Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов ее оптимизации

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов ее оптимизации"

На правах рукописи

ч

005014155

Ильина Лариса Александровна

ИЗУЧЕНИЕ МИКРОФЛОРЫ РУБЦА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

НА ОСНОВЕ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКОГО МЕТОДА Т-МЪР С ЦЕЛЬЮ РАЗРАБОТКИ СПОСОБОВ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ

03.01.06 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 5 МАР ¿012

Дубровицы - 2012

005014155

Работа выполнена в лаборатории зоологической микробиологии Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Лаптев Георгий Юрьевич

Официальные оппоненты:

Вахитов Тимур Яшэрович, доктор биологических наук, ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства, ведущий научный сотрудник лаборатории прикладной микробиологии.

Гладырь Елена Александровна, кандидат биологических наук, ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства РАСХН зав. лабораторией молекулярной генетики животных Центра биотехнологии и молекулярной генетики животных.

Ведущая организация: ГНУ ВНИИ генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН

Защита диссертации состоится »¿ШрТО^2012 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 006.013.01. при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук

Адрес института: 142132 Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВНИИЖ; тел./факс (4967) 65-11-01.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ РАСХН.

Автореферат разослан » ■ 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.013.01. Г7— С.В. Воробьева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На протяжении последних десятилетий изучение микроорганизмов рубца, их роли в пищеварении и обмене веществ в многокамерном желудке жвачных вызывает повышенный интерес, как ученых, так и практиков -животноводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организации более рационального и полноценного кормления животных и эффективного использования кормов для повышения продуктивности (Пивняк, Тараканов, 1982; Георгиевский, 1990; Прохоренко, 2006; Стрекозов и др., 2006; Романенко, 2007; Эрнст, Зиновьева, 2008; Hungate, 1966).

Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии (Bryant, 1959; Hungate, 1966; Dehority, Orpin, 1988; Hespell et al., 1997). Однако в настоящее время исследователями описан ряд ограничений и недостатков данных методов - прежде всего их трудоемкость и неточность (Dehority, 2003). Помимо этого, зарубежными специалистами было показано, что значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивируемыми видами. Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов, происходящих в рубце (Amann et al., 1992; Wintzingerode et al., 1997; Zoetendal et al., 1998; Krause et al., 2003; Shin, 2004).

Развитие метагепомных методов делает возможным дальнейшее изучение разнообразия микроорганизмов без ограничений традиционных методов микробиологии - т.е. минуя стадию культивирования. Большинство данных методов основано на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов (например, 16S/18S рРНК) и часто включают в себя стадии клонирования общей ДИК всех микроорганизмов в вектор, а затем анализ полученных библиотек клонов в базах данных (Stackebrandt, Goebel, 1994; Amann et al., 1995; Madden et al., 1996; Tajima et al. 1999; Nelson et al., 2003; Handelsraan, 2004). Однако, несмотря на широкий спектр возможностей, данные методы являются достаточно трудоемкими и дорогостоящими. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто изучить структуру микробного сообщества, но и проследить за изменением этой структуры в результате какого-либо воздействия. Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является Т-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) - молекулярно-биологический метод для изучения структуры микробной экосистемы, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Преимуществом использования данного подхода является возможность получения профиля микробного сообщества (бактерий, архей, грибов), что позволяет установить количество и относительную численность доминирующих групп микроорганизмов. Для определения таксономической структуры бактериальных сообществ по длинам рестрикционных фрагментов созданы компьютерные программы, например, программа FragSort (March et al., 2000). Таким образом, в результате возможно выявление микроорганизмов, оказывающих непосредственное влияние на продуктивность животных.

Цель исследований. Изучить состав микрофлоры рубца крупного рогатого скота, его изменения в течение суток, в процессе роста и развития животных, а также под действием пробиотических препаратов на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP для оценки возможности использования данного подхода в разработке способов его оптимизации.

Задачи исследований:

- модифицировать методику T-RFLP для изучения микрофлоры рубца крупного рогатого скота;

- сравнить результаты классических методов микробиологии и T-RFLP-анализа при изучении микрофлоры рубца жвачных животных;

- изучить закономерности суточной и возрастной динамики микробного сообщества рубца бычков с помощью T-RFLP-анализа;

- установить особенности микробиоценоза рубца дойных коров в зависимости от уровня продуктивности и состояния здоровья;

- оценить влияние пробиотических препаратов на микрофлору рубца крупного рогатого скота.

Научная новизна исследований. Впервые проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного молекулярно-биологического метода T-RFLP, в результате чего было выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых, а также установлена возможная роль данных микроорганизмов в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных. Изучены изменения во всех компонентах микробного сообщества (бактерии, археи, грибы), происходящие в течение суток, связанные с кормлением животных. Установлено, что рост и развитие пищеварительной системы животных сопровождается сменой доминирующих таксономических групп в составе бактерий, архей и грибов. В условиях рубцовой экосистемы проанализировано действие пробиотиков Целлобак-терин-Т и Целлобактерин-S на разные физиологические группы микроорганизмов.

Выявлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и количеством микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. С использованием модифицированного метода T-RFLP в рубце крупного рогатого скота выявлено более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), установлена их связь с физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных, что позволяет разработать способы регулирования микробиологических процессов в рубце, направленных на повышение эффективности использования корма жвачными животными, снижение заболеваемости и увеличение продуктивности животных.

Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных» (Дубровицы, ВИЖ, 2011).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены:

- на Международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» (Дубровицы, октябрь 2008 г.);

- на 13 и 14 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, 2008-2009 г.),

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов» (Москва, 1920 августа 2009 г.);

- на пятой Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 14-16 сентября 2010 г.);

- на пятой Международной конференции «Современное производство комбикормов «Комбикорма - 2010» (Москва, 22-24 ноября 2010).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных статей, в том числе пять в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

- изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода Т-ЯРЬР позволяет идентифицировать более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), в том числе некультивируемых, а также установить их возможную роль в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных;

- установлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и содержанием микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 197 страницах компьютерной верстки, содержит 40 таблиц, 18 рисунков, структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения производству и список использованной литературы, включающий 342 источника, в том числе 303 на иностранном языке.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа была выполнена в период с 2008 по 2011 гг. Общая схема проведения эксперимента представлена на рисунке 1.

Рис.1. Общая схема исследований

Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов

Изучение суточной динамики микробного сообщества рубиа бычков Исследования проводили на физиологическом дворе ГНУ ВИЖа (Подольский район Московской области) на бычках черно-пестрой породы, подобранных по возрасту и живой массе, прооперированных по наложению фистул рубца по Басову и дуоденальных анастомозов Синещекову. Основной рацион подопытных животных состоял из силоса. В рацион бычков первой группы бьш введен комбикорм, второй группы - комбикорм с добавлением 10 г Целлобактерина-S (дрожжи Saccharomyces ellipsoideus - штамм S4-38), третьей группы - комбикорм с добавлением 10 г Целлобактерина-Т (бактерии Bacillus subtilis - штамм 1-85). Оба пробиотика смешивали с комбикормом и задавали в утренние часы кормления. В основу физиологических исследований положена методика комплексного изучения процессов пищеварения, разработанная в лаборатории физиологии пищеварения сельскохозяйственных животных ГНУ ВИЖа (Синещеков, Шеремет, 1953).

Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубиа телят Исследование проводили в СПК «Кобраловский» Ленинградской области. Для опыта было отобрано 2 группы телят 11-20-суточных бычков черно-пестрой породы по принципу аналогов (живая масса, пол, возраст). Состав рациона животных представлен в таблице 1. Кормление телят было групповым, цельное молоко выпаивалось индивидуально. Сено, сенаж и силос телятам давали с 10-суточного возраста, комбикорм - с 30-суточного. Ежемесячно проводили взвешивание животных.

Таблица 1

Рацион бычков

Месяцы Корм, кг.

