни (между инфрапопуляциями из одного водоема; между популяциями) вклад соответствующих компонентов в общее разнообразие уменьшается (32.3% и 18.8% соответственно).

Таким образом, ЯАРО-маркеры, предложенные нами, оказались пригодными для выявления популяционной структуры двух видов трематод на уровне партеногенетического потомства (церкарий): обнаружены генетические различия между церкариями в пределах популяций (внутри спороцист и инфрапопуляций; между инфрапопуляциями), а также между популяциями. При этом наибольший вклад (53.0%) во внутривидовое разнообразие

9

церкарий вносит клональная изменчивость - на уровне спороцист (В. ро1утогрЬш), тогда как межпопуляционные различия (Т. зг1с1аЧ) характеризуются минимальными значениями дисперсии (18.8%).

2. Характеристика вариабельных КА1Ч)>> из генома церкарий трематод Тг'юкоЪИЪаггга ьыАай, Т. /гапкг и ЕсЫпоригурЫшп асоЫшит

Для создания НАРР-клонотеки использованы два праймера (Р29 и ОРАЮ), которые давали наиболее высокие оценки клоналы-юй изменчивости у спороцистоидных трематод. С их помощью получены ЯАРВ-спектры единичных церкарий трех видов спороцистоидных (Т.

Т. /гапЫ) и редиоидных (Е. асотМтп) трематод. Для клонирования были отобраны отдельные полиморфные фрагменты из спектров единичных церкарий, а также фрагменты из спектров нескольких церкарий. В целом, из спектров незрелых, а также свободноплавающих церкарий Г. Т. /гапЫ и Е. асотаШт отобрано 28 стабильно воспроизводящихся

фрагментов (ампликонов) размером более 300 п.н. На рис. 4 в качестве примера приведено 10 фрагментов, выбранных для клонирования из 1Ъ\РО-спектров Т. полученных с

помощью праймера ОРАЮ.

М ОРАЮ

Рисунок 4. RAPD-спектры церкарий Trichobilharzia szidati, полученные с помощью случайного праймера ОРАЮ. Обозначения: Lsm7, Lsm20 - иифрапопуляции церкарий; рамкой выделены клонированные ампликоны (Tsl3-Ts22); М - маркер молекулярных масс (100 bp Ladder).

Для каждого клонированного RAPD-ампликона проведено секвенирование 1-2 клонов. В результате секвенирования 33 клонов получено 32 последовательности, отличающихся между собой.

С помощью алгоритмов BLAST (blastn, blastx) для полученных последовательностей был проведен поиск значимой гомологии с аннотированными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями шиетосом млекопитающих (S. mansoni, S. japonicum). В 12 последовательностях, размер которых составил 372-1505 п.н., обнаружено 14 регионов, гомологичных ретроэлементам S. mansoni, S. japonicum. В одной последовательности (Ts82-32) выявлено три региона, в остальных 11 последовательностях найдены единичные области гомологии. В целом, в 5 последовательностях T. szidati (Ts71-00, Ts74-83, Ts82-32, Ts85-90, Ts51-82) и одной последовательности T. franki (Tl'47-26) обнаружено 7 регионов, гомологичных nLTR-ретротранспозонам (LINE) филогенетической клады (линии) RTE: SjCIiGCS20 и SjR2 (n=5), a также SjCIIGCS19 и Perere-3 (n=2). Кроме того, в последовательности Ech004 Е. acoiiiatiim выявлен регион, гомологичный nLTR-ретротранспозону линии CR1 - Регеге-5. В другой последовательности Е. aconiatum (EchOÛl) выявлен регион, гомологичный LTR-ретротрапспозопу клады Gypsy/Ty3 - Saci-3. В двух последовательностях (TÍ48-00, Ts83-28), выделенных из геномов Т. franki и Т. szidati, найдены регионы, гомологичные LTR-ретротранспозонам клады BEL - SjCHGCSlö и Saci-¡ (п=2). В двух других последовательностях Т. franki (TÍ98-00) и Т. szidati (Ts82-32), выявлены единичные регионы, гомологичные Penelope-подобным элементам - Регеге-10 и SjPenelope-2 соответственно. Для всех перечисленных выше 13 регионов выявлена гомология (на аминокислотном уровне) с геном pol. В одной последовательности (Ts47-78) найден участок размером 55 п.н., гомологичный некодирующей области nLTR-ретротранспозона Рсгегс-3. Многие регионы имели в кодирующей области стои-кодоны, инсерции/делещш кодонов, а также сдвиги рамки считывания. Размер участков гомологии варьировал от 35 до 459 п.н., а уровень сходства - от 25 до 80%. Наиболее сложная структура выявлена в последовательности Ts82-32 (рис 5). В ней идентифицировано четыре участка, два из которых (I, II) составляют регион, имеющий гомологию с Регеге-3. В данном регионе выявлен сдвиг рамки считывания. Два других участка (III, IV), расположенных ближе к 3-концу, оказались гомологичными SjPenelope-2 и SjCHGCS20 соответственно.

Поиск повторов, выполненный для 12 исследованных RAPDs, показал наличие в их составе тандемных и рассеянных повторяющихся последовательностей. Доля прямых тандемно организованных повторов составила 4.7%, инвертированных - 17.3%. Доля рассеянных повторов (ди-, три- и тетрануклеотидных) оказалась равной 19.8%. Среднее содержание данных компонентов составило 35.6%.

Ts82-32 (1505 п.и.)

I и . //. i i .III, i IV

54« 685 1065 1484

+1 | « MM 1 | +3 ^ 1505 298 557 943 1065

S. mansoni: Perere-3, END-RT (CAJ00236, 992 a.o.)

-—H

838 926

S. japonicum : SjPenelope-2, RT (CAX83714, 548 a.o.)

'M

151

111

S. japonicum : S)CHGCS20, END-RT (CAX83711, 918 a.o.)

Рисунок 5. Расположение трех регионов, гомологичных гену pol ретроэлементов Регеге-З (■Schistosoma mansoni), SjPenelope-2 (S. japonicum) и SjCHGCS20 (S. japonicum) в последовательности Ts82-32 Trichobilharzia szidati. Регион, имеющий гомологию с Perere-3, включает участки I и II; III и IV - регионы, гомологичные SjPenelope-2 и SjCHGCS20 соответственно; области, в которых гомология отсутствует, обозначены черным цветом; +1, +2, +3 - рамки считывания.

3. Характеристика нуклеотидных последовательностей из генома церкарий птичьих шистосом Trichobilharzia szidati и Bilharziella polonica, полученных с помощью праймеров, сконструированных на основе RAPDs

С целью более подробного исследования областей, в которых локализованы обнаруженные нами регионы, гомологичные ретроэлементам S. mansoni, S. japonicum, из RAPD-клонотеки были выбраны 4 наиболее протяженные последовательности. На их основе сконструировано 14 специфичных праймеров. С помощью этих праймеров, использованных в различных комбинациях, получены спектры амплификации церкарий двух видов птичьих шистосом - Т. szidati и В. polonica. На рис. б в качестве примера приведены спектры В. polonica, полученные с использованием праймера TR47-78R. Из спектров Т. szidati и В. polonica для клонирования были выбраны преимущественно крупноразмерные фрагменты (п=21).

TR47-78R

M Г

1200 ——

] BpNl

1031 —

» « » « » # I DpN2

Ш£ fe. Л ЛяЛ Ни« * л

^r ^ ТЧ

СПЦ1

спц2

Рисунок 6. Спектры амплификации церкарий Bilharziella polonica, полученные с помощью | праймера TR47-78R. Обозначения: спц - спороциста; рамкой выделены клонированные ампликоны (BpNl, BpN2); М - маркер молекулярных масс (100 bp Ladder).

В результате секвенирования 52 клонов получено 42 различающихся последовательности, размер которых варьировал от 304 до 1404 п.н. В данных последовательностях обнаружены прямые (9.4%) и инвертированные (22.4%) тандемно организованные повторяющиеся последовательности, а также рассеянные повторы (ди-, три-и тетрануклеотидные), доля которых оказалась равной 19.1%. Среднее содержание ~андемных и рассеянных повторов составило 41.6%.

С помощью биоинформатического анализа в 10 последовательностях выявлено 12 регионов аминокислотной гомологии с геном ро1 различных ретротранспозонов Я. татоп1 и

О. japonicvm. При этом в двух последовательностях (Ts49-66, Вр60-58) обнаружено по два г>егиона, а в остальных 8 последовательностях найдены единичные области гомологии. В целом, в 4 последовательностях T. szidati (Ts49-66, Ts76-85, Ts52-50, Ts72-64) и двух лоследовательностях В. polonica (Вр60-58, Вр70-00) обнаружено 8 регионов, гомологичных XTR-ретротранспозонам клады RTE: SjCHGCS20 и SjR2 (n=3), а также SjCHGCS19 и Derere-3 (п=5). В трех последовательностях T. szidati (Ts53-51, Ts51-24, Ts48-65) выявлено ри региона, гомологичных nLTR-ретротранспозонам клады CRI: Регеге и Регеге-7 (п=1), Регеге-2, -5, -6 (п=1), Регеге-8 (п=1). В последовательности Ts51-49 T. szidati выявлен диничный регион, сходный с LTR-ретротранспозоном линии Gypsy/Ty3 - SjCHGCS3. юльшая часть выявленных регионов имела инсерции/делеции кодонов, стоп-кодоны, а также сдвиги рамки считывания. Размер участков гомологии составил 39-1017 п.н., а уровень . омологии варьировал от 25 до 77%.

Таким образом, из генома четырех видов трематод (Г. /гапкг, Т. szidati, В. ро!опюа, Е. асоташт) получено 54 новых, ранее неизвестных последовательностей (общий размер - 23

тыс. п.н.). Содержание АТ-оснований оказалось равным 58.7%, а среднее содержание тандемных и рассеянных повторов составило 39.7%. В 22 последовательностях выявлено 26 не сходных между собой регионов размером от 55 до 1017 п.н., имеющих гомологию с ретроэлемешами шистосом млекопитающих из трех подклассов: ретротранспозонами, не содержащими длинных концевых повторов (LINE) - nLTR (76%), ретротранспозонами, имеющими длинные концевые повторы - LTR (16%), а также Репе1оре-подобньши элементами - PLE (8%) (рис. 7).

Рисунок 7. Распределение регионов, выявленных в составе последовательностей из геномов четырех видов трематод (TrichobiUiarzia franki, Т. szidati, Bilharziella polonica, Echinoparyphium aconiatum), по трем п/классам ретроэлементов. Обозначения: CRI, RTE -филогенетические клады nLTR-ретротранспозонов (nLTR); Gypsy/Ty3, BEL -филогенетические клады LTR-ретротранспозонов (LTR); PLE - Репе1оре-подобные элементы.

4. Разработка новой молекулярно-диагностической системы для детекции птичьих

Для того чтобы разработать молекулярно-диагностическую систему для детекции возбудителей церкариального дерматита человека - птичьих шистосом из рода ТпскоЫШаЫа - мы использовали последовательности, полученные в результате клонирования РАРВз двух видов трихобильгарций (Т. ]гапк1 и Т. яг'^аГС). Одна из последовательностей Т. /гапШ (Т198-00), гомологичная регроэлементу Регеге-10 5. татот (САДЮ247), оказалась пригодной для конструирования пары локус-специфичных ираймеров (TR98F и ТИ98К), стабильно амплифицирующих не более 1-2 фрагментов в спектрах церкарий трех видов трихобильгарций (Т. /гапЫ, Т. хггдаН, Т. regenti).

