Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу

Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу
ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу"

На правах рукописи УДК 576.3:576.7:616-006

Г\

ЕФРЕМОВ Ярослав Рейнгольдович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ СПОНТАННЫХ РЕВЕРСИЙ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК К НЕОПУХОЛЕРОДНОМУ ФЕНОТИПУ

Гистология, цитология, клеточная биология - 03.00.25

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2004

Работа выполнена в секторе онкогенетики Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, Лавровский В. А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Гуляева Л.Ф.

НИИ Молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, г. Новосибирск.

кандидат биологических наук, доцент Попова Н.А.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Институт клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск

[ » UMMU- 2004г. ]

Защита диссертации состоится «/<?» НЛОКХ ¿1Ш4Г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-ООЗ.О11.О1) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10. Факс: (3832) 33-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Одной из наиболее серьезных проблем клинической онкологии является метастазирование опухолей и, особенно, молчащее метастазирование. Молчащие метастазы практически не поддаются ранней диагностике, а клетки таких метастазов отличаются повышенной резистентностью к различным типам противоопухолевой терапии вследствие того, что очень долгое время способны находиться в состоянии покоя (GO). Такой феномен представляется труднообъяснимым в рамках классической теории канцерогенеза, согласно которой трансформированная клетка не' способна прекращать деление. Однако позже было показано, что клетки могут не только прогрессировать в сторону увеличения злокачественности, но и самопроизвольно возвращаться (ревертировать) к исходному фенотипу, и такая способность к спонтанной реверсии является универсальным свойством практически всех опухолевых линий in vitro. Более того, спонтанные реверсии являются скорее результатом эпигенетических изменений, чем изменений на уровне генома, о чем свидетельствуют высокие (в некоторых случаях до 45%), не сопоставимые с мутационными, частоты появления таких ревертантов.

Реверсия злокачественных клеток к неопухолевому фенотипу сопровождается восстановлением основных механизмов, регулирующих пролиферацию нормальных клеток, таких как: контактное торможение, зависимость от ростовых факторов и внеклеточного матрикса, апоптоз. Однако, такие ревер-танты обладают неустойчивым фенотипом и способны вторично трансформироваться через различные промежутки времени, а их прививка сингенным животным приводит, с определенной вероятностью, к возникновению опухолей через достаточно длительный латентный период (сравнимый с таковым при молчащем метастазировании). Таким образом, источником дремлющих метастазов, по-видимому, являются опухолевые клетки, временно ревертиро-вавшие к псевдонормалыюму фенотипу.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было исследование эпигенетических изменений, сопровождающих процесс реверсии клеток in vitro, что и определило следующие задачи:

1. Разработать метод оценки степени трансформации клеток для последующего использования при определении фенотипа исследованных клеток.

2. Проследить изменения в интенсивности синтеза мРНК наиболее универсальных ростовых факторов и их рецепторов, как основного инициирующего звена в формировании пролиферативных характеристик клеток, при изменении степени трансформированности как в сторону увеличения (опухолевая прогрессия), так и в сторону уменьшения (реверсия).

3. Сравнить профили содержания белковых продуктов генов, экспрессия которых наиболее достоверно коррелирует с тем или иным фенотипом, в клетках, различающихся как по степени трансформации, так и по ростовым характеристикам.

Научная новизна. Представляемая работа является первой попыткой выяснить, как изменяется экспрессия ростовых факторов и их рецепторов при

спонтанной реверсии опухолевых клеток к псевдонормальному фенотипу с использованием наиболее адекватной для поставленных задач экспериментальной клеточной модели, которая на данный момент является уникальной.

Теоретическая значимость. Выявлены эпигенетические изменения, сопровождающие процесс реверсии опухолевых клеток фибробластического происхождения к псевдонормальному фенотипу. Даны оценки взаимосвязи между интенсивностью синтеза мРНК и белкового продукта гена HGF и формированием определенного фенотипа исследованных клеток, который оценивался по таким параметрам, как контактное торможение роста и зависимость от внеклеточного матрикса.

Практическая значимость. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методов прогнозирования, ранней диагностики, а возможно и эффективной терапии молчащих метастазов.

Апробация работы. Основные результаты были представлены на международном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (С.-Петербург, Л16-18 октября 2001г.), а также на отчетных сессиях и межлабораторных семинарах ИЦиГ СО РАН (1999,2001,2004 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и обьем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов и списка литературы (197 наименований). Работа изложена на 105 страницах, содержит 11 рисунков и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В нашей работе впервые использована модель, состоящая из спонтанно трансформировавшихся и ревертировавших клеточных клонов и линий.

1. Оценка степени трансформации клеток по их ростовым характеристикам in vitro и in vivo. В экспериментах использовались опухолеродные и ревертантные клетки мышей генотипов СВА, СЗН и Balb/c. Индексы опухоле-родности выводились исходя из оценок таких параметров роста in vivo, как: 1) прививаемость (частота образования опухолей), 2) латентный период образования опухолей, 3) скорость гибели животных и 4) средний вес опухоли на момент смерти, а также степени контактного торможения и зависимости от субстрата in vitro. Полученные индексы использовали для определения фенотипа исследованных клонов и линий.

