Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса"

На правах рукописи

Саенко Юрий Владимирович

Изучение органоспецифичных

механизмов оксидативного стресса.

Специальность 03.00,13- физиология 14.00.25 фармакология, клиническая фармакология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск 2005

Работа выполнена на кафедре физиологии и патофизиологии и кафедре фармакологии с куреом клинической фармакологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ульяновский государственный университет»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор, Генинг Татьяна Петровна

доктор биологических наук, профессор, Напалкова Светлана Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Балашов Владимир Павлович доктор биологических наук, профессор Абзалов Ринат Абзалович

Ведущая организация - ГОУ ВПО «Самарский государственный университет»

Защита состоится « ¿У» декабря 2005 года в часов на

заседании диссертационного совета ДМ 212.276.01 при ГОУ ВПО «Ульяновский государственный педагогический университет им. И. Н. Ульянова» по адресу: г. Ульяновск, площадь 100-летия В И. Ленина, 4

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Ульяновский государственный университет им И Н. Ульянова».

Автореферат разослан « » ноября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационно!'О совета,

кандидат биологических паук, доцент О. Н. Валкина

ZU7006

3

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность темы работы

Механизмы оксидативного стресса интенсивно изучаются с середины 60-х годов [Mcllor and Tappel,1966] и в наше время, актуальность и острота этой проблемы не только не снизилась, но и многократно возросла. В настоящий момент мало найдётся патологических состояний, где-бы не было продемонстрировано сопутствующего развития оксидативного стресса. Одним из аспектов многогранной проблемы оксидативного стресса является изучение органоспецифичных механизмов его течения [Dröge,2002].

Известно, что различные органы и ткани в разной степени подвержены действию агентов, вызывающих оксидативный стресс, и демонстрируют различную устойчивость в процессе реализации этого патологического состояния [Бобырев и др.,1994, Meister, 1994]. По мнению ряда исследователей, это связано с различным уровнем экспрессии антиоксидантных ферментов и особенностями метаболизма различных тканей [Mates et, al.,1999, Allen and Tresini,2000, Wild and Mulcahy.2000]. Особенности метаболизма различных типов клегок связаны с устойчивостью к окислительному стрессу через внутриклеточный окислительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) [Schäfer and Buettner,2001], который является производным всех биохимических реакций клетки и вычисляется через отношение концентрации восстановленного глутатиона к концентрации оксиленного глутатиона [Kirlin et al ,1999]. Редокс-потенциал напрямую связан с тяжестью оксидативного стресса, чем он ниже, тем интенсивнее процессы перекисного оксиления биомолекул [Sies.1999, Cai and Jones,1998]. От величины внутриклеточного рсдокс-потенциала и, в частности, от концентрации восстановленного глутатиона зависят также и такие процессы как нролифереция, деление и программируемая клеточная смерть [Li et, al.,1998, Read,2000]. Если интенсивное развитие оксидагивного стресса приводит к некрозу, то его медленное развитие запускает механизмы апоптоза [Read,2000]. В литературе имеется ряд противоречивых данных о зависимости между редокс-потенциалом, показателями нсрскисного окисления липидов и активностью антиоксидантных ферментов в различных тканях и гинах клеток IБобырев и др.,1994, Paolicchi et al.,2002, Schäfer and Buettner.2001]. Понимание этих механизмов позволит целенжтршигенно воздействовать

''ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА

па внутриклеточные процессы путем активации тех или иных генов с целью смягчить последствия оксидативного стресса и предотвратить его развитие по нежелательному сценарию, а именно воспрепятствовать запуску механизмов программируемой клеточной смерти [Allen and Trcsini,2000, Kwak et al..2003].

Нами была использована модель доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса. Доксорубицин (ДОК) относится к семейству антрациклиповых антибиотиков и применяется в онкологии. Однако, наличие у доксорубицина серьёзных кардиотоксичсских [Singal and Iliskovic,1998. Billingham et al.,1978, Lefrak et al.,1973, Burke.1977] и, в меньшей степени, нефротоксических свойств [Lebrecht et al.,2004, Giri et al.,2004] существенно ограничивает его использование в онкологической практике. Существует несколько объяснений цитотоксичности доксорубицина на клеточном уровне, среди них: генерирование с участием ДОК свободных радикалов |Powis,1989, Davies and Doroshow,1986), ингибирование ферментов репликации ДНК |Skladaiiowski and Konopa,1993j, ингибирование клеточных ферментов до'ксорубицинолом (веществом, образующемся в результате биохимических превращений ДОК в клетке) [Forrest et al.,1991], влиянием доксорубицина на механизмы внутриклеточного гомеостаза железа [Minotti et al.,1999]. Однако, но мнению большинства исследователей, в нормальных тканях доксорубицин-индуцированная цитотоксичность связана преимущественно с образованием в клетке супероксиданионрадикалов в результате редокс-циклической активности ДОК, что в итоге приводит к внутриклеточному оксидативному стрессу JMinotti et al..l999, Dorr,1996, Kang et al.,1996, Kotaixiraju et al.,2000] и далее к апоптозу |Kim et al.,2003, Wang et al.,2004]. В связи с этим понимание механизмов токсичности доксорубицина может прояснить как органспсцифичные механизмы ДОК-индуцированпого оксидативного стресса, так и механизмы оксидативного стресса в целом [Minotti et al.,2004].

Для более глубокого понимания особенностей течения оксидативного стресса в различных тканях важно не только изучить воздействие специфического индуктора на чти ткани и их отпет, но еще более важно — проанализировать роль различных участников системного клеточного отпета на оксидативный стресс. Клеточный метаболизм регулируется, в основном, за счёт влияния на экспрессию генов тех или иных белков и ферментов. К настоящему времени накоплен достаточно богатый экспериментальный материал в этой области, который позволяет подобрать узко-специфичные регуляхоры экспрессии

целевых генов. Исходя из целей нашего исследования и анализа литературных данных нами были выбраны вещества, способные увеличивать экспрессию генов ряда ферментов антиоксидантной защиты (глутатион редуктазы. глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1) К таким веществам относятся- мелятонин [Reiter et al.,1999], глицин [Jacob et а]..2003], унитиол [Сао and Li,2004] и эритропоетин [Fisher,2003J.

Вместе с решением чисто теоретической задачи - изучением специфических тканевых механизмов развития оксидативного стресса, важной практической задачей является поиск фармакологических препаратов снижающиъх токсичность ДОК. Снижение токсичности ДОК может быть достигнуто несколькими аутями [Basser and Green,1993]. В частности, снижение токсичности ДОК способствует применение совместно с ДОК хелатора железа дсксразоксана [Hensley et al.,1999, Speyer et al.,1988|. Хотя дексразоксан достаточно эффективно снимает кардиотоксические эффекты ДОК [Green et al.,1990, Speyer et al.,1992], он, как оказалось, существенно снижает и эффективность ДОК в отношении лечения рака [Zhang et al.,2000. Hasinoff et al.,1996]. Одним из перспективных подходов к снижению токсичности антрациклиновых антибиотиков заключаются в поиске веществ, препятствующих развитию ДОК-индуцированного оксидативного стресса [Basser and Green,1993]. Применение антиоксидантов витамина Е, N-ацетилцистеина и пробукола хотя и демонстрировало обнадёживающие результаты в опытах па лабораторных животных [Dorr,1996, Siveski-Iliskovic et al. 1995], но оказалось не эффективным при их применении у людей [Singal et al.,1997, Minotti et al.,2004[. К препаратам, которые потенциально обладают способностью препятствовать развитию оксидативного стресса, можно отнести глицин [Shaikh et al ,1999], мелатонин [Okatani et al.,2000. Duel et al.,1998, Fowler et al.,2003], унитиол [Цветских и др.,2000, Сабирова и др,.2000[ и эритропоетин [Sommerburg et al.,1998, Abdelrahman et al.,2004].

Цель исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса, индуцироваиного доксорубицином, и возможностей его коррекции

Задачи исследования

1. Изучить параметры внутриклеточной антиоксидантной защиты и показатели перекиспого окисления липидов в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

2 Оценить функциональное состояние почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина

3. Рассмотреть влияние экзогенных индукторов антиоксидантных ферментов на состояние системы ПОЛ-антиоксидант в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

4. Изучить роль индукции ферментов антиоксидаитной защиты в регуляции функционального состояния почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

5 Оценить целесообразность применения глицина, мелатонипа, унитиола и эритропоетина с целью снижения токсичности доксорубицина.

Научная новизна исследования. Автором впервые установлено, что через 24 часа после введения ДОК (7,5 мг/кг) интенсивность оксидативного стресса наиболее выражена в тканях почек. В ткани печени признаки оксидативного стресса выражались только в снижение концентрации восстановленного глутатиона. В ткани сердечной мышцы признаков оксидативного стресса не наблюдается Продемонстрирована связь между возникновением ДОК-индуцировапттого стресса и нарушением функций почек, что выражается в росте плазменных концентраций мочевины и креатинина Впервые показана возможность фармакологической коррекции ДОК-индуцировапного оксидативного стресса глицином и эритропоетином. Впервые показано, что ключевым моментом нефропротекторного действия глицина и эритропоетина является предотвращение ими ДОК-индуцированного снижения концентрации восстановленного глутатиона в тканях почек. Продемонстрирована взаимосвязь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редуктазы. Показано, что увеличение активности глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 (НХ01) не приводит к снижению интенсивности ДОК-индуцированного оксидативного пресса

Основные положения выносимые на защиту

1. Однократное введение ДОК в дозе 7,5 мг/кг через 24 часа после введения не приводит к развитию оксидативного стресса в сердечной мышце и не вызывает нарушение её функционального состояния.

2. Однократное введение ДОК в дозе 7,5 мг/кг через 24 часа после введения приводит к снижению уровня восстановленного глутатиона в тканях печени,пе сопровождающегося изменением активности антиоксидантных ферментов и показателей оксидативной модификации

биомолекул, а также не вызывает нарушений функционального состояния печени.

3. Однократное введение ДОК в дозе 7,5 мг/кг через 24 часа после введения приводит к развитию оксидативного стресса в ткани почек и вызывает нарушение их функционального состояния:

4. Применение глицина, мелатонина и эритропоетина предотвращает развитие оксидативного стресса, вызванного ДОК в тканях почек и нормализует их функциональное состояние

5. При развитии ДОК индуцированного оксидативного стресса в тканях почек определяющую роль играет изменение величины внутриклеточного редокс-потенциала, обеспечиваемого глутатионредуктазой. Ипгибирование редокс-циклических реакций доксорубицина посредством НХ01 и(или) увеличение конъюгации ДОК с глутатионом катализируемое ферментом глутатион-Э-трансферазой не предотвращает развитие оксидативного стресса в ткани почек.

6. Мелатонии, глицин и эритропоетин могут быть использованы с целью снижения ДОК-индуцированного оксидативного стресса.

Научно-практическая ценность работы. Показана взаимосвязь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редуктазы в ткани почек. Установлена принципиальная возможность снижения доксорубицин-индуцированной токсичности глицином, мелатонином и эритропостином. Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования глицина, мелатонина и эритропоетина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклинопых антибиотиков.

Апробация работы. Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральных заседаниях сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факулыеха Ульяновского государственного университета, на ежегодных научно-практических межрегиональных конференциях врачей Ульяновской области (Ульяновск, 1999, 2000, 2004), международной конференции нефрологов (International society of Nephrology, Дрезден, 2004. участие в конференции поддержано грантом этого общества), XII международном конгрессе «Человек и лекарство», V-ежегодной конференции «Сердечная недостаточность 2004», международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта Гурзуф, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 статей ( в том числе 4 в центральных журналах) 5 тезисов (всероссийские и международные конференции и симпозиумы)

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, включает 13 таблиц, 29 рисунков, 237 источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследование выполнено на 90 самцах беспородных белых крыс весом 260 - 280 г, возраста 21-23 недели. Животные были разделены на б групп: контрольная группа (Контроль, п=15); группа, в которой животным внутрибрюшино вводился доксорубицин ("Фармсинтез", Москва) из расчёта 7,5 мг/кг массы животного (Доксорубицин, п—15); группа, в которой животным перед инъекцией ДОК внутривенно вводили гормон эпифиза - мелатонин (1СМ, США) в дозе 10 мг/кг (Мелатонин, п - 15); группа, в которой животным перед инъекцией ДОК внутривенно вводили аминокислоту глицин (ЮМ, США) в дозе 50 мг/кг (Глицин, п = 15); группа, в которой животным перед инъекцией ДОК внутривенно вводили унитиол (КЖ Октябрь г. Санкт-Петербург) в дозе 5 мг/кг (Унитиол, п — 15); группа, в которой животным перед инъекцией ДОК внутривенно вводили эритропоетин ("Эпокрин"г. Санкт-Петербург) в дозе 1200 МЕ/кг (Эритропоетин, п — 15). Забой животных проводили через 24 часа путем декапитации. Для приготовления общей цитоплазматической фракции, органы растирали при 4° С в гомогенизаторе Поттера с буфером содержащим 0,1 КС1, 1 ммоль ЭДТА, 20 ммоль Трис-НС1 (рН—7,0), 1 ммоль фенилметилсульфонил фторида, далее экстракт центрифугировали при 10000 g, супсрнатант разливали по пробиркам V — 0.2 мл и хранили до использования при -20° С.

Кровь забирали из подключичной артерии в пластиковые пробирки и инкубировали в термостате при 37 0 С в течении 1 часа. Затем центрифугировали 1500 g 5 мин. Сыворотку разливали в пластиковые пробирки V = 0,2 мл и хранили до использования при -20° С.

Активность глутатион редуктазы (ГР) определяли спектрофотометрически при длине волны 340 нм и выражали через количество окисленного НАДФН в мкмолт./мин на мг белка [СаНЬещ апс! Маппетк,1975].