Цельное молоко Концентраты Сено Силос Сенаж

Овсянка Комбикорм

1 230 - - Приуч. - 2 Приуч. - Приуч. -

2 190 2,0 10 Приуч. -16 Приуч. -16 Приуч. 16

3 80 - 32 37 45 45

4 - - 45 54 74 74

Всего 500 - 87 109 135 135

Анализ микробиоиеноза рубиа коров в производственных условиях Исследования проводили в условиях хозяйств Ленинградской, Тверской, Белгородской областей и Краснодарского края на первотелках и коровах старшего возраста черно-пестрой породы разного периода отела, состояния здоровья и уровня продуктивности (табл. 2):

- здоровые животные - ЗАО «Племзавод «Большевик» Лениградской области, ОАО «Агрофирма Дмитрова гора» Тверской области, МПФ «М. Орловка» Белгородской области, ГП «Племзавод ОПХ «Ладожское», ЗАО «Племзавод «Воля», ЗАО «Племзавод «Победа» Краснодарского края;

- животные, выбракованные по бесплодию, хромоте и снижению удоев - СПК "Племзавод "Детскосельский", ЗАО «Племзавод «Большевик», ЗАО «Племзавод «Раздолье», ЗАО «Племзавод «Приневское», СПК «Кобраловский» Ленинградской области.

Таблица 2

Характеристика рациона и продуктивности коров_

Хозяйство Состав рациона, кг Сред-не-сут.

Сено Силос Комбикорм Кукур. экстр. Патока Шрот Плющ, зерно Картофель Дробина Жом свекл. Зел. масса удой, кг

«Раздолье» №1415 3 25 9 1 1 7

о и «Приневское» №4036 2 35 3,5 - 1 - 3 - - - - 15

S. = «Детскоссльский» №1415 1 35 5 1 - - 5 - - - 25

3 g «Кобраловский» №4036, №1297 2 3S 5 - 0,5 15

П «Большевик» №1229, №452 2 35 6 - 1,5 - - - б 2 - 19

і «Большевик» №1342, №1241, №1030, №1352 2 35 6 - 1,5 - - - 6 2 - 30

О. О «Агрофирма Дмитрова гора» 14,8 10 7,8 2,3 2,8 - - 5,2 - - 22-25

U МПФ «М. Орловка» 13 12 . - 9 - - - 10 - 25-30

1 «Племзавод ОПХ «Ладожское» - 15 4 25 22-24

О. О «Племзавод «Воля» 12,5 15 8 - 0,8 - - - - - 10 28-30

еп «Племзавод «Победа» 12 10 9 10 21-27

Методики лабораторных исследований

Химический анализ кормов, кала, мочи и рубцового содержимого проводили в химико-аналитической лаборатории ГНУ ВИЖа по общепринятым методикам (М.Ф. Томмэ, 1969; Ю.И. Раецкая, В.Н. Сухарева, 1970).

Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов Микробиологические исследования проводили в лаборатории зоологической микробиологии ГНУ ВНИИСХМ и лаборатории молекулярной генетики ООО «Биотроф». Численность микроорганизмов в пробах рубцового содержимого определяли методом предельных разведений на селективных агаризованных питательных средах и выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г субстрата (Теппер, 1975; Зенова, 2002; Тараканов, 2006). Для приготовления разведений и создания анаэробных условий использовали раствор Дейтча и соавт. (Тараканов, 2006). Молочнокислые бактерии выявляли на агаризованной среде (САМ), энтерококки - на энтерококк-агаре, салротрофные бактерии - на мясо-пептонном агаре (МПА), энтеробактерии - на агаре Эндо-ГРМ. Для трансформации бактериальной ДНК рубца использовали штамм Escherichia coli DH5a. Для хранения и поддержания культуры использовали агаризованную среду LB.

Молекулярно-биологические методы. Молекулярно-биологические исследования проводили в лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ ВНИИСХМ и лаборатории молекулярной биологии ООО «Биотроф».

Экстракцию ДНК проводили из 0,5 мл рубцового содержимого с помощью двух методов (в трех повторностях), включающих лизис с помощью буфера на основе СТАВ (СТАВ 2%; Tris-HCl 0,1М; ЭДТА-№2 20 мМ; NaCl 1,4 М; рН 8,5) или SDS (SDS 2%; Tris-HCl 20 мМ; ЭДТА-№2 20 мМ; NaCl 2 М; рН 8,0), гомогенизацию стеклянными шариками в приборе FastPrep 24 (M.P.Biomedicals) и фенол-хлороформную экстракцию.

Очистку геномной ДНК проводили тремя способами: методом отмывки ДНК в агарозных блоках и экстракции фенолом, смесью фенол/хлороформ (1:1), хлороформом; методом очистки ДНК с помощью раствора СТАВ (СТАВ 2%; Tris-HCl 0,ЇМ; ЭДТА-Ыа2 10 мМ; NaCl 0,9 М; рН 8,0) и экстракции хлороформом; с помощью ДНК-сорбента Silica (Маниатис и др., 1984).

T-RFLP-анализ. Амплификацию генов бактериальных, архейных и грибных проводили с помощью праймеров, представленных в таблице 3 (Singh et al., 2006). Праймеры 63f, ITSlf, Ar3f имели с 5' конца флуоресцентную метку Су5 (цианин-5 дезоксицитидинтрифосфата).

Таблица 3

Праймеры для амплификации микроорганизмов рубца_

№ п/п Ген Назначение Название праймера Последовательность праймера

1 16S Бактерии 63f 1087г 5'-AGGCCTAACACATGCAAGTC-3' (Cy5) 5'-CTCGTTGCGGGACTTACCCC-3'

2 16S Археи Ar3f AR927r 5'-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3' (Cy5) 5'-CCCGCCAATTCCTTTAAGTTTC-3'

3 ITS Грибы ITSlf ITS4r 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' (Cy5) 5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

Электрофорез, амплификацию, выделение ДНК из геля и рестрикцию эндо-нуклеазами (НаеШ, Hhál и Mspl) проводили по стандартным методикам (Маниа-тис, 1984). Далее ДНК осаждали этанолом, растворяли в SLS (Beckman Coulter), добавляли маркер «Size Standart 600» (Beckman Coulter) и разделяли в секвенаторе CEQ8000 (Beckman Coulter). Вычисление размеров пиков и их площади проводили в программе Fragment Analysis (Beckman Coulter). Пики площадью менее 0,3% исключали из анализа. Оставшиеся пики объединяли в подтипы (филотипы) с принятой в исследовании погрешностью в 1,5 нуклеотида. Содержание филотипов микроорганизмов в экосистеме определяли при расчете процентной доли в микробном сообществе. Для определения таксономической принадлежности пиков, данные Т-RFLP для трех эндонуклеаз (НаеШ, Hhal и Mspl) обрабатывали с помощью программы Fragment Sorter (http://www.oardc.ohio-state.edu/trflpfragsort/index.php).

Секвенирование. Экстракцию ДНК из ночной культуры бактерий, амплификацию, электрофорез в агарозном геле и выделение ДНК из геля проводили по стандартным методикам (Маниатис, 1984). ПЦР-продукты клонировали в векторе pTZ-57R (Fermentas) по протоколу фирмы-изготовителя. Скрининг трансформантов проводили с помощью метода бело-голубой селекции (Маниатис, 1984). Секвенирование проводили с помощью секвенатора CEQ8000 (Beckman Coulter) по инструкции фирмы-изготовителя. Идентификацию микроорганизмов проводили сравнением нукпеотидной последовательности фрагментов гена 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных NCBI BLAST.

Статистическая обработка результатов исследований.