2. Оценка интенсивности транскрипции генов ростовых факторов и их

рецепторов, В рамках поставленных задач мы использовали метод полуколичественного RT-PCR для сравнения уровней мРНК исследованных генов в клеточных линиях и клонах, находящихся на разных стадиях трансформации. Эксперименты были разделены на 2 основных этапа: 1) исследование экспрессии ростовых факторов на небольшой панели клеток и 2) исследование экспрессии гепатоцитарного ростового фактора и рецепторов ростовых факторов на расширенных панелях клеток.

3. Оценка содержания белковых продуктов генов гепатоцитарногоростового фактора и его рецептора в различных клетках. Для оценки значимости

обнаруженных на втором этапе работ различий в уровнях мРНК некоторых

генов мы сравнили несколько клеточных линии и клонов по содержанию соответствующих белковых продуктов. Для этого мы использовали метод окрашивания клеток, фиксированных формальдегидом, специфическими антителами, конъюгированными с флюоресцеин изотиоцианатом (FITC) с последующим анализом на автоматическом проточном цитофлюориметре FACS Calibur (Becton Dickinson).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка индексов трансформированности исследованных клеток.

Поскольку наша модель содержит практически все типы клеток: незлокачественные, высокозлокачественные и практически все переходные формы, то на первом этапе работы нам пришлось разработать метод для оценки опухоле-родности клеток, которыи позволял бы отнести ту или иную клеточную линию к определенной фенотипической группе. В начале мы использовали метод прививки клеток сингенным животным с последующей оценкой таких параметров, как: 1) прививаемость (Р), 2) средняя скорость роста опухолей (Ij), 3) латентный период возникновения опухолей (I2) и 4) скорость гибели животных (I), на основе которых выводили индекс опухолеродности Т (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Индекс опухолеродности in vivo клеток линии FCBA2._

Клеточная линия

FCBA2.5.2.2

ООО

N/A

ООО

FCBA2V10.1

1 00

73 78*563

93 34 ± 21 92

73 60 ± 2 15

80 24 ± 9 90

FCBA2V40

1 00

100 00 ±12 36

82 89±17 31

100 00 ± 4 35

94 30 ± 11 34

FCBA2V40.2

1 00

75 71 ±10 79

68 53 ±19 53

82 15 ±4 66

75 46 ± 11 66

FCBA2V40.2.1

0 95

72 55 ± 9 02

62 48 ± 8 74

72 69 ±2 11

65 78 ± 6 29

FCBA2V40.2.6.1

1 00

67 52 ±16 15

54 49 ± 4 33

60 53 ±9 56

60 85 ±10 01

FCBA2V10.23.2

0 00

N/A

0 00

FCBA2V10.23.2.5

0 00

N/A

0 00

FCBA2V40.1.2

0 00

№А

N/A

0 00

FCBA2V40.3.1

1 00

<10 00

Таблица 2. Индекс опухолеродности in vivo клеток линий FC3H.

Клеточная линия Р I. h h Т

FC3H5 0 00 N/A N/A N/A 0 00

FC3H8 0 00 N/A N/A N/A 0 00

FC3H31.1.2.2 004 - - - <10 00

FC3H31.1.4.2 0 05 - - - <10 00

FC3H31.2.6.3 0 08 - - - <10 00

FC3H31.2.6.4 006 - - - <10 00

FC3H34.18 1 00 3 83 ± 0 31 100 00 ±6 83 18 42 ±0 84 40 75 £ 2 66

FC3H3V7.33.7 1 00 86 96 ± 21 30 46 15 ±1 78 66 97 ± 4 18 66 69 ± 9 09

FC3H3V7.33.7.1 0 95 100 00 ± 21 30 24 00 ± 0 96 3311 ±022 49 75 ± 7 12

FC3H3V7.29.1 1 00 91 30 ±14 78 33 33 ± 1 30 100 00 ±4 00 74 88 ±6 69

FC3H34V2M.9 1 00 65 22 ±10 87 30 00 ± 0 75 80 65 ± 6 95 58 62±6 19

FC3H3V7.20.2.4 0 00 N/A N/A N/A 0 00

FC3H3V7.33.7.2 086 73 91 ±17 39 12 24 ± 0 30 2841 ±182 32 84 ± 5 59

FC3H3V7.29.1.4 0 83 60 87 ±13 04 8 57 ± 0 42 22 73 ± 1 79 25 50 ± 4 22

FC3H3V7.29.1.6 1 00 73 91 ±19 57 14 29 ±0 63 32 89 ± 1 87 40 36 ± 7 36

FC3H3V7.10 Н 000 N/A N/A N/A 000

Полученные индексы, несмотря на репрезентативность, позволяют оценить опухолеродность клеток весьма приблизительно в силу нескольких причин, одна из которых — различная иммуногенность клеток, а другая - феноти-пическая нестабильность клеточных линий. Таким образом, для более адекватной оценки опухолеродности клеточных линий и клонов необходимо оценивать не только параметры их роста in vivo, по и такие основные свойства, характерные для роста in vitro, как контактное торможение (С) и способность роста в округлом состоянии (AIG), на основании которых мы вывели индекс трансформированости in vitro (Ту„) (табл. 3,4).

Таблица 3. Степень контактного торможения (С) и способность к росту в округлом состоянии (AIG) in vitro клеток линии FCBA2.