PLE

(8%)

шистосом m рода Trichobilhania (T. franki. T. szidati, T. regenti) на стадии промежуточного хозяина - моллюска

Использование этих праймеров в реакциях амплификации с ДНК Т. franki из трех 1 инфрапопуляций (Rami, NLaul5 и NLaul7) позволило получить ампликон размером -400 п.н. (рис. 8). Амликон аналогичного размера получен также на ДНК церкарий и спороцист из 4 инфрапопуляций Т. szidati (NLstlO, BzLst5, Steplst4 и Lsm20) и двух инфрапопуляций Т. regenti (Roml и Rom2). Кроме того, у всех образцов Т. szidati визуализирован дополнительный ампликон размером ~280 п.н., а у Т. regenti — дополнительный ампликон размером -230 п.н. Мы не обнаружили ни одного амплифицированного продукта при использовании в качестве матрицы ДНК трех других видов трематод: В. polonica (Schistosomatidae), Apatemon sp. (Strigeidae) и Diplostoimim sp. (Diplostomatidae). Отсутствие продуктов амплификации наблюдалось и при использовании ДНК трех видов неинфицированных моллюсков (R. auricularia, L. stagnalis и R. ovata), которые являются хозяевами трех исследованных видов шистосом (Т. franki, Т. szidati и Т. regenti соответственно).

Т. franki Т. szidati Т. regenti

и г 1 la 2 3 "4 43 5 6 7 "В Ва 9 '10 11 12 13 14 15

mm 5 400 <

Рисунок 8. Продукты амплификации, полученные с помощью локус-специфичных праймеров TR98F и TR98R в спектрах птичьих шистосом из рода Trichobilharzia при температуре отжига 60°С. Обозначения: спектры 1-3: Т. franki (инфрапопуляции Rami, NLaul5 и NLaul7 соответственно); спектры 4-7: Т. szidati (инфрапопуляции BzLst5, StepLst4, Lsm2 и Lsm20 соответственно); спектры 8-9: Т. regenti (инфрапопуляции Roml и Rom2 соответственно); спектры 10, 11 и 12: Bilharziella polonica, Apatemon sp. и Diplostomum sp. соответственно; спектры 13, 14 и 15: Lymnaea stagnalis, Radix auricularia и R. ovata -оответственно; буквой "а" рядом с номером спектра отмечены профили амплификации ДНК породисты; М - маркер молекулярных масс (100 bp Ladder).

Данные профили амплификации, полученные для исследованных трематод и моллюсков, стабильно воспроизводились при температуре отжига праймеров от 55°С до 60°С. При повышении температуры отжига до 65°С у всех трех видов оставался неизменным мажорный ампликон размером -400 п.н., однако, только у Т. szidati сохранялся , ;ополнительный ампликон размером -280 п.н.

Чтобы подтвердить пригодность разработанной системы для детекции птичьих шистосом на стадии моллюска были проведены два дополнительных эксперимента. В первом случае в реакции амплификации использовали ДНК, полученную из гомогената, содержащего фрагменты печени неинфицированного моллюска, смешанные в равных объемах (-1:1) со спороцистами паразита. Во втором случае в качестве матрицы использовали смесь (-1:1 по массе) ДНК паразита и хозяина. Для каждого из трех видов трихобильгарций (Т. franki, Т. szidati, Т. regenti) исследовано по одной инфрапопуляции (Rami, Lsm20, Rom2 соответственно). Независимо от способа получения ДНК-матрицы в спектрах присутствовали только ампликоны ожидаемого размера: по одному ампликону размером -400 п.н. в спектрах Т. franki и Т. regenti и два - размером -400 п.н. и -280 п.н. в спектрах Т. szidati.

С целью выявления внутри- и межвидовых различий в исследуемом участке ДНК проведено выравнивание 17 последовательностей, полученных в результате клонирования мажорных (-400 п.н.) ампликонов Т. franki, Т. szidati и Т. regenti. Эти последовательности отличались как по длине, так и по составу (рис. 9). Шесть клонов Т. franki отличались между собой только одной нуклеотидной заменой (трансверсией) и имели одинаковый размер - 391 п.н. Восемь клонов Т. regenti имели одинаковый размер (393 п.н.) и оказались идентичными. Кроме того, последовательности Т. franki, полученные для зрелых церкарий (Tf(ccr)16-Tf(cer)18) и совокупности незрелых церкарий из одной спороцисты (Tf(cer)13-Tf(cer)15) не различались. Сходным образом, последовательности Т. regenti, полученные для зрелых церкарий (Тг(сег)89-Тг(сег)92) и совокупности незрелых церкарий из одной спороцисты (Tr(sp)93-Tr(sp)96), не отличались между собой. Два клона Т. szidati (Ts400(cer)19 и Ts400(cer)21) различались единичной транзицией и имели одинаковый размер - 391 п.н. По сравнению с основным ампликоном (Ts400(cer)19) последовательность минорного фрагмента Т. szidati (Ts280(cer)23), размер которой составил 274 п.н., имеет 44 точечных замены и 5 участков точечных делеций разной протяженности (от 5 до 36 п.н.). При исключении из анализа делеций сходство между мажорным и минорным фрагментами ДНК Т. szidati составляет 82%. Сравнительный анализ последовательностей мажорного ампликона выявил высокую степень гомологии между ПЦР-продуктами: 87% гомологии между последовательностями Т. szidati и Т. regenti и 85% - между Т. franki и Т. regenti. Сходство между последовательностями Т. franki и Т. szidati составило 83%.

Tf98-00 Tf(cer)14 Tf(cer)13 Tf(cer)15 Tf (sp) 16 Tf (sp)17 Tf(sp)18 Ts400(cer)19 Ts400 (cer)21 Tr(cer)89 Tr (cer)90 Tr(cer)91 Tr(cer)92 Tr(sp)93 Tr(sp) 94 Tr(sp)95 Tr(sp)96

Clustal Consensus

____I____I____!____I____i----1____I____I----!----I----I----i----I----I----I----I----I----I----!----I

[SCGGCCTTA^ ГСАГАГГССГ

. T.T. • T.T. .T.T. .T.T. .T.T. .T.T.

. .CAT.....C...G____C.C____С.....ТТ.. .AA.........A

. .CAT.....C...G____C.C____С.....ТТ.. .AA.........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.CT.T.....................С.....T.T..T..........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.CT.T.....................С.....T.T. .T..........A

.T.T........CT.T.

.T.T.

TÍ9B-00 Tf(cer)14 Tf(cer)13 Tf(cer)15 Tf(sp)16 Tf (sp)17 Tf (sp)18 Ts400(cer)19 T&400(cer)21 Tr(cer)В9 Tr(cer)90 Tr(cer)91 Tr (cer)92 Tr (sp) 93 Tr(sp)94 Tr(sp)95 Tr(sp)96

Clustal Consensus

110 120 130 1-10 150 160 170 180 1 90 20 ____I____i____!____I____i----!____I----I----I----I----I----I .... !----I----I----!----I----I----I----!

AAATCC T CT CT G AAGAGCATCAAGG - AGCATTGAAAG TTCT СAAAGATAATGACAAAATTT TT ATAT TGC G AC С T GACAAAGACC CAGGAG T GGT GATGA

.A.-...........С......GA.........G. .C.G.....................GAT.CT____Т. . .С.

.A.-...........С......GA.........G. .С.G.....................GAT.СТ. . . .A. . .С.

.AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

. AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

. AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

. AACG..........С......GA..............G.....С...............G . TT..........С .

.AACG..........С......GA..............G.....С...............G-ГГ..........С.

.AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

.AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

. AACG..........С......GA..............G.....С...............G. TT..........С.

300 . I

Tf98-00 Tf(cer)14 Tf(cer)13 Tf(cer)15 Tf(вр)16 Tf(sp)17 Tf(sp)18 TS400(cer)19 Ts400(cer)21 Tr(cer)89 Tr(cer)90 Tr(cer)91 Tr(cer)92 Tr(ep)93 Tr(sp)94 Tr(Bp)95 Tr(sp)96

Clustal Consensus

TCGACACAGATGACTACATCGCAGAGATAAAAACTGTGTTAAATGATGCGTTGAGGTTTAAAGTTGAAGACTGCCAGAAAGATAAGACAGATGCGGTTGA

.A. . .G............A. . . .G.................CC.T.................CA.T. .A.............G

.A, . .G............A. . . .G.................CC.T.................CA.T. -A.............G

.A. . .G............A. . . .G. . .G. . .С.........CC.A.................CA.T.A..............T......A.

• A. . .0............A____в...а...С.........CC.A.................CA.T.A..............T......A

.A...G............A____G...G...C.........CC.A.................CA.T.A..............T......A.

.A...G............A. . . .G. . .G. . .C.........CC.A.................CA.T.A..............T......A,

• A. . .G............A. . . .G. . -G. . .C.........CC.A.................CA.T.A. .............T......A.

■ A...G............A....G...G...C.........CC.A.................CA.T.A..............T......A.

• A...G............A....G...G...C.........CC.A.................CA.T.A..............T......A

.A. . .G............A. . . .G. . .G. . .C.........CC.A.................CA.T.A..............T......A.

A.C. A.C.

Tf98-00 Tf<cer)14 Tf(cer)13 Tf(cer)15 Tf(sp)16 Tf(sp)П Tf(sp)18

310 320 330 340 350 360 370 380 390 400

----I----I____I----!----)----I----I----i----i----i----I----I----I----j----I----I----I----;----i----I . ■ ■ ■ I----i . .

AAAACATATCACAAACGTACTGAGGGATCTTCTAAAGAAAAAAATGATTGATAACAATAAGTGCAATGAACTGAATACCCGAGGATACCGTTCGCCACTCA^GTAAGGCCGG|

Ts400 (cer)19 ____AG..... .....C. . . .CA. . . .G____ ____G. . .T. -C. . .c.. . . . .T. .A..G. .CT. .T-AC.

Ts400(cer)21 ____AG..... .....c.. . .CA. . . .G____ ____G. . .T. .c.. .c.. . . . .T. .A..G. .CT. .T-AC.

Tr (cer) 89 .....G..... .....c.. ...A.. .....C. .T. . .c. .c.. . .. .c. .A.... .TT. ...AC.

Tr(cer)90 .....G..... .....c.. ...A.. .....C. .T. . .c. .c.. . .. .c. .A.... • TT. ...AC.

Tr(cer)91 .....G..... .....C. . ...A.. .....C. . T. . .c. .c.. . .. .c. .A.... • TT. ...AC.

Tr(cer)92 .....G..... .....c.. ...A.. .....C. . T. . .c. .c.. . .. .c. .A____ • TT. ...AC.

Tr(sp)93 .....G..... .....c.. . . .A. . .....C. .T. . .c. • C. . . .. .c. .A____ • TT. ...AC.

Tr(sp)94 .....G..... .....C. . ...A.. .....C. . T. . .с. • C... .. .с. , A____ .TT. ...AC.

Tr(sp)95 .....G..... .....c.. ...A.. .....C. • T. . .c. .c... .. .c. .A.... • TT. . ..AC.

Tr(sp)96 .....G..... .....c.. . . .A. . .....C. . T. . .c. • C . .c. .A____ • TT.