Активность Глутатион-8-трансферазы определяли

спектрофотометрически при 25° С, с 1-хлоро-2,4-динотробензеном в качестве субстрата [НаЫй ct а1.,1974|.

Активность цитоплазматической НАД(Ф)Н:хинон

оксидоредуктазы определялась в соответствии с методом Фишера [Fisher and Gutierrez,1991], с 2,6-дихлорофснолиндофеполом в качестве субстрата.

Активность аспартатаминотрансферазы (Ь-аснартат:2-оксоглутарат аминотрансферазы, КФ 2.6.1.1.) определяли в соответствии с динитрофенилгидразиновым методом Райтмана-Френкеля [Reitman and Frankel,1957] с использованием наборов фирмы "PLIVA-Lachema"(Чешская Республика, г. Брно).

Активность креатинкипазы (АТФ:креатин N-фосфотрансфераза, К.Ф. 2 7.3.2.) определяли в соответствии с методом Эпора-Розенберга [Ennor and Rosenbeig,1954].

Концентрацию глутатиона восстановленного (rSH) определяли в реакции с 5,5'-дитио-бис-нитробепзойной кислотой [Ellinan.1972].

Содержание белковых карбонильных ípynn определяли 2.4-динитрофенилгидразиновым методом по методике Левина с соавт. [Levin et al..1990]. Предварительно из образца удалялась ДНК в реакции преципитации с 1% сульфатом срептомицина. Количество карбонильных групп выражали в нМ па мг/белка. для пересчёта использовали коэффициент экстинции 21 мМ -1см-1.

Концентрацию малонового диальдегида определяли в тес i с с тиобарбитуровой кислотой по методу Л.Б Андреевой [Андреева,1988]. Концентрацию малоново1 о диальдегида выражали в наномоль/мг белка для тканевых экстрактов и в наномоль/л дли плазмы, для пересчёта использовали коэффициент экстинции 156 мМ "'см"1.

Общий биллирубин определяли методом Ендрасеика-Грофа [Jendrassik and Clcghorn,1936] с использованием набора фирмы "Витал-Диагностика"(г. Санкт-Петербург). Концентрацию общего билирубина находили по калибровочному графику построенному с использованием стандартного раствора билирубина концентрацией 5 м к моль/л.

Концентрацию креатин ипа определяли методом Поппера [Popper et al.,1937| с использованием набора фирмы "Ольвекс"(г. Москва). Концентрацию креатинипа находили по калибровочному графику построенному с использованием стандартного pací вора креатипина концентрацией 100 мг/%.

Концентрацию мочевины в плазме определяли методом, основанным на реакции мочевины с диацетилмонооксимом, с использованием набора фирмы "Ольвекс"(г. Москва) Концентрацию мочевины находили по калибровочному графику, построенному с использованием стандартного раствора этого вещества, концентрацией 10 ммоль/л.

lü

Концентрацию белка в пробах оценивали при помощи метода Бредфорда [Bradford, 1976), основанного па связывании красителя кумасси G-250 с белками.

Выбор сроков и доз препаратов осуществлялся: ДОК - по работам J. Aróla ([Aróla et al.,2000]). D. L. Gustafson |Gustafson et al.,1993|; глицина - по работам Z A Shaikh [Shaikh et al.,1999|; мелатонин - P. Dziegie] [Dziegiel ct al.,2002]; унитиол - согласно рекомендациям производителя при отравлениях солями тяжёлых металов; эритропоетин в соответствии с работами С. J. Parsa [Parsa et al.,2003] и С. Moon [Moon et al ,2003].

Результаты обработаны статистически с использованием критерия Маппа-Уитни. Показатели представлены как M±SD. Различия между группами считали достоверными при р 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика доксорубицин-индуцированного

оксидативного стресса. Однократное введение ДОК в дозе 7,5 мг/кг вызвало увеличение концентрации малонового диальдегида (МДА) и снижение концентрации глутатиона восстановленного в тканях ночек крыс в первые сутки эксперимента. Активность глутатион редуктазьт снизилась на 25 %(р 0.001) ДОК не оказывал влияния на активность НАД(Ф)Н:хипои оксидоредуктазы 1 (НХ01) и глутатион-S-трансферазы (ГБТ). Введение ДОК вызывало снижение концентрации глутатиона восстановленного на 32% (р ' 0,05) и вызывало увеличение концентрации малопового диальдегида на 42% (р 0.05) Не было выявлено достоверных отличий в концентрации белковых карбонильных групп между контрольной группой и группой животных которым вводился ДОК. Снижение концентрации TSH и увеличение концентрации малонового диальдегида свидетельствует о развитии оксидативного стресса в тканях почек после однократного введения ДОК (табл. 1).

Введение ДОК не вызвало изменений ферментативной активности изучаемых ферментов в ткапях печени Однако, ДОК вызвал снижение концентрация TSH на 18% (р 0,05). Не было отмечено достоверных различий между контрольной группой и группой "Доксорубицин"в содержании МДА и белковых карбонильных групп. Таким образом однократное введение доксорубицина не вызывало оксидативного стресса в ткапях печени (табл 4) Через 24 часа после введения ДОК не было выявлено различий ни по одному изучаемому параметру в тканях сердечной мышцы между контрольной группой и группой животных, которым вводился ДОК (табл. 3).

Таблица 1.

Изменение активности ферментов антиоксидантной защиты и параметров перекисного окисления липидов в ткани почек после

введения ДО К

Показатель Контрольная группа Группа "Доксорубицин" Р

НАД(Ф)Нхинон оксидоредуктаза мкмоль/мин/мг белка 0,487 ± 0,181 0,375 ± 0,074

Глутатион-8-трансфереза мкмоль/мин/мг белка 0,118 ± 0,015 0,105 ± 0,025

Глтатион редуктала мкмоль/мин/мг белка 0,0857 ± 0,007 0.0621 ± 0,008 р-0,001

Глута1Ион восстановленный мкмоль/гр ткани 0,089 ± 0,011 0,061 '± 0,018 р- 0,05

Карбонильные группы белков мкмоль/мг белка 2,13 ± 1,01 4,21 ± 2,36

Малоновый диальде1ид нмоль/мг белка 0,45 * 0,075 0,78 ± 0,11 р '0,05

В таблице 4 представлен ряд параметров плазмы крови, характеризующих функциональное состояние сердца (креатинкиназа), печени ( яспартатаминотрансфераза, альбумин и общий билирубин) и почек (креатинин и мочевина), а также параметров перекисного окисления липидов контрольной группы и группы животных которым вводился доксорубицин. Одноразовая инъекция доксорубицина (7,5 мг/кг) не влияла на активность аспартатаминотрансферазы и креатинкиназы, а также не вызывала изменений в концентрации общего билирубина и альбумина (табл. 4).

В группе животных, которым вводился ДОК. концентрация креатинина в плазме возросла на 26%. Концентрация мочевины в плазме животных, которым вводился ДОК, также увеличилась на 36% (табл. 4). Через сутки после введения ДОК в плазме животных наблюдалось увеличение продуктов свободно-радикального окисления биомолекул. Концентрация малонового диальдегида в группе "Доксорубицин "была на 89% выше, чем в плазме животных контрольной группы и составила (р 0,05) Концентрация белковых карбонильных групп в плазме животных, которым вводился ДОК, составила 6,78 мкмоль/мг белка (р < 0,05), т.е. более чем в 3 раза выше, чем в контрольной группе.

Влияние глицина, мелатонина, унитиола и эритропоетина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс. Как

Таблица 2.

Изменение активности ферментов нитиоксидантиой защиты и параметров перекисного окисления лииидов п ткани печепи после

введения доксорубицина

Показатель Контрольная группа Группа "Доксорубицин" Р

НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктача мкмоль/мин/м1 белка 0,567 1 0,180 0.349 ± 0,071

Глутатион-Б-трансфереза мкмоль/мин/мг белка 0,387 ±0,055 0,324 ± 0,048

Глта 1 ион редуктаэа мкчоль/мин/мг белка 0,030 ± 0,005 0,029 ± 0,004

Глу гагион восстановленный мкмоль/гр ткани 0,175 ± 0,016 0,144 ± 0.008 ]> 0,05

Карбонильные 1 руины белков мкмоль/мг белка 3,18 1,68 2,73 -Ь 1,59

Малоновый диальдегид нмоль/мг белка 0,69 ± 0,072 0,82 ± 0,18

видно на рисунке 1 введение доксорубицина приводило к некоторому снижению (р - 0,09) активности НХ01 В группе животных, получавших ДОК, активность НХ01 составляла 77% от активности этого фермента в тканях почек контрольной группы. Совместное введение глицина с ДОК приводило к увеличению активности НХ01 по сравнению с группой животных которым вводился ДОК (р - 0,01). В группе животных которым вводился ДОК совместно с глицином, активность НХ01 была на 46% выше активности этого фермента в тканях почек животных получавших доксорубицин, и на 13% выше, чем в контрольной группе (рис 1). Совместное введение мелатонина с доксорубицином не вызывало достоверного изменения активности НХ01 по сравнению как г контрольной группой, так и с группой «Доксорубицин», хотя активность этого фермента в группе животных, получавших ДОК с мелагонином. была выше по сравнению с группой которой вводился один доксорубицин на 20%, но отличие было статистически не значимым (рис. 1). При введении унитиола с доксорубицином активность НХ01 возрастала на 31%, но сравнению с группой животных получавших, ДОК (р 0,05), но не отличалась от активности этого фермента в тканях почек контрольной группы животных В тканях почек животных, получавших дополнительно к ДОК эритропоетин, активность НХ01 была на 104% выше, чем активность этого фермента в тканях почек животных,

Таблица 3

Изменение активности ферментов антиоксидантной защиты и параметров перекисного окисления липидов в ткани сердца после

введении доксорубицина

Показатель Контрольная группа Группа "Докеорубицин"

НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктаза мкмоль/мин/мг белка 0,083 ± 0,010 0,088 ± 0,012

Глуаа гион-Я-трансфсреза мкмоль/мин/мг белка 0,027 ±0,006 0,023 ± 0,003

Глгатон рсдукгаза мкмоль/мин/мг белка 0,030 ± 0,005 0,029 ± 0,004

Глутатион восстановленный мкмоль/гр ткани 0,034 ± 0,005 0,0375 ± 0,0027

Карбонильные группы белков мкмоль/мг белка 1,68 ± 0,65 1,55 ± 0,56

Малоновый диальдегид нмоль/мг белка 0,39 ± 0,012 0,56 ± 0,018

Таблица 4. Влияние ДОК на показатели функциональной активности органов и параметры перекисно!о окисления липидов плазмы крови крыс (М ± т).

Показатель Контрольная i рупиа Докеорубицин

Аспартатаминоарасфераза МЕ/л 25,2 ± 5,3 38,7 ± 7,8

Креатипкиназа МЕ/л 32,17 ± 7,87 26,18 ±9,13

Общий билирубин мкмоль/л 3,18 ± 0,78 2,18 ± 0,54

Альбумин г/л 30,1 ± 3,2 27,3 ± 6,7

Креатинин мг/% 0,53 ± 0,04 0,67 ± 0,07 р^ 0,05

Мочевина ммоль/л 4,53 ± 0,87 6,17 ± 0,73 р< 0,05

Малоновый диальдегид нмоль/л 25,17 ± 3,14 47,67 ± 2,17 р^-0,05

Карбонильные группы мкмоль/мг белка 2,17±1,7 6,78± 2,18 р-' 0,05

получавших только ДОК (р 0,01), и на 58 % больше, чем в почках контрольной группы животных. Однако, в последнем случае, различия между группами были статистически не значимыми (рис. 1) Таким образом, в тканях почек животных, получавших ДОК, активность НХ01 не изменялась. При введении вместе с доксорубицином дополнительно

Рис. 1. Влияние совместного введения препаратов с доксорубицином на активность цитоплазматической НАД(Ф)Н:хипон оксидоредуктазы в в тканях почек. Док - доксорубицин Гли - Доксорубицин — глицин, Мел - доксорубицин + мелатонин, Уни - доксорубицин I унитиол, Эпо -доксорубицин I эритропоетип. Примечание: * - статистически значимое различие с группой Док, * - р 0,05; ** - р ■ 0,01; *** - р ' 0,001

глицина, унитиола и эритропоетина активность НАД(Ф)Н хинои оксидоредуктазы увеличивалась по сравнению с группой животных получавших доксорубицин, по статистически не отличалась от контрольной группы животных. Совместное введение мелатонина с доксорубицином не влияло на активность НХ01.

Активность НХ01 в тканях сердца и печени у животных контрольной группы составляла 0,083±0,010 и 0,567±0.180 мкмоль/мин/мг белка соответственно. Введение животным ДОК, а также совместное введении доксорубицина с глицином, мелатонином, унитиолом и эритропостином не приводило к статистически значимому изменению активности этого фермента.