Из данных, приведенных в таблицах 3 и 4 видно, что способность к контактному торможению есть сугубо количественный признак и, в той или иной степени, он присущ всем клеточным линиям и клонам, даже злокачественным. Можно также отметить, что существует два альтернативных механизма реверсий. Первый - через восстановление контактного торможения до того уровня, когда клетки перестают делиться, достигнув конфлюэнтности, и второй вариант - через потерю способности к росту в неприкрепленном состоя-

нии, когда клетки, достигшие конфлюэнтности, не останавливаются полностью, а замедляют свое деление, а те из них, которые выходят во второй слой, начинают апоптировать. В целом все ревертанты абсолютно не способны к многослойному росту in vitro и, соответственно, имеют рейтинг злокачественности (Т,*г) равный нулю. Аналогично ревертантам, клетки, находящиеся на начальных этапах трансформации, также имеют TVfr равный нулю. Исключение составили только клоны 31.2.2 и 31.4.2, которые, несмотря на неспособность расти многослойно, тем не менее не апоптировали в отсутствие контактов с субстратом.

На заключительной стадии данного этапа работы мы вывели общий индекс злокачественности который рассчитывался как среднее арифметическое от соответствующих индексов in vivo и in vitro (рис. 1).

2. Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантпых линиях и клонах in vitro и in vivo.

Известно, что в процессе трансформации многие клетки приобретают такое свойство, как повышенный уровень синтеза различных ростовых факторов. С другой стороны, направленное подавление экспрессии в злокачественных клетках тех или иных ростовых факторов во многих случаях приводит к реверсии опухолевого фенотипа. Мы решили оценить, как меняется экспрессия ростовых факторов при реверсии. Поскольку основным механизмом, регулирующим количество того или иного белка в клетке, является контроль на уровне транскрипции соответствующего гена, мы решили сравнить методом RT-PCR количество мРНК девяти основных ростовых факторов в злокачественных и ревертантных клетках нашей модели. Для работы мы взяли несколько злокачественных клеточных линий и клонов трех, независимо полученных сарком (FCBA2V40, FC3H3V7 и FC3H4V8), от 1 до 2 соответствующих ревер-тантов, а также нормальные эмбриональные фибробласты мышей СВА и клетки гепатомы МН22а (табл. 5).

Таблица 5. Клеточные линии и клоны, использованные в экспериментах по оценке интенсив-ности транскрипции генов основных ростовых факторов.

№ Название клона, ливни Краткая характеристика клона, ливни

1 FCBA2V40 неклоннровакная матричная культура злокачественных клеток

2 FCBA2V10.23.2 неопухолевый ревертантный клон

3 FCBA2V10.23.2.5 неопухолевый ревертантный клон

4 FC3H3V7.33.7 злокачественный клон

5 FC3H3V7.29.1 злокачественный клон

6 FC3H3V7.20.2.4 неопухолевый ревертантный клон

7 FC3H3V7.10.H неопухолевый ревертантный клон

8 FC3H4V8.5.5.3 злокачественный клон

9 FC3H4V8.5.6.4 неопухолевый ревертантный клон

10 FCBA0 культура нормальных эмбриональных фнбробластов мышей СВА

11 МН22а неклониро ванная матричная культура гепатомы мышей СЗН

Данные, приведенные на рис.2 (номера дорожек соответствуют номерам клеточных линий, приведенных выше), показывают, что в целом транскрипция исследованных ростовых факторов в злокачественных и ревертантных клетках носит случайный характер и практически не коррелирует с определенным фенотипом. Единственным ростовым фактором, характер экспрессии которого более или менее укладывался в рамки нашей гипотезы, оказался гепатоцитарный ростовой фактор (HGF). Экспрессия HGF была значительно снижена в ревертантных клонах линий FCBA2 и FC3H3 по сравнению с их злокачественными аналогами. Отсутствие мРНК HGF в злокачественных клетках МН22а объясняется, по-видимому, их эпителиальным происхождением, а практически неопределяемый уровень этой мРНК в клетках клонов 29.1 и 5.5.3 - недостаточной концентрацией кДНК.

РСПЧ „

0 900 . 0 «00 0 700 0 600 0 500 0 400 0 300 0200 О 100 0 000

§'¿¿51

I 400

иоо 1000 О 100 0 600 0 400 0.200 . 0 000

юы

йяЙЙВйПаа

12Э4567891011

0 600 . озоо.

0400 0.300 . 0.200 . О 100 ^ 0000 1й-а

РЕЮТ-В

1(00 1400 1200 1 ООО О «00 0 600 0 400 0.200 0 000

тсгр

■•.•«•-г*-*.

Р-асНп

. ¿»т.*. ' ^«'ЬУМТ'М •Т^яСи-

12345 676 9 Ю и

Рнс.2. Относительное содержание мРИК ростовых факторов в нормальных (светлые столбцы), злокачественных (темные столбцы) и ревертантных (серые столбцы) клетках мышей. Приведены средние от нормированных значений интенсивности свечения полос на электрофореграмме со стандартной ошибкой.

Основываясь на полученных по ростовым факторам данных, мы спланировали дальнейшую работу следующим образом:

1. Расширить используемую панель клеток;

2. Сравнить злокачественные и ревертаигные клетки по экспрессии рецепторов уже исследованных ростовых факторов;

3. Исследовать экспрессию HGF на расширенной панели клеток;

Расширить панель исследуемых клеток мы решили за счет дополнительно взятых клеток-предшественников и большего количества злокачественных и ревертантных клонов и линий. Кроме того, некоторые злокачественные линии были привиты сингенным мышам и клетки образовавшихся опухолей также были взяты для экспериментов. В результате получилось 2 панели клеток: панель СВА и панель СЗН (табл. 6,7).