Clustal Consensus

Рисунок 9. Выравнивание последовательностей -400 п.н. ампликонов, полученных с помощью праймеров TR98F и TR98R в спектрах церкарий и спороцист трех видов трихобильгарций. Обозначения: Tf98-00, Tf(cer)13-Tf(sp)18 - последовательности Trichobilharzia franki; Ts400(cer)19, Ts400(cer)21 — последовательности Т. szidati', Tr(cer)89-Tr(sp)96 — последовательности Т. regenti; cer — церкарии; sp — спороциста; точками обозначены нуклеотидные позиции, идентичные нуклеотидам в последовательности Tf98-00; пунктиром обозначены делеции; последовательность случайного праймера Р29 заключена в рамку; последовательности праймеров TR98F и TR98R выделены серым фоном.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

К наиболее интересным результатам нашего исследования относится явление клональной изменчивости партсногснстичсского потомства (церкарий), зарегистрированное у представителей 9 семейств трематод. Ранее использование RAPDs позволило выявить генетическую гетерогенность метацеркарий из спороцист Microphallus pygmaeus [Халтурин и др., 2000], а также изменчивость в клонах церкарий S. haematobium [Shiff ct al., 2000]. Впервые явление клональной изменчивости было подробно изучено на церкариях S. mansoni, полученных при экспериментальном заражении моллюсков В. glabrata единичными мирацидиями, а также на дочерних спороцистах, выращенных in vitro на культуре клеток В. glabrata. Предполагалось, что неравномерное распределение повторов W1 и W2 между церкариями в пределах спороцист, а также между спороцистами связано с митотической рекомбинацией, происходящей при размножении партенит [Grcvelding, 1999; Baync and Grcvciding, 2003]. Однако молекулярные или цитогенстичсскис доказательства, подтверждающие рекомбинационные события в онтогенезе партенит, до сих пор не представлены.

Обнаруженные нами различия в уровне клональной изменчивости спороцистоидных и редиоидных трематод, по-видимому, свидетельствуют о разных путях эволюции генома в этих группах. Результаты более детального анализа генетической изменчивости церкарий, полученные на большем числе видов и с использованием различных молскулярно-генетичсских маркеров, возможно, позволят судить об эволюции и взаимосвязях между отдельными семействами и видами спороцистоидных и редиоидных трематод.

Предлагаемые нами RAPD-маркеры оказались также пригодными для выявления популяционной структуры двух видов трематод (В. polymorphic и Т. szidati) на уровне партсногснстичсского потомства. При этом оказалось, что наибольший вклад во внутривидовую RAPD-изменчивость церкарий вносит разнообразие внутри отдельных спороцист, т.е. клональная изменчивость.

Структурный анализ вариабельных RAPDs показал, что данные последовательности содержат тандемные (прямые, инвертированные) и рассеянные повторы (ди-, три- и тетрануклеотидные). Свыше 40% исследованных RAPDs включали области, имеющие значимую гомологию с ретроэлсмснтами S. mansoni и S.japonicum. В последовательностях Т. szidati, Т. franki, В. polonica и Е. aconiatum наблюдалось преобладание АТ-оснований (58.7%), как и в геноме шистосом млекопитающих (65.9%) [Liu ct al., 2009]. Среднее содержание тандемных и рассеянных повторов в последовательностях изученных трематод (39.7%) оказалось сопоставимым с общим содержанием повторяющейся ДНК в геноме S.

mansoni (40%) и S. japonicum (40.1%) [Berriman ct al., 2009; Liu ct al., 2009]. Почти треть последовательностей суммарной клонотски включала регионы, гомологичные ретроэлементам шистосом млекопитающих (nLTR, LTR, PLE). Большинство этих регионов (76%) оказались фрагментами nLTR-ретротранспозонов. Показано, что данный тип мобильных генетических элементов (МГЭ) преобладает и в геноме шистосом млекопитающих [Berriman et al., 2009; Liu ct al., 2009].

Ретротранспозоны и другие МГЭ обнаружены практически у всех эукариот и играют важную роль в эволюции и реорганизации геномов [Berg and Howe, 1989]. Важнейшим из механизмов, контролирующих экспрессию и частоту перемещений МГЭ, является система РНК-интсрфсренции (РНКи) - защитная клеточная система, распознающая в клетке присутствие двухцепочечной РНК [Fire et al., 1998]. К настоящему моменту 5. mansoni является единственным изученным представителем плоских червей, для которого продемонстрировано наличие РНКи [Boyle et al., 2003; Skclly et al., 2003]. Недавно было показано, что одним из источников коротких интерференционных РНК, или siPHK (short interfering RNA) в геноме Drosophila являются определенные области - мастсрлокусы регуляции активности МГЭ [Brennecke et al., 2007]. Данные локусы содержат большое количество дефектных копий мобильных элементов (в том числе, отдельные фрагменты МГЭ, а также копии, встроенные друг в друга), объединенных в кластеры, находящиеся под контролем промоторов. Не исключено, что фрагменты ретроэлементов, выявленные нами в геноме птичьих шистосом {Т. szidati, Т. franki, В. polonica) и Е. aconiatum, могут служить источником коротких интерференционных РНК, использующихся для подавления экспансии мобильных элементов. Большая часть этих фрагментов (85%) содержит в кодирующей области стоп-кодоны, индели кодонов, а также сдвиги рамки считывания. Кроме того, в трех наиболее протяженных последовательностях, размер которых составил 928-1505 п.н., обнаружены фрагменты сразу нескольких элементов, расположенные последовательно. Однако, возможно, что обнаруженные нами фрагменты не входят в состав мастсрлокусов регуляции активности МГЭ. Тем не менее, они могут служить своего рода генетической "памятью" о мобильных элементах, действию которых подвергался геном в прошлом. Учитывая тот факт, что транспозиции мобильных элементов могут изменять экспрессию генов, вызывать различные хромосомные перестройки, а также способствовать появлению новых генов, перемещения МГЭ в геноме, очевидно, вносят определенный вклад в формирование специфических признаков, повышающих адаптивность вида [Betran and Long, 2002; Oliver and Greene, 2009]. Так, например, предполагается, что в результате дивергенции азиатских (S. japonicum) и африканских шистосом (S. mansoni) от общей азиатской предковой линии два семейства nLTR-ретротранспозонов (SR2 и Perere-3/SR3) подверглись

20

множественным транспозиционным событиям в геноме S. mansoni, что, по-видимому, увеличило потенциал данного вида к специализации в новых условиях среды [Venancio et al., 2010]. Возможно, что транспозиционные взрывы МГЭ имели место и в эволюционной истории европейских видов птичьих шистосом, изученных нами.

С медицинской точки зрения птичьи шистосомы привлекают особое внимание тем, что они являются возбудителями церкариального дерматита человека. Вследствие сходства биохимического состава некоторых липидных фракций покровов птиц и человека церкарии птичьих шистосом способны проникать в кожу человека (неспецифичсского хозяина), вызывая аллергическую реакцию [Haas and van de Roemcr, 1998]. Предложенная нами новая молскулярно-диагностичсская система является специфичной к ДНК птичьих шистосом из рода Trichobilharzia, т.к. исключает амплифицирование ДНК трематод из других семейств (Strigcidae и Diplostomatidac), а также близкородственных птичьих шистосом из рода Bilharziella. Немаловажным для детекции паразита на стадии промежуточного хозяина является тот факт, что разработанные праймеры (TR98F и TR98R) не амплифицируют ДНК моллюсков R. auricularia, L. stagnalis, R. ovala, являющихся хозяевами соответствующих видов трихобильгарций. Одно из преимуществ предлагаемой тест-системы состоит в том, что она основана на использовании метода ПЦР с локус-спсцифичными праймерами и ие требует ссквенирования продуктов. Этот простой и дешевый способ детекции может найти широкое применение при мониторинге природных очагов возбудителей церкариального дерматита человека. Отмстим, что обнаруженные нами межвидовые различия в интенсивности амплификации мажорного ампликона (-400 п.н.) могут свидетельствовать о различиях в копийности последовательностей, гомологичных последовательности ТГ98-00; для точной же оценки числа копий в дальнейшем необходимо провести блот-гибридизационные эксперименты. В перспективе возможна разработка и видовой диагностики трихобильгарций на основании найденных видоспецифичных замен в составе последовательностей мажорного ампликона.

выводы

1. С помощью RAPD-маркеров впервые выявлено наличие клоналыюй генетической изменчивости церкарий 10 видов трематод, относящихся к 9 семействам (Notoeotylidae, Halipegidac, Echinostomatidae, Schistosomatidae, Strigeidac, Gorgoderidac, Buccphalidae, Diplostomatidae, Plagiorchiidae). Показано, что эта изменчивость значительно выше в группе спороцистоидных трематод (22.5%) по сравнению с редиоидными формами (6.2%);

2. На примере двух видов (Bucephalus polymorphus, Trichobilharzia szidati) впервые показана пригодность предложенных RAPD-маркеров для выявления популяционной структуры на уровне партеногенетичсского потомства трематод: обнаружены генетические различия между церкариями одного вида в пределах популяций (внутри спороцист и инфрапопуляций; между инфрапопуляциями) и между ними. Показано, что наибольший вклад во внутривидовую изменчивость церкарий вносит клональная изменчивость (разнообразие внугри отдельных спороцист);

3. В результате клонирования 49 ампликонов, выделенных из генома церкарий четырех видов трематод (Trichobilharzia szidati, Т. franki, Bilharziella polonica, Echinoparyphium aconiatum), получено 74 различающихся последовательности. В 54 последовательностях найдены тандемные и рассеянные повторы, среднее содержание которых составило 39.7%;

4. С помощью биоинформатического анализа в 22 последовательностях выявлены регионы размером от 55 до 1017 п.н., имеющие гомологию с ретроэлсментами шистосом млекопитающих (S. mansoni, S. japonicum), входящими в состав трех п/классов: nLTR (76%), LTR (16%) и PLE (8%). Большинство этих регионов оказались гомологичными кодирующей области (ген pot) и имели сдвиги рамки считывания, стоп-кодоны, а также инсерции/делеции кодонов;

5. На основе одной из последовательностей, имеющей гомологию с ретроэлементом Рсгсге-10 S. mansoni, разработана новая молекулярно-диагноетическая система для детекции трематод из рода Trichobilharzia (Schistosomatidae) на стадии промежуточного хозяина (моллюска).