«з 0,20

i

Контроль Док Гли Мел Уни Эпо

Рис. 2. Влияние совместного введения препаратов с доксорубицином на активность цитоплазматической глутатион-З-трансфсраз в тканях почек. Док - доксорубицин Гли - Доксорубицип | глицин, Мел -доксорубицин I мелатонин, Уни - доксорубицин - унитиол, Эно -доксорубицин + эритропоетин. Примечание: * - статистически значимое различие с группой Док (р ''0,05)

Активность ГЭТ в тканях почек животных, получавших ДОК, не отличалась от активности этого фермента в почках у животных контрольной группы (рис. 2). В тканях почек животных, получавших вместе с ДОК глицин активность Г8Т, хотя и была на 32% выше, чем аналогичный показатель в группе животных, получавших ДОК, но отличия не были статистически достоверными (р= 0,08). Активность ГБТ у животных получавших ДОК с мелатонином и ДОК с эритропоетином не отличалась от активности этого фермента в тканях почек животных, которые получали только ДОК, и от активности ГБТ в тканях почек контрольной группы животных(рис. 2). Совместное введение унитиола с ДОК приводило к увеличению активности ГБТ в тканях

почек этой группы животных на 39% , в сравнению с группой животных получавших ДОК (р <' 0,05), в сравнении с контрольной группой активность этого фермента, хотя и была несколько выше, но статистически достоверно не отличалась от неё (рис. 2)

Активность ГЭТ в тканях печени и сердца не отличалась между различными группами животных

120

Контроль Док Гли Мел Уни Эпо

Рис. 3. Влияние совместного введения препаратов с доксорубицином на активность цитоплазматической глутатион редуктазы в тканях почек. Док - доксорубицин Гли - Доксорубицин f глицин, Мел - доксорубицин + мелатонин, Уни - доксорубицин уиитиол, Эпо - доксорубицин I эритропоетин. Примечание: * - статистически значимое различие с группой Док (* - р - 0,05; ** -р <г 0,01; *** - р - 0,001), Ц- - статистически значимое различие с контрольной группой (# - р - 0.05; # Ц - р 0,01)

Как показано на рисунке 3 введение ДОК приводило к статистически достоверному снижению (р 0,01) активности глутатион редуктазы (ГР). В группе животных получавших доксорубицин активность ГР в тканях почек была ниже на 37% в сравнении с контрольной

группой животных. Совместное введение глицина с ДОК приводило к увеличению активности ГР по сравнению с группой животных которым вводился ДОК (р <■ 0,01). В группе животных получавших совместно ДОК и глицин активность ГР была па 50% выше активности что го фермента в тканях почек животных получавших только ДОК. и но отличалась от показателей активности этого фермента в контрольной группе животных (рис. 3) Совместное введение мелатонина с ДОК вызывало увеличение активности ГР на 47%в сравнении с группой животных, которым вводился ДОК (р ' 0,001). и оставалось неизменной в сравнении с контрольной группой (рис. 3). При введении унитиола с ДОК активность ГР возрастала на 40% но сравнению с г руппой животных получавших ДОК (р - 0,001), но не отличалась от активность этого фермента в тканях почек контрольной группы животных. В тканях почек животных получавших совместно ДОК и эритропоетип активность ГР была на 35% выше, чем активность этого фермента в тканях почек животных получавших ДОК (р 0,001), и не отличалась от аналогичного показателя у животных контрольной группы (рис. 3).

В тканях печени и сердца животных контрольной группы активность ГР составляло 0,03±0,01 и 0,030±0,005 мкмоль/мин/мг белка соответственно. Введение изучаемых фармакологических препаратов не вызывало достоверных изменений активности этого фермента в тканях сердца и печени.

Однократная инъекция ДОК через 24 часа приводила к снижению (р = 0,05) концентрации TSH в тканях почек (рис 4). В группе животных, которым вводился ДОК концентрация FSH составляла 68% от концентрации TSH в тканях почек контрольной группы животных (р ^ 0,05). Совместное введение глицина с ДОК приводило к увеличению концентрации FSH в почках в сравнении с группой животных которым вводился ДОК (р 0,05) в среднем на 45%. В этой группе животных концентрация FSH статистически достоверно не отличалась от таковой TSH в тканях почек животных контрольной группы (рис. 4) Совместное введение мелатонина с ДОК вызывало увеличение концен трации FSII до уровней, детектируемых в контрольной группе животных (рис. 4), что на 42% выше, чем аналогичный показатель в группе животных, получавших только ДОК (р -- 0,05) Введение унитиола с ДОК не приводило к изменению концентрации TSH в почках в сравнении как с контрольной группой животных, так и с группой животных, получавших ДОК (рис.4). В тканях почек животных, получавших дополнительно к ДОК и эритропоетин, концентрация TSH была на 78% выше, чем концентрация этого вещества в тканях почек животных, получавших

0,14

55 0,12

х

«

»- 0,10

I

л

5 0.08 о

г о

§■ 0,06 X

г

« 0,04 0,02 0,00

Рис. 4. Влияние совместного введения препаратов с доксорубицином на концентрацию глугатиона восстановленного в тканях почек. На рисунке используются следующие обозначения: Док - доксорубицин; Гли - Доксорубицин I глицин; Мел - доксорубицин + мелатонин; Уни - доксорубицин + унитиол; Эпо - доксорубицин I эритропоетин. Примечание: * - статистически значимое различие с группой Док, (* -р " 0,05; ** - р '' 0,01); # - статистически значимое различие с контрольной группой (// - р 0,05)

только ДОК(р -- 0,01), и на 22%, выше чем в почках контрольной группы животных, но в последнем случае, между группами различия были статистически не значимыми (рис. 4).

У животных, получавших ДОК, концентрация ГБН в тканях печени снижалась с 0,175 мкмоль/мг ткани до 0,144 мкмоль/мг ткани (р ' 0,05). При предварительном введение глицина и мелатонина концентрация ТЭН п тканях печени не отличалась от аналогичного показателя в контрольной группые животных

Концентрация восстановленного глутатиопа в тканях сердца во всех

Контроль Док Гли Мел Уни Эпо

группах животных (получавших ДОК, ДОК с мелагоиипом, ДОК с глицином, с уншиолом и с эритропоетином) статистически достоверно но отличалась от анало1ичного показателя в контрольной группе животных (0,034 ± 0,005 мкмоль/мг белка)

Предварительное введение изучаемых препаратов не приводило к достоверному снижению концентрации белковых карбонильных групп в юмогенате тканей в сравнении с группой животных которым вводился ДОК.

Как видно из рисунка 5, одноразовая инъекция ДОК через 24 часа ч привела к увеличению (р ' 0,01) концентрации малоново! о диальдегида

(МДА) в тканях почек на 73% в сравнении с контрольной группой животных. После совместного введения глицина с ДОК концентрация МДА в почках в сравнении с группой животных которым вводился ДОК была на 47% ниже (р 0,05). и на 17% выше концентрации МДА в тканях почек животных контрольной группы (р • 0,1). При совместном введение мелатонина с ДОК концентрация МДА была на 90% ниже в сравнении с аналогичным показателем у животных получавших ДОК (р ' 0,001) и практически не отличалась от таковой в контрольной группе животных. После совместного введения унитиола с ДОК концентрация МДА статистически не отличалась от аналогичного показателя в группе животных которым вводился ДОК и контрольной группе (рис 5). В тканях почек животных из группы получавших совместно ДОК с эритропоетином концентрация МДА была на 129% ниже, чем концентрация этого вещества в тканях почек животных получавших только доксорубицин (р ^ 0,001), и па 32 % ниже чем в почках контрольной группы животных, но в последнем случае, между группами различия были статистически не значимыми (рис. 5).

В тканях печени и сердца животных всех групп концентрация МДА статистически не отличались от показателей контрольной группы животных, тогда как совместное введение мелатонина с ДОК, ДОК с эритропоетином и ДОК с глицином приводило к снижению концентрации МДА в тканях почек до уровня характерного для кон г рольной группы животных, а совместное введение ДОК с унитиолом не препятствовало ДОК-индуцированному увеличению концентрации МДА в тканях почек.

Исследуемые препараты но разному влияли па показатели содержания мочевины и креатинина в плазме крови опытных групп животных Введение ДОК животным приводило к росту содержания креатинина и, вызывало тенденцию к росту концентрации мочевины в плазме. Это свидетельствовало о тенденции к развитию нарушения

Контроль Док Гли

Мел

Уни

Эпо

Рис. 5. Влияние совместного введения препаратов с доксорубицином на концентрацию малонового диальдегида в тканях почек.Примечание: Док - доксорубицин, Гли - Доксорубицин • глицин, Мел - доксорубицин -1- мелатонин, Уни - доксорубицин 1 унитиол, Эпо - доксорубицин + эритропоегин; * - статистически значимое различие с группой Док (* -р 0.05: ** - р - 0.01, *** - р - 0;01);## - статистически значимое различие с контрольной группой (р 0,01)

функционального состояния почек В группах животных, которые перед введением ДОК получали глицин, мелатонин и эритропоетин концентрация креатинина составляла 0,55±0,12, 0,47±0,18 и 0,55±0,12 соответственно и статистически достоверно (р 0,05) была ниже чем величина аналогичного показателя в группе животных получавших только доксорубицин, но статистически не отличалась от концентрации креатинина в плазме контрольной группы животных. В группе крыс которым вместе с ДОК вводился унитиол концентрация креатинина плазмы была выше чем в контрольной группе и составляла 0,79±0,11 и статистически не отличалась от аналогичного показателя группы

животных получавших ДОК. Аналогичное изменение вызывало совместное введение препаратов и на концентрацию мочевины в плазме Так в группах животных, которым вводился ДОК вместе с глицином , ДОК с мелатонином и ДОК с эритропостином, концентрация мочевины в плазме была достоверно ниже, чем у животных которым вводился только ДОК (3,71±1,01, 3,67±1,25 и 3,71=Ы ,01 ммоль/л соответственно) и статистически не отличалась от аналогичного показателя в контрольной группе животных, для которой этот показатель составлял 4,53±1,27 ммоль/л. В группе животных, которым вместе с ДОК вводился унитиол, концентрация мочевины была 6,89±0,93 и статистически не отличалась от аналогичного показателя у животных которые получали ДОК, но была выше (р 0,05) по сравнению с контрольной группой животных. Влияние изучаемых фармакологических препаратов на показатели креатинина и мочевины плазмы сходны с влиянием па показатели содержания ГБП и МДА в тканях почек (рис. 4, 5) Исследуемые вещества, которые приводили к нормализации концентрации ГБН и МДА (глицин, мелатонин и эритропоетин), также вызывали нормализацию содержания креатинина и мочевины в плазме. В связи с этим можно сделать заключение, что повышение содержания креатинина и мочевины в плазме животных получавших ДОК связано с индукцией ДОК оксидативного стресса в тканях почек, что в итоге приводит к ухудшению показателей функциональной активности почек. Из всех изучаемых препаратов, только при совместном введении мелатонина с доксорубицином показатели ПОЛ плазмы были ниже в сравнении с анологичными показателями группы животных получавших ДОК и составили для МДА - 27,34±10,15, для белковых карбонильных групп - 3,17±1,97, и статистически не отличались от аналогичных показателей контрольной группы животных (25,17±3,14 и 2,17±0,7 соответственно). Концентрация МДА и белковыхкорбонильных групп в плазме животных получавших ДОК с; глицином, ДОК с унигиолом и ДОК с эритропостином статистически не отличались показателей животных получавших один ДОК и были выше аналоыгтых показателей в контрольной группе животных

В итоге можно сделать ряд выводов о влиянии изучаемых препаратов на ДОК-индуцированный оксидативный стресс в тканях почек. Наиболее эффективными препаратами из сравниваемых, по нашему мнению являются глицин и эритропоетин. Именно введение этих препаратов совместно с ДОК вызвало наиболее благоприятный эффект. Так в группах животных получавших глицин и эритропоетин возрастала активность НХ01 (рис 1), ГР (рис 3), концентрация ГЭН (рис 4),

снижались концентрация МДА п тканях ночек (рис 5), прослеживалась тенденция к снижению концентрации белковых карбонильных групп, в плазме крови снижались концентрации креатинина и мочевины в сравнении с группой животных получавших только ДОК. Все выше перечисленные показатели в этих группах животных статистически не отличались (кроме активности НХ01) от аналогичных показателей контрольной группы животных. Мелатотшн, в данной постановке эксперимента, также обладал значительной эффективностью, но в отличии от эритропоетина и глицина, его совместное введение с ДОК не приводило к увеличении активности НХ01, что является существенным недостатком т.к. НХ01, помимо участия в дстоксикации ДОК, также принимает участие в стабилизации фактора транскрипции р53, который является важным белковым фактором, препятствующим злокачественному перерождению клеток [Anwar et al.,2003]. То, что мелатонин снижал степень окислительной модификации биомолекул плазмы, в данном случае не имеет существенного значения, т.к. активация процессов перекисного окисления в плазме в остром эксперименте не влияет на развитие внутриклеточного оксидативного стресса, и сама по себе не может вызвать нарушения функционирования органов в столь короткие сроки (24 часа). Унитиол не препятствовал развитию ДОК-ипдуцированного оксидативного стресса через 24 часа после введения, и из всех изучаемых фармакологических препаратов оказался самым не эффективным.

ВЫВОДЫ

1 Однократное введение доксорубицина в дозе 7,5 мг/кг но приводит к развитию оксидативного стресса в сердечной мышце, а также не вызывает изменения плазменных показателей её функционального состояния.

2. Однократное введение доксорубицина в дозе 7,5 мг/кг снижает концентрацию востановленного глутатиона на фоне отсутствия изменений в активности ферментов антиоксидантной защиты, концентрации малонового диальдегида и белковых карбонильных групп, а также не изменяет плазменные показатели функционального состояния печени.

3 Однократное введение доксорубицина в дозе 7,5 мг/кг приводит к возникновению в ткани почек оксидативного стресса и нарушению функционального состояния почек.

4. В механизме развития доксорубицип-индуцированного оксидативного стресса в ткани почек определяющую роль играет

снижение внутриклеточного редокс-потенциала обеспечиваемого глутатио н роду ктазой.

5. Ингибировапие редокс-циклических реакций доксорубицина посредством НАД(Ф)Н:хиноп океидоредуктазы 1 и(или) увеличение коныогации доксорубицина с глутатионом катализируемое ферментом глутатион-Б-трансферазой не предотвращает развитие оксидативпого стресса в ткани почек;

6. Глицин и эритропоетин предупреждают в1.гзванный доксорубицином внутриклеточный оксидативный стресс в хканях почек и нормализуют их функциональное состояние Глицин и эритропоетин не приводят к нормализации параметров перекисного оксилепия липидов плазмы.