Таблица 6. Клеточные линии и клоны FCBA.

Л*« Название клона, линии Краткая характеристика клона, линия

1 FCBA0 культура нормальных фиброблнстов мышей СВА

2 FCBA2.5.2.2 неопухолевый клон-предшественник

3 FCBA2V40 матричная культура злокачественных клеток, in vitro

4 FCBA2V40 клетки, взятые из опухоли in vivo

5 FCBA2V40.2 злокачественный клон, т vitro

6 FCBA2V40.2 клетки, взятые из опухоли in vivo

7 FCBA2V10.1 злокачественный клон, in vitro

8 FCBA2V10.1 клетки, взятые из опухоли in vivo

9 FCBA2V40.2.1 злокачественный клон, in vitro

10 FCBA2V40.2.1 клетки, взятые из опухоли in vivo

11 FCBA2V40.2.6.1 злокачественный клон, in vitro

12 FCBA2V40.6.1 клетки, взятые из опухоли in vivo

13 FCBA2V10.23.2 неопухолевый ревертантный клон

14 FCBA2V10.23.2.5 неопухолевый ревертантный клон

15 FCBA2V40.1.2 неопухолевый ревертантный клон

16 FCBA2V40.3.1 неопухолевый ревертантный клон

Таблица 7. Клеточные линии и клоны FC3H.

№ Название клона, линия Краткая характеристика клона, линии

1 FC3H0 культура нормальных фибробластов мышей СЗН

2 FC3H5 матричная линия неопухол. иммортализованных фибробластов

3 FC3H8 матричная линия неопухол. иммортализованных фибробластов

4 FC3H3.1.6.4 неопухолевый клон-предшественник

S FC3H3.4.18 слабо злокачественный клон-предшественник

6 FC3H3V7.33.7 злокачественный клон, т vitro

7 FC3H3V7.33.7.1 злокачественный клон, in vitro

8 FC3H3V7.29.1 злокачественный клон, in vitro

9 FC3H3.4V2M.9 злокачественный метастаз ирующий клон, in vitro

10 FC3H3V7.33.7 клетки, взятые из опухоли in vivo

11 FC3H3V7.29.1 клетки, взятые из опухоли in vivo

12 FC3H3.4V2M.9 клетки, взятые из опухоли in vivo

13 FC3H3V7.20.2.4 неопухолевый ревертантный клон

14 FC3H3V7.33.7.2 неопухолевый ревертантный клон

15 FC3H3V7.29.1.4 неопухолевый ревертантный клон

16 FC3H3V7.29.1.6 неопухолевый ревертантный клон

17 FC3H3V7.10.H неопухолевый ревертантный клон

Папель СВА

Панель СЗН

^ * * ¿ч * -

г НСга

** - V

ТСТРКожригТУреЗ

ЕбРЯ

зЙа

ТОП1

г£

1 <1 * к ^^ 4

12 345 6 7 в9Ю1112иМ1516

РисОтносительное содержание мРНК рецепторов ростовых факторов в нормальных (светлые столбцы), злокачественных (темные столбцы) и ревертантных (серые столбцы) клетках мышей. Приведены средние от нормированных значений интенсивности свечения полос на электрофоре грамме со стандартной ошибкой.

На указанных клетках были исследованы уровни транскрипции следующих рецепторов ростовых факторов: БОРЫ, НОРЫ, ТвБрЯ тип 3, ЮРЫ-2 (рис.3), а также ТСРРЯ типы 1 и 2, ЮРК-2, РОРК-1 и РОвРКа (данные не приведены). Как видно из представленных диаграмм, профиль транскрипции исследованных генов носит, как и в случае с мРНК ростовых факторов, скорее спорадический характер и, за исключением мелких деталей, не позволяет выявить принципиальных корреляций с опухолевым потенциалом клеток, поэтому дальнейшие усилия мы сконцентрировали на изучении HGF (рис.4).

Приведенные данные принципиально полностью совпали с ранее полученными. Видно, что клетки, обладающие неопухолевым фенотипом (либо находящиеся на ранних стадиях трансформации, либо претерпевшие процесс реверсии), характеризуются достаточно низким, по сравнению со злокачественными, количеством мРНК HGF. Единственным исключением оказались клетки клона 31.6.4. Более того, практически у всех злокачественных линий и клонов наблюдалось достоверное увеличение количества данной мРНК в клетках, взятых из опухолей, выросших у сингенных животных после прививки (in vivo), по сравнению с теми же клетками, взятыми из культуры in vitro. Эти данные позволили сформулировать несколько положений, которые мы в дальнейшем использовали как рабочие гипотезы:

1. Реверсия опухолевых клеток нашей модели связана с подавлением экспрессии мРНК HGF;

2. Постоянная активация рецептора HGF является ключевым событием при потере клетками нашей модели контактного торможения и зависимости от внеклеточного матрикса (т.н. "Anchorage-independent growth");

3. Уровень транскрипции мРНК HGF увеличивается в ответ на внешние условия, имеющиеся в системе in vivo и отсутствующие in vitro. При этом, однако, надо отметить, что злокачественные клетки линии FC3H3, в отличие от клеток линии FCBA2, продемонстрировали значительную вариабельность по данному признаку как in vitro, так и in vivo. Мы обнаружили существенные различия не только между клетками, находящимися на разных стадиях озлокачествления (например, слабозлокачественный клон 34.18 и высокозлокачественный клон 33.7), но и между клонами, практически не отличающимися по своей злокачественности (клоны 33.7 и 29.1). Мы предположили, что такой феномен целиком связан с гетерогенностью популяций клеток in vitro, которая полностью исчезает в клетках опухолей in vivo.