Математическую и статистическую обработки результатов проводили стандартными методами дисперсионного и корреляционного анализа с использованием критерия Стьюдента (Фишер, 1958; Лакин, 1990) с помощью программного обеспечения Excel ХР/2000. Статистический анализ данных T-RFLP проводили в программе «Past». Для анализа биоразнообразия в сообществе рассчитывали показатель Шеннона Сравнение микробных сообществ проводили с помощью метода неметрического многомерного шкалирования Non-metric MDS и кластерного анализа (UPGMA), основанные на расчете коэффициентов сходства Брея-Кертиса. Для определения взаимосвязей между содержанием микроорганизмов в рубце с различными показателями рассчитывали коэффициенты корреляции Пирсона.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Модификация метода T-RFLP для изучения микробиоценоза рубца крупного рогатого скота

Основной проблемой при изучении микрофлоры рубца крупного рогатого скота с помощью метода T-RFLP является экстрагирование геномной ДНК из образцов рубцового содержимого, свободной от загрязняющих веществ, ингибирующих дальнейшее проведение анализа (Tebbe, Vahjen, 1993; Zhou et al., 1996; Frostegard et al., 1999; Sylvia, 2005). Для выбора оптимального способа экстракции ДНК мы опробовали два метода, включающие лизис клеточных стенок микроорганизмов (с помощью растворов на основе СТАВ или SDS), гомогенизацию образцов и фенол-хлороформную экстракцию (Yu and Morrison, 2004). Установлено, что применение метода выделения ДНК на основе раствора SDS в качестве лизирующего раствора с последующей очисткой раствором СТАВ позволяет экстрагировать ДНК, пригодную для T-RFLP-анализа (рис.2, 3)

Рис. 2. Агарозный гель-электрофорез геномной ДНК

А, Б, В - метод на основе раствора СТАВ; Г, Д,Е-метод на основе раствора БОБ; М - маркер молекулярного веса. (ОепеІІиІег 100+ п.н., Регтемаз).

Рис. 3. Агарозный гель-электрофорез амплификации ДНК

А - ДНК очищена с помощью легкоплавкой агарозы; Е - ДНК очищена с помощью буфера на основе СТАВ; В - ДНК очищена с помощью Silica; М - маркер молекулярного веса (GeneRuler 100+ п.н., Fermentas).

Результаты подбора условий для амплификации универсальных фрагментов генов микроорганизмов рубца крупного рогатого скота представлены в таблице 4.

Таблица 4

Микроорганизм Концентрация буфера Mg в смеси ПЦР Режим ПЦР

Бактерии 1,5 тМ 1 шаг: 95°С - 3 мин; 2 шаг; 94°С - 30 с, 45°С - 30 с, 72°С - 1,5 мин - 35 раз; 3 шаг: 72°С -10 мин

Грибы 3,0 тМ 1 шаг: 95°С - 3 мин; 2 шаг: 94°С - 45 с, 57°С - 45 с, 72°С - 1,5 мин - 35 раз; 3 шаг: 72°С -15 мин.

Археи 3,0 тМ 1 шаг: 95°С - 3 мин; 2 шаг: 94°С - 45 с, 55°С - 45 с, 72°С - 1,5 мин - 35 раз; 3 шаг: 72°С - 15 мин.

При выборе эндонуклеаз для T-RFLP-анализа учитывали количество фраг^ ментов генов бактерий, архей и грибов, полученных при рестрикции (табл. 5). Согласно данным исследователей, при малом числе фрагментов ДНК образуются комплексные пики, анализ которых трудно поддается интерпретации, (Liu, 1997; Osborn et al., 2000; Engebreston, Moyer, 2003). Таким образом, для анализа Г-RFLP-грамм были выбраны следующие эндонуклеазы: для бактериального сообщества -Mspl, для грибного - Hhal, для архейного - НаеШ.

Таблица 5

Количество терминальных рестрикционных фрагментов T-RFLP-грамм мик-___робного сообщества рубца__

Микроорганизм Количество терминальных рестрикционных фрагментов

Mspl Hhal НаеШ

Бактерии 250 ±6,3 120 ±2,9 45 ± 0,9

Грибы 39 ±2,1 138 ±3,2 65 ± 1,1

Археи 40 ± 1,9 105 ±0,9 127 ± 3,2

Для проверки воспроизводимости результатов T-RFLP-анализа рассчитывали коэффициенты сходства Брея-Кертиса для трех параллельных определений. Установлено, что для всех компонентов микробного сообщества были получены высокие индексы сходства: для бактериального сообщества - 0,84-0,92, для грибного -0,89-0,91, для архейного - 0,90-0,91.

Сравнительный анализ микрофлоры рубца бычков с помощью традиционных микробиологических методов и T-RFLP показал, что процентное соотношение различных групп микроорганизмов было сопоставимо, однако имело неточности: количество колоний на энтерококк-агаре превышало количество всех молочнокислых бактерий на MRS-arape в 10 раз (рис. 4). Определение таксономической принадлежности колоний с энтерококк-агара с помощью метода секвенирования показало, что 32% колоний - принадлежат к роду Bacillus, 50% - Aerococcus (Lactobacillales), 18% - Enterococcus (Lactobacillales). Таким образом, установлено, что результаты исследования микрофлоры рубца бычка с помощью T-RFLP-анализа более точные по сравнению с традиционными методами культивирования микроорганизмов.

А Б

Рис. 4. Результаты сравнительного анализа микрофлоры рубца бычка при анализе: А - T-RFLP, Б - традиционные микробиологические методы.

Для проверки возможности определения филогенетической принадлежности бактерий в программе FragSort для колоний с энтерококк-агара проводили T-RFLP-анализ и расшифровку рестрикционных профилей штаммов. Сравнение результатов секвенирования и T-RFLP выявило неточности в определении вида бактерий методом T-RFLP: штамм Aerococcus в программе имел совпадения с фрагментами бактерии Atopostipes (Carnobacteriaceae), а для штамма Bacillus sp. - с разными видами бактерий рода Bacillus. Поэтому для характеристики бактериальных сообществ с помощью программы FragSort в дальнейших исследованиях в качестве сравнительных таксономических единиц использовали род, семейство или порядок бактерий.

3.2. Результаты исследования динамики микробного сообщества рубца жвачных животных в течение суток и влияния на нее лробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактсрин-Я

Решение вопросов, связанных с реализацией продуктивного потенциала крупного рогатого скота невозможно без понимания особенностей пищеварения жвачных, в том числе суточной динамики микробного сообщества. В связи с этим на экспериментальном физиологическом дворе ГНУ ВИЖа был проведен опыт по изучению суточной динамики микробиоценоза рубца бычков с помощью метода Т-ЛРЬР и оценке воздействия пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Б на микрофлору рубца, процессы желудочно-кишечного пищеварения и обмен веществ животных.

Интенсивность течения ферментативных процессов в рубце бычков

Анализ результатов учета заданных кормов и их остатков показал, что введение в рацион бычков пробиотиков Целлобактерин-Б и Целлобактерин-Т способствовало повышению потребления сухого вещества на 2,1 и 15,5% соответственно, что, вероятно, было связано с более высокой поедаемостью силоса у опытных животных.

Установлено, что обшее количество летучих жирных кислот (ЛЖК) в рубцовой жидкости животных контрольной и опытных групп возрастает, достигая максимума через два-три часа после кормления. Показано, введение в рацион пробиотиков способствовало увеличению общей концентрации ЛЖК, а также повышению уровня масляной (на 6,4% и 1,8% соответственно) и пропионовой кислот (на 9,4% и 1,4%), а также понижению содержания ацетата в рубце (на 4,8% и 1%) по сравнению с контролем (табл. 6). Также было выявлено увеличение количества аммиака в рубце животных при скармливании пробиотиков.

Таблица 6

Динамика показателей рубцового метаболизма_

Показатель Группа Время взятия проб

За 1 час до кормления После кормления через (час.)

1 2 3 4

pH Контр. б,93±0,03 7,0±0,04 7,05±0,02 7,09±0,07 7,01±0,02

Целлоб.-S 7,0±0,02* 6,96±0,02 6,79*0,07 6,91±0,04 6,87±0,06*

Целлоб.-Т 7,24±0,04"* 7,0±0,07 6,7640,09 7,08±0,04 6,79±0,08"

ЛЖК (Ммоль/ 100мл) Komp. 6,59±0,04 7,39±0,09 8,16±0,04 8,86±0,09 9,21±0,07

Целлоб.-S 7,82±0,07*** 9,41±0,08*** 9,34±0,12*** 10,08±0,Н*" 9,53±0,03

Целлоб.-Т 8,59±0,2*" 12,46±0,18»" 12,04±0,22*" 9,52±0,09"* 8,9±0,13*

Аммиак (мг%) Контр. 8,89±0,11 14,24±1,09 15,б±0,7 13,16±0,02 9,4±0,02

Целлоб.-S 7,88±0,17"* 18,57±0,98ф* 21,73±1,23** 19,08±0,95'** 15,2±0,32"*

Целлоб.-Т 7,32±0,08"* 15,0±0,67 14,23±0,67' 14,85±0,84 15,51±0,76***

Примечание: *р<0,05, *• р<0,01, р<0,001 (к контролю).

