Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение межмолекулярных взаимодействий противоопухолевых препаратов (тиоТЕфа, проспидина, доксорубицина, фарморубицина) с некоторыми структурными компонентами нуклеиновых кислот и белков методом масс-спектрометрии

ВАК РФ 03.00.05, Ботаника

Автореферат диссертации по теме "Изучение межмолекулярных взаимодействий противоопухолевых препаратов (тиоТЕфа, проспидина, доксорубицина, фарморубицина) с некоторыми структурными компонентами нуклеиновых кислот и белков методом масс-спектрометрии"

ХАЕК1ВСШЙ ДЕРЖАБНИЙ УНИКРСИТМ

ОД

г На правах рукопису

1*! ДГ 0

ГРЕБЕНИК ЛЮДМИЛА 1ВАН1ВНА

БИБЧЕННЯ М1ЖМ0ЛЕКУЛЯРНИХ ВЗАЕМ0Д1Й ПРОТИПУХШННИК ПРЕПАРАТ 1В (ТЮТЕФА, ПРОСП1Д1НА, ДОКСОРУБ1ЦИНА, ФАРШРУБ1ЦИНА) 3 ДЕЯКИМИ СТРУКТУРНИМИ КОМПОНЕНТАМИ НУКЛЕ1НОВЯХ КИСЛОТ ТА Б1ЛК1В МЕТОДОМ МАС-СПЕКТРОМЕТР1I

03.00.05 - Б1оф1зика

Автореферат дисертацП на вдобутта наукового ступеня кандидата 61олог1чних наук

Харк1в - 1996

Дисертащею е рукоггас

Робота виконана е ГнституП прикладно! ф!зики HAH Украпш

Науковий керхвник - доктор ф1зико-математичних наук, професор,

Сулодуб Леонхд Федорович

Офщицй опоненти - доктор б1ол!чаих наук, професор,

РадаБский Юр1й Леон3.дович

доктор ф1зико-математичних наук, старший наукоЕий ствробз-тник, Сорок1н Б1ктор Олександровкч

Пров1диа opraHiaauia - Шститут проблем крХобхологИ та

кр!омедицини HAH Укра1ни, м. Харкгв

Захист в1дбудегься £>3 _193G р. на зас1данн1

спещалАвовано! вчено! ради К 02.02.16 XapKiECbKoro державного университету за адресою: 310077, M.XapKiB, пл. СЕободи, 4, аудитор1я 3-15, о 1У годинх 15 хв.

3 дисертащею можна ознайомитися в Централыйй науковш б1бл1отец1 Харк1вського державного ун!верситету, м.Харк!в, пл. Свободи, 4.

Автореферат розшланий___^ ОЛ-_ 1ЭЭ6 р.

Вчений секретар crieuiajiisoEaHoi Ечено1 ради кандидат 61олог1чних наук

Актуаяыпсть теми: Уапхи в ni знати молекулярних MexaaioMiB протипухлинних фармакологiminx npenapaTiB на б1ом>злекули лалтйзованих юИтин багаго в чому обумовленг вираженою тенденщею ^учасно! $i3HKo-xiMi4Hoi б1одогП до стр1мкого розширеннн кола (цзичних методов достджень, що використовуються для отримання шформацП, яка характеризуе HKicni i KiJtbKicni параметри м1лаголеку-ялрних взаемодш л1карських речовин i компонентов б1омолекул-"мше-ией" як в модедьних умовах, так i in vivo (Ross, 1964; Lawley, 1975; Singer, 1975; Верк1н и др. 1985; Пацковский и др., 1989; Шейнкер и цр. 1989; Husaln et al., 1992; Zimmerman, 1993). Одним is на*Шлыа перспективних ф1зичних методов досл1джень, що ycnicmo викорнстову-ються в 0ioxiMi4HHX i молекулярно-б^лоПчних додатках фармакологи протипухлинних препаратов, е мас-спектромегр1я (МС) (Matsui et al., 1994), вокрема, часопралхтна МС з ioHiaaaiera уламками пoдiлy 252-Cf (time-of-flight plasma desorpticn mass spectrometry /TGF-PDi<G/) (Macfarlane, 1974; Jungclas et al., 1983; Cooks, 1983; Smdqvist, 1985; Roepstorff, 1987). Особливсжи MexaHisMiB десорбцНЛсшзацП орган1чних речовин в PDMS дозволяють:

1) виб1рк0Е0 детектувати в модельних сум!шах х in vivo присутн! в сл!дових кглькостях (< 1 pmol) коваленто зв'язшй аддукти л!карсь-кйл речовин s б1омолекулани;

2) вивчати некованентно зв'язан! мультимолекуляр^ структуро-ван1 асоц1ати фармаколог1чних npenapaTiB з бюмалекулами- "Mimeнами" у виглядi так званих гетерокластерних KEaзiмoлeкyляpниx 1он1в