Таким образом, полученные данные вполне подтверждают состоятельность наших рабочих гипотез. Единственным исключением из этих правил оказались клетки клона 31.6.4. Имевшихся у нас данных было недостаточно для разумного объяснения данного феномена, поэтому мы решили исследовать ряд дополнительных клонов, имеющих общее с 31.6.4 происхождение и представляющих две контрастные группы, отличающиеся по степени контактного торможения. Кроме уже указанных четырех клонов FC3H3 мы взяли две клеточные линии FBalb, а именно: злокачественную матричную культуру FBaV10 и её ревертантный клон FBaV10.6.4. В конечном итоге эта клеточная панель выглядела следующим образом:

Как видно из приведенных результатов (рис.5), вариации по количеству мРНК обоих рецепторов были весьма незначительны и, в целом, вполне соог-ветствовали ранее полученным. Данные по количеству мРНК HGF в клетках линии FBalb также вполне укладывались в общую картину с ранее полученными результатами, а именно: злокачественные клетки содержали указанной мРНК больше, чем их ревертантные аналоги. Особенный интерес для нас имели данные о содержании мРНК HGF в клонах серии FC3H31. Здесь мы наблюдали четкую корреляцию с количеством HGF и способностью клеток входить в GO при контактном торможении. Так клоны 31.6.4, 31.6.3 и 31.4.2, которые содержали очень высокое количество данной мРНК, при контактном торможении были неспособны входить в классическую GO фазу, в то время как клетки клона 31.2.2, напротив, отличались низким (более чем в 3.5 раза) количеством мРНК и легко переходили в GO при достижении конфлюэнтности .

Таким образом, приведенные данные позволяют нам сделать несколько выводов:

1. Реверсия опухолевых клеток к неопухолеродному фенотипу сопровождается значительным (до 130 раз) снижением мРНК гепатоцитарного ростового фактора. Такие данные были получены для трех, независимо полученных клеточных линий фибробластического происхождения.

2. Для иммортализованных клеточных линий и клонов, находящихся на ранних этапах трансформации (неопухолевые клетки-предшественники), существует жесткая корреляция между количеством мРНК HGF и способностью клеток к переходу в GO фазу при достижении конфлюэнтного монослоя (контактном торможении), причем способность клеток к переходу в GO находится в обратной зависимости от количества такой мРНК. Эти данные были получены для четырех, независимо полученных клеточных линий фибробластического происхождения - FCBA2, FC3H3, FC3H5 и FC3H8.

3. Для опухолевых клеточных линий и клонов характерно увеличение (до 9 раз) количества мРНК HGF в клетках опухолей, выросших у сингенных животных (in vivo) по сравнению с теми же клетками, взятыми из культуры in vitro. Такие данные были получены практически для всех опухолевых линий и клонов (кроме FCBA2V40, для которых не было показано достоверных отличий), которые были исследованы в этих двух состояниях.

Однако все приведенные факты касаются только мРНК HGF. Поэтому для подтверждения значимости найденных нами существенных различий между опухолевыми и псевдонормальными клеточными линиями и клонами по содержанию мРНК HGF мы проанализировали некоторые из них на предмет содержания белкового продукта данного гена, а также его рецептора.

3.3. Сравнение злокачественных и псевдонормальных клеток по содержанию белковых продуктов исследованных генов.

Для анализа белковых продуктов HGF и HGFR мы выбрали несколько клеточных линий и клонов так, чтобы в полученной выборке были представлены как злокачественные, так и ревертантные клетки FCBA2 и FC3H3. В результате панели клеток выглядели следующим образом:

Липия FCBA2:

Ливия FC3H3:

1. V40 in vitro;

2. V40.2 in vitro;

3. V40.6.1 In vitro;

4. V40.6.1 In vivo;

5. 23.2;

6. V40.1.2;

1. 31.6.4;

2. 33.7;

3. 29.1;

4. 20.2.4;

5. 10.H;

Результаты экспериментов в виде диаграмм приведены на рисунке 6, при этом для удобства мы привели данные, как по белку, так и по мРНК. Полученные результаты показали, что разницы по содержанию белка в исследо-занных клетках крайне незначительны (не более 2-х раз). Принимая во внимание то, что использованный нами метод позволяет определять только общее содержание определенного белка на клетку, а не его концентрацию, мы предположили, что указанные различия могут быть связаны с размером клеток. Так, например, при визуальном анализе клетки клона 31.6.4 выглядят раза в 1.5-2 крупнее, чем клетки 20.2.4 или ЮЛ, что приблизительно соответствует разнице в количестве белка. Исходя из этого, мы предположили, что концентрация НОБ в исследованных клетках практически одинакова и не коррелирует с количеством мРНК. Аналогичные результаты мы получили и для рецептора НОБ. Как видно из рисунка, профили этих двух белков (НОБ и НОБЯ) практически полностью совпадают при почти полном отсутствии какой-либо корреляции с количеством мРНК. То есть, активно делящиеся клетки, как злокачественные, так и незлокачественные, практически не отличаются между собой по концентрациям белковых продуктов НОБ и его рецептора.