7. Мелатонин предупреждасч доксорубиции-индуцированный оксидативный стресс в тканях почек, а также блокирует доксорубицип-индуцированное перекиснос окисление липидов в плазме крови.

8. Унитиол (5 мг/кг) при его совместном введении с доксорубицином (7,5 мг/кг) через 24 часа не предупреждает доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс в тканях почек

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Тишкип В С.Влияние пикамилона и карнитина хлорида на динамику электрокардиографических и биохимических показателей у больных острым инфарктом миокарда./В. С. Тишкин, И А. Кузмина. J1. В. Петренко, К). В Саепко// Учёные записки Ульяновскою 1 осударственного университета. Серия: Клиническая Медицина. Выпуск 1(4), Ульяновск 1999.- С. 122-127

2. Саенко Ю.В. Роль оксидативного стресса в патологии сердечнососудистой системы у больных с заболеванием почек.(Сообщение 1. Патафизиология оксидативпого стрееса)/Ю.В. Саенко, А. М. Шутов // Нефрология и Диализ, 2004;6(1) 47-53

3. Шутов A.M. Роль оксидативного стресса в патологии сердечнососудистой системы у больных с заболеванием почек.(Сообщение 2 Клинические аспекты оксидативного стресеа)/А. М. Шутов, Ю.В. Саенко// Нефрология и Диализ, 2004;6(2)-27-35

4 Фармакологическая коррекция оксидативного стресса , индуцированного доксорубицином в почках крыс./ Саенко Ю.В., Напалкова С.М., Шутов A.M., Брынских Г. Т.// Нефрология, 2005;9(1):69-74.

5. Эритропоетин снижает проявления оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, в почках крыс./Саенко Ю.В., Шутов A.M., Напалкова С.М., Селиванова О. С.// Нефрология. 2005;9(2):96-100.

6. Со,емко Ю. В. Эритропоетин предотвращает развитие острой доксорубицин-индуцированпой нефротоксичности / Ю. В. Саенко, Г. Т. Брьшских, О.С Селиванова. //Учёные записки Ульяновского государственного Университета. Серия: Клиническая Медицина. Выпуск 3(9), Ульяновск. 2004 г. с. 67-72

7. Возможности коррекции оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в почках крыс /К). В. Саенко [и др.| //Материалы XIT Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2005. - С. 791.

8 Доксорубицин-шгдуцированный оксидативный стресс в миокарде и паренхиме почек./ Ю. В Саенко, Г. Т. Брынских. О. С. Селиванова, М. А. Альберт // Тезисы V-ежегодной конференции "Сердечная недостаточность 2004 Москва. 2004. - С.190-191

9. Saenko Yu.V. Protective effect of erythropoethin against doxorubicin induced acute nephrotoxocoty. /Yu.V. Saenko , N.Y. Marder, G.T. Brynskih //Proc. Annual Meeting of International Socicty of Nephrology «Forefront of nephrology» - Drezden (Germany): 2004 - Pp 67-68

10. Влияние эритропоэтина па доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс у крыс /Ю. В. Саенко [и др.] //Актуальные вопросы здравоохранения. Проблемы, поиски, решения: материалы ХХХХ научно-практической межрегиональной конференции врачей. -Ульяновск: ОГУП "Облтипография "Печатный двор", 2005. - С. 686-688.

11. Селиванова О. С. Возможности коррекции глицином оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, в почках крыс /О. С. Селиванова, С. М. Напалкова, Ю. В. Саенко //'Материалы 2-й Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека: /под ред., В. И. Мидленко. -Ульяновск: УлГУ, 2005. - С 81-82.

12. Чернов H.H. Снижение окислительного действия доксорубицииа на систему глутатиона в почках крыс /H.H. Чернов, Ю.В. Саенко, С.М. Напалкова //Материалы 13-й международной конференции «Новые информационные технологии медицине, биологии, фармакологии и экологии». ЯлтагГурзуф (Украина), 2005. - С.235

Подписано в печать 17.11.05. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз Заказ №159/6^

Отпечатано с оригинал-макета в лаборатории оперативной полиграфии Ульяновского государственного университета 432970, г Ульяновск, ул. Л. Толстого, 42

'423 5 35

РПБ Русский фонд

2006-4 26749

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Саенко, Юрий Владимирович

Условные обозначения

Введение б

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Патофизиология оксидативного стресса.

1.1.1 Причины возникновения свободно-радикальных молекул и их основные типы.

1.1.2 Последствия оксидативного стресса.

1.2 Антиоксидантная система и внутриклеточный ф окислительно-восстановительный потенциал.

1.3 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса.

1.4 Современные фармакологические подходы к снижению токсичности доксорубицина.

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Характеристика экспериментального материала.

2.2 Методы исследования.

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуж-» дение 52 ® 3.1 Характеристика доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса.

3.2 Влияние глицина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс. ф 3.3 Влияние мелатонина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс.

3.4 Влияние унитиола на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс. ф 3.5 Влияние эритропоетина на доксорубицин-индуцированный оксидативный стресс.

3.6 Сравнительная характеристика влияния глицина, мелатонина, унитиола и эритропоетина на механизмы ф доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса"

Актуальность проблемы

Механизмы оксидативного стресса интенсивно изучаются с середины 60-х годов [165] и в наше время, актуальность и острота этой проблемы не только не снизилась, но и многократно возросла. В настоящий момент мало найдётся патологических состояний где-бы не было продемонстрировано сопутствующего развития оксидативного стресса. Одним из аспектов многогранной проблемы оксидативного стресса является изучение тканьспецифичных механизмов его течения [93].

Известно, что различные органы и ткани в разной степени подвержены действию агентов, вызывающих оксидативный стресс, и демонстрируют различную устойчивость в процессе реализации этого патологического состояния [4, 159]. По мнению ряда исследователей, это связано с различным уровнем экспрессии аитиоксидантных ферментов и особенностями метаболизма различных тканей [156, 39, 235]. Особенности метаболизма различных типов клеток связаны с устойчивостью к окислительному стрессу через внутриклеточный оксилительно-восстановительный потенциал (редокс-потенциал) [211], который является производным всех биохимических реакций клетки и вычисляется через отношение концентрации восстановленного глутатиона к концентрации оксиленного глу-татиона [116]. Редокс-потенциал напрямую связан с тяжестью оксидативного стресса, чем он ниже, тем интенсивнее процессы перекисного оксиления биомолекул [217, 66]. От величины внутриклеточного редокс-потенциала и, в частности, от концентрации восстановленного глутатиона зависят также и такие процессы как, пролифереция, деление и программируемая клеточная смерть [74, 199]. Если интенсивное развитие оксидативиого стресса приводит к некрозу, то его медленное развитие запускает механизмы апоптоза [199]. В литературе имеется ряд противоречивых данных о зависимости между редокс-потенциалом, показателями перекисного окисления липидов и активностью антиоксидантных ферментов в различных тканях и типах клеток [4, 184, 211]. Понимание этих механизмов позволит целенаправленно воздействовать на внутриклеточные процессы путем активации тех или иных генов с целью смягчить последствия оксидативного стресса и предотвратить его развитие по нежелательному сценарию, а именно воспрепятствовать запуску механизмов программируемой клеточной смерти [39, 169].

Нами была использована модель доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса. Доксорубицин относится к семейству антрацикли-новых антибиотиков и применяется в онкологии. Однако, наличие у док-сорубицина серьёзных кардиотоксических [218, 42, 76, 63] и, в меньшей степени, нефротоксических свойств [168, 40] существенно ограничивает его использование в онкологической практике. Существует несколько объяснений цитотоксичности доксорубицина на клеточном уровне, среди них: генерирование с участием ДОК свободных радикалов [190, 82], ингибирование ферментов репликации ДНК [219], ингибирование клеточных ферментов доксорубицинолом (веществом образующемся в результате биохимических превращений ДОК в клетке) [113], влиянием доксорубицина на механизмы внутриклеточного гомеостаза железа [167]. Однако, по мнению большинства исследователей, в нормальных тканях доксорубицин-индуцированная цитотоксичность связана, преимущественно, с образованием в клетке супероксиданион радикалов в результате редокс-циклической активности доксорубицина, что в итоге приводит к внутриклеточному оксидативиому стрессу [167, 88, 142, 91] и далее к апоптозу [43, 92]. В связи с этим, понимание механизмов токсичности доксорубицина может прояснить, как органспецифичные механизмы доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса, так и механизмы оксидативного стресса в целом [44].

Для более глубокого понимания особенностей течения оксидативного стресса в различных тканях важно не только изучить воздействие специфического индуктора на эти ткани и изучить их ответ, но ещё более важно проанализировать роль различных участников системного клеточного ответа на оксидативный стресс. Клеточный метаболизм регулируется, в основном, за счёт влияния на экспрессию генов тех или иных белков и ферментов. К настоящему времени накоплен достаточно богатый экспериментальный материал в этой области, который позволяет подобрать узко-специфичные регуляторы экспрессии целевых генов. Исходя из целей нашего исследования и анализа литературных данных нами были выбраны вещества, способные увеличивать экспрессию генов ряда ферментов антиоксидантной защиты, а именно глутатион редук-тазы, глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1. Это мелатонин [180], глицин [118], унитиол [68] и эритропоетин [106].

Вместе с решением чисто теоретической задачи - изучения специфических тканевых механизмов развития оксидативного стресса, важной практической задачей является поиск фармакологических препаратов, снижающих токсичность доксорубицина. Снижение токсичности доксо-рубицина может быть достигнуто несколькими путями [52]. В частности, снижение токсичности доксорубицина способствует применение совместно с доксорубицином хелатора железа - дексразоксана [41, 221]. Хотя дек-сразоксан достаточно эффективно снимает кардиотоксические эффекты доксорубицина [103, 132], он, как оказалось, существенно снижает и эффективность доксорубицина в отношении лечения рака [117, 95]. Одним из перспективных подходов к снижению токсичности антрациклиновых антибиотиков заключаются в поиске веществ препятствующих развитию доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса [52]. Применение антиоксидантов - витамина Е, N-ацетилцистеина и пробукола хотя и демонстрировало обнадёживающие результаты в опытах на лабораторных животных [88, 191], но оказалось малоэффективным при их применении у людей [38, 44]. К препаратам, которые потенциально обладают способностью препятствовать развитию оксидативного стресса, можно отнести глицин [216], мелатонин [178, 136, 107], унитиол [31, 25] и эритропоетин [87, 98].

Цель исследования. Целыо настоящего исследования явилось изучение органоспецифичных механизмов оксидативного стресса, индуцированного доксорубицином, и возможностей его коррекции. Задачи исследования

1. Изучить параметры внутриклеточной антиоксидантной защиты и показатели перекисного окисления липидов в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

2. Оценить функциональное состояние почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

3. Рассмотреть влияние экзогенных индукторов антиоксидантных ферментов на состояние системы ПОЛ-антиоксидант в ткани почек, печени и сердца после однократного введения доксорубицина.

4. Изучить роль индукции ферментов антиоксидантной защиты в регуляции функционального состояния почек, печени и сердца, после однократного введения доксорубицина.

5. Оценить целесообразность применения глицина, мелатонина, уни-тиола и эритропоетина с целью снижения токсичности доксорубицина.

Научная новизна исследования

Автором впервые установлено, что через 24 часа после введения доксорубицина (7,5 мг/кг) интенсивность оксидативного стресса наиболее выражена в тканях почек. В ткани печени признаки оксидативного стресса выражались только в снижение концентрации восстановленного глутатиона. В ткани сердечной мышцы признаков оксидативного стресса не наблюдается.

Продемонстрирована связь между возникновением доксорубицин-индуцированного стресса и нарушением функций почек, что выражается в росте плазменных концентраций мочевины и креатинина.

Впервые показана возможность фармакологической коррекции доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса глицином и эритропоетином. Впервые показано, что ключевым моментом нефропро-текторного действия глицина и эритропоетина является предотвращение ими доксорубицин-индуцированного снижения концентрации восстановленного глутатиона в тканях почек.

Продемонстрирована взаимосвязь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редукта-зы. Показано, что увеличение активности глутатион-Б-трансферазы и НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 не приводит к снижению интенсивности доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса

Основные положения выносимые на защиту

1. В сердечной мышце оксидативный стресс через 24 часа после введения доксорубицина не возникает.

2. Система ПОЛ-антиоксидант печени и её функциональное состояние не изменяется при однократном введение доксорубицина.

3. В ткани почек на фоне однократного введения доксорубицина возникает оксидативный стресс и нарушается их функциональное состояние.

4. Применение глицина, мелатонина и эритропоетина предотвращает развитие оксидативного стресса, вызванного доксорубицином, в тканях почек и нормализует их функциональное состояние.

5. При развитии доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в тканях почек определяющую роль играет изменение величины внутриклеточного редокс-потенциала, обеспечиваемого глутатион-редуктазой. Ингибирование редокс-циклических реакций доксору-бицина посредством НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы 1 и(или) увеличение конъюгации доксорубицина с глутатионом, катализируемое ферментом глутатион-З-трансферазой, не предотвращает развитие оксидативного стресса в ткани почек.

6. Мелатонин, глицин и эритропоетин могут быть использованы с целью снижения доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса.

Научно-практическая ценность работы

Показана взаимосвясь между интенсивностью оксидативного стресса и активностью цитоплазматической глутатион редуктазы в ткани почек. Установлена принципиальная возможность снижения доксорубицин-индуцированной токсичности глицином, мелатонином и эритропоетином. Полученные данные создают предпосылки для изучения возможности использования глицина, мелатонина и эритропоетина в онкологии с целью снижения токсичности антрациклиновых антибиотиков.