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи:

1. С.К. Семенова, Г.Г. Хрисанфова, А.В. Корсуненко, М.В. Воронин, С.А. Беор, С.Н. Водяницкая, Е.А. Ссрбина, Н.И. Юрлова, А.П. Рысков. Мультилокусная изменчивость нартеногснстичсского потомства - церкарий трематод разных видов (класс Trematoda). Доклады Академии Наук, 2007, том 414, № 4, с. 570-573;

2. А.В. Корсуненко, А.В. Тютин, С.К. Семенова. Клональная и популяционная RAPD-измснчивость церкарий из спороцист Bucephalus polymorphic (Trematoda: Buccphalidae). Генетика, 2009, том 45, № 1, с. 73-80;

3. A.V. Korsuncnko, G.G. Chrisanfova, A.P. Ryskov, S.O. Movscssyan, V.A. Vasilyev, S.K. Semyenova. Detection of European Trichobilharzia schistosomes (/'. frankt, T. szidati, and T. regenti) based on novel genome sequences. Journal of Parasitology, 96(4), 2010, pp. 802-806;

Тезисы:

1. Г.Г. Хрисанфова, А.В. Корсуненко, М.В. Воронин, С.В. Бсэр, Н.И. Юрлова, С.Н. Водяницкая, С.К. Семенова. Сравнительный анализ RAPD-измснчивости личиночных стадий трематод разных видов и проблемы нестабильности генома партснит. Материалы II межрегиональной научной конференции «Паразитологическис исследования в Сибири и на Дальнем Востоке», Новосибирск, 15-20 сентября 2005, с. 224-225;

2. Хрисанфова Г.Г., Корсуненко А.В., Беэр С.А., Воронин М.В., Юрлова Н.И., Водяницкая С.Н., Семенова С.К. RAPD-измснчивость партсногснстических поколений и церкарий некоторых фуркоцеркарных трематод. Материалы международной научной конференции «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов», Москва, 19-21 апреля 2006, с. 297-299;

3. Корсуненко А.В. RAPD-измснчивость и характеристика вариабельных участков генома партсногснстических поколений трематод. Материалы международной конференции «Генетика в России и мире», Москва, 28 июня-2 июля 2006, с. 98;

4. A. Korsuncnko, G. Chrisanphova, М. Voronin, S. Be'cr, S. Vodyanitskaya, N. Yurlova and S. Semyenova. RAPD-fingcrprinting of free-swimming cercariae and ccrcariac isolated from daugther sporocysts of some trcmatode families. Thesis of the 11th International Congress of Parasitology, Scotland, Glasgow, 6-11 August 2006 (опубликовано на CD);

5. A. Korsuncnko, G. Chrisanphova and S. Semyenova. RAPD variability of parthcnogenetic progeny (cercariae) of two trcmatode species groups. Thesis of Cold Spring Harbor Laboratory Meeting "The Biology of Genomes", USA, Cold Spring Harbor, 8-12 May 2007, p. 192;

6. С.К. Семенова, A.A. Лонаткин, B.A. Васильев, E.B. Корчагина, А.В. Корсуненко, Г.Г. Хрисанфова, А.П. Рысков. Филогеномика и молекулярная коэволюция на примере дигснстичсских сосальщиков (класс Trematoda). Материалы международной конференции «Вычислительная филогенетика и систематика», Москва, 16-19 ноября 2007, с. 293-296;

7. Chrisanfova G., A. Korsunenko, A. Lopatkin, М. Voronin, S. Be'cr, О. Zazornova, S. Vodyanitskaya, N. Yurlova, Т. Dorojenkova, E. Hcydorova, V. Mishcnkov, T. Zhukova, E. Bychkova, S. Semyenova. Diversity of DNA sequences and species identification of

cercariac of bird schistosomes obtained from Russian and Belarusian water ponds. Thesis of Xth European Multicolloquium of Parasitology, Franco, Paris, August 24-28 2008, pp. 110-111;

8. Корсунснко A.B., Тютин A.B., Семенова C.K. RAPD-измснчивость церкарий из спороцист Bucephalus polymorphus (Trematoda: Bucephalidae), паразитирующих на моллюсках Dreissena polymorpha (Bivalvia: Drcissenidae). Материалы международной научной конференции «Биоразнообразис и экология паразитов наземных и водных ценозов», посвященной 130-летию со дня рождения академика К.И.Скрябина, Москва, 9-11 декабря 2008, с. 170-173;

9. С.К. Семенова, Г.Г. Хрисанфова, В.А. Васильев, А.А. Лопаткин, А.В. Корсуненко, Е.В. Корчагина, А.П. Рысков. Молекулярная филогения и филогсография паразитических червей - трематод. Материалы V съезда Вавиловского Общества генетиков и селекционеров. Москва, 21-28 июня 2009, с. 301;

10. Корсуненко А.В., Хрисанфова Г.Г., Рысков А.П., Мовсесян С.О., Семенова С.К. Разработка новой молскулярно-диагностичсской системы для детекции птичьих шистосом из рода Trichobilharzla (Т. franki, Т. szidati, Т. regenti) на стадии моллюска-хозяина. Материалы международной научной конференции «Теоретические и практические проблемы паразитологии», Москва, 30 ноября-3 декабря 2010, с. 181-

Регистрационные номера нуклеотидных последовательностей, депонированных в

183.

GenBank: GU980749-GU980755

Подписано в печать 16 ноября 2010 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 860 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Корсуненко, Анна Владимировна

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Особенности жизненного цикла, биологии и систематики паразитических червей класса Дигенетические Сосальщики, или Трематоды (Platyhelminthes: Trematoda).

1.2. Партеногенез и клональная изменчивость. "Нестабильность" генома трематод.

1.3. Особенности организации генома трематод.

1.3.1. Геном шистосом млекопитающих Schistosoma mansoni и S. japonicum. Уникальные и повторяющиеся последовательности трематод.

1.3.2. Мобильные генетические элементы трематод.

1.4. Исследование геномной вариабельности и филогении трематод с помощью молекулярно-генетических маркеров.

1.4.1. Внутривидовая и межвидовая генетическая изменчивость.

1.4.2. Молекулярная филогения трематод.

1.5. Использование молекулярно-генетических маркеров для диагностики трематод.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

И. 1. Материалы.

II.2. Методы.

11.2.1. Выделение ДНК.

11.2.2. Полимеразная цепная реакция.

11.2.3. Элюция и секвенирование.

11.2.4. Клонирование.

11.2.5. Статистическая обработка результатов.

11.2.6. Биоинформатический анализ данных.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ.

III. 1. Исследование RAPD-изменчивости партеногенетического потомства у представителей различных семейств трематод.

III. 1.1. Клональная изменчивость в группах спороцистоидных и редиоидных трематод.

III. 1.2. Клональная и популяционная изменчивость церкарий трематод Bucephaluspolymorphus и Trichobilharzia szidati.

111.2. Характеристика вариабельных RAPDs из генома церкарий трематод Trichobilharzia szidati, Т. franki и Echinoparyphium aconiatum.

111.2.1. Создание RAPD-клонотеки.

111.2.2. Структурные особенности RAPDs.

111.3. Характеристика нуклеотидных последовательностей из генома церкарий птичьих шистосом Trichobilharzia szidati и Bilharziella polonica, полученных с помощью праймеров, сконструированных на основе RAPDs.

111.3.1. Составление клонотеки.

111.3.2. Структурные особенности последовательностей, полученных на основе RAPDs.

111.4. Разработка новой молекулярно-диагностической системы для детекции птичьих шистосом из рода Trichobilharzia (Т. franki, Т. szidati, Т. regenti) на стадии промежуточного хозяина — моллюска.

111.4.1. Подбор праймеров и оптимизация молекулярно-диагностической системы.

111.4.2. Сравнительная характеристика последовательностей птичьих шистосом Т. franki, Т. szidati, Т. regenti, полученных с помощью локус-специфичных праймеров

TR98F и TR98R.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

IV. 1. Исследование RAPD-изменчивости партеногенетического потомства у представителей различных семейств трематод.

IV.2. Анализ последовательностей, выделенных из геномов четырех видов трематод (Trichobilharzia szidati, Т. franki, Bilharziella polonica и Echinoparyphium aconiatum).

IV.3. Разработка новой молекулярно-диагностической системы для детекции птичьих шистосом из рода Trichobilharzia (Т. franki, Т. szidati, Т. regenti) на стадии промежуточного хозяина - моллюска.

V. ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Геномная вариабельность трематод (Trematoda) на стадии промежуточного хозяина - моллюска"

Совершенствование молекулярно-биологических и генно-инженерных методов, а также наличие вычислительных алгоритмов, позволяющих обрабатывать объемные базы данных, определяет интенсивное развитие одного из современных направлений биологии, а именно геномики. Она изучает общие принципы построения геномов, а также особенности их структурно-функциональной организации в группах различного таксономического ранга. Эволюционный подход постепенно становится основным приемом для определения функций отдельных генов и их взаимодействия в пределах генома. Он позволяет предсказывать и идентифицировать функционально важные области генов, а также проследить за формированием элементов «непостоянства» генома. Методы геномики и биоинформатики все чаще используют для выяснения общих закономерностей эволюции организмов, происхождения генетического полиморфизма и биоразнообразия.

Изучение геномов паразитических червей представляет актуальную фундаментальную задачу. Класс Трематоды, или Дигенетические сосальщики

Platyhelminthes: Trematoda) является одной из наиболее интересных групп \ паразитических червей. Она объединяет более 18000 видов (свыше 140 семейств) паразитов беспозвоночных и позвоночных животных, населяющих наземные и водные экосистемы [Gibson et al., 2002; Скрябин, 1948].

Трематоды отличаются от остальных червей наличием сложного жизненного цикла, связанного со сменой животных-хозяев и чередованием нескольких последовательных партеногенетических и одного гермафродитного поколения. Все трематоды - эндопаразиты, обитающие во взрослом состоянии во внутренних органах позвоночных животных и человека, которые являются их дефинитивными (окончательными) хозяевами. Роль первого промежуточного хозяина всегда выполняют разные виды моллюсков, в теле которых сформировавшийся из оплодотворенной яйцеклетки мирацидий претерпевает регрессивный метаморфоз и дает начало первому партеногенетическому поколению — материнской спороцисте. В результате диплоидного партеногенеза в материнской спороцисте формируется следующее партеногенетическое поколение (партениты) — дочерние спороцисты или редии. Партениты дают начало церкариям - свободноплавающим личинкам, которые выполняют расселительную функцию. В конечном итоге, цикл завершается в организме окончательного хозяина, где развиваются половозрелые черви - мариты [Скрябин, 1948; Гинецинская, Галактионов, ' 1978].

Ранее считалось, что партеногенетическое потомство трематод (церкарии), представляет собой совокупность генетически однородных особей (клон). Однако с помощью различных молекулярно-генетических маркеров у некоторых представителей трематод зарегистрировано наличие клональной генетической изменчивости. Так, например, в результате экспериментального заражения моллюсков Biomphalaria glabrata единичными мирацидиями Schistosoma mansoni обнаружена генетическая неоднородность церкарий из одной и той же спороцисты, а также различия между дочерними спороцистами, связанные с неравномерным распределением повторов W1 и W2. Предполагается, что в основе выявленной клональной изменчивости лежит механизм митотической рекомбинации [Grevelding, 1999; Bayne and Grevelding, 2003].

Трематоды до сих пор остаются малоизученными с точки зрения структурной организации и эволюции генома. Только в 2009 г. были расшифрованы полные последовательности ядерных геномов двух представителей данного класса - возбудителей шистосоматоза человека S. mansoni и S. japonicum [Berriman et al., 2009; Liu et al., 2009]. Показано, что геномы этих паразитов имеют ряд особенностей. Например, по сравнению с геномами других беспозвоночных они имеют относительно большой размер и низкую частоту генов, а длина интронов может значительно варьировать в пределах одного гена. Кроме того, показано, что в протеоме S. japonicum отсутствует около 4000 белковых доменов; характерных для других многоклеточных организмов. Предполагается, что утрата около 1000 из этих доменов может быть отчасти обусловлена приспособлением к паразитическому образу жизни. Свыше трети генома шистосом млекопитающих составляют повторяющиеся последовательности, представленные тандемными и рассеянными повторами, а также мобильными элементами, преимущественно ретротранспозонами.

Помимо фундаментального значения исследование структурной организации генома трематод может иметь практическое приложение в медицине и сельском хозяйстве при разработке экспресс-методов генотипирования возбудителей заболеваний человека и животных, а также для создания нового поколения лекарств и усовершенствования вакцин.