[ (фармаколо^чний препарат )а_+(б1омолекула-"м1шенъ")т+ Ш ,п >1,т >1. Останнхй напрямок щкавий в суто прикладному аспект! - як основа для вивчення деталей MexaHisMiB взаемодН нових протипухлинних фармако-лог1чних npenapaTiB (noxiflHi антрацикдикозих ачтиб!отик1в, лексит-ропсини) з б1омолекулами-"м1шенями" sa допомогою нековалентного зв'язуЕання i сгернчно! в1дпоп1дносг1 компонента (Lawn, 1988), з метою розробки нових, б!льш ефектиЕНих npenapaTiB. KpiM того, дослдаешш нековалентно зв'язаних комплекс1в бiомолеи:/л з нйзькомо-легсулярними л бандами е суттевою частиною нового фундаментального напряыку молекулярно1 OioxiMi'i i фармакологи - супрамолекуяярно! xiMii (Lehn, 1987; Rebek, 1990), предмет яко! - моделювання селек-тивних взаемодш органхчних сполук в мультимолекулярних стругауроЕа-них нековапенто зв'язаних комплексах, наближених до б1ологхчних структур. Розвиток уявлень супрамолекудяршп xiMi'i дозволить прово-дити направлений синтез високоефективних протипухлинних npenapaTiB нових поколхнь, х1м10терапевтичний ефект яких обумовлений оборотним високоспецифхчним зв'язуванням з б1омолекулами-"м1тенями", вокрема, д1лянками геному wanirHisoBano'i кл1тини, що в1дпов1дають за процеси росту i регуляцП осганньо! (Hurley et al., 1988). В csiraii приведения тенденщй уявляеться достатньо перспективним застссування

ТОГ-РОМЗ до модельних систем, що Екточають прогипухлишп речовш алк!люючого типу або пох1дн! антрациклинових антиб1отик1В-1нтеркаи тор!в 1 компааенти нукле!нових кислот як основних кл!тинних 5!омс лекул-"мшеней" зазначених препарат 1в.

Мета 1 задач! досд!дження. Метою роботы е вивчення на молеку ляриому р!вн1 лроцесав взаемодП як кдасичних протипухлинних нрепг рат^Е алкгдюючого типу (т!оТЕФ, просп1д1н), необоротно модиф1куючи кампоненти нуклсинових кислот (НК), так 1 нових протипухлинних пре парат!в направлено! дП (докооруб1цин , фарморуб1цин), що утворевот на осное! стерично! е!дпов1дност! специфачн! нековалентно зв'язан супрамолекулярн! комплекси - асоц!ати з д1лянками геному мазали во вано! шитини, методом часапрол!тно1 мас-спектрометрП а !ои!зац1е уламкаыи подхлу 252-СГ (ТОР-РБМЗ).

0сновн1 задач! досшджень. Виходячи в мети були вианачен! так асковнх задач!:

1) Вивчити методом часопрол!тно! плазменно-десорбц!йно мае-спектрометрИ (ТОГ-РОУЗ) шляхи ковалентно! модифз.кацП кошо нент!в нуклегнових кислот протипухлинними препаратами т!оТЕ2ом проспанном.

2) Провести експерименти по виявленню та детальному вивчеш не ковалентно зв'язаних комплексов бюмолекул (гетерокластер1в) ; ТОГ-РОМЗ.

3) Вивчити процеси взаемодГ! протипухлинних антрацшшновкх ан-тиб!отик!в - АА (доксоруб1цина 1 фарморуб!цина) а деякими мономерам] нукле!нових кислот та б1лклв методом ТОР-РОМЗ.

4) Встановити кореляцгйн! зв'язки м1ж ф1зико-х!м!чними параметрами гетерокдастерних !он1в АА з б1омолекулами р!зно! х1м!чно1 при-роди та ступенем протипухлинно! активност! вказаних АА.

5) Виявити основн1 иринцяяи ыас'-спбктрометркчко! 1дентиф:кац13 стерео!эомерних молекул дакарських речовин стосовно до метод} Т0Р-РШ5.

Наукова новизна роботи:

1) методом ТОГ-РОМБ виявленг нов!, ран1ше не виявлен! !ншим1 ф!зико-ххьйчними методами, аддукти протипухлинних речовин алк!дючо-го. типу (т1оТЕФ, просп!д1н) в компонентами нукле!нових кислот;

2) вперяю показаний феномен утЕорення в ТОР-РОМЗ гетерокдастерних 1он1в б!омолекул ! розробленг теоретико-методолог!чн1 осноеи еи-користання останн1х при модедюваши процес1Е нековалентного зв'язу-вання протипухлинних препарат!в з б!омолекулами-"м!шенями";

3) вперше в рамках методу ТОР-РИС встановлено бегпосер-едн!!? вплив на процес утворення гетерокдастерних !он!в типу [фармако-логгчний препарат + бюмолекула- "ы!шень"3 зд!бносп зазначешк ком-

юнбнт1в формувати в ход! сп1в1сристал1гаци 1з р1дко1 фази лзаз1кристал1ч1и структури, сгабШзован! на основ 1 стерично! адповд-дност! нековадентними (ван-дер-ваадьсовими, водневими) зв*азами (Китайгородський, 1985);

4) встановлена корелятивна залелапсть м1ж структурно-термоди-олчними параметрами гетерокластерних юнХв типу Сантрацикл1новий штиб!отик (АА) + б1омолекула-"м1шень"3 1 ступеней х1м1отерапэвтич-Ю1 протипухлинно! активности стерео1зомерннх АА - фарморуб!цина 2 [оксоруб1цина;

5) наведен! експериментальн1 результата, як1 св1дчать про те, ;о гетерокластерн! 1.они б:шмолекул 1 протипухлинних препаратов вини-сають як внаагадок десорбцПЛошгацП кваз1кристаи1чних макроклас-:ер1в, як! десорбуються щлком 13 твердофазного зразка (Липгс1аз, .987; МасГаг1апе, 1987), так 1 газофазних реакщй (Соокз, 13835.