Апробация работы

Материалы, представленные в работе, докладывались на межкафедральных заседаниях сотрудников кафедр теоретического и терапевтического профиля медицинского факультета Ульяновского государственного университета, на ежегодных научно-практических межрегиональных конференциях врачей Ульяновской области (Ульяновск, 1999, 2000, 2004), международной конференции нефрологов (International society of Nephrology, Дрезден, 2004, участие в конференции поддержано грантом этого общества), XII международном конгрессе «Человек и лекарство», V-ежегодной конференции «Сердечная недостаточность 2004», международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» (Ялта-Гурзуф, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 статей ( в том числе 4 в цен-^ тральных журналах) 5 тезисов (всероссийские и международные конференции и симпозиумы).

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературных источников. Работа изложена на 168 страницах машинописного текста, включает 13

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Саенко, Юрий Владимирович

Заключение

Интенсивность оксидативного стресса и состояние внутриклеточной системы антиоксидантной защиты в тканях почек, печени и сердца через сутки после введения разовой токсической дозы доксорубицина характеризовалось различной степенью воздействия на изучаемые параметры. Изменения, вызываемые доксорубицином, характеризовались снижением уровня восстановленного глутатиона и повышением концентрации МДА по сравнению с контрольной группой животных (табл. 3.1). ДОК не только индуцировал оксидативный стресс в тканях почек, но также и вызвал снижение активности ГР. Введение доксорубицина также приводило к увеличению концентраций креатинина и мочевины в плазме крови, что свидетельствует о нарушении функциональной активности почек (табл. 3.4). В тканях сердечной мышцы и печени ДОК не вызывал оксидативного стресса (табл. 3.2, 3.3), также, как и не вызывал нарушение их функциональной активности (табл. 3.4). Но в этих тканях доксоруби-цин вызывал снижение активности глутатион редуктазы. Доксорубицин приводил к заметной активации процессов свободно-радикального окисления биомолекул в плазме, что отразилось в повышении концентраций МДА и карбонильных групп в плазме крови (табл. 3.4). Таким образом, ДОК способен в разной степени воздействовать на ткани сердца, почек и печени. Единственным органом, где ДОК через 24 часа после введения в дозе 7,5 мг/кг индуцировал оксидативный стресс, по нашим данным, являются почки. Кроме этого, ДОК приводил к заметной активации процессов свободно-радикального окисления биомолекул в плазме. В тканях сердечной мышцы и печени ДОК не вызывал оксидативный стресса.

Совместное введение глицина с доксорубицином не приводило к развитию оксидативного стресса в изучаемых органах. Наиболее благоприятный эффект введение глицина совместно с доксорубицином оказало на ткани почек, где развитие ДОК-индуцированиого оксидативного стресса было наиболее выражено. Совместное введение глицина с ДОК препятствовало снижению уровня ГЭН и активности ГР, повышению концентрации малонового диальдегида в тканях почек. Кроме этого, глицин вызывал увеличение активности НХО-1. Введение глицина приводило к нормализации содержания креатинина и мочевины в плазме, что свидетельствовало о нормальном функционирования почек в группе животных, получавших вместе с доксорубицином глицин. В тканях печени глицин также предотвращал доксорубицин-индуцированное снижение концентрации восстановленного глутатиона и приводил к снижению активности ТЭТ. Глицин не оказывал влияния на изучаемые показатели в тканях сердца. Совместное введение глицина и ДОК не приводило к нормализации показателей свободно-радикального окисления биомолекул в плазме крови. В данной группе увеличение активности НХ01 и ГР сопровождалось нормализацией концентрации глутатиона и МДА в тканях, в которых происходит активация процессов свободно-радикального окисления биомолекул. Так, увеличение активности этих ферментов в группе животных, получавших совместно с ДОК глицин, в сравнении с группой получавших только доксорубицин привело к нормализации не только показателя перекисного окисления липидов - концентрации МДА и показателя, характеризующего внутриклеточный редокс-потенциал -концентрации глутатиона, но и нормализовало концентрации креатинина и мочевины в плазме крови.

Результаты экспериментов по изучению влияния мелатонина на развитие ДОК-индуцированного оксидативного стресса в тканях и плазме крови крыс продемонстрировали положительные результаты в отношении ряда параметров. Так, наиболее благоприятный эффект вызывало введение мелатонина на ткани почек, где развитие ДОК-индуцированного оксидативного стресса было наиболее выражено. Совместное введение мелатонина с ДОК предотвращало доксорубицининдуцированное снижение уровня ГБН и активности ГР, повышение концентрации малонового диальдегида в тканях почек. Введение мелатони-на совместно с ДОК приводило к нормализации содержания креатинина и мочевины в плазме, что свидетельствовало об улучшении функционирования почек по сравнению с группой животных, которым вводился доксорубицин.

В тканях печени мелатонин также предотвращал доксорубицин-индуцированное снижение концентрации восстановленного глутатиона. Мелатонин не оказывал влияния на изучаемые показатели в тканях сердца. Совместное введение мелатонина и доксорубицина приводило к снижению показателей свободно-радикального окисления биомолекул в плазме крови по сравнению с группой животных получавших доксорубицин. На основании этого мы сделали вывод, что совместное введение мелатонина с ДОК не приводит к возникновению оксидативного стресса в изучаемых органах, не вызывает нарушений их функциональной активности и не вызывает свободно-радикальное окисление биомолекул плазмы крови. Из всех изученных ферментов мелатонин нормализует и даже увеличивает активность только глутатион редуктазы. Хотя и имеется тенденция в росте активности НХ01. Нормализация активности ГР сопровождается исчезновением признаков доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в тканях почек.

Интенсивность оксидативного стресса и состояние внутриклеточной системы антиоксидантной защиты в тканях почек, печени и сердца через сутки после введения ДОК совместно с унитиолом характеризовались неоднозначными результатами. Наиболее благоприятный эффект введение унитиола оказало на активность антиоксидантных ферментов. Совместное введение унитиола с ДОК способствовало увеличению активности НХ01 (в тканях почек) и глутатион-Б-трансферазы (в тканях почек и печени). Однако этот эффект не приводил к нормализации содержания восстановленного глутатиона (ткани печени и почек) и малонового диальдегида (ткани почек), что свидетельствует об отсутствии влияния на развивающийся в этих органах оксидативиый стресс, вызванный введением доксорубицина. Введение унитиола не приводило к нормализации содержания креатинина и мочевины в плазме, что свидетельствовало о дисфункции почек в этой группе животных. Совместное введение унитиола и доксорубицина не приводило к нормализации показателей свободно-радикального окисления биомолекул в плазме крови. Из этого можно сделать вывод, что унитиол в данных условиях не способен предотвращать ДОК-индуцированный внутриклеточный оксидативиый стресс тканей изучаемых органов и препятствовать токсическому влиянию доксорубицина на изучаемые органы.

Результаты экспериментов по изучению влияния эритропоетина на развитие доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса в тканях и плазме крови крыс продемонстрировали положительные изменения большинства изучаемых параметров. В отличие от других изучаемых препаратов, эритропоетин оказывал благоприятный эффект не только на ткани, в которых доксорубицин вызывал явный оксидативиый стресс. Так, во всех исследованных органах в группе животных, получавших совместно с доксорубицином эритропоетин, концентрация восстановленного глутатиона была достоверно выше по сравнению с группой животных, получавших доксорубицин (рис. 3.19). Но наиболее благоприятный эффект при введение эритропоетина наблюдался в тканях почек, где развитие ДОК-индуцированного оксидативного стресса было наиболее выражено. Совместное введение эритропоетина с ДОК увеличивало активность НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы (рис. 3.16), предотвращало доксорубицин-индуцированное снижение уровня ГЭН и активности ГР (рис. 3.18, 3.19), повышение концентрации малонового диальдегида (табл. 3.11) в тканях почек. Введение эритропоетина совместно с доксорубицином приводило к нормализации содержания креатинина и мочевины в плазме, что свидетельствовало о улучшении функционирования почек по сравнению с группой животных, которым вводился доксорубицин. В тканях печени эритропоетин также предотвращал ДОКиндуцированное снижение концентрации восстановленного глутатиона (рис. 3.19), увеличивал активность НХ01, ГБТ и ГР. Совместное введение эритропоетина и доксорубицина не приводило к снижению показателей свободно-радикального окисления биомолекул в плазме крови по сравнению с группой животных, получавших доксорубиции. В результате можно сделать вывод, что эритропоетин способен блокировать развитие ДОК-индуцированного внутриклеточного оксидативного стресса в тканях почек и препятствовать проявлению нефротоксических эффектов доксорубицина.

В результате сравнительной оценки эффективности изучаемых препаратов в предотвращении доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса можно сделать заключение, что наиболее эффективными препаратами из сравниваемых, по нашему мнению, являются глицин и эритропоетин. Именно введение этих препаратов совместно с доксорубицином вызывало наиболее благоприятный эффект. Так, в группах животных, получавших доксорубиции и глицин, а также доксорубиции и эритропоетин увеличивалась активность НХ01 (рис. 3.21), глутатион редук-тазы (рис. 3.25), концентрация восстановленного глутатиона (рис. 3.27), снижались концентрация малонового диальдегида в тканях почек (рис. 3.29), прослеживалась тенденция к снижению концентрации белковых карбонильных групп (рис. 3.28), в плазме крови снижались концентрации креатинина и мочевины в сравнении с группой животных, получавших доксорубиции (табл. 3.13). Все вышеперечисленные показатели в этих группах животных статистически не отличались (кроме активности НХ01) от аналогичных показателей контрольной группы животных.

Мелатонин также, по нашему мнению, обладал значительной эффективностью, но, в отличии от эритропоетина и глицина, его совместное введение с доксорубицином не приводило к увеличению активности НХ01, что является существенным недостатком. То, что мелатонин снижал степень окислительной модификации биомолекул плазмы,является эффектом положительным , но не влияющем на развитие внутриклеточного оксидативного стресса в остром эксперименте.

Унитиол не препятствовал развитию доксорубицин-индуцированного оксидативного стресса и из всех изучаемых фармакологических препаратов оказался самым неэффективным.

Нормализация активности НАД(Ф)Н:хинон оксидоредуктазы и глутатион-Б-трансферазы не сопровождалась нормализацией концентрации МДА и карбонильных групп (рис. 3.21, 3.23, 3.28, 3.29) и концентрации восстановленного глутатиона (3.22, 3.24). В свою очередь нормализация активности глутатионредуктазы в группах, получавших док-сорубицин с мелатонином, доксорубицин с глицином и доксорубицин с эритропоетином, сопровождалось нормализацией концентрации МДА и восстановленного глутатиона (рис. 3.25, 3.26, 3.28). В группе животных, получавших доксорубицин с унитиолом не происходило нормализации активности глутатион редуктазы и показателей, свидетельствующих о развитии внутриклеточного оксидативного стресса (рис. 3.27, 3.28, 3.29) Величина активности внутриклеточной глутатионредуктазы не коррелировала с показателями окислительной модификации биомолекул плазмы (концентрация малонового диальдегида и белковых карбрнильных групп). Такой вывод можно сделать, проанализировав опыты совместного введегшея доксорубицина с мелатонином, доксорубицина с эритропоетином и доксорубицина с глицином. Во всех этих группах активность глутатион редуктазы нормализовывалась и практически не отличалась от показателей контрольной группы, однако показатели окислительной модификации биомолекул плазмы снижались до уровней, наблюдаемых в контрольной группе только у животных, получавших совместно ме-латонин с доксорубицином. У животных получавших глицин с доксо-рубицином и эритропоетин с доксорубицином, аналогичные показатели были достоверно выше чем в контрольной группе и группе животных получавших доксорубицин с мелатонином (табл. 3.13, рис. 3.25).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саенко, Юрий Владимирович, Ульяновск

1. Андраханов, Б.В. Некоторые современные нредставления о биологической зна-чимости перекисного окисления липидов и системах его регуляции. / В.В. Анд-раханов, Е.А. Лунина, Е.Г. Ленская // Вопросы медицинской химии. — 1990. —№ 3. - с. 130-138.

2. Андреева, А. И. Модификация метода опреде.пепия перекисей липидов в тесте с тиобарбитуровой кислотой. / А. И. Андреева, Л. Кожемякин // Лабораторноедело. — 1988. - № 41. — с. 41-46.

3. Барабой, Б.А. Перекисное окисление и стресс. /В.А. Варабой, И.И. Врехман, В.Г. Голотин. — Санкт-Петербург, 1992.

4. Вулганов, А. А. Метаболизм железа и металлопротеиды / А. А. Вулганов // Вопросы медицинской химии. — 1988. — Л'^ 3. — с. 2-6.

5. Изменения функционального состояния левого желудочка при воздействии ан- трациклиновых антибиотиков. / Н. Т. Ватутин, Н. В. Калинкипа, Е. В. Кетинги др. // Кардиология. — 2001. — Т. 2. — с. 46-49.

6. Бладимиров, Ю. А. Свободные радикалы и антиоксиданты. / Ю. А. Владими- ров // Вестник РАМН — 1998. — jY^ . 7. — с. 43-51.147148

7. Воскресенский, О. Н. Перекиси липидов в живом организме. / О. Н. Воскресен- ский, А. П. Левицкий // Вопросы медицинской химии. — 1970. — Т. 16, JV^ 6. —с. 563-583.

8. Гершанович, М. Л. Кардиоксан: профилактика кардиотоксичности антрацик- линов. / М. Л. Гершанович. // Вопросы онкологии. — 2004. — Т. 50, И-. 4. —с. 482-491.

9. Морфология печени в ранние и отдаленные сроки после введения противо- опухолевых препаратов. / Е. Д. Гольдберг, Т. И. Фомина, Т. В. Ветошкинаи др. // Вюллетенъ экспериментальной биологии и медицины. -— 1998. — Т.126, №. 1 1 . - с . 43-48.

10. Дубинина, Е. Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных моле- кул в метаболизме тканей в состояниях окислительного стресса. / Е. Е. Дуби-нина // Вопросы медицинской химии. — 2001.— Т. 47, № 6. — с. 561-581.