Целью данной работы является исследование геномной вариабельности партеногенетического потомства (церкарий) различных видов трематод, выявленной с помощью RAPD-маркеров.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Оценить клональную RAPD-изменчивость церкарий отдельных видов в группах спороцистоидных и редиоидных трематод;

2. На примере двух видов трематод (Bucephalus polymorphus и Trichobilharzia szidati) оценить уровни и распределение внутривидовой RAPD-изменчивости церкарий;

3. С помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) амплифицировать, затем клонировать и секвенировать RAPDs отдельных представителей спороцистоидных и редиоидных трематод;

4. На основании полученных последовательностей разработать локус-специфичные праймеры и использовать наборы этих праймеров для амплификации новых последовательностей генома трематод;

5. Выявить структурные особенности полученных последовательностей: определить AT/GC-содержание, провести поиск повторов, а также поиск гомологии с известными нуклеотидными и аминокислотными последовательностями шистосом млекопитающих (S. mansoni, S. japonicum) из GenBank;

6. Разработать молекулярно-диагностическую систему, пригодную для детекции птичьих шистосом (возбудителей церкариального дерматита человека) на стадии промежуточного хозяина — моллюска.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Корсуненко, Анна Владимировна

V. выводы

1. С помощью RAPD-маркеров впервые выявлено наличие клональной генетической изменчивости церкарий 10 видов трематод, относящихся к 9 семействам (Notocotylidae, Halipegidae, Echinostomatidae, Schistosomatidae, Strigeidae, Gorgoderidae, Bucephalidae, Diplostomatidae, Plagiorchiidae). Показано, что эта изменчивость значительно выше в группе спородистоидных трематод (22.5%) по сравнению с редиоидными формами (6.2%);

2. На примере двух видов {Bucephalus polymorphus, Trichobilharzia szidati) впервые показана пригодность предложенных RAPD-маркеров для выявления популяционной структуры на уровне партеногенетического потомства трематод: обнаружены генетические различия между церкариями одного вида в пределах популяций (внутри спороцист и инфрапопуляций; между инфрапопуляциями) и между ними. Показано, что наибольший вклад во внутривидовую изменчивость церкарий вносит клональная изменчивость (разнообразие внутри отдельных спороцист);

3. В результате клонирования 49 ампликонов, выделенных из генома церкарий четырех видов трематод (Тrichobilharzia szidati, Т. franki, Bilharziella polonica, Echinoparyphium aconiatum), получено 74 различающихся последовательности. В 54 последовательностях найдены тандемные и рассеянные повторы, среднее содержание которых составило 39.7%;

4. С помощью биоинформатического анализа в 22 последовательностях выявлены регионы размером от 55 до 1017 п.н., имеющие гомологию с ретроэлементами шистосом млекопитающих (S. mansoni, S. japonicum), входящими в состав трех п/классов: nLTR (76%), LTR (16%) и PLE (8%). Большинство этих регионов оказались гомологичными кодирующей области (ген роГ) и имели сдвиги рамки считывания, стоп-кодоны, а также инсерции/делеции кодонов;

5. На основе одной из последовательностей, имеющей гомологию с ретроэлементом Perere-10 S. mansoni, разработана новая молекулярно-диагностическая система для детекции трематод из рода Trichobilharzia (Schistosomatidae) на стадии промежуточного хозяина (моллюска).

IV.3. Разработка новой молекулярно-диагностической системы для детекции птичьих шистосом из рода Trichobilharzia (T.franki, T. szidati, T. regenti) на стадии промежуточного хозяина — моллюска

С медицинской точки зрения птичьи шистосомы привлекают особое внимание тем, что они являются возбудителями церкариального дерматита человека, или церкариоза. Церкарии покидают моллюсков и находят дефинитивных хозяев (водоплавающие птицы семейства Утиных), в основном, благодаря хеморецепции. Вследствие сходства биохимического состава некоторых липидных фракций покровов птиц и человека церкарии птичьих шистосом способны проникать в кожу человека, вызывая аллергическую реакцию [Haas and van de Roemer, 1998]. Способность церкарий внедряться в организм неспецифического хозяина была установлена еще в первой половине XX века, когда были выявлены очаги церкариозов в США и Западной Европе [Brumpt, 1931; Cort, 1928]. Первые данные о природных очагах возбудителей церкариозов в России относятся к 60-м годам XX столетия [Курочкин, 1959; Чеботарев, 1957]. Однако позже на экспериментально зараженных животных (мыши, хомяки, морские свинки, кролики, макаки-резус) было показано, что церкарии трихобильгарций способны не только проникать в кожу млекопитающих, вызывая церкариальный дерматит, но и трасформироваться затем в шистосомул, мигрирующих в легкие [Appleton and Brock, 1986; Bourns et al., 1973; Haas and Pietsch, 1991; Horak and Kolarova, 2000; Horak et al., 1998; Olivier, 1953]. В Европе основными возбудителями церкариального дерматита человека являются три вида трихобильгарций - T. franki, Т. szidati, Т. regenti. Исследованные нами птичьи шистосомы Т. szidati и Т. franki относятся к висцеральным формам, поражающим различные внутренние органы, тогда как Т. regenti является назальной формой [Horak et al., 2002]. Было показано, что в отличие от висцеральных форм церкарии T. regenti способны мигрировать в спинной мозг и вызывать нейромоторные нарушения у экспериментально зараженных мышей, представляя, таким образом, серьезную опасность для здоровья млекопитающих, включая человека [Horak et al., 1999; Hradkova, 2001]. В настоящее время случаи заболевания церкариальным дерматитом зарегистрированы практически на всех континентах (более чем в 90 странах). В последние годы в связи с резко возросшей заболеваемостью в Европе была создана

БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю искреннюю благодарность руководителю лаборатории организации генома ИБГ РАН, Алексею Петровичу Рыскову, а также Сергею Оганесовичу Мовсесяну, руководителю лаборатории экспериментальной паразитологии Центра паразитологии ИПЭЭ РАН, за интерес к работе и научную поддержку. Я благодарна моему научному руководителю, Серафиме Константиновне Семеновой, за руководство, обсуждение экспериментов и результатов. Отдельную благодарность я хочу выразить сотруднице лаборатории организации генома Хрисанфовой Галине Григорьевне за обучение основным методикам, повседневную помощь в работе и ценные советы, а также активное обсуждение экспериментов и полученных результатов. Кроме того, хочу выразить большую признательность моему мужу, Александру Арифову, за разработку одного из вычислительных алгоритмов, использованных в работе, а также за помощь в оформлении рукописи и всестороннюю поддержку.

В особенности хочу поблагодарить всех, кто принимал участие в сборе биологического материала. В их числе сотрудники лаборатории организации генома — С.К. Семенова, Г.Г. Хрисанфова, A.A. Лопаткин, Р.И. Луданный, а также сотрудники Центра паразитологии Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова — М.В. Воронин и С.А. Беэр.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Корсуненко, Анна Владимировна, Москва

1. Беэр С. А. 1996. Региональные причинно-следственные связи между различными загрязнениями и заболеваемостью людей паразитами. // Региональные проблемы и управление здоровьем населения России. М.: РАЕН. С. 116-124.

2. Беэр С. А. 2000. Среда мегаполиса и экологические проблемы паразитологии. // Проблемы биомедицины на рубеже XXI в. М.: РАЕН. С. 50-63.

3. Беэр С. А., Воронин М. В. 2007. Церкариозы в урбанизированных экосистемах. // М.: Наука, с.

4. Галактионов К. В., Добровольский А. А. 1998. Происхождение и эволюция жизненных циклов трематод. // С.-Петербург: Изд-во «Наука». 404 с.

5. Гвоздев В. А. 1998. Подвижная ДНК эукариот // Соросовский образовательный журнал. Т. 8. №. С. 8-14.

6. Гинецинская Т. А. 1968. Трематоды их жизненные циклы, биология и эволюция. // Л. с.

7. Гинецинская Т. А., Добровольский А. А. 1978. Частная паразитология. Паразитические простейшие и плоские черви: Учеб. Пособие для биолог, спец. Вузов // М: Высш. школа. 303 с. с.

8. Добровольский А. А., Галактионов К. В., Мухамедов Г. К., Синха Б. К., Тихомиров И. А. 1983. Партеногенетические поколения трематод // Тр. Ленингр. о-ва естествоиспытателей. Т. 82. № 4. С. 1-108.

9. Жимулёв И. Ф. 2003. Общая и молекулярная генетика: Учеб. пособие. // Новосибирск: Сиб. универ. изд-во. с.

10. Зайцев Г. Н. 1984. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. // М.: Наука, с.

11. Курочкин Ю. В. 1959. О церкариальных дерматитах человека в дельте Волги // Helmintología. Т. № 1/4. С. 225.

12. Морозова Е. В., Рысков А. П., Семенова С.К. С. 2002. RAPD-изменчивость двух видов трематод (Fasciola hepatica и Dicrocoelium dendriticum) из популяции крупного рогатого скота // Генетика. Т. 28. № 8. С. 1155-1162.

13. Скрябин К. И. 1948. Трематоды животных и человека. Основы трематодологии. // М., Л.: Изд-во Академии наук СССР. с.

14. Халтурин К. В., Михайлова Н. А., Гранович А. И. 2000. Генетическая неоднородность природных популяций партенит Microphallus piriformes и М. pygmaeus II Паразитология. Т. 34. № 6. С. 486-500.

15. Чеботарев Р. С. 1957. Шистосоматидный дерматит у человека // Мед. паразитология. Т. №2. С. 172-175.

16. Abbasi I., King С. H., Sturrock R. F., Kariuki C., Muchiri E. and Hamburger J. 2007. Differentiation of Schistosoma haematobium from related schistosomes by PCR amplifying an inter-repeat sequence // Am J Trop Med Hyg. V. 76. № 5. P. 950-955.

17. Adlard R. D., Barker S. C., Blair D. and Cribb Т. H. 1993. Comparison of the second internal transcribed spacer (ribosomal DNA) from populations and species of Fasciolidae (Digenea) // Int J Parasitol. V. 23. № 3. P. 423-425.

18. Aldhoun J. A., Faltynkova A., Karvonen A. and Horak P. 2009a. Schistosomes in the north: a unique finding from a prosobranch snail using molecular tools // Parasitol Int. V. 58. №3. P. 314-317.

19. Aldhoun J. A., Kolarova L., Horak P. and Skirnisson K. 2009b. Bird schistosome diversity in Iceland: molecular evidence // J Helminthol. V. 83. № 2. P. 173-180.

20. Anderson G. R. and Barker S. C. 1993. Species differentiation in the Didymozoidae (Digenea): restriction fragment length differences in internal transcribed spacer and 5.8S ribosomal DNA // Int J Parasitol. V. 23. № 1. P. 133-136.

21. Appleton C. C. and Brock K. 1986. The penetration of mammalian skin by cercariae of Trichobilharzia sp. (Trematoda: Schistosomatidae) from South Africa // Onderstepoort J Vet Res. V. 53. № 4. P. 209-211.

22. Arkhipova I. R. 2006. Distribution and phylogeny of Penelope-like elements in eukaryotes // Syst Biol. V. 55. № 6. P. 875-885.

23. Arkhipova I. R., Pyatkov K. I., Meselson M. and Evgen'ev M. B. 2003. Retroelements containing introns in diverse invertebrate taxa // Nature Genetics. V. 33. № 2. P. 123-124.

24. Attwood S. W., Upatham E. S., Meng X. H., Qiu D. C. and Southgate V. R. 2002. The phylogeography of Asian Schistosoma (Trematoda: Schistosomatidae) // Parasitology. V. 125. № Pt 2. P. 99-112.

25. Bae Y. A. and Kong Y. 2003. Evolutionary course of CsRnl long-terminal-repeat retrotransposon and its heterogeneous integrations into the genome of the liver fluke, Clonorchis sinensis // Korean J Parasitol. V. 41. № 4. P. 209-219.