Основн! положения, що виносяться на захист.

1) ТОР-РОМБ як Бисокочутливий метод ф1зико-х1м1чного анал!зу аомолекул надае мсшшв1сть одночасного спостереження як мхнорних совалентно зв'язаних аддукт1в осташпх з протипухлинними предарата-га, так 1 нековалентно зв'язаних супрамолекулярних комплегапв бхомо-гекул з вказаними препаратами.

2) При взаемодП високоенергетичних уламк1в под!лу 252-СГ з гвердофазними мультикомпонентними зраз нами баомолекул (А,В,С,Б) ут-юрюються гетерокластерн!, стаб1л1зован1 нековалентними зв'язками .они С Аш-Вк'С1-0г], де ш, к, 1, е - О, 1, 2 ... п.

3) Як1сний та кхльк1сний склад гетерокластер1в бшмолекуд виз-гачаеться наявн!стю специф1чних мтюлекулярних зв'язк!в та 1х -тер-юдинам1чними характеристиками мл.ж вказаними б!омолекулами в ТЕердо-разних зразках.

4) Спостереження в мас-спектр! мультикомпонентних гразк!в помолекул рхзно! ххм1чно1 природи А,' В, С, 0 гетерокластерних 1он1в !А • В], СА • С] з ¿нтенсивтстю пж1в в1дпов1дно I та I' (1>> I') ;в1дчить про те, що, по-перше, б1омолекула А здатна зв'явуватись не-совалентними зв'яаками з В та С, але не з Р; 1, по-друге, ст1йга.сть сомплексу АВ вища за АС.

5) На основ1 ТОГ-РБШ анал1зу розроблений метод проведения екс-фес-скршйнгу бюмолекул - потенщйних "мшеней" протипухлинних 1репарат1в в галуз! прикладнох онкофармакологП.

Теоретичне та практичне значения роботи. Результата лроЕедених (осл!джень мають сугтеве значения в фундаменгальн1 галуз1 б1оф!зики -ззаемодП високоенергетичних часток з бдомолекулами шатини. Щодо фактичного значения роботи, встановлено, що: ТОГ-РШЗ може бути а гспххом використана в фармаколог1чн1й х1мП для проведения екс-фес-скршйнга на предмет виявлення зд1бност1 заново синтезованих

б.

протипухлинних фармаколог i чних npenapaTiB осташпх поколiнь утвор вати обумовлюючi х!мштерапевтичний ефект Еисокоспециф1ч!п, веков лентно зв'язшй комплекси з 01омолекулами-"мшенями" (компонента нуклешових кислот, б1лками, вуглеводами) (Rebek, 1990), а також д реестрацН ковалентно зв'заних аддукт!в б1омолекул з ксенобштикам присущими в модельних сумшах i in vivo в слхдових к1лькост (Gaudiano et al., 1990).

Апробац1я роботи: Ochobhí результата досл1джень були предста ленi на IX Всесоюзному симпоз1ум1 по щленаправленому пошу л!карських речовин (Рига, 1991), науново-практичнiй конференцП м лодих досл1дннк1е ФТ1НТ АН УССР (XapKiB, 1991), XII Мгжнароднш ко ференцИ з мас-спектрометрП (Амстердам, 1991),школ1-сем1нар! ФТ1 АНУ "Використання мас-спектрометр!i в 01ологП 1 медицин!" (Харк! 1992), V Шлшароднхй Пекшськш конференцП в проблем пютрументал ного aíiaalsy (Пек1н, 1993), пауков i й конференцП "Шляхи шдввден продуктивное^ i hkoctí схльскогосподарсыап продукцН" Сумський с шститут (Суми, 1993), 4-му 1пжнародному cimosiyMi по молекулярн аспектах xiMio'xepanil пухлинних вахворювань (Гданьськ, 1993), 3-Ьйжнародному симпоз1ум1 "Мас-спектрометр1я в медицин! i бходог! (Сан-Франциско, 1994), XI11-1й Шжнароднз.й конференцП з ыас-спект метрП (Будапешт, 1994), ciMnoaiyMi "Синтез, експериментальне ей чення та кл!ничне застосування четвертичних амстевих саолу (Черн1вц1, 1995), пауковому ceMiHapi В1дд1лу íohho'í ф1зики гнститу ядерних досл!джень Ун1верситету м. Уппсала (Швещя), а такса засХданн! науково! Ради 1ПФ НАНУ i мУскафедральному зас1данн1 меди ного факультету СумДУ.

Пубд i кацП. Результати досупджень викдадешй в 5 статтях та тезах.

Структура i обсяг дисертацп: Дисертавдя складаеться ia всгуп шести глав, заключно! частини, загальних bhchobkíb та списку цитов но! лхтератури. Робота викладена на 19D стор1нках i вмгщуе: 1 CTopiHDK машинописного тексту, 45 рисунка, 1 таблицю. Список цитов но! лНератури включае 212 назв.

Об'ект та методи досд1джень.