11. Збровская, И. И. Антноксидантная система организма, ее значение в метабо- лизме. Клинические аснекты. / И. А. Збровская, М. В. Ванникова // ВестникРАМН. — 1995. - W 6. - с. 53-60.

12. Котсевников, Ю. Н. О иерекисиом окислении линидов в норме и патологии. / Ю. Н. Кожевников // Вопросы медицинской химии. — 1985. — j\'^ 5. — с. 2-7.

13. Кулинский, В. И. Виологическая роль глутатиона. / В. И. Кулинский, Л. Ко- лисниченко // Успехи современной биологии. — 1990. — Т. 51.— с. 20-34.

14. Лурье, Е. Ю. Аналоги аминокислот с антиокислите.пьной активностью. / Е. Ю. Лурье, П. Катеди, И. П. Дубовский // Тезисы докладов IV конферен-ции «Виоаншиоксидант» Москва, 2-4 июня, 1992.— 1993.—Т. 1. — с . 218-219.

15. Луцепко, В. Молекулярные ме-ханизмы нротивоонухо.левой активности ан- тибиотиков антрациклинового ряда. / В. Луценко, Н. В. Фельдман, Г. Гу-манов.// Вопросы биологической м,едиципской и фармацевтической химии. —1993.-№. 1.-С. 3-9.

16. Малиновская, Н. К. Роль мелатонина в организме человека / Н. К. Малинов- ская // Клиническая медицина. — 1998. — Л- 10. с.15-22149

17. Маршал, В. Дэ/с. Клиническая биохимия / В. Дж. Маршал. — Мир, 2000.

18. Морозкина,Т.С. Избирательное влияние комплекса витаминов Е, А, С на ан- тиоксидантную защиту онухолевых и нормальных тканей. / Т.С. Морозки-Pia, В.Н. СуколиР1Ский, А.В. Стрельников // Вопросы медицинской химии. —1991. —№ 2 . - с . 59-61.

19. Розанцев Э. Г. Оргаршческая химия свободиых радикалов. / Э. Г. Розаргцев., В. Шолле. — Москва: Наука, 1979.

20. Румянцев, А. Г. Эритропоетин в диагностике, профилактике и .печении apie- мий. / А. Г. Румянцев, Е. Ф. Морщакова, А. Л. Павлов.- Москва., 2003.

21. Семёнов, Н. Н. Цепргые реакции. / Н. Н. Семёнов. — Москва: Наука, 1986.

22. Семиглазов, В. Ф. Предупреждение кардиотоксического действия антрацик- линов с номощыо кардиор<.сар1а. / В. Ф. Семиглазов // Вопросы онкологии. —1997. - Т 43, JY^ 6. - с. 569-574.

23. Кардиотоксическое действие противоопухолевых препаратов антрациклирюво- го ряда. / А. М. Тимарюв, М. В. Тиманова, Л. Ю. Великова, Ю. Кудряшо-ва // Вюллетень экпериментальной биологии и медицины.— 1995.— JY^ . 1.—с. 28-30.

24. Хазанов, В. А. Влияиие доксорубицина pia окислрхтельрюе фосфорилироварше в митохорщриях ГО.ПОВНОГО мозга. / В. А. Хазанов, А. Вородина, Н. В. Смирно-ва // Вюлпетень экспериментальной биологии и медицины. — 1999. — Т. 128,№ 10. - с. 445-447.

25. Цветских, В. Е. Активность гомеостатических и аитиоксидаитиых ферментов нрн хроническом нилонефрите / В. Е. Цветских, Б. А. Бердичевский, В. Р. Сул-танбаев // Урология. — 2000. — Т. 3. — с. 13-15.

26. Эммануэль, Н. М. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. / Н. М. Эммануэль. — Москва: Наука, 1965.

27. Acrolein causes transcriptional induction of phase ii genes by activation of nrf2 in human lung type ii epithelial (a549) cells. / R. Tirumalai, T. R. Kumar, K. H. Mai,S. Biswal // Toxicol. Lett. — 2002. — Vol. 132, no. 1. — Pp. 27-36.

28. Activation of the mitogen-activated protein kinase pathway by the erythropoietin receptor. / Y. Miura, 0 . Miura, J. N. Ihle, N. Aold // J. ВЫ. Chem. — 1994. —Vol. 269. — P. 29962-29969.

29. Acute doxorubicin cardiotoxicity involves cardiomyocyte apoptosis. / 0 . J. Arola, A. Saraste, K. Pulkki et al. // Cancer Res. - 2000. - Vol. 60. - Pp. 1789-1792.

30. Acutely administered melatonin reduces oxidative damage in lung and brain inducaed by hyperbaric oxygen. / M. I. Pablos, J. R. Reiter, J.-I. Chuang et al. //J. Appl. Physiol. - 1997. - Vol. 83, no. 2. - Pp. 354-358.

31. Adderley, S. R. Oxidative damage of cardiomyocytes is limited by extracellular regulated Idnases 1/2-mediated induction of cyclooxygenase-2. / S. R. Adderley,D. J. Fitzgerald // J. Biol С/гет.— 1999.- Vol. 274, no. 8 . - Pp. 5038-5046.

32. Adriamycin cardiomyopathy: pathophysiology and prevention. / P. K. Singal, N. Iliskovic, T. Li, D. Kumar // FASEB J. - 1997. - Vol. 11. - Pp. 931-936.

33. Allen, R. Oxidative stress and gene regulation. / R. Allen, M. Tresini // Free Rad. Biol. Med. - 2000. - Vol. 28. - Pp. 463-499.

34. Amelioration of doxorubicin-induced cardiac and renal toxicity by pirfenidone in rats / S. N. Giri, M. A. Al-Bayati, X. Du et al. // Cancer. Chemother. Pharmacol. —2004. - Vol. 53, no. 2. - Pp. 141-150.

35. American society of clinical oncology clinical practice guidelines for the use of chemotherapy and radiotherapy protectants. / M. L. Hensley, L. M. Schuchter,

36. Lindley et al. // J. Clin. Oncology. - 1999. - Vol. 17, no. 10. - Pp. 3333-3355.

37. Anthracycline cardiomyopathy monitored by morphologic changes. / M. E. Billingham, J. W. Mason, M. R. Bristow, J. R. Daniels // CancerTreat. Rep. - 1978. - Vol. 62. - P. 865-872.I151

38. Anthracycline-induced suppression of gata-4 transcription factor: Implication in the regulation of cardiac myocyte apoptosis / Y. Kim, A.-G. Ma, K. Kitta et al. / / Mol.Pharmacol - 2003. — Vol. 63. — Pp. 368-377.

39. Anthracyclines: Molecular advances and pharmacologic developments in antitumor activity and cardiotoxicity. / G. Minotti, P. Menna, E. SalvatoreUi et al. / /Pharmacol. Rev. — 2004. — Vol. 56. — Pp. 185-229.

40. Anusevicuis, Z. Two-electron reduction of quinones by rat liver nad(p)h:quinone oxidoreductase: quantative structure-activity relationships. / Z. Anusevicuis,J. Sarlauskas, N. Genas / / Arch. Biochem. Biophys. — 2002. — Vol. 404. — Pp. 254-262.

41. Apaf-1, a human protein homologous to c. elegance ced-4, participates in cytochrom c-dependent activation of caspase-3. / H. Zou, W. J. Henzel, X. Liu et al. / / Cell. —1997. - Vol. 90. - Pp. 405-413.

42. Apoptosis - the p53 network / S. Haupt, M. Berger, Z. Goldberg, Y. Haupt / / J. Cell Science. - 2003. - Vol. 116. - Pp. 4077-4085.

43. Arner, E. S. J. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. / E. S. J. Arner, A. Holmger / / Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267. - Pp. 6102-6109.

44. Arteel, C. Protection against peroxinetrite. / G. Arteel, K. Briviba, H. Sies / / EEBS 1.etters. - 1999. - Vol. 445. - Pp. 226-230.

45. Babibor, B. NADPH oxidase: An update. / B. Babibor / / Blood.— 1999.— Vol. 93. - Pp. 1464-1476.

46. Barkett, M. Gontrol of apoptosis by rel/nf-kb transcription factors. / M. Barkett, T. Gilmore / / Oncogene.— 1999.— Vol. 18.— P. 6910-6924.

47. Basser, R. L. Strategies for prevention of anthracycline cardiotoxicity. / R. L. Basser, M. D. Green / / Cancer Treat. Rev. — 1993. — Vol. 19. — Pp. 57-77.

48. Bcl-2 functions in an antioxidant pathway to prevent apoptosis. / D. M. Hockenbery, Z. N. Oltvai, X. M. Yin et al. / / Cell - 1993. - Vol. 75. - Pp. 241-251.

49. Beckman, K. Oxidative decay of DNA. / K. Beckman, B. A. . / / J. Biol Chem. — 1997.- Vol. 272 . - Pp. 19633-19636.152

50. Beyer, R. E. The role of dt-diaphorase in the maintenance of the reduced antioxidant form of coenzyme q in membrane systems. / R. E. Beyer, J. Segura-Aquilar,S. D. Bernardo // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. - Vol. 93. - Pp. 2528-2532.

51. Brigelius-Flohe, R. Vitamin E: function and metabolism. / R. Brigelius-Flohe, M. Traber // FASEB J. - 1999.- Vol. 1 3 . - Pp. 1145-1155.

52. Brzezinski, . Melatonin in humans. / . Brzezinski // N. Engl. J. Med. — 1997. — ь Vol. 16. - Pp. 186-195.

53. Bunik, V. I. 2-0X0 acid dehydrogenase complexes in redox regulation. / V. I. Bunik // Eur. J. Biochem. - 2003. - Vol. 270. - P. 1036-1042.

54. Gai, H. Endothelial disfunction in cardiovascular diseases. The role of oxidant stress. / H. Cai, D. Harrison // Circ. Res. - 2000. - Vol. 87. - Pp. 840-844.

55. Cai, J. Superoxide in apoptosis: mitochondrial generation triggered by cytochrome с loss. / J. Cai, D. P. Jones // J. Biol. Chem. - 1998. - ' Vol. 273. - P. 11401-11404.^ 67. Candel, N. / N. Candel, P. Schumacker // J. Appl. Physiol. — 2000. - Vol. 88.

56. Cao, Z. The chemical inducibility of mouse cardiac antioxidants and phase 2 enzynies in vivoq / Z. Cao, Y. Li // Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2004. —.. Vol. 317. -- Pp. 1080-1088.I153

58. Carlberg, I. Purification and characterization of the flavoenzyme glytathione reductase from rat liver. / I. Carlberg, B. Mannervik / / J. Biol. Chem. — 1975. —Vol. 250. - Pp. 5475-5480.

60. Channon, K. Nitric oxide synthase in atherosclerosis and vascular injury: Insights from experimental gene therapy. / K. Ghannon, H. Qian, S. George / /Arteriosder.Thromb. Vasc.Biol. - 2000. - Vol. 20. - Pp. 1873-1881.

61. Chong, Z. Z. Erythropoietin is a novel vascular protectant through activation of aktl and mitochondrial modulation of cysteine proteases. / Z. Z. Ghong, J. Q. Kang,K. Maiese / / Circulation. - 2002. — Vol. 106. - P. 2973-2979.

62. Gleavage of bid by caspase-8 mediates the mitochondrial damage in the apoptosis. / H. Li, H. Zhu, C. J. Xu, J. Yuan / / Cell. - 1998. - Vol. 94. - Pp. 491-501.

63. Glinical and pharmacologic investigation of the effects of a-tocopherol on adriamycin cardiotoxicity. / S. S. Legha, Y. M. Wang, B. Mackay et al. / / Ann. N. Y. Acad.Sci. - 1982. - Vol. 393. - P. 411-418.

64. A clinicopathologic analysis of adriamycin cardiotoxicity. / E. A. Lefrak, J. Pitha, S. Rosenheim, J. A. Gottlieb / / Cancer (Phila.). - 1973. - Vol. 32. — Pp. 302-314.

65. Commoner, B. Free radicals in biological materials. / B. Gommoner, J. Townsend, G. E. Pake / / Nature. - 1954. - Vol. 174. - Pp. 689-691.

66. Crane, F. Biochemical functions of Goenzyme QiO. / F. Grane / / J. Am. Coll. Nutr. - 2001. - Vol. 20. - Pp. 591-598.

67. Croteau, D. Repair of oxidative damage to nuclear and mitochondrial DNA in mammalian cells. / D. Groteau, V. Bohr / / J. Biol. Chem.— 1997.— Vol. 272.—Pp. 25409-25412.i154

68. Daunorubicin-induced apoptosis in rat cardiac myocytes is inhibited by dexrazoxane. / D. B. Sawyer, R. Fukazawa, M. A. Arstall, R. A. Kelly // Circ.Res. - 1999. - Vol. 84. - Pp. 257-265.

69. Davies, K. J. Redox cycling of anthracyclines by cardiac mitochondria, i. anthracycline radical formation by nadh dehydrogenase. / K. J. Davies,J. H. Doroshow // J. Biol. C/iem. - 1986. - Vol. 2 6 1 . - Pp. 3060-3067.

70. Decline in transcriptional activity of nrf2 causes age-related loss of glutathione synthesis, which is reversible with lipoic acid / J. H. Suh, S. V. Shenvi, B. M. Dixonet al. // Proc. Nati. Acad. Sci. USA.-2004:.-Vol. 101, no. 1 0 . - Pp. 3381-3386.

71. Determination carbonyl content in oxidatively modified proteins. / R.'L. Levin, D. Garland, С N. Oliver et al. // Methods Enzym. — 1990. — no. 186. — Pp. 464-478.

72. Dietary glycine inhibits activation of nuclear factor kappa b and prevents liver injury in hemorrhagic shock in the rat / J. L. Mauriz, B. Matilia, J. M. Culebras et al. //Free Radio. Biol. Med. - 2001. - Vol. 31, no. 10. - Pp. 1236-1244.