Ранее мы говорили о корреляции между количеством мРНК НОБ и способностью клеток к контактному торможению. Мы решили проверить, как изменяется количество белка в псевдонормальных клетках при переходе в фазу ОО, обусловленную контактным торможением. Для этого мы взяли два клона: 23.2 и У40.1.2, характеризующиеся высокой степенью контактного торможения. Клетки этих клонов были исследованы в двух состояниях:

1. Состояние активного деления (предконфлюэнтный монослой);

2. Состояние покоя (2 суток в конфлюэнтном монослое).

Как видно из рисунка 7, популяция клеток, находящихся в состоянии контактного торможения, характеризуется тем, что:

1. Большая часть клеток (до 70%) практически полностью теряет НОБ;

2. Оставшаяся часть клеток содержит на ~25% меньше указанного белка. Мы предположили, что снижение уровня НОБ необходимо для перехода клеток в ОО. Однако возник вопрос, почему при приблизительно одинаковом содержании НОБ у ревертантов и трансформированных клеток первые, тем не менее, способны к контактному торможению, а вторые - нет. По-видимому, основной причиной этого являются различия в количестве соответствующей мРНК. Возможно, того количества мРНК, которое имеется у ревертантов, достаточно для эффективного синтеза необходимого количества НОБ в делящихся клетках, которое приблизительно одинаково и для ревертантов, и для трансформированных клеток, а по достижении конфлюэнтности в клетках

запускаются механизмы, подавляющие синтез соответствующих белков. В результате, синтез HGF в ревертантах практически полностью подавляется, в то время, как у трансформированных клеток, за счет значительно более высокого уровня мРНК, данный белок продолжает нарабатываться в количествах, достаточных для пролиферации даже в условиях конфлюэнтности.

Рис.б. Относительное содержание белка и мРНК гепатоцитарного ростового фактора и его рецептора в злокачественных клетках in vitro (серые столбцы), in vivo (темно-серые столбцы) и неопухолсвых клетках (светло-серые столбцы). Количество белка рассчитывалось как интенсивность флюоресценции FITC-конъюгированных антител по данным проточной цитофлюориметрии. Для мРНК приведены те же значения, что и на рисунках 3 и 4, но без стандартной ошибки.

Рис7. Результаты проточной цитофлюориметрии клеток клонов 232 (вверху) и У40.1.2 (внизу), окрашенных антителами против НОЕ. Пунктирный профиль соответствует контролю (только вторые антитела), сплошной профиль - эксперименту (первые АТ + вторые АТ). М1 - маркер окрашенной субпопуляции клеток.

Таким образом, переход клеток в фазу GO при контактном торможении сопровождается снижением количества белка HGF, причем часть клеток теряет этот белок полностью, а оставшиеся содержат его на 20-25 % меньше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реверсия злокачественных клеток к псевдонормальному фенотипу связана со значительными изменениями в их пролиферативной активности, способности к контактному торможению и зависимости от внеклеточного мат-рикса. Мы предположили, что реверсия может быть связана с изменениями на уровне экспрессии одного или нескольких ростовых факторов или их рецепторов, как наиболее вероятных кандидатов, которые с одной стороны характеризуются достаточно высокой эпигенетической лабильностью, а с другой - обеспечивают тонкую модуляцию клеточной пролиферации и дифференцировки.

Результаты, представленные в работе, в целом подтверждают данную гипотезу, хотя и не могут быть признаны абсолютным ее доказательством. Наличие четкой корреляции между количеством мРНК гепатоцитарного ростового фактора и фенотипом клеток, а именно крайне высокое ее содержание у опухолевых клеток и практически полное отсутствие у ревертантов, безусловно говорит в пользу нашего предположения. С другой стороны, несколько типично неопухолевых клонов нашей модели отличаются крайне высоким, сравнимым с таковым у злокачественных клеток, содержанием данной мРНК. Мы предположили, что высокий уровень мРНК НОБ является необходимым, но не достаточным условием наличия трансформированного фенотипа. Анализ не-опухолеродных клонов, различающихся по содержанию мРНК НОБ, показал, что клоны с высоким уровнем данной мРНК были неспособны к эффективному контактному торможению. Более того, мы обнаружили, что при переходе клеток в фазу ОО, обусловленную контактным торможением, наблюдается значительное снижение в количестве белка НОБ по сравнению с делящимися клетками. При этом, однако, достоверных отличий между активно пролифери-рующими опухолевыми и неопухолевыми клетками по содержанию белкового продукта НОБ обнаружено не было. Мы предположили, что указанный эффект связан с наличием неких механизмов, регулирующих эффективность трансляции мРНК НОБ на разных этапах клеточного цикла.

Для объяснения отсутствия заметного эффекта экзогенного НОБ и антител против е-Ме! на неопухолевые клоны мы предложили две альтернативные гипотезы. Одна из них предполагает, что клетки нашей модели обеспечивают функциональную аутокринную "петлю" за счет повышенного синтеза НОБ, а нечувствительность к антителам против е-Ме! объясняется тем, что данная петля реализуется через стимуляцию внутриклеточных форм рецепторов. Другая гипотеза предполагает отсутствие какой либо чувствительности исследованных клеток к НОБ, а снижение количества соответствующей мРНК является лишь маркером процесса реверсии, а не ее причиной. Однако, в любом случае, полученные результаты представляются весьма ценными, т.к. в будущем могут помочь в идентификации факторов транскрипции, отвечающих за такой характер экспрессии НОБ и, соответственно, других генов, экспрессия которых регулируется аналогично НОБ.