Дослдаення особливостей формування м1жмолекулярних комплекс протипухлинних npenapaTiB 3i структурними компонентами макрошдек шйтини - бюмолекулами-"м1шекями", проводили у модельних система Протипухлинними препаратами, hkí входили до складу цих систем, бу. алк1лююч1 агента (тюТЕФ, проспдан) 1 1нтеркалююч1 речовини (доке руб1цин, фарморуб!цин). Asothctí основи, нуклеозиди, нуклеотиди амйюкислоти використовували як 61омолекули-"м1шен1".

В ексиериментах був викориоганий гшТЕФ, попередньо очищений подвпшою перекристшпвац1ею (Косевич и др., 1987). Використсвували фарморубхцин (enipyöiuHH пдрохлорид) i адр1ашцин (доксоруб1цин' г1дрохлорид) "Farmitalia Carlo Erba" (1тал1я); дезогалрибонукяэозиди dAdo, dThd, dGuo, dCyd; рибонуклеозиди Guo, Cyd (НДКТ1 БАР, Facia); asoTHCxi основи Cyt "Chemapol" (4exia), 1-MeCyt, 5-MeCyt, iso-Cyt "Serva" (Шмеччина), амшокислоти Phe, iso-Phe, Leu, Val, Ile, Cys, Gly, His, Lys, Arg "Sigma" (США); лактоза "Merck" , ¡птроцелюлоза "Schleicher & Schuell" (Шмеччина).

Мод1ф1кац1ю дезокс1гуанозин-5'-фосфата (pdGuo) i дезоксщити-дин-5'-фосфата (pdCyd) проводили, розчиняючи реагенти в бэдхстхлъ-ованш бод1, BMimyM4H i 1нкубуючи отриману сумхш (37°С, pH 6,5 -7,0) на водяшй 6aHi (Серебряний и др., 1986). При вивчен1 ctíískoctí комшшкс!в тшТЕФа з нукдеотидами в кислотному i лужному середовивд у систему додавали ОД н NaOH або 0,1 н HCl i витримували при tíh же температур! 15 хвилин.

Реакцш npocnifliHa з pdGuo проводили при 37°С 2,5 години з по-передньои температурной активащею розчину препарата (анкубащя 2 години при 37°С).

Досл1дження формування нековалентно зв'язаних комплегалв антра-циклпгавих антибютшйв з азотистими основами, нугаеозидами, нуклео-тидами i аминокислотами проводили у екв1молярних сум!шах доксо-руб!цина або фарморуб1цина з вказаними структурними компонентами пол1мер1в.

Поставлен! експериментальн1 задач1 розв'язували is застосуван-ням як основного методу досл1дження часопрол!тно! мас-спектрсметрП з ioHisaiûeio уламками под1лу 252-Cf (T0F-PEMS) на прилад1 мас-спект-poMeipi 6ioxiMi4HDMy - МСБХ (АО "Selmi", Суми, Укра1на).

Проби готували на ochobí н!троцедюдоано1 i лактозно! матриць, або Baarafli без матриц! (металев1Й п1дкладинщ) - в залелшостг в!д мети експерименту (Roepstorff et al., 1987). Ал!квоту аналгзуемо! проби (10 - 50 мкл) наносили на пробонесучий диск i шдсушували у струменг теплого пов!тря або аргона. Мас-спектри отримували при прискорюючому напруженн1 Unp - ± 20 kV. Для кожно! cepi'i експери-MeHTiB проводили попередне мас-спектромегричне досл1дення контроль-них проб речовин, hkí використовувались при стБоренн! моделышх систем.

РЕЗУЛЬТАТ!! ТА IX ОБГОВОРЕННЯ Модельна система "rioTEŒ - дезокхприбонуклеотид"

При мас-спектрометричному досл1дженн1 взаемодП таоТЕФа з де-зокс1рионуклеотидами були отриман1 сл!дуюч1 результати.Виявлено, що протипухлинний препарат rioTEŒ утворое гетерокластерн1 1они а дезок-с1рибонуклеотидом типу С (дезоктрибокуклеотид) • (тшТЕФ)п 3", причому

с тех i омег ричний параметр п заложить в!д xímímho'í природи нуклеотиду ягап.0 в склад комплексу "т!оТЕФ + pdGuo" входить до 9 молекул проти пухлинного препарату Сп - 1-9), то в аналог1чну структуру, характер ну для НоТЕФ i pdCyd - т1льки дв! молекули нуклеотиду (п - 1-2).

На рис. 1 представлений ыас-спектр 1нкубащйно1 сумШ pdGu (М) i TioTEiD, до 4ítko видно iiíkm íohíb з т/г - 346,1 - CM - Н]~ m/z - 536,2 - Ш +(TioTE$)1 - Hf , m/z - 725,0 - [М + (т1оТЕФ^ "НЗ" т/г - 914,1 - СМ (тюТЕФХ, т/2 - 1103,1 - СМ + (т!оТЕФ)^-HÍ. т/:

- 1292,0 - СМ +(Т1оТЕФ)5-HD" , с m/z - 1481,3 - СМ + (tíoTE<D)4 -Ш" m/z - 1670,1 - СМ + (tíoTE<S)j -Н]~ , m/z - 1859,0 - СМ +(ПоТЕФ)г -НГ т/2 - 2048,2 - СМ + (тЮТЕФ)/ нГ (Тн - 2-10 5 ). Для íhhuix нуклеоти-Д1в - pdAdo i pdThd,аналогi4Hi коыплекси з tíoTEE не виявленЩ! результата анаходягься в повшй в1дпов1дност1 з експериментаяьнши роботами, що показали гйдвщену аф1нн1сть TioTE'i до GC-абагачениз д1лянок ДНК, i, особливо, пох!дних гуан1ну (Gua).