26. Barber K. E., Mkoji G. M. and Loker E. S. 2000. PCR-RFLP analysis of the ITS2 region to identify Schistosoma haematobium and S. bovis from Kenya // Am J Trop Med Hyg. V. 62. № 4. P. 434-440.

27. Barker S. C. and Blair D. 1996. Molecular phylogeny of Schistosoma species supports traditional groupings within the genus // J Parasitol. V. 82. № 2. P. 292-298.

28. Barral V., Morand S., Pointier J. P. and Theron A. 1996. Distribution of schistosome genetic diversity within naturally infected Rattus rattus detected by RAPD markers // Parasitology. V. 113 ( Pt 6). P. 511-517.

29. Barsiene J. V. 1993. The chromosome sets of trematodes. // Parazitologiia. V. 27. № 4. P. 336-353.

30. Bayne C. J. and Grevelding C. G. 2003. Cloning of Schistosoma mansoni sporocysts in vitro and detection of genetic heterogeneity among individuals within clones // J Parasitol. V. 89. №5. P. 1056-1060.

31. Bell A. S., Sommerville C. and Tellervo Valtonen E. 2001. A molecular phylogeny of the genus Ichthyocotylurus (Digenea, Strigeidae) // Int J Parasitol. V. 31. № 8. P. 833-842.

32. Benson G. 1999. Tandem repeats finder: a program to analyze DNA sequences // Nucleic Acids Res. V. 27. № 2. P. 573-580.

33. Berg D. E. and Howe M. M. 1989. Mobile DNA. // Washington, USA: American Society of Microbiology, c.

34. Betran E. and Long M. 2002. Expansion of genome coding regions by acquisition of new genes // Genetica. V. 115. № 1. P. 65-80.

35. Biemont C. and Vieira C. 2006. Genetics: junk DNA as an evolutionary force // Nature. V. 443. №7111. P. 521-524.

36. Biessmann H., Champion L. E., O'Hair M., Ikenaga K., Kasravi B. and Mason J. M. 1992. Frequent transpositions of Drosophila melanogaster HeT-A transposable elements to receding chromosome ends // EMBO J. V. 11. № 12. P. 4459-4469.

37. Blair D. 2000. Genomes of Paragonimus westermani and related species: current state of knowledge // Int J Parasitol. V. 30. № 4. P. 421-426.

38. Blair D., Campos A., Cummings M. P. and Laclette J. P. 1996. Evolutionary biology of parasitic platyhelminths: The role of molecular phylogenetics // Parasitol Today. V. 12. № 2. P. 66-71.

39. Bourns T. K., Ellis F. C. and Rau M. E. 1973. Migration and development of Trichobilharzia ocellata (Trematoda: Schistosomatidae) in its duck hosts // Can J Zool. V. 51. №10. P. 1021-1030.

40. Bowles J., Blair D. and McManus D. P. 1995. A molecular phylogeny of the human schistosomes // Mol Phylogenet Evol. V. 4. №> 2. P. 103-109.

41. Bowles J., Hope M., Tiu W. U., Liu X. and McManus D. P. 1993. Nuclear and mitochondrial genetic markers highly conserved between Chinese and Philippine Schistosoma japonicum // Acta Trop. Y. 55. № 4. P. 217-229.

42. Boyle J. P., Wu X. J., Shoemaker C. B. and Yoshino T. P. 2003. Using RNA interference to manipulate endogenous gene expression in Schistosoma mansoni sporocysts // Mol Biochem Parasitol. V. 128. № 2. P. 205-215.

43. Brant S. V. and Loker E. S. 2009. Molecular systematics of the avian schistosome genus Trichobilharzia (Trematoda: Schistosomatidae) in North America // J Parasitol. V. 95. № 4. P. 941-963.

44. Brennecke J., Aravin A. A., Stark A., Dus M., Kellis M., Sachidanandam R. and Hannon G. J. 2007. Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila // Cell. V. 128. № 6. P. 1089-1103.

45. Brindley P. J., Laha T., McManus D. P. and Loukas A. 2003. Mobile genetic elements colonizing the genomes of metazoan parasites // Trends Parasitol. V. 19. № 2. P. 79-87.

46. Brindley P. J., Lewis F. A., McCutchan T. F., Bueding E. and Sher A. 1989. A genomic change associated with the development of resistance to hycanthone in Schistosoma mansoni // Mol Biochem Parasitol. V. 36. № 3. P. 243-252.

47. Britten R. J. 1996. DNA sequence insertion and evolutionary variation in gene regulation // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 93. № 18. P. 9374-9377.

48. Brumpt E. 1931. Cercaria ocellata determinant la dermatite des nageurs provient d une bilharzie des canrds // C.r. Acad Sci. V. 193. P. 612-614.

49. Corces V. G. and Geyer P. K. 1991. Interactions of retrotransposons with the host genome: the case of the gypsy element of Drosophila // Trends Genet. V. 7. № 3. P. 86-90.

50. Cort W. W. 1928. Schistosome dermatitis in the United States (Michigan) // J Amer Med Assoc. V. 90. P. 1027-1029.

51. Cribb T. H., Bray R. A., Olson P. D. and Littlewood D. T. 2003. Life cycle evolution in the digenea: a new perspective from phylogeny // Adv Parasitol. V. 54. P. 197-254.

52. Davies C. M., Webster J. P., Kruger O., Munatsi A., Ndamba J. and Woolhouse M. E. 1999. Host-parasite population genetics: a cross-sectional comparison of Bulinus globosus and Schistosoma haematobium // Parasitology. V. 119 ( Pt 3). P. 295-302.

53. DeMarco R., Machado A. A., Bisson-Filho A. W. and Verjovski-Almeida S. 2005. Identification of 18 new transcribed retrotransposons in Schistosoma mansoni // Biochem Biophys Res Commun. V. 333. № 1. P. 230-240.

54. DeMarco R., Venancio T. M. and Verjovski-Almeida S. 2006. SmTRCl, a novel Schistosoma mansoni DNA transposon, discloses new families of animal and fungi transposons belonging to the CACTA superfamily // BMC Evol Biol. V. 6. P. 89.

55. Despres L., Imbert-Establet D. and Monnerot M. 1993. Molecular characterization of mitochondrial DNA provides evidence for the recent introduction of Schistosoma mansoni into America // Mol Biochem Parasitol. V. 60. № 2. P. 221-229.

56. Despres L., Kruger F. J., Imbert-Establet D. and Adamson M. L. 1995. ITS2 ribosomal RNA indicates Schistosoma hippopotami is a distinct species // Int J Parasitol. V. 25. № 12. P. 1509-1514.

57. Dimitri P., Junakovic N. and Area B. 2003. Colonization of heterochromatic genes by transposable elements in Drosophila // Mol Biol Evol. V. 20. № 4. P. 503-512.

58. Drew A. C., Brindley P. J., Lewis F. A., Liang Y. S. and Minchella D. J. 1998. Tandemly repeated genomic sequence demonstrates inter- and intra-strain genetic variation in Schistosoma japonicum // Trop Med Int Health. V. 3. № 5. P. 373-380.

59. Drew A. C., Minchella D. J., King L. T., Rollinson D. and Brindley P. J. 1999. SR2 elements, non-long terminal repeat retrotransposons of the RTE-1 lineage from the human blood fluke Schistosoma mansoni // Mol Biol Evol. V. 16. № 9. P. 1256-1269.

60. Driscoll A. J., Kyle J. L. and Remais J. 2005. Development of a novel PCR assay capable of detecting a single Schistosoma japonicum cercaria recovered from Oncomelania hupensis // Parasitology. V. 131. № Pt 4. P. 497-500.

61. Dvorak J., Vanacova S., Hampl V., Flegr J. and Horak P. 2002. Comparison of european Trichobilharzia species based on ITS1 and ITS2 sequences // Parasitology. V. 124. № Pt 3. P. 307-313.

62. Dybdahl M. F. and Lively C. M. 1996. The geography of coevolution: comparative population structures for a snail and its trematode parasite // Evolution. V. 50. P. 22642275.

63. Evgen'ev M. B. and Arkhipova I. R. 2005. Penelope-like elements—a new class of retroelements: distribution, function and possible evolutionary significance // Cytogenet Genome Res. V. 110. № 1-4. P. 510-521.

64. Excoffier L., Laval G. and Schneider S. 2005. Arlequin (version 3.0): an integrated software package for population genetics data analysis // Evol Bioinform Online. V. 1. P. 47-50.

65. Ferte H., Depaquit J., Carre S., Villena I. and Leger N. 2005. Presence of Trichobilharzia szidati in Lymnaea stagnalis and T. franki in Radix auricularia in northeastern France: molecular evidence // Parasitol Res. V. 95. № 2. P. 150-154.

66. Feschotte C. 2004. Merlin, a New Superfamily of DNA Transposons Identified in Diverse Animal Genomes and Related to Bacterial IS 1016 Insertion Sequences // Molecular Biology and Evolution. V. 21. № 9. P. 1769-1780.

67. Fire A., Xu S., Montgomery'M. K., Kostas S. A., Driver S. E. and Mello C. C. 1998. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans // Nature. V. 391. № 6669. P. 806-811.

68. Gazave E., Marques-Bonet T., Fernando O., Charlesworth B. and Navarro A. 2007. Patterns and rates of intron divergence between humans and chimpanzees // Genome Biol. V. 8. №2. P. R21.

69. Gibson D. I., Jones A. and Bray R. A. 2002. Keys to the Trematoda. // Wallingford: CABI Publishing, c.

70. Granovitch A. I. and Mikhailova N. A. 2004. Rocky shore trematodes of the west coast of Sweden: distibution and life cycle strategies // Acta Parasitologica. V. 49. № 3. P. 228-236.

71. Grevelding C. G. 1995. The female-specific W1 sequence of the Puerto Rican strain of Schistosoma mansoni occurs in both genders of a Liberian strain // Mol Biochem Parasitol. V. 71. №2. P. 269-272.

72. Grevelding C. G. 1999. Genomic instability in Schistosoma mansoni // Mol Biochem Parasitol. V. 101. № 1-2. P. 207-216.

73. Grossman A. I., McKenzie R. and Cain G. D. 1980. Sex heterochromatin in Schistosoma mansoni // J Parasitol. V. 66. № 2. P. 368-370.

74. Haas W. and Pietsch U. 1991. Migration of Trichobilharzia ocellata schistosomula in the duck and in the abnormal murine host // Parasitol Res. V. 77. № 7. P. 642-644.

75. Haas W. and van de Roemer A. 1998. Invasion of the vertebrate skin by cercariae of Trichobilharzia ocellata: penetration processes and stimulating host signals // Parasitol Res. V. 84. № 10. P. 787-795.

76. Hamburger J., Turetski T., Kapeller I. and Deresiewicz R. 1991. Highly repeated short DNA sequences in the genome of Schistosoma mansoni recognized by a species-specific probe // Mol Biochem Parasitol. V. 44. № 1. P. 73-80.

77. Hamburger J., Xu Y. X., Ramzy R. M., Jourdane J. and Ruppel A. 1998b. Development and laboratory evaluation of a polymerase chain reaction for monitoring Schistosoma mansoni infestation of water // Am J Trop Med Hyg. V. 59. № 3. P. 468-473.

78. Hanelt B., Adema C. M., Mansour M. H. and Loker E. S. 1997. Detection of Schistosoma mansoni in Biomphalaria using nested PCR // J Parasitol. V. 83. № 3. P. 387-394.

79. Hashimoto K., Watanobe T., Liu C. X., Init I., Blair D., Ohnishi S. and Agatsuma T. 1997. Mitochondrial DNA and nuclear DNA indicate that the Japanese Fasciola species is F. gigantica // Parasitol Res. V. 83. № 3. P. 220-225.