выводы

1. Предложен метод количественной оценки степени трансформации клеток на основании их ростовых характеристик in vitro и in vivo.

2. Показано, что in vitro реверсия опухолевых клеток трех независимо полученных сарком FCBA2, FC3H3 и FBalb/c к псевдонормальному фенотипу сопровождается значительным, до 100 раз, снижением количества мРНК гепатоцитарного ростового фактора.

3. Количество мРНК HGF увеличивается в клетках опухолей, выросших in vivo по сравнению с теми же клетками, взятыми из культуры in vitro.

4. Показано, что клетки, содержащие повышенное количество мРНК HGF не способны к эффективному контактному торможению.

5. Активно делящиеся клетки, как злокачественные, так и незлокачественные, практически не отличаются между собой по концентрациям белковых продуктов HGF и его рецептора, а концентрации белкового продукта EGFR нельзя связать с каким-либо признаком.

6. Переход клеток в фазу GO при контактном торможении сопровождается снижением количества белка HGF, причем часть популяции теряет этот белок полностью, а оставшиеся клетки содержат его на 20-25% меньше.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Lavrovsky Y.V., Svinarchuk F.P., Lavrovsky УЛ., Yefremov Y.R., Vlassov V.V., 1993. "c-fos gene expression in cell revertants from a transformed to a pseudonormal phenotype." FEBSLetters 316,161-164.

2. Lavrovsky Y., Yefremov Y., Lavrovsky V., 1994. "The reversion of nighly tumorigenic cell lines to non-tumorigenic phenotype is associated with c-jun down-expression." FEBS Letters 356,212-214.

3. Лавровский В.А., Чагин A.C., Субханкулова Т.Н., Ефремов Я.Р., 1999. "Интернализация комплекса «ростовой фактор - рецептор», инициируемая антителами, вызывает апоптоз клеток in vitro. " Отчетная сессия Института Цитологии и Генетики СО РАН. Труды 1999г. 217-223.

4. Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н., Лавровский В.А. "Временная реверсия фенотипа опухолевых клеток к неопухолеродному фенотипу как модель для изучения молчащего метастазирования." Тезисы докладов и сообщений представленных на Международный симпозиум "Биология клетки в культуре" (Санкт-Петербург, 16-18 октября 2001 г.). Опубликовано в: Цитология, 43, 859.

5. Лавровский В Л., Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н., Мануйлов В.А., Хрипко Ю.И., 2002. "Случайное распределение уровня экспрессии ростовых факторов у злокачественных и ревертантных клонов мышиных и человеческих опухолей." Цитология 44,702-711.

Подписано к печати 30.04.2004 г. Формат бумаги 60x90 1/16. Печ. л. 1. Уч.-изд. л. 0,7 Тираж 100 экз. Заказ 49.

Ротапринт Института Цитологии и Генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Трансформация клеток и приобретение ими опухолевого фенотипа.

1.1.1. Молекулярные аспекты иммортализации.

1.1.2. Контактное торможение.

1.1.3. Рост в неприкрепленном состоянии, анойкис.

1.2. Реверсия опухолеродных клеток к неопухолеродному фенотипу.

1.2.1. Индуцированные реверсии.

1.2.2. Спонтанные реверсии .'.

1.2.3. Спонтанные реверсии как источник дремлющих метастазов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клеточные линии и культуры.

2.1.1. Оценка роста клеток в сингенных животных.

2.1.2. Оценка контактного торможения клеток по включению 3Н-тимидина.

2.1.3. Оценка способности клеток к росту в неприкрепленном состоянии.

2.2. Выделение суммарной РНК из клеток.

2.3. ДНКазная обработка и анализ выделенной РНК.

2.4. Обратная транскрипция.

2.5. Определение относительных концентраций полученной кДНК методом полуколичественного ПЦР.

2.6. Сравнение уровней экспрессии исследованных генов в различных клетках методом полуколичественного ПЦР.

2.7. Математическая обработка полученных данных.

2.8. Проточная цитофлюорометрия.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Сравнение ростовых характеристик злокачественных и ревертантных линий и клонов in vitro и in vivo.

3.1.1. Оценка опухолеродности клеток по росту опухолей в сингенных животных.

3.1.2. Оценка опухолеродности клеток по основным параметрам роста in vitro.

3.2. Сравнение уровней мРНК различных ростовых факторов и их рецепторов в злокачественных и ревертантных линиях и клонах in vitro и in vivo.

3.2.1. Оценка уровней синтеза мРНК основных ростовых факторов клетками in vitro

3.2.2. Оценка уровней синтеза мРНК рецепторов ростовых факторов клетками in vitro и in vivo.

3.2.3. Оценка уровней синтеза мРНК Гепатоцитарного Ростового Фактора (HGF) опухолевыми и псевдонормальными клетками in vitro и in vivo.

3.3.1. Сравнение опухолевых и псевдонормальных клеток, находящихся в логарифмической фазе роста, по содержанию белковых продуктов HGF, HGFR и EGFR.