73. Digicaylioglu, M. Erythropoietin-mediated neuroprotection involves cross-talk betAveen jak2 and nf-kappab signalling cascades. / M. Digicaylioglu, S. A. Lipton //Nature. — 2001. - Vol. 412. - Pp. 641-647.

74. Does long-term treatment of renal anaemia with recombinant erythropoietin influence oxidative stress in haemodialysed patients? / 0 . Sommerburg, T. Grune,H. Hampl et al. // Nephrol. Dial. Transplant. — 1998. — Vol. 13. — Pp. 2583 - 2587.

75. Dorr, R. T. Cytoprotective agents for anthracyclines. / R. T. Dorr // Semin. Oncol- 1996.- Vol. 23, no. 8 . - Pp. 23-34.

76. Doxorubicin cardiotoxicity may be due to its metabolite, doxorubicinol. / R. D. Olson, P. S. Mushlin, D. E. Brenner et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —1988. - Vol. 85. - Pp. 3585-3589.

77. Doxorubicin-induced apoptosis in endothelial cells and cardiomyocytes is ameliorated by nitrone spin traps and ebselen / S. Kotamraju, E. A. Konorev,155J. Joseph, В. Kalyanaraman // J. Biol. Chem.— 2000.— Vol. 275.—P. 33585-33592.

78. Doxorubicin induces apoptosis in normal and tumor cells via distinctly difFrent mechanisms: Intermediacy of h2O2 and p53-dependent pathways. / S. Wang,E. A. Kornev, S. Kotamraju et al. // J. Biol. Chem.— 2004.— Vol. 279.—Pp. 25535-25543.

79. Droge, W. Free radicals in the physiological control of cell function. / W. Droge // Physiol. Rev. — 2002. — Vol. 82. — Pp. 47-95.

80. Early anthracycline cardiotoxicity. / M. R. Bristow, P. D. Thompson, R. P. Martin et al. // Am. J. Med. - 1978. - Vol. 65. - P. 823-832.

81. The effect of dexrazoxane (icrf-187) on doxorubicin- and daunorubicin-mediated growth inhibition of Chinese hamster ovary cells. / B. B. Hasinofi', J. С Yalowich,Y. Ling, J. L. Buss // Anticancer Drugs.— 1996.— Vol. 7. — Pp. 558-567.

82. Ellman, G. L. Tissue sulfliydryl groups. / G. L. EUman // Arch. Biochem. Biophys. — 1972. - Vol. 82. - Pp. 70-77.

83. Ennor, A. H. I A. H. Ennor, H. Rosenberg // Biochem. J.— 1954.— Vol. 57.— Pp. 203-209.

84. Erythropoietin attenuates the tissue injury associated with hemorrhagic shock and myocardial ischemia. / M. Abdelrahman, E. J. Sharpies, M. C. McDonald et al. //&. - 2004. - Vol. 22, no. 1 . - Pp. 63-69.

85. Erythropoietin has a mitogenic and positive chemotactic effect on endothelial cells. / A. Anagnostou, E. S. Lee, N. Kessimian et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.—1990. - Vol. 87. - P. 5978-5982.

86. Erythropoietin prevents motor neuron apoptosis and neurologic disability in experimental spinal cord ischemic injury. / M. Celik, N. Gokmen, S. Erbayraktar,M. Akhisaroglu // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.— 2002.— Vol. 99.— Pp. 2258-2263.

87. Erythropoietin protects cardiac myocytes from hypoxia-induced apoptosis through an akt-dependent pathway. / A. F. Tramontano, R. Muniyappa, A. D. Black et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun. — 2003. — Vol. 308, no. 4. — Pp. 990-994.

88. Erythropoietin reduces myocardial infarction and left ventricular functional decline after coronary artery ligation in rats. / С Moon, M. Krawczyk, D. Ahn et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. - 2003. - Vol. 100. - P. 11612-11617.156

89. Evidence of the selective alteration of anthracycline activity due to modulation by icr-187 (adr-529). / M. D. Green, P. Alderton, J. Gross et al. // Pharmacol. Ther.—1990. - Vol. 48. - Pp. 61-69.

90. Fisher, J. W. Erythropoietin: Physiology and pharmacology update. / J. W. Fisher // Exp. Biol. Med. - 2003. - Vol. 228. - P. 1-14.

91. Fowler, G. Melatonin does not directly scavenge hydrogen peroxide: demise of another myth. / G. Fowler, M. Daroszewska, K. U. Ingold // Free Radic. Biol.Med. - 2003. - Vol. 34. - Pp. 77-83.

92. Frey, P. Radical mechanisms of enzymatic catalysis / P. Frey // Annu. Rev. Biochem. - 2001. - Vol. 70. - Pp. 121-148.

93. Fridovich, I. Superoxide radical and superoxide disrnutases. / I. Fridovich // Annu. Rev. Biochem. - 1995. - Vol. 64. - Pp. 97-112.

94. Fridovich, I. Superoxide anion radical (0^'), superoxide dismutases, and related matters. / I. Fridovich // J. Biol. C/iem. - 1997. — Vol. 2 7 2 . - Pp. 18515-18517.

95. Gata-1 blocks il-6-induced macrophage differentiation and apoptosis through the sustained expression of cyclin dl and bcl-2 in a murine myeloid cell line ml. /H. Tanaka, I. Matsumura, K. Nakajima et al. // Blood.— 2000.— Vol. 95.—Pp. 1264-1273.

96. Generation of superoxide by purified brain nitric oxide synthase. / S. Pou, W. Pou, D. Bredt et al. // J. Biol. C/iem. — 1992. - Vol. 2 6 7 . - Pp. 24173-24176.

97. Genomic sequence and expression of a cloned human carbonyl reductase gene with - daunorubicin reductase activity. / G. L. Forrest, S. Akman, J. H. Doroshow et al. //Mol Pharmacol. - 1991. - Vol. 40. - Pp. 502-510.k157

98. Gewirtz, D. A. A critical evaluation of the mechanisms of action proposed for the antitumor effects of the anthracycline antibiotics adriamycin and daunorubicin. /D. A. Gewirtz / / Biochem. Pharmacol-1999. —Vol. 5 7 . - P. 727-741.

99. Girotti, A. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effectors action in biological systems. / A. Girotti / / J. Lipid Res.— 1998.— Vol. 39.— Pp. 1529-1542.

100. Glutathione redox potential in response to differentiation and enzyme inducers. / W. G. Kirlin, J. Gai, S. A. Thompson et al. / / Free Radio. Biol Med. — 1999. —Vol. 27. — P. 1208-1218.

101. Glycine prevents apoptosis of rat sinusoidal endothelial cells caused by deprivation of vascular endothelial growth factor. / Y. Zhang, K. Ikejima, H. Honda et al. / /Hepatology. — 2000. — Vol. 32, no. 3. — Pp. 542-546.

102. Glycine prevents the induction of apoptosis attributed to mesenteric ischemia/reperfusion injury in a rat model. / T. Jacob, E. Ascher, A. Hingorani,S. Kallakuri / / Surgery. - 2003. - Vol. 134, no. 3. - Pp. 457-466.

103. Glycine prevents the induction of apoptosis attributed to mesenteric ischemia/reperfusion injury in a rat model. / T. Jacob, E. Ascher, A. Hingorani,S. Kallakuri / / Surgery. - 2003. - Vol. 134, no. 3. — Pp. 457-466.

104. Griendling, K. NAD(P)H oxidase. Role in cardiovascular biology and disease. / K. Griendling, D. Sorescu, M. Ushio-Fukai / / Giro. Res.— 2000.— Vol. 86.—Pp. 494-501.

105. Grim,m, G. Hif-l-induced erythropoietin in the hypoxic retina protects against light-induced retinal degeneration. / C. Grimm / / Nat. Med. — 2002. — Vol. 8. —P. 718-724.

106. Gross, A. Bcl-2 family members and the mitochondria in apoptosis. / A. Gross, J. M. McDonnell, S. J. Korsmeyer / / Genes and Dev.— 1999. — Vol. 13, no. 15.—Pp. 1899-1911.

107. НаЫд, W. G. Glutathione s-transferase. the first enzymic step in mercapturic acid formation. / W. G. Habig, M. J. Pabst, W. B. Jakoby // J. Biol. Chem. — 1974. —Vol. 249. - Pp. 7130-7139.

108. Halliwell, B. The antioxidants of human extracellular fluids. / B. Halliwell, J. Gutteridge // Arch. Biochem. Biophys. — 1990. — Vol. 280. — Pp. 1-8.

109. Halliwell, B. • H. Free radicals in biology and medicine. / B. H. Halliwell, J. M. Gutteridge.— Oxford, UK: Oxford Univer. Press, 1989.

110. Hoidal, J. Reactive oxygen species and cell signaling. / J. Hoidal // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. - 2001. - Vol. 25. - Pp. 661-663.

111. Hwang, C. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum / G. Hwang, A. Sinskey, H. Lodish // Science. — 1992. — Vol. 257. — Pp. 1496-1502.

113. Singh I. Mammalian peroxisomes: metabolism of oxygen and reactive oxygen species. /I. Singh // Ann. NY Acad. Sci.- 1996.-Vol. 804. — Pp. 612-627.

114. Icrf-187 permits longer treatment with doxorubicin in women with breast cancer. / J. L. Speyer, M. D. Green, A. Zeleniuch-Jacquotte et al. // J. Clin. Oncol. — 1992. —Vol. 10. - Pp. 117-127.

115. Increase in fragmented phosphatidylcholine in blood plasma by oxidative stress. / B. Frey, R. Haupt, S. Alms et al. // J. Lipid Res.- 2000.- Vol. 4 1 . - Pp. 1145-1153.

116. Induction of apoptotic program in cell-free extracts: Requirement for datp and cytochrome с / X. Lie, G. N. Kim, J. Yang et al. // Cell. — 1996. - Vol. 86. -Pp. 147-157.

117. Induction of hepatic heme oxygenase-1 and ferritin in rats by cancer chemopreventive dithiolethiones. / T. Primiano, T. W. Kensler, P. Kuppusamyet al. // Carcinogenesis. — 1996. — Vol. 17. — Pp. 2291-2296.t159

118. Inhibition of ldl oxidation by melatonin requires supraphysioiogic concentrations. / P. B. Duel, D. L. Whealton, A. Shultz, H. Nguyen / / Clin. Chem. - 1998. - Vol. 44,no. 9.

119. Interaction between erythropoietin and peripheral polymorphonuclear leukocytes in hemodialysis patients. / B. Kristal, R. Shurtz-Swirski, S. M. Shasha et al. / /Nephron. — 1999. — Vol. 81, no. 4. — Pp. 406-413.

120. Interaction of human nad(p)h:quinone oxidoreductase 1 (nqol) with the tumor suppressor protein p53 in cells and cell-free systems. / A. Anwar, D. Dehn, D. Siegelet al. / / J. Biol. Chem. - 2003. - Vol. 278, no. 12. - P. 10368-10373.

121. Investigation of doxorubicin tissue toxicity: does amifostine provide chemoprotection? an experimental study. / S. K. Rigatos, G. P. Stathopoulos,I. Dontas et al. / / Anticancer Res. — 2002. — Vol. 22, no. 1(A). — Pp. 129-134.

122. Jaenke, R. S. An anthracycline antibiotic-induced cardiomyopathy in rabbits. / R. S. Jaenke / / Lab. Investig. — 1974. - Vol. 30. - P. 292-304.

123. Malloy, H. T. The determination of bilirubin with the photoelectric colorimetr/ H. T. Malloy and K. A. Evelyn / / J. Biol. Chem.- 1937. - Vol. 1 1 9 . - Pp. 481-490.

124. Kang, Y. J. Suppression of doxorubicin cardiotoxicity by overexpression of catalase in the heart of transgenic mice. / Y. J. Kang, Y. Chen, P. N. Epstein / / J. Biol.Chem. - 1996. - Vol. 271. - Pp. 12610-12616.

125. Klatt, P. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress. / P. Klatt, S. Lamas / / Eur. J. Biochem.— 2000.— Vol.267. - Pp. 4928-4944.

126. Koshi, J. Free radicals. / J. Koshi; Ed. by J. Koshi. — NY: Acad.Press, 1980.

127. Kourie, J. Interaction of reactive oxygen species with ion transport mechanisms. / J. Kourie / / Am. J. Physiol. - 1998. - Vol. 275. - Pp. C1-C24.

128. Kramer, J. Phospholipid hydroperoxides are precursors of lipid alkoxyl radicals produced from anoxia/reoxygenated endothelial cells. / J. Kramer, B. Dickens,W. Weglicki / / J. Mol. Cell. CardioL- 1995. - Vol. 2 7 . - Pp. 371-381.

129. Laurent, G. Signaling pathways activated by daunorubicin. / G. Laurent, J. P. Jaffrezou / / Blood. - 2001. - Vol. 98. - P. 913-924.

130. Lewis, W. Anthracycline effects on actin and actin-containing thin filaments in cultured neonatal rat myocardial cells. / W. Lewis, B. Gonzales / / Lab. Investig. —1986. - Vol. 54. - P. 416-423.

131. Li, . Adriamycin-induced early changes in myocardial antioxidant enzymes and their modulation by probucol. / . Li, P. K. Singal / / Circulation. — 2000. — Vol. 102. —Pp. 2105-2110.

132. Li, T. Early changes in myocardial antioxidant enzymes in rats treated with adriamycin. / T. Li, L Danelisen, P. K. Singal / / Mol. Cell. Biochem. — 2002. —Vol. 232. — Pp. 19-26.

133. Liver-targeted doxorubicin: effects on rat regenerating hepatocytes. / G. D. Stefano, M. Derenzini, F. Kratz et al. / / Liver Int. — 2004. — Vol. 24, no. 3. — Pp. 246-252.