Ыльш того, в експериментах, в яких проводили пор1внянш зв'ягування тхоТЕФ з р1зними нуклеотидами, показано, що в трьахком-понентному середавшиД АнкубацИ (tíoTE<D + pdGuo + pdCyd) перевалшс виникали комплекс« з pdGuo (pdGuo■(т1оТЕФ)п), де п - 1-3.

BiAJI 1КИ М 1:32

270Ю- HN ip^V . \

H¿N N N / s \ !

2400°- он , • Ыг^) :

21000; О-р-О-ф! V N /

18000- L 0Н °Н П J

1 П= 1 - 9

15000 -

120002

9000 • 3

4

6000 ■ .

оШШдш

1000 2000

Рис.1» T0F-PDMS саектр cyMimi тхоТЕФ i pdGuo, 1нкубованш

1 годину при 37*С. иприс.- - 20 kV, к1лькл.сть стартiв -

2 ООО ООО, матридя - ттроцелюлъоза.

úa>

нн

/ s

9Н Hj о-Р-о-уу

он он

1

N

ZI

П= 1 - 9

|щ

1000

2000

I.BiflJiiKH

700 600

500

i

400

г

300

200

100

3

4

012345678 t, годшш

Рис. 2 Крива накопичення у середовищ анкубацИ комплексу TioTE<D 3 pdGuo: 1 - pdGuo; 2 - [pdGuo (т!оТЕФ)< 3; 3 - [pdQuo (т1оТЕФ)гЗ; 4 - [pdGuo (тшТЕФ)53.

Hapemri, T0F-PDM3 використовуЕали з метою вивчення дина*1ки накопичення комплексов т1оТЕФ з pdGuo в процесс! !нкубацП. Озтималь-ний час ХнкубацП т1оТЕФ з pdGuo, необэадний для отримання антенсив-них niKiB ioniB [TioTE® + pdGuo - нГ (рис.2) складае 2-4 години i практично сл!впадае з результатами, отриманими !ншши досл!дниками з використанням йших метод1в (Серебрянний, 1987).

Моделъна система "npocnifliH - дезокс!гуаноз1н-5*-фосфат".

Бастосування методу T0F-PDMS до дано! модельно1 система дозволило виявити новий, ран!ше не i дешифрований аддукт, я кий в мас-спектр1 представлений п1ком в m/z - 525,5 (рис. 3). Ексаеримен-талый умови отримання аддукта св!дчать на користь того, що в ре-акц1ю з нуклеотидом вступае високореакщйноздатний фрагмент проспана, що утворюеться п1д час температурно! активацП препарату (2 години при 70°С). Виявлений в реакц1йн1й систем! м!норш« аддукт мае наведену нижче структуру:

о

сн3а-сн-с он

nh2

I, в i дл ikh_м 1:10

1500 j

1350

1200 1050

S00

500

m/z

1000

Рис. 3 T0F-PDM3 спектр cywimi простд1ну (попереднь'о 1.нкубова-ного 2 години при 70°С) i pdGuo. 1)приск.- +20 kV; KiJibKicTb стартiв - 25 ООО; без матршд.

Утворення i реестращя гетерокластерних комплегапв в

T0F-PDM3.

В cepi'i експеримент1в а двохкомпонентними еквгмолярними сумша-ми типу (dN+dN*) (dAdo+dThd; dGuo+dCyd; dAdo+dCyd; dCyd+dThd; dAdo+dGuo; dThd+dGuo) вперше показана можлив1сть утворення в T0F-PDMS ia твердофазних кристалгчних полЛкомпонентних зразкхЕ поряд з гомокластерними шнами, гетерогенних acouiariB бшмолекул (рис. 4).

T0F-PDM3 подтверджена показана paHime з використанням Лшпих МС-методик (FD, FAB, MALDI), пьдвищена ст1йглсть гетерокластерного двохкомпонентного ioHy [dGuo + dCyd + Н]+пор1внянно з аналог1чними нековалентно зв'язаними асощатами Лнших дезоксхрибонукдеозидiB, npucyniix в щ.й же проб!.

l.BiAJIiKH n 1-6

600 —

a.

I,B1

1030

875 700

52a

330

лл i KH

к 1:8 11-

17a

494,5

735,6

978,7

ЩВД, jiiil^i;,

¿UO 300 400 500 m/z 400 600 ЬОО 1000 too. 4 T0F-PDM3 спектри сум1шей дезоксирибонуклеозщЦв a) dpuo и dCyd ; 6) dAdo и dThd. иприск.- +15 kV; к1льк1сть старт1в - 100 ООО; без матршц.

Анал1зу пхдгали також твердофазн1 системи HKi м!стять в coGi Иомолекули piBHOi х!м1чно1 природи, а саме: ам1нокислоти L-Phe, -Тгр, His i компонента НК (Gua, Cyt, Ura). Анал1з мас-onsKTpiB вка-1аних модельних систем також тдтвердив можлив1сть детекцП в '0F-PDM3 гетерогенних нековалентно зв'язаяих асоц1ат1в, що мХстять )i3Hi за природою, але,напевно,досить добре в1дпов1дн1 один одному ;тереох1м1чно i функционально, б1омолекули.