Показано, что у бычков, получавших в составе комбикорма пробиотики, отмечается общая тенденция к повышению переваримости всех питательных веществ, кроме БЭВ (табл.7). Кроме того, анализ эвакуации химуса в дуоденальном отделе кишечника показал, что количество химуса у животных, которым скармливали Целлобакгерин-Б было на 34,6%, а Целлобактерин-Т - на 50% больше, чем в контроле, что связано с более интенсивным гидролизом углеводов. Таким образом, установлено, что добавление в рацион пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобакте-рин-Э оказало стимулирующее действие на течение ферментативных процессов в рубце бычков.

Таблица 7

Количество переваренных питательных веществ рационов_

Показатели Группа

Контроль Целлобактерин-Б Целлобахтерин-Т

% % %

Сухое вещество 65,5 ±0,98 66,79 ± 1,12 67,43 ± 1,29

Органическое вещество 67,71 ± 0,89 69,34 ± 1,24 70,26 ±2,11

Сырой протеин 62,24 ±1,22 63,18 ±0,85 67,08 ± 2,32

Сырой жир 51,47 ± 2,11 56,28 ±2,17 63,01 ±2,17*»

Сырая клетчатка 52,89 ± 1,98 56,5 ±3,11 59,96 ± 2,09»

БЭВ 74,95 ±2,76 74,98 ± 1,87 74,95 ± 1,98

Примечание: *р<0,05, ** р<0,01 (к контролю).

Результаты анализа суточной динамики микробиоценоза рубца бычков

Структуру микробного сообщества рубца бычков анализировали с помощью метода Т-КПЛ\ Для каждого животного учитывали состав бактериального, грибного и архейного сообществ, начиная за час до утреннего кормления (7 часов утра) и далее через каждый час (до 22 часов вечера).

Анализ суточной динамики микробного сообщества в рубце бычков показал, что через два-три часа после кормления животных увеличивалась доля микроорганизмов фил Bacteroid.es и ҐігтісШез: сахаролитических бактерий семейств С/оягп-сііасеае, ЕиЬасІегіасеае, лактат-утилизирующих - семейства Уеіііопеїіасеае и ами-лолитических - семейства Васіегоісіасеае (табл. 8).

Таблица 8

Содержание доминирующих микроорганизмов в рубце бычков

Группа Вариант Количество микроорганизмов в рубце животных, %

7 часов 9 часов 11 часов 13 часов

Фила Контроль 8,82±1,14 3,48±1,01 14,01 ±3,09** 4,89±1,46

Целлоб-Б 4,62±1,90 5,35±1,66 10,03±2,26 11,44±3,18

Целлоб-Т 9,73±2,78 7,25±1,43 10,54±2,73 10,73±1,66

Семейство Вас1сгоик1сеае Контроль 0,40±0,03 0,27±0,02 0,86±0,51 0,16±0,08

Целлоб-в 0,21 ±0,02 0,93±0,14 2,04±1,40 2,54±1,19

Целлоб-Т 0,59±0,03 0,26±0,05 2,98±0,78* 0,33±0,04

Фила ПгписШех Контроль 41,75±3,73 30,27±2,33 41,89±6,48 33,46±0,71

Целлоб-Б 42,53±3,82 36,64±4,85 40,13±4,53 34,86±5,81

Целлоб-Т 37,93±6,92 32,11 ±4,63 27,60±3,90 42,12±2,84

Семейство С1о$Тг1Жасеае Контроль 7,26±1,68 6,77±0,96 6,06±1,17 8,06±0,61

Целлоб-Б 9,86±0,81 7,36±0,21 6,81±0,57 7,69±2,00

Целлоб-Т 5,29*2,03 4,22±1,68 4,64±1,68 10,46±1,99

Семейство ВиЬасГепасеае Контроль 2,13±0,45 0,78±0,64 4,26±0,49* 2,71 ±0,50

Целлоб-Б 3,51±0,76 3,21±0,83 4,13±0,63 2,64±0,65

Целлоб-Т 1,26±0,70 5,36±0,98* 2,67±0,31 2,77±0,43

Семейство ЬасИ-позр1гасеае Контроль 17,95±0,94 11,57±1,45 13,37±3,25 7,62±0,89

Целлоб-Б 8,73±0,99 5,24±1,44 7,32±1,84 6,62±0,68

Целлоб-Т 12,61±3,82 9,29*5,21 7,98±0,19 12,79±2,79

Семейство Яыттососсасеае Контроль 9,24±2,83 0,55±0,46*** 15,51±3,96 9,67±0,02

Целлоб-Б 8,94±1,28 5,81±0,93 6,20±0,83 6,61 ±0,91

Целлоб-Т 11,84±3,17 8,58±0,04 11,76±3,84 11,70±2,02

Семейство УеШопеПасеае Контроль н.п.д.о. н.п.д.о. н.п.д.о. 0,43±0,06

Целлоб-Б 2,69*0,63 1,49±0,70 3,93±1,06 1,92±1,39

Целлоб-Т 2,12±0,71 0,54±0,22 1,93±0,03 1,46±0,40

Примечание: н.п.д.о. - ниже предела достоверного обнаружения *р<0,05, ** р<0,01, *** р<0,001, (к врем, кормления - 7 ч)

Результаты расчета среднего содержания микроорганизмов в течение суток показали, что добавление в рацион бычков пробиотиков способствовало увеличению доли амилолитических, лактатферментирующих бактерий (табл. 9).

Таблица 9

Бактерии Среднесуточное количество бактерий, %

Контроль Целлобактерин-З Целлобактерин-Т

Сем. Вас1его1с!асеае 0,45*0,28 1,84*1,05 1,00±0,65

Сем. ЬасИпозрггасеае 13,4*4,42 6,54*1,24 10,35±1,84

Сем. Яиттососсасеае 8,42*2,76 7,07*1,40 11,15*1,38

Сем. УеШопеИасеае 0,27*0,09 1,98*0,75» 1,02*0,45

Примечание: *р<0,05 (к контролю)

Установлена достоверная положительная связь между количеством амилолитических бактерий семейства Вас1его1с1асеае и содержанием пропионовой кислоты в рубце (г=0,79), а также достоверная отрицательная - между содержанием лактат-угилизируюших микроорганизмов семейства УеШопеИасеае и лактат-продуцирующих бактерий семейства ЬаМоЬасШасеае с количеством уксусной кислоты (г=-0.50 и 1=-0.89 соответственно). Полученные нами результаты согласуются с рядом исследований (Пивняк, Тараканов, 1982; Тараканов, 1987), которые показали, что взаимосвязь между данными группами микроорганизмов обусловлена особенностями их метаболизма: амилолитические бактерии при сбраживании крахмала продуцируют молочную и янтарную кислоты, тогда как лактатферменти-рующие бактерии преобразуют данные кислоты в пропионовую. Таким образом, установлено, что добавление в рацион пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобак-терин-Б вследствие повышения переваримости легкогидролизуемых кормов сопровождалось изменением направленности бродильных процессов в преджелудках.

Анализ динамики сообществ архей и грибов в рубце бычков в течение суток показал, что содержание отдельных микроорганизмов варьировало в зависимости от времени кормления и от варианта опыта. Расчет коэффициентов корреляции позволил выявить микроорганизмы, связанные с показателями рубцового пищеварения. Результаты расчета коэффициентов сходства Брея-Кертиса и кластерного анализа всех компонентов микробного сообщества также показали разделение образцов рубцового содержимого в зависимости от времени кормления (рис. 5).

ЦТ-134 К-1ЭЧ

К-10Ч

К-2СМ ЦТ-114 ЦТ-16Ч ЦТ-74 ЦТ-20Ч ЦТ-22Ч К-9Ч К-і 14

кием

К-7Ч

ЦТ-184

К. 234

ЦС-7Ч

ЦС-1ЄЧ

ЦС-11Ч

ЦС-1ЭМ

ЦС-22Ч

ЦС-9Ч

ЫС-18Ч

ЦС-20Ч

ЦТ.9Ч

А Б В

Рис. 5. Дендрограммы сходства микробных сообществ рубца здоровых и выбракованных животных: А - бактериальное сообщество; Б - сообщество архей; В - грибное сообщество. К- контроль, ЦТ - Целлобактерин-Т, ЦС - Целлобактерин-8,7 4-22 Ч- время взятия образцов рубцового содержимого.