134. Lu, S. C. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts and controversies. / S. G. Lu / / FASEB J. - 1999. - Vol. 13. - Pp. 1169-1183.

135. Mannaerts, G. Peroxisomal lipid degradation via a- and /5-oxidation in mammalians / G. Mannaerts, P. V. Vendhoven, M. Gasteels / / Cell Biochem.Biophys. - 2000. - Vol. 32. - Pp. 73-87.

136. Mashima, R. Reduction of phosphatidylcholine hydroperoxide by apdlipoprotein A- 1: purification of the hydroperoxidereducing proteins from human blood plasma. /R. Mashima, Y. Yamamoto, S. Yoshimura / / J. Lipid Res. — 1998. — Vol. 39. —Pp. 1133-1140.

137. Mates, J. Antioxidant enzymes and human diseases. / J. Mates, G. Perez-Gomez,

138. N. de Gastro / / Clin. Biochem. 1999. — Vol. 32. — Pp. 595-603.

139. McHugh, J. Nitric oxide and regulation of vascular tone: pharmacological and physiological considerations. / J. McHugh, D. Gheek / / Am. J.' Critical Care.—1998. - Vol. 7. - Pp. 131-140.

140. Mediavilla, M. D. Melatonin increases p53 and p21wafl expression in mcf-7 human breast cancer cells in vitro. / M. D. Mediavilla, S. Gos, E. J. Sanchez-Barcelo / /1.ife Sci. - 1999. - Vol. 65. - P. 415-420.

141. Meister, A. Glutathione-ascorbic acid antioxidant system in animals. / A. Meister / / J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - Pp. 9397-9400.161

142. Melatonin as an effective protector against doxorubicin-induced cardiotoxicity / X. Liu, Z. Chen, С Chya et al. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. — 2002. -Vol. 283. - P. H254-H263.

143. Melatonin attenuates renal failure and oxidative stress induced by mercuric chloride in rats. / M. Nava, F. Romero, Y. Quiroz et al. // Am. J. Renal Physiol. — 2000. -—Vol. 279. - Pp. F910-F918.

144. Melatonin decreases apoptosis and expression of apoptosis-associated proteins in acute puromycin aminonucleoside nephrosis. / A. Pedreanez, J. Rincon, M. Romeroet al. // Nephrol. Dial Transplant. — 2004. — Vol. 19.

145. Melatonin is protective in necrotic but not in caspasedependent, free radical- independent apoptotic neuronal cell death in primary neuronal cultures. / C. Harms,M. Lautenschlager, A. Bergk et al. // FASEB J. - 2000. - Vol. 14. - P. 1814-1824.

146. Melatonin protects against cardiac toxicity of doxorubicin in rat. / M. F. Xu, S. Ho, Z. M. Qian, P. L. Tang // J. Pineal Res. - 2001. - Vol. 31, no. 4. - Pp. 301-307.

147. Mellor, A. The inhibition of mitochondrial peroxidation b}' ubiquinone and ubiquinol. / A. Mellor, A. L. Tappel // J. Biol Chem. - 1966. - Vol. 241, no. 19. —Pp. 4353-4356.

148. Minotti, G. Sources and role of iron in lipid peroxidation. / G. Minotti // Chem,. Res. Toxieol - 1993. — Vol. 6. - Pp. 134-146.

149. Minotti, G. Role of iron in anthracycline cardiotoxicity: new tunes for an old song? / G. Minotti, G. Cairo, E. Monti // FASEB J. - 1999. - Vol. 1 3 . - Pp. 199-212.

150. Mitochondrial dna and its respiratory chain products are defective in doxorubicin nephrosis. / D. Lebrecht, B. Setzer, R. Rohrbard, U. A. Walker // Nephrol. Dial.Transplant. - 2004. - Vol. 19. - Pp. 329-336.

151. Modulation of gene expression by cancer chemopreventive dithiolethiones through the keapl-nrf2 pathway / M.-K. Kwak, N. Wakabayashi, K. Itoh et al. // J. Biol.Chem. — 2003. - Vol. 278, no. 10. — P. 8135-8145.

152. Molkentin, J. D. The zinc finger-containing transcription factors gata-4, -5 and -6. ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. /J. D. Molkentin // J. Biol Chem. - 2000. - Vol. 275. - Pp. 38949-38952.

153. The neurohormone melatonin inhibits cytokine, mitogen and ionizing radiation induced nf-kb. / N. Mohan, K. Sadeghi, R. J. Reiter, M. L. Meltz // Biochem.Mol. Biol. /nt. - 1994.- Vol. 37.—Pp. 1063-1070.

154. Nguyen, T. Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element / T. Nguyen, P. J. Sherratt, C. B. Picket // Annu.Rev. Pharmacol. Toxicol. — 2003. — Vol. 43. — Pp. 233-260.

155. Nohl, H. Do mitochondria produce oxygen radicals in vivo? / H. Nohl, D. Hegner // Eur. J. Biochem. - 1978. - Vol. 82. - Pp. 563-567.

156. A novel protective effect of erythropoietin in the infarcted heart. / C. J. Parsa, A. Matsumoto, J. Kim et al. // J. Clin. Invest. — 2003. — Vol. 112. — P. 999-1007.

157. An nrf2/small maf heterodimer mediates the induction of phase ii detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. / K. T. Itoh, S. Chiba,T. Takahashi et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun.— 1997.— Vol. 236.—Pp. 313-322.

158. Okatani, Y. Melatonin stimulates glutathione peroxidase activity in human chorion. / Y. Okatani, A. Wakatsuki, K. Ahinohara // J. Pineal Res.— 2001.—Vol. 30. - Pp. 199-205.

159. Oka,tani, Y. Melatonin increases activities of glutathione peroxidase and superoxide dismutase in fetal rat brain. / Y. Okatani, A. Wakatsuki, С Kaneda // J. PinealRes. - 2000. - Vol. 28. - Pp. 89-96.

160. Overexpression of metallothionein in the heart of transgenic mice suppresses doxorubicin cardiotoxicity / Y. J. Kang, Y. Ohen, A. Yu et al. // J. Clin. Invest. —1997. - Vol. 100. - Pp. 1501-1506.

161. The oxidant/antioxidant network: role of melatonin. / R. J. Reiter, D. X. Tan, J. Cabrera et al. // Biol. Signals Recept—1999. —Vol. 8, no. 1-2. — Pp. 56-63.

163. Paolicchi, A. Glutathione catabolism as a signaling mechanism. / A. Paolicchi, S. Dominichi, A. Pompella // Biochem. Pharmacol. — 2002. — Vol. 64, no. 5-6. —Pp. 1027-1035.4

165. Powis, G. Free radical formation by antitumor quinones. / G. Powis // Free Rad. Biol. Med. - 1989. - Vol. 6. - Pp. 63-101.

166. Radjendirane, V. Disruption of the dt diaphorase (nqol) gene in mice leads to increased menadione toxicity. / V. Radjendirane, P. Joseph, Y. H. Lee / / J. Biol.Chem. - 1998. - Vol. 273. - Pp. 7382-7389.

167. A randomized controlled trial assessing the prevention of doxorubicin cardiomyopathy by n-acetylcysteine. / C. Myers, R. Bonow, S. Palmieri et al. / /Semin. Oncol. - 1983. - Vol. 10. - P. 53-55.

169. Reactive oxygen species released from mitochondria during brief hypoxia induce preconditioning in cardiomyocytes. / T. V. Hoek, L. Becker, Z. Shao et al. / / J.Biol. Chem. - 1998. - Vol. 272. - Pp. 18092-18098.

171. Regulation of cellular iron metabolism by erythropoietin: activation of iron- regulatory protein and upregulation of transferrin receptor expression in erythroidcells. / G. Weiss, T. Houston, S. Kastner et al. / / Blood.— 1997.— Vol. 89.—Pp. 680-687.

172. Reiter, R. J. Melatonin: Lowering the high price of free radicals. / R. J. Reiter / / News Physiol Sol - 2000. - Vol. 15. - Pp. 246-250.

173. Reitman, S.A colorimetric method for the determination of serum glutamic oxalacetic and glutamic pyruvic transaminases. / S. Reitman, S. Frankel / / Amer.J. Clin. Pathol. - 1957. - Vol. 28. - Pp. 56-63.

174. Rice-Evance, C. Thechniques in free radical research. / C. Rice-Evance, A. Diplock, ./L,. M. Symons. — Amsterdam: Elsevier, 1991.

175. Rushmore, T. H. Glutathione s-transferases, structure, regulation, and therapeut ic implications. / T. H. Rushmore, C. B. Pickett // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol.2 6 8 . - P p . 11475-11478.

176. Sanders, S. NADH-oxidase activity of human xanthine-oxidoreductase generation 1^. of superoxide anion. / S. Sanders, R. Eisenthal, R. Harrison // Eur. J. Biochem.—1997. - Vol. 245. - Pp . 541-541.

177. Serum cholesterol and lipid peroxidation are decreased by melatonin in diet induced hyperholesterolemic rats. / M. Hoyos, J. M. Guerrero, R. Perez-Cano et al. // J.Peneal. Res. - 2000. - Vol. 28, no. 3. - Pp. 150-155.

178. Shaikh, Z. A. Oxidative stress as a mechanism of chronic cadmium-induced hepatotoxicity and renal toxicity and protection by antioxidants. / Z. A. Shaikh,T. T. Vu, K. Zaman // Toxicol. Appl Pharmacol— 1999.— Vol. 154, no. 3.—Pp. 256-263.

179. Sies, H. Glutathione and its role in cellular functions. / H. Sies // Free Radio. Biol. Med. - 1999. - Vol. 27. - P. 916-921.

180. Singal, P. K. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. / P. K. Singal, N. Iliskovic // N. Eng. J. Med. - 1998. - Vol. 339. - Pp. 900-905.

181. Skladanowski, A. Adriamycin and daunomycin induce programmed cell death (apoptosis) in tumour cells./ A. Skladanowski, J. Konopa // Biochem. Pharmacol. —1993. - Vol. 46. - Pp. 375-382.

182. Snyder, S. Я. The glycine synaptic receptor in the mammalian central nervous system. / S. H. Snyder // Br. J. Pharmacol—2000. —Vol. 131.— Pp. 109 - 114.

183. Speyer, J. L. Protective effect of the bispiperazinedione icrf-187 against doxorubicin- induced cardiac toxicity in women лvith advanced breast cancer. / J. L. Speyer,M. D. Green, E. Kramer // N. Fngl J. Med. - 1988. - Vol. 319. - Pp. 745-752.

184. Sugden, D. Melatonin: binding site characteristics and biochemical and cellular responses. / D. Sugden // Neurochem. Int.— 1994. — Vol. 24. — Pp. 147-157.

185. Superoxide and peroxynitrite in atherosclerosis. / C. White, T. Brock, L.-Y. Chang et al. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. - 1994. - Vol. 91. - Pp. 1044-1048.

186. Suppression of gst-p by treatment with glutathione-doxorubicin conjugate induces potent apoptosis in rat hepatoma cells / T. Asakura, Y. Hashizume, K. Tashiroet al. // Int. J. Cancer. - 2001. - Vol. 94, no. 2. - Pp. 171-177.

187. Taylor, R. Mechanical deformation of the arterial wall in hypertension: A mechanism for vascular pathology / R. Taylor // Am. J. Med. Sci. - 1998. — Vol. 316. -Pp. 156-161.167

188. Temelocos, G. Renal abnormalities in rat fetuses exposed to doxorubicin. / G. Temelocos, J. M. Huston / / Journal of Urology.— 2004.— Vol. 171, no. 2.—Pp. 877-881.

189. Thiol-mediated redox regulation of apoptosis. possible roles of cellular thiols other than glutathione in t cell apoptosis. / N. Sato, S. Iwata, K. Nakamura et al. / / J.Immun. - 1995. - Vol. 154. - Pp. 3194-3203.

190. Tight association of the human mella-melatonin receptor and gi: precoupling and constitutive activity. / F. Rocka, L. Brydon, M. Waldhoer et al. / / Mol.Pharmacology.-1999. — Vol. 56. — Pp. 1014-1024.

191. Vleet, J. F. Gardiac disease induced by chronic adriamycin administration in dogs and an elevation of vitamin e and selenium and cardioprotectants. / J. F. A l^eet,J. V. Ferrans, W. E. Weirich / / Am. J. Pathol. - 1980. - Vol. 99. - P. 13-22.

192. Wang, W. Endogenous glutathione conjugates: occurrence and biological functions. / W. Wang, N. Ballatori / / Pharm. Rev. — 1998. — Vol. 50. — Pp. 335-355.

193. Wang, X. The expanding role of mitochondria in apoptosis. / X. Wang / / Genes Dev. - 2001. - Vol. 15. - Pp. 2922-2933.

194. Weiss, R. B. The anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin? / R. B. Weiss / / Semin. Gncol. — 1992. - Vol. 19, no. 670-686.

195. Wenger, R. Mammalian oxygen sensing, signalling and gene regulation / R. Wenger / / J. Exp. Biol. - 2000. - Vol. 203. - Pp. 1253-1263.

196. Wild, A. G. Regulation of gamma-glutamylcysteine synthetase subunit gene expression: insights into transcriptional control of antioxidant defenses. / A. G. Wild,R. T. Mulcahy / / Free Radic. Res. - 2000. - Vol. 32, no. 4. - Pp. 281-301.

197. Xu, M. Melatonin protection against lethal myocyte injury induced by doxorubicin as refiected by efi^ ects on mitochondrial membrane potential. / M. Xu, M. Ashraf / /J. Mol. Gell Gardiol. - 2002. - Vol. 34, no. 1. - Pp. 75-79.168

198. Zhao, Y. Effect of cytochrome с on the generation and elimination of O2' and H2O2 in mitochondria. / Y. Zhao, Z. Wang, J.-X. Xu // J. Biol. Chem. - 2003. - Vol.278. - Pp. 2356-2360.