МодельHi сисгеми "антрациилшовий антибштик - б1омолекула-"мхшень"

Докладно виЕчений в моделыйй твердофазной систем! процес комп-шксоутворення протипухлинних ciepeoisoMepiB АА доксоруб1цина i фар-юруб!цина 1з структурними компонентами бюполхмер1в кл1тини, особ-шво з нуклеозидами, оскгльки для основного механхзму протипухлинко1 их дано! групи препарат!в постульовано наявн1сть 1нтеркаляцП плосок хромофор1в антибютшйв Mi« нуклеотидними парами молекул!! ДНК 'Bailly, 1991). Виходячи is сучасних погляд1в про вир1шалыи внесок } молекулярний MexaHisM протипухлинного ефекту даних антибюттйв сомплексних нековалентно зв'язаних утворень АА а НК i б1лковими ком-юнентами хроматину, також були ctEopeHi експериментальн1 умови для зпостережения асоц1атхв молекул АА з деякими аминокислотами, вокре-¿а, з ам^юкислотами.щр найб1лып часто зустр1чаються в активних центрах молекул ферментхв (His, Phe).

ШдсумоЕша результата cepil експериментхв по досл^женню неко-

I. В1ДЛ1КИ

400

400 ■

320 '

240

160 к».

&0 Щи

о П

900

1,В1ДЛ1КИ

750

625"

500 •

375-

260-

125 яЬ

0 РН

м 1:0

833.3

855,3

а.

700

^ ^ а

800 900 т/г

С.

Рис. 5 ТОР-РШЗ спектри сум!шей фзрморуб!цина (Рг) 1

дезоксирибонуклеозид1в: а) Рг 1 сЬ^о; б) Рг 1 сЮио. иприск.- +15 кУ; к! ль клеть старев - 100 ООО; без матриц!.

валентного зв'язування АА з компонентами шйтинних макромоле-кул-"м!шеней" наведен! в таблиц!. Анзлйз 24 вивчених модельких систем показав високу комплексоутворшчу здатн1сть протипухлинних препаратов дано! групи по вэ-дношенню до компоненте НК 1 61лк1е, щр знайшло свое воображения в ыас-спектрах ТОР-РГЮ у вигляд1 1нтен-сивних п1к1в гетерокяастерних 10н1в типу САА + б!омале1сула-"м1тень"3. Незначна р1зниця в х1м1чн1й структур! стерео!зомер1в фарморуб!цина (Рг) ! доксоруб!цина (Бг) чинить значний вплив як на утворення гете-рошастерних !он1в при Еведенн1 е модельну систему того чи ! нагого АА, так 1 на !нгенсивн!сть в1дпов1дних дам хонам п!к1в в мас-спект-рах.

Так, наприклад, Рг утворюе гетерогенн1 асоц!ати з с!Ас1о, йБио 1 сЗТЬс!, апе не а (ЗСус! (рис.5 ). Якщр прийняти в1дносну 1нтенсиЕнхсть п!к!в таких гетерокластерких !он1е аа шру стаб!льност1 асоц!ат!в, то для комплексу з dGuo характерно б1льш м!цне зв'язування, яке виз-начаеться, напевно, стеричною В1дпов1дн1стю взаемод!ючих молекул. Дал!, анал!з !нтенсивност1 п1к!в гетерокластерних !он!в у б!нарних сум!шах, а також досл1дження конкурентно! Еибхрковост! в зв'язуванн! АА з дезокс1рибонуклеозидами в трьохкомпонентн!й сум!ш! "АА+Си\мч3м*" дозволив побудувати ряд стаб1льност! комплексов 1 виб1рковостг АА по в!дкошенню до dN. Для Рг вш мае; такий вигляд: dGuo > dIhd > dAdo ? dCyd.

Для стерео!зомера Рг - доксоруб!цина (Ог), навпаки, характерне

ТАБЛИЦЯ

ИластероутЕорсння фарморуб1цина i доксоруб1цина з бшмолекулами

Снодука (М*),утворю-юча гетеро-кластерШ iони з АА Фарморуб1цин (M4) ДоксорубЩин (Мг)

Вид юна В1днос на íh-тенс. nina . M/z Вид юна в1днос на íh- тенс. пика m/z

1 1. ЛАКТОЗА CM1 +++ 886,3 шЧм^+Н]"1" +++ 886,3

2. dAdo [М^+Ма+Н3+ + 795,4 - - -

3. dThd Ш^+М^+НЗ* ++ 786,3 - - -

4. dGuo [Mj+Mt+Ha]+ . [M +Ma+2Na-H3 +++ ++ 833,3 855,3 [KTW+Nar +++ + 811.3 833.4

5. dCyd - - - - - -

6. dGuo+dAdo tW^+dGuo+Nal4 H3+ +++ + 833.3 855.4 [M^+dGucH-Н]4! [Ma+dGuo+Naf + ++ 811,4 833,3

7. dGuo+dThd [M2+dGuo+Na]+ +++ 833,3 [M5+dGuo+Hl+ ++ 811,3

8. dAdo+dThd t^+dThd+H]"1" + 736,3 - - -

9. dG|jg+dAdo+ [Mf+dGuo+H]++ [M^dGuoHlal ■н-+ 811,4 833!3 [M?+dGuo+H]+^ [Ma+dGuo+Na3 + ++ 811,3 833,3