3.3. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца жвачных животных

Следующим этапом наших исследований было изучение закономерностей возрастных изменений в рубце телят с помощью T-RFLP-анализа. Одним из показателей, характеризующих у жвачных животных микрофлору «взрослого типа», является ее способность к перевариванию клетчатки (Тараканов, Николичева, 1986). На основании анализа содержания микроорганизмов, способных ферментировать компоненты растительных кормов (бактерии семейств Bacteroidaceae, Clo-stridiaceae, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Ruminococcaceae), в рубце подопытных животных можно сделать выводы о том, что доля данных микроорганизмов у бычков к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного (табл. 10). Обоснованность данного заключения подтверждается тем, что в 4-5-месячном возрасте количество данных микроорганизмов практически не увеличивается. Наши данные согласуются с результатами исследований Севастьяновой, Тараканова и Николичевой (Севастьянова, 1966; Тараканов, Николичева, 1986), которые на основании анализа показателей рубцового пищеварения и метаболической активности целлюлозолитической микрофлоры бычков разного возраста, сделали вывод о том, что данные показатели достигают уровня «взрослого типа» лишь к 3-4 месячному возрасту. Установлено, что добавление в рацион бычков пробиотика Целлобактерин-Т способствовало более раннему (2-месячные телята) увеличению доли целлюлозолитиков практически до уровня взрослого животного. Полученные результаты подтверждаются данными статистической обработки результатов (рис. 6).

Помимо этого, что в рубце бычков всех возрастов были выявлены патогенные бактерии семейства Enterobacteriaceae, а также родов Staphylococcus и Fusobacterium. Кроме того, анализ бактериального сообщества выявил значительное количество некультивируемых видов в рубце всех бычков.

Таблица 10

Содержание бактерий в рубце бычков_

Таксономический ранг микроорганизмов Вариант Доля микроорганизмов в рубце животных, %

1 мес. 2 мес. 3 мес. 4 мес. 5 мес.

Сем. ШрАоЪасЫпасеае Контр. 41,07±3,26 8,68±1,54 1,16±0,29 2,79±0,78 3,22±0,14

Целлоб-Т 36,71±4,11 0,47±0,11*** Н.П.Д.О. 1,47±0,56 0,81±0,22"»

Фила Вас[его1с1е1е$ Контр. 0,74±0,11 5,69±0,56 5,63±0,22 5,47±0,22 14±2,11

Целлоб-Т 3,78 ±0,65" 4,63±0,76 4,57±1,10 12,7±1,19"» 7,08±0,78*

Семейство С1озМсИасеае Контр. 3,21 ±0,34 27,6± 1,15 7,32±0,78 6,88±0,65 1,92±0,45

Целлоб-Т 1,62±0,24** 3,84*0,02'" 5,49±0,55 10,6±1,16« 6,6±0,22*"

Семейство ЕиЬас1епасеае Контр. Н.П.Д.О. 2,98± 0,34 9,06±0,43 8,24±0,34 5,59±1,09

Целлоб-Т 1,0±0,23 2,38±0,76 25,83±4,02" 20,35±0,55*" 18,67±1,5***

Семейство ЬасИпо$р1гасеае Контр. 1,74 ±0,12 2,45± 0,28 6,39±0,45 7,24±0,39 8,31±0,67

Целлоб-Т 4,81±0,34*** 18,84±2,45**' 13,41±1,76** 11,09±1,08*» 9,3±0,95

Семейство Яиттососсасеае Контр. 17,72 ±1,1 2,97± 0,45 35,97±3,72 27,87±2,16 10,42±2,1

Целлоб-Т 15,78±2,11 15,85±1,18*** 9,63±0,65"» 5,79±0,56*** 8,13±1,67

Семейство УеШопеИасеае Контр. 1,34 ±0,19 0,53± 0,04 3,35±1,11 1,76±0,11 1,09±0.34

Целлоб-Т 2,61±0,15»" 8,13±0,98"* 3,37±0,67 3,3±0,26"* 2,76±0,55*

Некультиви-руемые бактерии Контр. 9,15±1,17 23,2±2,65 11,4±0,98 13,6±2,11 27,4 ±4,18

Целлоб-Т 10±2,17 28,7±2,87 19,7±1,09"* 11,1±0,56 27,2±0,60

Примечание: н.п.д.о. - ниже предела достоверного обнаружения *р<0,05, ** р<0,01, ••* р<0,001 (кконтролю).

А Б В

Рис. 6. Дендрограммы сходства бактериального (А), архсйного (Б) и грибного сообществ (В) рубна бычков разного возраста. К-кошроль, Ц-варианг с Целлобактерином. 1-5 - возраст бычков, мес.

Установлено, что добавление в рацион пробиотика Целлобактериц-Т способствовало увеличению прироста живой массы бычков (табл. 11). При этом выявлена достоверная положительная связь между продуктивностью животных и содержанием бактерий, ферментирующих растительные корма (семейств Clostridia, Eubacteriaceae, Lachnospiraceae, Veillonellaceae) и достоверная отрицательная - с долей микроорганизмов семейств Lactobacillaceae, Bifidobacteriaceae, Bacillaceae.

Таблица 11

Показатели прироста живой массы бычков_

Показатели Возраст бычков, мес

1 . 2 . _ з 4

Опытный вариант

Живая масса, кг 52,71 ±1,18 73 ± 3,42 101,71 ±3,39 123,71 ±2,53»

Среднемесячный, га- 12,71 ±1,18 20,28 ±2,89 29,71 ±5,10 22,0 ±3,42

Контрольный вариант

Живая масса, кг 52,14± 1,60 72,86 ±2,16 95,86 ±1,26 115,43 ±1,18

Среднемесячный, кг 11,57± 1,79 20,71 ±3,10 23,0 ±2,57 19,57 ± 1,57

Примечание: *р<0,05 (к контролю).

Результаты анализа динамики сообществ архей и грибов в рубце бычков также продемонстрировали возрастные изменения, при этом одни доминирующие филотипы сменялись другими по мере взросления и развития пищеварительной системы животных. Показано, что добавление в рацион пробиотика Целлобакге-рин-Т также оказало влияние на данные микроорганизмы.

3.4. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях

Следующим этапом наших исследований было изучение закономерностей в составе микрофлоры рубца коров с разным уровнем состояния здоровья, молочной продуктивности и с различными рационами. Известно, что в настоящее время 4 для поддержания потребностей в энергии высокопродуктивных молочных коров в рационы включают большое количество концентратов, что приводит к изменению направленности биохимической деятельности микрофлоры преджелудков. При этом наблюдается ухудшение здоровья и сокращение продуктивного долголетия крупного рогатого скота (Курилов, 1971; Mertens, 1997; Pereira, 2000; Leiva, 2000). Некоторые ученые связывают данные нарушения с состоянием лактатного

ацидоза, который развивается при избытке крахмала в рационе. Однако отсутствуют четкие доказательства существования этой связи.

Сравнительный анализ микрофлоры рубца всех здоровых и выбракованных коров свидетельствует о существенном нарушении баланса микроорганизмов (бактерий, грибов и архей) в микробном сообществе рубца исследованных нами выбракованных коров.

Результаты анализа бактериального сообщества рубца выбракованных животных продемонстрировали низкое содержание целлюлозолитических бактерий семейств 1аскпохр1гасеае и Ииттососсасеае, лактат-утилизирующих - семейства УеШопеПасеае, высокий уровень молочнокислых бактерий семейства ЬасюЬасШасеае, ферментирующих моносахара до лактата в рубце, и бактерий рода РтоЪасХеггит.