80. Hertel J., Haberl B., Hamburger J. and Iiaas W. 2003. Description of a tandem repeated DNA sequence of Echinostoma caproni and methods for its detection in snail and plankton samples // Parasitology. V. 126. № Pt 5. P. 443-449.

81. Hertel J., Hamburger J., Haberl B. and Haas W. 2002. Detection of bird schistosomes in lakes by PCR and filter-hybridization // Exp Parasitol. V. 101. № 1. P. 57-63.

82. Hertel L. A., Barbosa C. S., Santos R. A. and Loker E. S. 2004. Molecular identification of symbionts from the pulmonate snail Biomphalaria glabrata in Brazil // J Parasitol. V. 90. №4. P. 759-763.

83. Heussler V., Kaufinann H., Glaser I., Ducommun D., Muller C. and Dobbelaere D. 1998. A DNA probe for the detection of Dicrocoelium dendriticum in ants of Formica spp. and Lasius spp // Parasitol Res. V. 84. № 6. P. 505-508.

84. Heussler V., Kaufmann H., Strahm D., Liz J. and Dobbelaere D. 1993. DNA probes for the detection of Fasciola hepatica in snails // Mol Cell Probes. V. 7. № 4. P. 261-267.

85. Horak P., Dvorak J., Kolarova L. and Trefil L. 1999. Trichobilharzia regenti, a pathogen of the avian and mammalian central nervous systems // Parasitology. V. 119 ( Pt 6). P. 577581.

86. Horak P. and Kolarova L. 2000. Survival of bird schistosomes in mammalian lungs // Int J Parasitol. V. 30. № 1. P. 65-68.

87. Horak P., Kolarova L. and Adema C. M. 2002. Biology of the schistosome genus Trichobilharzia//Adv Parasitol. V. 52. P. 155-233.

88. Horak P., Kovar L., Kolarova L. and Nebesarova J. 1998. Cercaria-schistosomulum surface transformation of Trichobilharzia szidati and its putative immunological impact // Parasitology. V. 116 (Pt2). P. 139-147.

89. Hradkova K. 2001. Development and migration of Trichobilharzia regenti in ducks and mice // Helmintología. V. 38. № 4. P. 247.

90. Itagaki T. and Tsutsumi K. 1998. Triploid form of Fasciola in Japan: genetic relationships between Fasciola hepatica and Fasciola gigantica determined by ITS-2 sequence of nuclear rDNA // Int J Parasitol. V. 28. № 5. P. 777-781.

91. Itagaki T., Tsutsumi K. I., Ito K. and Tsutsumi Y. 1998. Taxonomic status of the Japanese triploid forms of Fasciola: comparison of mitochondrial ND1 and COI sequences with F. hepatica and F. gigantica // J Parasitol. V. 84. № 2. P. 445-448.

92. Iwagami M., Ho L. Y., Su K., Lai P. F., Fukushima M., Nakano M., Blair D., Kawashima K. and Agatsuma T. 2000. Molecular phylogeographic studies on Paragonimus westermani in Asia // J Helminthol. V. 74. № 4. P. 315-322.

93. Jansma W. B., Rogers S. H., Liu C. L. and Bueding E. 1977. Experimentally produced resistance of Schistosoma mansoni to hycanthone // Am J Trop Med Hyg. V. 26. № 5 Pt 1. P. 926-936.

94. Jarne P. and Theron A. 2001. Genetic structure in natural populations of flukes and snails: a practical approach and review// Parasitology. V. 123 Suppl. P. S27-40.

95. Johnston D. A. 2006. Genomes and Genomics of Parasitic Flatforms. // Parasitic flatworms: molecular biology, biochemistry, immunology and physiology. A. G. Maule and N. J. Marks. London, UK: CAB International. C. 37-80.

96. Johnston D. A., Kane R. A. and Rollinson D. 1993. Small subunit (18S) ribosomal RNA gene divergence in the genus Schistosoma // Parasitology. V. 107 ( Pt 2). P. 147-156.

97. Jouet D., Ferte H., Depaquit J., Rudolfova J., Latour P., Zanella D., Kaltenbach M. L. and Leger N. 2008. Trichobilharzia spp. in natural conditions in Annecy Lake, France // Parasitol Res. V. 103. № 1. P. 51-58.

98. Jousson O. and Bartoli P. 2001. Molecules, morphology and morphometries of Cainocreadium labracis and Cainocreadium dentecis n. sp. (Digenea: Opecoelidae) parasitic in marine fishes // Int J Parasitol. V. 31. № 7. P. 706-714.

99. Jousson O., Bartoli P. and Pawlowski J. 1998a. Molecular phylogeny of Mesometridae (Trematoda, Digenea) with its relation to morphological changes in parasites // Parasite. V. 5. № 4. P. 365-369.

100. Jousson O., Bartoli P., Zaninetti L. and Pawlowski J. 1998b. Use of the ITS rDNA for elucidation of some life-cycles of Mesometridae (Trematoda, Digenea) // Int J Parasitol. V. 28. №9. P. 1403-1411.

101. Junakovic N., Terrinoni A., Di Franco C., Vieira C. and Loevenbruck C. 1998. Accumulation of transposable elements in the heterochromatin and on the Y chromosome of Drosophila simulans and Drosophila melanogaster // J Mol Evol. V. 46. № 6. P. 661668.

102. Kane R. A. and Rollinson D. 1994. Repetitive sequences in the ribosomal DNA internal transcribed spacer of Schistosoma haematobium, Schistosoma intercalatum and Schistosoma mattheei // Mol Biochem Parasitol. V. 63. № 1. P. 153-156.

103. Kaplan R. M., Dame J. B., Reddy G. R. and Courtney C. H. 1995. A repetitive DNA probe for the sensitive detection of Fasciola hepatica infected snails // Int J Parasitol. V. 25. № 5. P. 601-610.

104. Kaukas A., Dias Neto E., Simpson A. J., Southgate V. R. and Rollinson D. 1994. A phylogenetic analysis of Schistosoma haematobium group species based on randomly amplified polymorphic DNA // Int J Parasitol. V. 24. № 2. P. 285-290.

105. Kazazian H. H., Jr. 2004. Mobile elements: drivers of genome evolution // Science. V. 303. №5664. P. 1626-1632.

106. Keeney D. B., Waters J. M. and Poulin R. 2007a. Clonal diversity of the marine trematode Maritrema novaezealandensis within intermediate hosts: the molecular ecology of parasite life cycles // Mol Ecol. V. 16. № 2. P. 431-439.

107. Keeney D. B., Waters J. M. and Poulin R. 2007b. Diversity of trematode genetic clones within amphipods and the timing of same-clone infections // Int J Parasitol. V. 37. № 3-4. P. 351-357.

108. Kidwell M. G. and Lisch D. 1997. Transposable elements as sources of variation in animals and plants // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 94. № 15. P. 7704-7711.

109. Kramerov D. A. and Vassetzky N. S. 2005. Short retroposons in eukaryotic genomes // Int Rev Cytol. V. 247. P. 165-221.

110. Krautz-Peterson G., Radwanska M., Ndegwa D., Shoemaker C. B. and Skelly P. J. 2007. Optimizing gene suppression in schistosomes using RNA interference // Mol Biochem Parasitol. V. 153. № 2. P. 194-202.

111. Laha T., Kewgrai N., Loukas A. and Brindley P. J. 2005. Characterization of SR3 reveals abundance of non-LTR retrotransposons of the RTE clade in the genome of the human blood fluke, Schistosoma mansoni // BMC Genomics. V. 6. P. 154.

112. Laha T., Loukas A., Verity C. K., McManus D. P. and Brindley P. J. 2001. Gulliver, a long terminal repeat retrotransposon from the genome of the oriental blood fluke Schistosoma japonicum // Gene. V. 264. № 1. P. 59-68.

113. Le T. H., Blair D. and McManus D. P. 2001a. Complete DNA sequence and gene organization of the mitochondrial genome of the liverfluke, Fasciola hepatica L. (Platyhelminthes; Trematoda) // Parasitology. V. 123. № Pt 6. P. 609-621.

114. Le T. H., Humair P. F., Blair D., Agatsuma T., Littlewood D. T. and McManus D. P. 2001b. Mitochondrial gene content, arrangement and composition compared in African and Asian schistosomes // Mol Biochem Parasitol. V. 117. № 1. P. 61-71.

115. Lister C., Jackson D. and Martin C. 1993. Transposon-induced inversion in Antirrhinum modifies nivea gene expression-to give a novel flower color pattern under the control of cycloidearadialis // Plant Cell. V. 5. № 11. P. 1541-1553.

116. Littlewood D. T. and Johnston D. A. 1995. Molecular phylogenetics of the four Schistosoma species groups determined with partial 28S ribosomal RNA gene sequences // Parasitology. V. Ill ( Pt2). P. 167-175.

117. Littlewood D. T., Rohde K., Bray R. A. and Herniou E. A. 1999: Phylogeny of Platyhelminthes and the evolution of parasitism // Biological Journal of the Linnean Society. V. 681 P. 20.

118. Lively C. M. 1989. Adaptation by a parasitic trematode to;local populations of its snail // Evolution. V. 43. P.1 1663-1671.

119. Lo C. M., Morgan J. A., Galzin R. and Cribb T. H. 2001. Identicaldigeneans in coral reef fishes from. French Polynesia and the Great Barrier. Reef-(Australia) demonstrated" by morphology and molecules // Int J Parasitol: V. 31. №14. P.' 1573:1578}

120. Lushai G. and Loxdale H. D. 2002. The biological improbability of a clone // Genet Res. V. 79.'№ l.P. 1-9.

121. Luton K., Walker D. and Blair D. 1992. Comparisons of ribosomal internal transcribed spacers from two congeneric species of flukes (Platyhelminthes: Trematoda: Digenea) // Mol Biochem Parasitol. V. 56. № 2. P. 323-327.

122. Malik H. S., Burke W. D. and Eiekbush T. H. 1999. The age and evolution of non-LTR retrotransposable elements // Mol Biol Evol. V. 16. № 6. P. 793-805.

123. Malik H. S. and Eiekbush T. H. 1999. Modular evolution of the integrase domain in the Ty3/Gypsy class of LTR retrotransposons // J Virol. V. 73. № 6. P. 5186-5190.

124. Malik H. S. and Eiekbush T. H. 2001. Phylogenetic analysis of ribonuclease H domains suggests a late, chimeric origin of LTR retrotransposable elements and retroviruses // Genome Res. V. 11. № 7. P. 1187-1197.

125. Mandrioli M. 2000. Mariner-like transposable elements are interspersed within the rDNA-associated heterochromatin of the pufferfish Tetraodon fluviatilis (Osteichthyes) // Chromosome Res. V. 8. № 2. P. 177-179.

126. Marx K. A., Bizzaro J. W., Blake R. D., Hsien Tsai M. and Feng Tao L. 2000. Experimental DNA melting behavior of the three major Schistosoma species // Mol Biochem Parasitol. V. 107. № 2. P. 303-307.

127. McGarry J. W., Ortiz P. L., Hodgkinson J. E., Goreish I. and Williams D. J. 2007. PCR-based differentiation of Fasciola species (Trematoda: Fasciolidae), using primers based on RAPD-derived sequences // Ann Trop Med Parasitol. V. 101. № 5. P. 415-421.

128. Morgan J. A. and Blair D. 1995. Nuclear rDNA ITS sequence variation in the trematode genus Echinostoma: an aid to establishing relationships within the 37-collar-spine group // Parasitology. V. 111 ( Pt 5). P. 609-615.