10. dCyd+dAdo+ dGuo+dThd 11. Guo +++ 827,2 [M* +Î?+H3+ ++ 827,2

12. Cyd ПЛ1 +M2+H3+ pH 10,6 +++ 737,3 CM1 +Ma+H]+ pH 6,7 ++ 787,3

13. Gua - - - - -

14. Ade CM^+M^H]"4" 679,2 - - -

15. Cyt СМ'1+Мг+Н]+ +++ 655,2 ш',+мг+ш+ +++ 655,2

16. Gua+Cyt [M2+Cyt+H3+ +++ 655,3 CM2+Cyt+Hl+ +++ 655,3

17. Ade+Cyt [M^+Cyt+H]4" +++ 655,2 [M2+Cyt+H3+ ++ 655,1

18. 1-MeCyt CM1+M2+H]+ +++ 669,3 CM"'+M2+H3+ +++ 669,3

19. 5-MeCyt Ш^+мЧн]4" +++ 669,2 [M^+tZ+H]"4" ++ 669,2

20. хзо-Cyt CM^+M^+H]4" ++ 655,2 ++ 655,3

21. Phe - - - - • - -

22. iso-Phe ш',+мгч-нз+ + 709,3 [Ы^+^+НЗ4" + 709,2

23. His+dGuo [MÄ+dGuo+H3+, CHis+dGuo+НГ ++ +++ 811.2 423,3 CM^+dGuo+Hl* [His+dGuo+HJ ++ +++ 811,3 423,2

24. His шЧмЧнз*" +++ 699,3 •i Z + [M1+M +H3 +++ 699,1

комплексоутворення тальки по в1дношенню до dGuo, тому годабно! коре-лацП для даного препарату показати не вдалося. IIpiopiTeT стерео-xiMiuHo'i в1дпов1дност1 взаемодшчих молекул при формуванн1 супрамо-лекулярного комплексу п1дтверджуеться також на приклад! системи "АА +.His", в Mac-cnerapi яко! вхдзначений характерний niK гетероклас-терного iOHy [АА +■ His +■ Н]+. При розгляд! трьохкомпонентно! системи "АА + dGuo + His" тдтверджуеться конкурентна перевага АА по в1дно-шенню до dGuo.

11рисутн1сть в мас-спектр1 дано! реакгййно! cyMimi niKy единого гетерокластерного iony, щр мхстить молекули АА i dGuo, напевно, пов'язана з наявш.стго б1льшо1 кш>кост1 сайт1в зв'язування з АА б молекул! dGuo пор!вняно з His.

Мас-спектрометрично показана зд1бн1сть Fr i Dr до зв'язування, KpiM компонент1в НК i 6iJiKiB, з Еуглеводами, зокрема з лактозою. Ос-танне Шдтверджено в експериментах з використанням оптичних метод1в (Husain N., 1992). Biibm того, лактоза була використана як матрикс при вивченн1 АА та ix взаемодП з бшмолекулами, так як даний диса-харид BiflnoBiflas кригер1ям правил подбору матриксу в TOF-PDMS, зап-ропонованих Jungclas et al. (1993), i значно п1двищуе шформа-THBHiCTb мас-спектру.

ВИСНОВКИ

1. Методом TOF-PDMS твердофазних кристал1чних зразк1В модельних сум1шей препарату TioTEI> в компонентами НК 1дентиф!кован1 hobi, ранше не виявлен! 1шпими мас-спектрометричними методами, складн! гетерокластерн1 1они типу [дезокс!рибонуклеотид (pdN)+(TioTE®)n-H3 , де п - 1-9 (для pdGuo). Показана залемпсть стех1ометр!1 гетероклас-терних iOHiB CpdN+(TioTE®)n -Н3~в!д xiMi4HOl приради дезоксирибонук-деотщцв:

pdN pdGuo pdCyd pdAdo pdThd

n 1-9 1-2 О О

2. Вивчення модельно1 системи "npocnifliH - б1омолекула-"м1шень" (pdGuo)" TOF-PDMS дозволило виявити модиф1кований по фосфатному за-лишку дезокс^рибонуклеотиду м!норний ковалентно зв'язаний аддукт npocnifliHa i pdGuo, в1дм!нний в1д канон1чних аддукт1в нуклеотид1в, модиф1кованих по атому N7 азотисто! основи (Gua).

3. Вперше показано 1снування в TOF-PDMS феномену утворення is твердофазних кристайчних пол1компонентних вразкхв поряд is гомок-ластерними 1онами СА„+ Hi*, п >, 1; [Bm+ HI4 , m 1, гетерокластерних ioHiB СА + В + Н]"г, що складаються, зокрема, i3 комп-лементарних б1омолекул (dAdo-dThd, dGuo-dCyd) - для сум!шей нуклео-зид1в або б!омолекул, aKi розр1зняються за ф1аико^м1чними параметрами i х!М1чн1й структур!: наприкяад, (ам1нокислота - ам1нокислота')

для cyMimi канон1чних амЛнокислот.