Таблица 12

Среднее содержание бактерий в рубце здоровых и выбракованных коров

Фила Сем. Сем. Сем. Сем. Фила

Хозяйство Вас!его1- 1мскпо!р1- Нитто- УеШопе!- ЬасюЬа- РшоЬас-

гасеае соссасеае 1асеае сШасеае 1епа

о «Ладожское» 8,61 ¿0,9 12,03 ±1,2 3,45 ±1,0 3,66 ±0,28 0,38 ±0,19 0,24 ±0,03

«Воля» 11,52 ±2,3 15,79 ±3,2 3,82 ±0,3 6,33 ±0,5 0,31 ±0,01 2,49 ±0,26

«Победа» 2,31 ±0,4 13,25 ±2,8 3,59 ±0,3 4,97 ±0,95 1,36 ±0,5 1,88 ±0,2

со О о О. «Дмитрова гора» 7,39*2,78 13,3±2,5 3,33±0,9 4,12±1,05 1,13±0,54 1,87±0,38

о «М. Орловка» 6,67±2,1 18,55±2,54 4,65±1,34 4,75±1,43 0,64±0,11 1,46±0,92

го «Большевик» 0,64*0,11 16,7±3,29 5,3±0,23 3,53±0,78 3,19±0,12 0,65±0,09

X «Большевик» 8,82±2,16 2,8±0,89 2,9±0,98 0,6±0,06 2,9±0,98 3,55±0,55

03 О о «Раздолье» 0,2±0,И 4,47±0,52 3,03±0,37 1,62±0,7 5,55±0,67 1,82±0,3

м ЕЕ «Приневское» 1,61±0,7 0,93±0,26 4,26±0,87 0,68±0,19 2,78±0,45 4,08±1,07

о «Детскосельский» 0,24±0,11 5,2±2,8 7,03±0,6 1,87±0,56 1,7610,56 2,07 ±0,2

т «Кобраловский» 10,1±0,65 1,8±0,15 3,0±0,11 0,5±0,56 6,7±0,60 4,0±0,22

Расчет коэффициентов корреляции показал, что содержание в рубце бактерий семейств ¿аскпоярггасеае и УеШопеПасеае было достоверно положительно связано с уровнем молочной продуктивности (г=0,76 и г=0,60 соответственно). Стоит отметить, что при высоком содержании комбикормов в рационе жвачных животных, крахмал (который входит в состав комбикорма) сбраживается до молочной кислоты, вследствие чего повышается кислотность в рубце, что приводит к угнетению роста лактат-ферментирующих и целлюлозолитических бактерий, что в результате приводит к накоплению молочной кислоты. Таким образом, запускается каскадный механизм лактатного ацидоза. В таких условиях в рубце начинает размножаться бактерия ГшоЬааепит песгорИогит (использующая лакгат в качестве энергетического субстрата), вызывающая некробактериоз. Её проникновение через слизистую в кровь обуславливает дальнейшее инфицирование - абсцессы печени и других внутренних органов, поражения копыт, кожи или слизистых. Таким образом, результаты наших исследований дают возможность предположить, что снижение удоев у выбракованных животных, вероятно, произошло в результате лактатного ацидоза (Иосск, 1997).

Дендрограммы сходства бактериальных, грибных и архейных сообществ рубца коров также свидетельствуют о значительном различии микробиоценоза рубца здоровых коров и выбракованных животных (рис.7). Расчет коэффициентов сходства показал значительное влияние рациона на микробиоценоз рубца. При

сравнении бактериального сообщества, наибольшим сходством обладали выбракованные коровы СПК «Кобраловский» и ЗАО «Племзавода «Большевик», которые получали похожие рационы. При этом результаты анализа дендрограммы сходства грибного сообщества указывают на высокое сходство среди выбракованных животных из отдельных хозяйств.

г!ИТ=55

-К№403< С

Б №1229 £

-БЛ452

-К№1297

-РЖ«?

Б №1352 -

Д№1415 С

Б №1241 Г

Б №1030

Б №1342

П№1100 в

(3

[Е

Б №1030 С

Б №1241 с

Б №1352

Б №1342

П№1100

К№129?

Б №12» с

Р№647 г

ДМ4К

К№4036

Б №412 £

о

г^деесеее

кЕ

п№иоо

Д >61415 К №403« К №129' Е №11» Б №452 Р№«47 Б >41241 Б №1030 Б №1342 Б >41352

В

Рис. 7. Дендрограммы сходства микробных сообществ рубца здоровых и выбракованных животных Ленинградской области: А - бактериальное сообщество; Б - сообщество архей; В - грибное сообщество. К - СПК «Кобраловский», Б - ПЗ (большевик», Д - СПК «Детскосельский, П - ПЗ «Приневское» , Р - ПЗ «Раздолье».

Таким образом, с использованием модифицированного метода Т-М-ЪР получены экспериментальные данные, которые дополняют знания о микрофлоре пред-желудков и её роли в питании жвачных, что открывает новые перспективные направления поиска способов направленной регуляции микробиологических процессов в преджелудках, позволяющих повысить эффективность использования корма, увеличить продуктивность и снизить заболеваемость крупного рогатого скота.

4. ВЫВОДЫ

1. Метод Т-ШТ^Р модифицирован для анализа микрофлоры рубца крупного рогатого скота, в том числе выбраны методы экстракции и очистки ДНК, условия ПЦР-амплификации универсальных фрагментов генов микроорганизмов, эндонук-леазы рестрикции, что позволило получить высоковоспроизводимые результаты. Индексы сходства Брея-Кергиса для бактериального сообщества составляют 0,840,92, для грибного - 0,89-0,91, для архейного - 0,90-0,91.

2. В рубце крупного рогатого скота с использованием модифицированного мо-лекулярно-биологического метода Т-М^Р выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых видов. Результаты Т-ЮгЬР-анализа бактериального сообщества рубца крупного рогатого скота сопоставимы с данными традиционных микробиологических методов.

3. Во всех компонентах микробного сообщества рубца крупного рогатого скота зафиксированы изменения, связанные с кормлением животных: через два-три часа после кормления животных в рубце увеличивается доля сахаролитических (семейств С1озпсИасеае, ЕиЬаЫепасеае), лактат-утилизирующих (семейства УеШопеИасеае) и амилолитических бактерий (филы Вас1егог(1е1ез).

4. Введение в рацион бычков пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Э оказывает регулирующее действие на состав бактериального сообщества в рубце и показатели рубцового пищеварения: увеличивается доля амилолитических (в 2,22

и 4,08 раз соответственно) и лактатферментирующих бактерий (в 3,77 и 7,33 раза), а также измененяется соотношение ЛЖК в рубце в сторону увеличения доли про-пионата (на 9,4 и 1,4%) по сравнению с контрольным вариантом.

5. Изучен процесс формирования состава микробного сообщества в рубце в процессе роста и развития животных на основе молекулярно-биологического метода Т-ЯБЬР. Показано, что смена рациона в процессе роста бычков сопровождается сменой доминирующих таксономических единиц в составе бактерий, архей и грибов.

6. Содержание в рубце бычков микроорганизмов, ферментирующих растительные корма, к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного. Введение в рацион пробиотика Целлобактерин-Т способствует более раннему увеличению количества целлюлозолитических, амилолитических и лактатферментирующих микроорганизмов в рубце животных.

7. Установлена достоверная положительная связь между содержанием в рубце бычков разного возраста бактерий, обладающих способностью ферментировать углеводы растительных кормов (семейств ВаМегогсксеае, СЫгпсИасеае, ЕиЬас1епа-сеае, ЬасЪповркасеае, Яиттососсасеае) с долей в рационе сена, силоса и концентратов, а также с увеличением продуктивности животных.

8. Снижение продуктивности у исследованных коров сопровождалось значительными нарушениями в таксономической структуре микробного сообщества: выявлено низкое количество целлюлозолитических (0,93±0,26-7,03±0,6%), лактатферментирующих бактерий (0,5±0,16 - 1,87±0,56%), а также высокое содержание молочнокислых бактерий (до 6,7±0,60) и фузобактерий (до 4,08±1,07%).

9. Установлена достоверная положительная связь между уровнем молочной продуктивности коров и долей бактерий семейств Ъаскпозриасеае и УеШопеИасеае (г=0,76 и г=0,60 соответственно) и достоверная отрицательная - с содержанием бактерий рода РизоЪааепит (г=-0.78).