129. Morgan J. A. and Blair D. 1998a. Relative merits of nuclear ribosomal internal transcribed spacers and mitochondrial COl and ND1 genes for distinguishing among Echinostoma species (Trematoda) // Parasitology. V. 116 ( Pt 3). P. 289-297.

130. Morgan J. A. and Blair D. 1998b. Trematode and monogenean rRNA ITS2 secondary structures support a four-domain model // J Mol Evol. V. 47. № 4. P. 406-419.

131. Muller N., Zimmermann V., Hentrich B. and Gottstein B. 1996. Diagnosis of Neospora caninum and Toxoplasma gondii infection by PCR and DNA hybridization immunoassay // J Clin Microbiol. V. 34. № 11. P. 2850-2852.

132. Mulvey M., Aho J. M., Lydeard C., Leberg P. L. and Smith A. 1991. Comparative population genetic structure of a parasite (Fascioloides magna) and its definitive host // Evolution. V. 45. P. 1628-1640.

133. Nei M. and Li W. H. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 76. № 10. P. 5269-5273.

134. Niewiadomska K. and Laskowski K. 2002. Systematic relationships among six species of Diplostomum Nordmann, 1832 (Digenea) based on morphological and molecular data // Acta Parasitologica. V. 47. P. 20-28.

135. Oliver K. R. and Greene W. K. 2009. Transposable elements: powerful facilitators of evolution // BioEssays. V. 31. № 7. P. 703-714.

136. Olivier L. 1953. Observations on the migration of avian schistosomes in mammals previously unexposed to cercariae // J Parasitol. V. 39. № 3. P. 237-246.

137. Olson P. D., Cribb T. H., Tkach V. V., Bray R. A. and Littlewood D. T. 2003. Phylogeny and classification of the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda) // Int J Parasitol. V. 33. № 7. P. 733-755.

138. Pearson J. C. 1972. A phylogeny of life-cycle patterns of the Digenea // Adv Parasitol. V. 10. P. 153-189.

139. Pontes L. A., Dias-Neto E. and Rabello A. 2002. Detection by polymerase chain reaction of Schistosoma mansoni DNA in human serum and feces // Am J Trop Med Hyg. V. 66. № 2. P. 157-162.

140. Prugnolle F., Liu H., de Meeus T. and Balloux F. 2005a. Population genetics of complex life-cycle parasites: an illustration with trematodes // Int J Parasitol. V. 35. № 3. P. 255263.

141. Prugnolle F., Theron A., Pointier J. P., Jabbour-Zahab R., Jarne P., Durand P. and de Meeus T. 2005b. Dispersal in a parasitic worm and its two hosts: consequence for local adaptation // Evolution. V. 59. № 2. P. 296-303.

142. Quack T., Doenhoff M., Kunz W. and Grevelding C. G. 1998. Schistosoma mansoni: the varying occurrence of repetitive elements in different strains shows sex-specific polymorphisms // Exp Parasitol. V. 89. № 2. P. 222-227.

143. Reusch T. B. H., Rauch G. and Kalbe M. 2004. Polymorphic microsatellite loci for the trematode Diplostomum pseudospathaceum II Molecular Ecology Notes. V. 4. P. 577-579.

144. Rodrigues N. B., Coura Filho P., de Souza C. P., Jannoti Passos L. K., Dias-Neto E. and Romanha A. J. 2002a. Populational structure of Schistosoma mansoni assessed by DNA microsatellites // Int J Parasitol. V. 32. № 7. P. 843-851.

145. Rollinson D., Kaukas A., Johnston D. A., Simpson A. J. and Tanaka M. 1997. Some molecular insights into schistosome evolution // Int J Parasitol. V. 27. № 1. P. 11-28.

146. Rudolfova J., Littlewood D. T., Sitko J. and Horak P. 2007. Bird schistosomes of wildfowl in the Czech Republic and Poland // Folia Parasitol (Praha). V. 54. № 2. P. 88-93.

147. Rushforth A. M. and Anderson P. 1996. Splicing removes the Caenorhabditis elegans transposon Tel from most mutant pre-mRNAs // Mol Cell Biol. V. 16. № 1. P. 422-429.

148. Sandoval H., Manga-Gonzalez Y., Campo R., Garcia P., Castro J. M. and Perez de la Vega M. 1999. Preliminary study on genetic variability of Dicrocoelium dendriticum determined by random amplified polymorphic DNA // Parasitol Int. V. 48. № 1. P. 21-26.

149. Schulenburg J. H. G., Englisch U. and Wagel J.-W. 1999. Evolution of ITS1 rDNA in the Digenea (Platyhelminthes: Trematoda): 3' end sequence conservation and its phylogenetic utility // J Mol Evol. V. 48. P. 2-12.

150. Semyenova S. K., Morozova E. V. and Chrisanfova G. G. 2003. RAPD variability and genetic diversity in two populations of liver fluke, Fasciola hepatica II Acta Parasitológica. V. 48. №2. P. 125-130.

151. Sermswan R., Mongkolsuk S., Panyim S. and Sirisinha S. 1991. Isolation and characterization of Opisthorchis viverrini specific DNA probe // Mol Cell Probes. V. 5. № 6. P. 399-407.

152. Shianna K. V., Rytter R. and Spanier J. G. 1998. Randomly amplified polymorphic DNA PCR analysis of bovine Cryptosporidium parvum strains isolated from the watershed of the Red River of the North // Appl Environ Microbiol. V. 64. № 6. P. 2262-2265.

153. Shiff C., Brouwer K. C. and Clow L. 2000. Schistosoma haematobium: population genetics of S. haematobium by direct measurement of parasite diversity using RAPD-PCR // Exp Parasitol. V. 96. № 1. P. 47-51.

154. Sire C., Durand P., Pointier J. P. and Theron A. 2001a. Genetic diversity of Schistosoma mansoni within and among individual hosts (Rattus rattus): infrapopulation differentiation at microspatial scale // Int J Parasitol. V. 31. № 14. P. 1609-1616.

155. Sire C., Langand J., Barral V. and Theron A. 2001b. Parasite (Schistosoma mansoni) and host (Biomphalaria glabrata) genetic diversity: population structure in a fragmented landscape // Parasitology. V. 122. № Pt 5. P. 545-554.

156. Skelly P. J., Da'dara A. and Harn D. A. 2003. Suppression of cathepsin B expression in Schistosoma mansoni by RNA interference // Int J Parasitol. V. 33. № 4. P. 363-369.

157. Sorensen R. E., Curtis J. and Minchella D. J. 1998. Intraspecific variation in the rDNA its loci of 37-collar-spined echinostomes from North America: implications for sequence-based diagnoses and phylogenetics // J Parasitol. V. 84. № 5. P. 992-997.

158. Spakulova M., Horak P. and Dvorak J. 2001. The karyotype of Trichobilharzia regenti Horak, Kolarova et Dvorak, 1998 (Digenea: Schistosomatidae), a nasal avian schistome in Central Europe // Parasitol Res. V. 87. № 6. P. 479-483.

159. Spotila L. D., Hirai H., Rekosh D. M. and Lo Verde P. T. 1989. A retroposon-like short repetitive DNA element in the genome of the human blood fluke, Schistosoma mansoni // Chromosoma. V. 97. № 6. P. 421-428.

160. Spotila L. D., Rekosh D. M., Boucher J. M. and Lo Verde P. T. 1987. A cloned DNA probe identifies the sex of Schistosoma mansoni cercariae // Mol Biochem Parasitol. V. 26. № 12. P. 17-20.

161. Spotila L. D., Rekosh D. M. and LoVerde P. T. 1991. Polymorphic repeated DNA element in the genome of Schistosoma mansoni // Mol Biochem Parasitol. V. 48. № 1. P. 117-120.

162. Stohler R. A., Curtis J. and Minchella D. J. 2004. A comparison of microsatellite polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Schistosoma mansoni // Int J Parasitol. V. 34. № 5. P. 595-601.

163. Suomalainen E., Saura A. and J. L. 1987. Cytology and evolution in parthenogenesis // Boca Raton, Florida, USA: CRC Press. 216 c.

164. Tabara H., Sarkissian M., Kelly W. G., Fleenor J., Grishok A., Timmons L., Fire A. and Mello C. C. 1999. The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans // Cell. V. 99. № 2. P. 123-132.

165. Vaury C., Bucheton A. and Pelisson A. 1989. The beta heterochromatic sequences flanking the I elements are themselves defective transposable elements // Chromosoma. V. 98. № 3. P. 215-224.

166. Venancio T. M., Wilson R. A., Verjovski-Almeida S. and DeMarco R. 2010. Bursts of transposition from non-long terminal repeat retrotransposon families of the RTE clade in Schistosoma mansoni // Int J Parasitol. V. 40. № 6. P. 743-749. v

167. Walker T. K., Rollinson D. and Simpson A. J. 1989. A-DNA probe from Schistosoma mansoni allows rapid determination of the sex of larval parasites // Mol Biochem Parasitol. V. 33. № l.P. 93-100.

168. Walsh P. S., Metzger D. A. and Higuchi R. 1991. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material // Biotechniques. V. 10. № 4. P. 506-513.

169. Webster P., Mansour T. E. and Bieber D. 1989. Isolation of a female-specific, highly repeated Schistosoma mansoni DNA probe and its use in an assay of cercarial sex // Mol Biochem Parasitol. V, 36. № 3. P. 217-222.

170. Welsh J. and McClelland M. 1990. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers // Nucleic Acids Res. V. 18. № 24. P. 7213-7218.

171. WHO 2002. Prevention and control of schistosomiasis and soiltransmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee // World Health Organ Tech Rep Ser V. 912. P. 2-3.

172. Williams J. G., Kubelik A. R., Livak K. J., Rafalski J. A. and Tingey S. V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers // Nucleic Acids Res! V. 18. № 22. P. 6531-6535.

173. Williamson V. M., Caswell-Chen E. P., Westerdahl B. B., Wu F. F. and Caryl G. 1997. A PCR Assay to Identify and Distinguish Single Juveniles of Meloidogyne hapla and M. chitwoodi // J Nematol. V. 29. № 1. P. 9-15.

174. Wilson W. D., Johnson P. T., Sutherland D. R., Mone H. and Loker E. S. 2005. A molecular phylogenetic study of the genus Ribeiroia (Digenea): trematodes known to cause limb malformations in amphibians // J Parasitol. V. 91. № 5. P. 1040-1045.

175. Wongratanacheewin S., Pumidonming W., Sermswan R. W., Pipitgool V. and Maleewong W. 2002. Detection of Opisthorchis viverrini in human stool specimens by PCR // J Clin Microbiol. V. 40. № 10. P. 3879-3880.

176. Xiong Y. and Eickbush T. H. 1990. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences // EMBO J. V. 9. № 10. P. 3353-3362.

177. Xu J., Rong R., Zhang H. Q., Shi C. J., Zhu X. Q. and Xia C. M. 2010. Sensitive and rapid detection of Schistosoma japonicum DNA by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) // Int J Parasitol. V. 40. № 3. P. 327-331.

178. Yeh F. C., Yang R. and Boyle T. 1999. POPGENE. Version 1.31. Microsoft Windows-based Freeware for Population Genetic Analysis. University of Alberta. Edmonton, AB, Canada

179. Zarlenga D. S. and Higgins J. 2001. PCR as a diagnostic and quantitative technique in veterinary parasitology // Vet Parasitol. V. 101. № 3-4. P. 215-230.