4. На основ i T0F-PDMS показана корелящя Mis:

а) iHTeHCHBHicno niKiB гетерокластерних ioHiB [ДА + б!омолеку-ла-"мшенъ"] i х1м1чною природою б1омолекул, aKi складають гетерок-ластерну структуру: вхдносна штенсивисть niKiB iOHiB CAA+dGuo+H] , CAA+dThd+H]+, CAA+dAdo+H3+, узгоджуеться з неодноразово показаною paiiime методами молекулярной бшлогП л1двищеною афппистю АА до GC-збагачених д1лянок нукле1нових кислот;

б) мас-спектрометричними даними (феноменом утворення спе-циф1чних гетерокластерних ioHiB типу LAA + б1омолекула-"м1шень"] та iHTencMBHicTio ix niKiB в мас-спектрах) i протипухлинною xiMiOTepa-певтичною ai-tTHBHicTKJ, як! не суттево в!др1зияються за xiMi4Hoa структурою АА - cTepeoisouepiB фарморуб1цина i доксору61цина. Б1льш активний по вЛдношеншо до мал1гн!защйних кл1тин препарат - фармо-руб1цин, утворюе гетерокластернЛ 1они is значно б1льшою к1льк1стю ргзних за xiMi4Hoio структурою б!омолекул в nopiBiranni з менш ефек-тивним протипухлинним АА - доксоруб1цином.

5. Знайдена високоефективна високоспециф!чна матрица, яка доз-воляс вивчати методом TQF-PDMS гетерокластерн1 ioHU типу [АА + бхомолекула-"м1шень"] - лактоза.

6. Показано, що АА утворшть гегерокластерШ iOHH типу ГАА + амшокислота + Н]+з основною ам1нокислотою His i ам1нокислоташ, в склад яких входить ароматичне к!льце (iso-Phe).

Список статей, надрукованих за темою дисертацп:

1. Суходуб Л.Ф., Чиванов В.Д., Гребеник Л.И., БондаренкоП. В., Зубарев P.A., Кныш А.Н. Наблюдение продуктов модификации дезоксигуа-нозин-5'-фосфата тиоТЭФом с помощью масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления 1салифорния-252// Биоорг.хим. - 1991. - Т. 17,N7. -С. 999-1001.

2. Суходуб Л.Ф., Чиванов В.Д., Гребеник Л.И., Еондаренко П.В., Зубарев P.A., Кныш А.Н. Изучение взаимодействия триэтилентиофосфами-да с нуклеотидами методом масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления калифорния-252//Укр. биохим. журн. - 1992. - Т. 64,N 1. -С.41-49.

3. Суходуб Л.Ф., Гребеник Л.И., Чиванов В.Д. Применение времяп-ролэтной масс-спектрометрии с ионизацией осколками деления калифорния- 252 к изучению механизмов действия лекарственных препаратов на ДНК и ее компоненты// Биофизика. - 1994. - Т. 39,вып.2. - С. 289-293.

4. Гребеник Л.И., ЧиЕанов В.Д., Суходуб Л.Ф. Масс-спектрометрическое изучение специфичности взаимодействия противоопухолевых антибиотиков доксорубицина и фарморубицина с компонентами биополимеров// ВЛсник Сумського державного утверситету. - 1994.- N 1.

С.106 - 120.

5. Sukhodub L.F., Grebenik L.I., Chivanov V.D. Study of anticancer drug interaction with DMA by means of particle-induced desorption mass-spectrometry: prospidine and

deoxyguanosine-5'-monophosphate//Rapid Commun. Mass Spectrom. 1994. - v.8 - P. 195 - 198.

Гребеник Л.И. Изучение межмолекулярных взаимодействий противоопухолевых препаратов (тиоТЕФа, проспидина, доксорубицина, фармору-бицина) с некоторыми структурными компонентами нуклеиновых кислот и белков методом масс-спектроыегрии.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.05 - биофизика. Харьковский государственный университет. Харьков, 1996.

Изучены процессы взаимодействия противоопухолевых препаратов алкшшрукщего типа (тиоТЕФа, проспидина) и интеркадяторов (доксорубицина, фарморубицина) с некоторыми азотистыми основаниями, нуклео-зидами, нуклеотидами и аминокислотами методом масс-спекгрометрии с ионизацией осколками деления Cf-252 (TQF-PDMS). Обнаружены новые ковадентно и нековалентно связанные аддукты, являющиеся результатом взаимодействия указанных соединений. На основании T0F-PDMS эксперимента показана корреляция между химической структурой стереоизоме-ров - доксорубицина и фарморубицина, их способностью к комплексооб-равованию с мономерами Сиомолекул и противоопухолевой активностью.

Grebenik L.I. Study of intermolecular interactions of antitumor drugs (thioTEPA, prospydine, doxorubicine, farmorubicine) with some structural components of nucleic acids and proteins by means of mass spectrometry.

The thesis submited for a candidate's degree in biological sciences in speciality 03.00.05 - biophysics. Kharkov state university. Kharkov, 1996.

Processes of the interaction of antitumor drugs of the alkylation type (thioTEPA, prospydine) and intercalators (doxorubicine, farmorubicine) with some nitrogen bases, nucleosides, nucleotides and amino acids has been studied by means of the time-of-flight 252-Cf particle desorption mass-spectrometry. New covalent and noncovalent binding adducts, which are the results of the interaction above mentioned compounds has been found. On the basis of TOF-PDMS experiments suggests correlation between chemical structure of stereoisomers - doxorubicine and farmorubicine, their possibility to complexation with biomolecule's monomers and antitumor activity.

, Ключов1 слова: нукле1нов1 кислоги, бхлки, т!оТЕФ, npocnifliH, антрацикл1нов1 антибиотики, мае-спектрометр!я.