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Научным учреждениям рекомендуем проводить комплексный анализ микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода Т-КРЬР для разработки методов направленной регуляции микробиологических процессов в преджелудках, позволяющих повысить эффективность использования корма, увеличить продуктивность и снизить заболеваемость животных.

Сельскохозяйственным предприятиям рекомендуем применение пробиотиков на основе бацилл и дрожжей для регуляции состава микробного сообщества в рубце крупного рогатого скота для увеличения продуктивности бычков на откорме и дойных коров.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

1. Лаптев, Г.Ю. Микробиология рубца крупного рогатого скота / Г.Ю. Лаптев, JI.A. Кряжевских // Животноводство России. - М., 2008. - №10. - С. 56-57.

2. Кряжевских, Л.А. Метод T-RFLP - основа профилактики некробакгерио-за скота/ Г.Ю. Лаптев // Животноводство России. - М., 2009. - №10. - С. 38-39.

3. Лаптев, Г.Ю. Исследование бактериального сообщества рубца с помощью метода T-RFLP / Г.Ю. Лаптев, JI.A. Кряжевских // Молочное и мясное скотоводство.-2010.- №3.-С. 16-18.

4. Ильина, JI.A. Исследование бактериального сообщества рубца коров с помощью T-RFLP-анализа / Л.А. Ильина, А.Ф. Балакирева, Е.А. Йылдырым, Г.Ю. Лаптев // Молочное и мясное скотоводство. - 2011. - №2. - С.24-27.

5. Лаптев, Г.Ю. Рациональное кормление высокопродуктивных коров / Г.Ю. Лаптев, JLA. Ильина // Кормопроизводство. - 2011. - №10. - С. 44-45.

Статьи в других изданиях.

6. Кряжевских, J1.A. Методические подходы к изучению бактериальной микрофлоры рубца крупного рогатого скота / Л.А. Кряжевских, Г.Ю. Лаптев Н 13-я Путинская международная школа-конференция молодых ученых, 28 сент - 2 окт

2009.-С. 202-203.

7. Лаптев, Г.Ю. T-RFLP - новый метод анализа микрофлоры крупного рогатого скота / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов: материалы междунар. научно-практической конф. Москва, 19-20 августа 2009 г. - М., 2009. - С. 36-40.

8. Кряжевских, Л.А. Изучение микробиологических процессов в рубце жвачных - основа профилактики некробакгериоза / Л.А. Кряжевских, Г.Ю. Лаптев // Сельскохозяйственные вести. - М., 2009. - № - С. 22.

9. Кряжевских, JLA. Метагеномный анализ экосистемы рубца жвачных животных / Л.А. Кряжевских // 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых, 2010. - С. 237.

10. Лаптев, Г.Ю. T-RFLP - новый биотехнологический метод для оценки микрофлоры крупного рогатого скота / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Кряжевских // Актуальные проблемы биологии в животноводстве: материалы пятой междунар. конф., посвященной 50-летию ВНИИФБиП. Боровск, 14-16 сентября 2010. - М., 2010. С. 287-288.

11. Кряжевских, Л.А. Биотехнологии в основе продуктивного долголетия КРС / Л.А. Кряжевских // Сельскохозяйственные веста. - 2010. - №3. - С. 48.

12. Лаптев, Г.Ю. Комбикорма и микрофлора рубца высокоудойных коров / Г.Ю. Лаптев, Л.А. Ильина // Современное производство комбикормов «Комбикорма - 2010»: материалы пятой междунар. конференции. Москва, 22-24 ноября

2010.-М., 2010. С. 89-100.

13. Романов, В.Н. Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных / В.Н. Романов, C.B. Воробьева, В.Г. Двалишвили, В.М. Дубо-резов, М.Г. Чабаев, Р.В. Некрасов, Г.В. Иванова, Г.Ю. Лаптев, Л.А. Ильина // Методические рекомендации. Дубровицы. - ВИЖ. 2011.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967) 65-13-18 (8-4967)65-15-97

Сдано в набор 08.02.2012. Подписано в печать 09.02.2012

_Заказ № 8. Печ. л. 1,0. Тираж 150 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ильина, Лариса Александровна, Санкт-Петербург

61 12-3/767

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ РАСХН

На правах рукописи

Ильина Лариса Александровна

Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода Т-ЮЪР с целью разработки способов ее оптимизации

03.01.06 - биотехнология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук Г.Ю. Лаптев

Санкт-Петербург - 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.......................................................................................4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................................5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................11

1.1. Особенности пищеварения у жвачных животных....................................11

1.2. Экосистема рубца.........................................................................................16

1.2.1. Симбиоз между микроорганизмами рубца и животным....................16

1.2.2. Условия, необходимые для роста и размножения микроорганизмов в рубце..................................................................................................................17

1.2.3. Микроорганизмы рубца.........................................................................20

1.2.4. Взаимодействие между микроорганизмами в рубце..........................27

1.3. Возможность управления процессами ферментации в рубце..................30

1.4. Методы изучения микробиоценоза рубца жвачных животных...............35

1.4.1. Традиционные микробиологические методы.....................................35

1.4.2. Метагеномный анализ микробных сообществ....................................39

1.4.3. Проблемы получения качественной ДНК для метагеномных исследований....................................................................................................42

1.4.4. Молекулярно-генетические методы для изучения рубца жвачных..45

1.4.5. Т-БО^ЬР-анализ........................................................................................49

1.5. Заключение по обзору литературы.............................................................52

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ............................................54

2.1. Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов...............54

2.1.1. Изучение суточной динамики микробного сообщества рубца бычков ............................................................................................................56

2.1.2. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца телят...................................................................................................................58

2.1.3. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях ............................................................................................................................60

2.2. Методики лабораторных исследований.....................................................63

2.2.1. Химический анализ кормов, кала и мочи............................................63

2.2.2. Химический анализ проб рубцового содержимого............................64

2.3. Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов.64

2.4. Молекулярно-генетические методы...........................................................66

2.4.1. Т-ЯБЬР-анализ........................................................................................67

2.4.2. Секвенирование......................................................................................71

2.5. Статистическая обработка материалов исследований..............................72

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.'..........................73

3.1. Модификация Т-КБЬР-анализа для изучения микробиоценоза рубца жвачных животных.................................................................................................73

3.1.1. Выбор метода выделения и очистки геномной ДНК..................................73

3.1.2. Подбор условий амплификации микроорганизмов рубца жвачных....77

3.1.3. Выбор эндонуклеаз рестрикции для Т-КТЪР-анализа...........................80

3.1.4. Анализ воспроизводимости методики Т-КРЬР......................................81

3.1.5. Анализ результатов Т-ЫБЪР.....................................................................83

3.1.6. Сравнительный анализ результатов исследования микробного сообщества рубца бычков с помощью традиционных методов микробиологии и Т-КРЬР...................................................................................85

3.2. Результаты исследования динамики микробного сообщества рубца жвачных животных в течение суток и влияния на нее пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-8...................................................................88

3.2.1. Интенсивность течения ферментативных процессов в рубце бычков.89

3.2.2. Результаты анализа суточной динамики микробиоценоза рубца бычков...................................................................................................................96

3.3. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца жвачных животных...............................................................................................122

3.4. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях.....137

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.....................................................................................................158

ВЫВОДЫ...............................................................................................................161

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ..................................................................163

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................................................164

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЭВ - безазотистые экстрактивные вещества; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; л - литр; M - моль;

ME - массовые эксиваленты;

мг - миллиграм;

мин - минуты;

мкг - микрограм;

мкл - микролитр;

мл - миллилитр;

КАА - крахмало-аммииачный агар;

ЛЖЕС - летучие жирные кислоты;

МПА - мясопептонный агар;

нг - нанограмм;

об/мин - оборотов в минуту;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

САМ - сусло-агар с мелом;

DGGE - денатурирующий градиентный гель-электрофорез; FISH - флуоресцентная гибридизация «ш situ»;

T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов; TGGE - температурный градиентный гель-электрофорез.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На протяжении последних десятилетий изучение микроорганизмов рубца, их роли в пищеварении и обмене веществ в многокамерном желудке жвачных вызывает повышенный интерес, как ученых, так и практиков - животноводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организации более рационального и полноценного кормления животных и эффективного использования кормов для повышения продуктивности (Пивняк, Тараканов, 1982; Георгиевский, 1990; Прохоренко, 2006; Стреко-зов и др., 2006; Романенко, 2007; Эрнст, Зиновьева, 2008; Hungate, 1966).

Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии (Bryant, 1959; Hungate, 1966; Dehority, Orpin, 1988; Hespell et al., 1997). В настоящее время исследователями (Dehority, 2003) описан ряд ограничений и недостатков данных методов, в том числе невозможность правильного подсчета микробов ввиду их роста на питательных средах культивирования не из одной клетки, а из их скопления (Wells, Russell, 1996), разного количества микроорганизмов, выявляемых при микроскопировании и культивировании на искусственных средах (Leedle et al, 1982; Wells, Russell, 1996; Zoetendal et al., 2004). Классификация бактерий рубца, основанная на изучении фенотипических характеристик и биохимических тестов, также не является достаточно точной. Кроме того, зарубежными специалистами недавно было показано, что значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивируемыми видами (нежизнеспособными при культивировании на существующих питательных средах), однако активными в процессах рубцовой ферментации. Установлено, что в настоящее время не существует ни одной среды, на которой возможно поддержание роста всех жизнеспособных бактерий рубца. Кроме того, известны виды микроорганизмов, для которых применяемые условия культивирования не подходят или которые вступили в некультивируемое состояние или никогда ранее не культивируемые виды вследствие отсутствия подходящих методов (Amann et al.,

1995). Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов ферментации, происходящих в рубце и взаимодействия микроорганизмов (Amann et al., 1992; Wintzingerode et al., 1997; Zoetendal et al., 1998; Krause et al., 2003; Shin, 2004).

Развитие метагеномных методов делает возможным дальнейшее изучение разнообразия микроорганизмов без ограничений традиционных методов микробиологии - т.е. минуя стадию культивирования. Метагеномные методы изучения микробных сообществ основаны на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов и часто включают в себя стадии клонирования общей (тотальной) ДНК всех микроорганизмов, выделенной из образца, в вектор и затем анализ полученных библиотек клонов (Эрнст, Зиновьева, 2008; Handelsman, 2004). Для определения вида микроорганизма нук-леотидная последовательность сравнивается с последовательностями из баз данных (Stackebrandt, Goebel, 1994; Amann et al., 1995; Madden et al., 1996; Ta-jima et al., 1999; Nelson et al., 2003). Наиболее распространенным является анализ, основанный на изучении вариабельных фрагментов консервативных элементов генов 16S/18S рРНК. Выбор генов 16S/18S рРНК в качестве маркеров в филогенетических исследованиях обусловлен, прежде всего, их повсеместной распространенностью во всем живом мире и доступностью огромных массивов данных о структуре генов рРНК у самых разнообразных микроорганизмов.

Несмотря на широкий спектр возможностей, составление и анализ библиотек клонированных фрагментов генов 16S/18S рРНК микроорганизмов является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто описать структуру микробного сообщества, но и проследить, как изменяется эта структура с течением времени в результате какого-либо воздействия. Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) - молекулярно-биологический метод для

изучения структуры микробной экосистемы, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Сущность данного метода заключается в амплификации целевого гена (например, гена 16S рРНК) с определенным набором праймеров, один из которых мечен флуоресцентной меткой, рестрикции полученного продукта с помощью частощепящих рестриктаз, с последующим определением количества терминальных рестрикционных фрагментов. Интенсивность флюоресценции каждого пика отражает относительное количество (долю) каждого филотипа в микробном сообществе. Для анализа бактериальных сообществ созданы компьютерные программы, позволяющие детальную расшифровку T-RFLP - профилей, результатом которых является не только установление количества и относительной численности доминирующих групп микроорганизмов, но и их таксономической принадлежности, например, программа FragSort или другие (March et al., 2000). Таким образом, метод T-RFLP является удобным методом мониторинга динамики структуры микробного сообщества. В результате возможно выявление групп микроорганизмов, оказывающих непосредственное влияние на продуктивность животных, а также выявлять патогенные микроорганизмы.

Цель исследований. Изучить состав микрофлоры рубца крупного рогатого скота, его изменения в течение суток, в процессе роста и развития животных, а также под действием пробиотических препаратов на основе молеку-лярно-биологического метода T-RFLP для оценки возможности использования данного подхода в разработке способов его оптимизации.

Задачи исследований:

- модифицировать методику T-RFLP для изучения микрофлоры рубца крупного рогатого скота;

- сравнить результаты классических методов микробиологии и T-RFLP-анализа при изучении микрофлоры рубца жвачных животных;

- изучить закономерности суточной и возрастной динамики микробного сообщества рубца бычков с помощью T-RFLP-анализа;

- установить особенности микробиоценоза рубца дойных коров в зависимости от уровня продуктивности и состояния здоровья;

- оценить влияние пробиотических препаратов на микрофлору рубца крупного рогатого скота.

Научная новизна исследований. Впервые проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного молекулярно-биологического метода Т-РРЪР, в результате чего было выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых, а также установлена возможная роль данных микроорганизмов в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных. Изучены изменения во всех компонентах микробного сообщества (бактерии, археи, грибы), происходящие в течение суток, связанные с кормлением животных. Установлено, что рост и развитие пищеварительной системы животных сопровождается сменой доминирующих таксономических групп в составе бактерий, архей и грибов. В условиях рубцовой экосистемы проанализировано действие пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Б на разные физиологические группы микроорганизмов.

Выявлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и количеством микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. С использованием модифицированного метода Т-КРЪР в рубце крупного рогатого скота выявлено более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), установлена их связь с физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных, что позволяет разработать способы регулирования микробиологических процессов в рубце, направленных на повышение эффективности использования корма жвачными животными, снижение заболеваемости и увеличение продуктивности животных.

Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных» (Дубровицы, ВИЖ, 2011).

Предложения производству.

Данные комплексного исследования микробиоценоза рубца крупного рогатого скота с помощью Т-КРЪР-анализа позволяют рекомендовать использование данного метода для разработки оптимальных методов повышения эффективности мероприятий, направленных на снижение заболеваемости животных и на увеличение продуктивности животных.

Результаты, полученные в данной работе позволяют рекомендовать про-биотики Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Б для включения в рационы бычков на откорме по 10 г. на голову в сутки.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены:

- на Международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» (Дубровицы, октябрь 2008 г.);

- на 13 и 14 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, 2008-2009 г.),

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов» (Москва, 19-20 августа 2009 г.);

- на пятой Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 14-16 сентября 2010 г.);

- на пятой Международной конференции «Современное производство комбикормов «Комбикорма - 2010» (Москва, 22-24 ноября 2010).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных статей, в том числе три в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

- изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода Т-КБЬР позволяет идентифицировать более 200 фило-типов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), в том числе некультиви-руемых, а также установить их возможную роль в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных;

- установлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и содержанием микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 197 страницах компьютерной верстки, содержит 40 таблиц, 18 рисунков, структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения производству и список использованной литературы, включающий 342 источника, в том числе 303 на иностранном языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Особенности пищеварения у жвачных животных

Жвачные животные занимают особое место среди других растительноядных. Это, прежде всего, связано с их огромной хозяйственной важностью. Кроме того, жвачные отличаются уникальными особенностями функционирования пищеварительного аппарата. Огромную роль в пищеварении жвачных играют микроорганизмы-симбионты (бактерии, грибы, метаногенные ар-хеи, простейшие, бактериофаги) (Георгиевский, 1996; Rüssel, 2002, Church, 1993). Только знание особенностей пищеварения жвачных животных может ориентировать на решение прикладных задач, связанных с их рациональным кормлением (Пивняк, 1982; Hungate, 1996).

К жвачным животным относят крупный рогатый скот, овец, коз, лосей, антилоп, жираф, а также мозоленогих (верблюдов, лам, альпак, гуанако). Жвачные животные имеют самый сложный желудок среди растительноядных млекопитающих, который морфологически и функционально состоит из четырех отделов: рубца, сетки, книжки и сычуга (рис. 1) (Геогиевский, 1990; Russell, Rychlik,