3.3.2. Сравнение количества белкового продукта HGF в псевдонормальных клетках, находящихся в логарифмической фазе роста и в GO, обусловленной контактным торможением (конфлюэнтные клетки).

3.4. Реакция клеток на HGF, EGF и PDGF АА.

3.4.1. Эффективность спасения клеток от алоптоза в присутствии HGF, EGF и PDGF АА.

3.4.2. Влияние антител против рецептора HGF на пролиферацию и апоптоз клеток

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу"

Актуальность исследования. Одной из наиболее серьезных проблем клинической онкологии является метастазирование опухолей и, особенно, молчащее метастазирование. Молчащие (дремлющие) метастазы практически не поддаются ранней диагностике, а клетки таких метастазов отличаются повышенной резистентностью к различным типам противоопухолевой терапии. Указанные проблемы являются следствием того, что метастазировавшие клетки очень долгое время способны находиться в состоянии покоя (GO). Данный феномен представляется труднообъяснимым в рамках классической теории канцерогенеза, которая гласит, что трансформированная клетка теряет все основные механизмы негативного контроля клеточного цикла и, соответственно," не способна прекращать деление. Однако, более поздние трактовки данной теории говорят о том, что злокачественность является количественным признаком и, соответственно, клетки могут не только прогрессировать по данному признаку, но и самопроизвольно возвращаться (ревертировать) к исходному фенотипу. Первые работы относительно возможности таких реверсий появились около 25 лет назад, однако, только в начале 90-х годов прошлого века было показано, что способность к спонтанной реверсии является универсальным свойством практически всех опухолевых линий in vitro. Более того, было показано, что спонтанные реверсии являются скорее результатом эпигенетических изменений, чем изменений на уровне генома. В пользу данного утверждения свидетельствуют высокие (в некоторых случаях до 50%), не сопоставимые с мутационными, частоты появления таких ревертантов.

Реверсия злокачественных клеток к неопухолевому фенотипу сопровождается i восстановлением основных механизмов, регулирующих пролиферацию нормальных клеток, таких как: контактное торможение, зависимость от ростовых факторов и внеклеточного матрикса, апоптоз. Однако, такие ревертанты обладают неустойчивым фенотипом и способны вторично трансформироваться через различные промежутки у времени, а их прививка сингенным животным приводит, с определенной вероятностью, к возникновению опухолей через достаточно длительный латентный период (сопоставимый с таковым при молчащем метастазировании). Поэтому, в случае ревертантов говорят не о нормальном, а о псевдонормальном фенотипе. Таким образом, источником дремлющих метастазов, по-видимому, являются опухолевые клетки, временно ревертировавшие к псевдонормальному фенотипу.

На данный момент времени практически ничего не известно о механизмах таких реверсий, и исследования в этой области могут дать ключ не только к пониманию неких фундаментальных законов клеточной биологии, но и дать толчок к развитию новых методов прогнозирования, диагностики и эффективной терапии молчащих метастазов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является исследование эпигенетических изменений, сопровождающих процесс реверсии клеток in vitro, что и определило следующие задачи:

2. Проследить изменения в интенсивности синтеза мРНК наиболее универсальных ростовых факторов и их рецепторов,. как основного инициирующего звена в формировании пролиферативных характеристик клеток, при изменении степени трансформированности как в сторону увеличения (опухолевая прогрессия), так и в сторону уменьшения (реверсия).

Научная новизна. Представляемая работа является первой попыткой выяснить, как изменяется экспрессия ростовых факторов и их рецепторов при спонтанной реверсии опухолевых клеток к псевдонормальному фенотипу с использованием наиболее адекватной для поставленных задач экспериментальной клеточной модели, которая на данный момент является уникальной.

Теоретическая значимость. Выявлены эпигенетические изменения, сопровождающие процесс реверсии опухолевых клеток фибробластического происхождения к псевдонормальному фенотипу. Даны оценки закономерностей между интенсивностью синтеза мРНК и белкового продукта гена HGF и формированием определенного фенотипа исследованных клеток, который оценивался по таким параметрам, как контактное торможение роста и зависимость от внеклеточного матрикса.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Ефремов, Ярослав Рейнгольдович

выводы

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реверсия злокачественных клеток к псевдонормальному фенотипу связана со значительными изменениями в их пролиферативной активности, способности к контактному торможению и зависимости от внеклеточного матрикса. Теоретически, такие изменения могут бьггь связаны с любым звеном в сигнальных каскадах клетки, однако на практике, по-видимому, реализуются преимущественно те, которые связаны с наиболее лабильными в эпигенетическом плане генами и их белковыми продуктами. Такое предположение косвенно подтверждается с одной стороны достаточно высокими, до 45%, частотами появления ревертантных клонов [Lavrovsky et al., 1992; Ефремов и др., 2001; Лавровский и др., 2002], а с другой - количественным характером, признака злокачественности. Исходя из этого, было логично предположить, что реверсия может быть связана с изменениями на уровне экспрессии одного или нескольких ростовых факторов или их рецепторов, как наиболее вероятных кандидатов, которые с одной стороны характеризуются достаточно высокой эпигенетической лабильностью, а с другой - обеспечивают тонкую модуляцию клеточной пролиферации и дифференцировки.

Результаты, представленные в данной работе, в целом подтверждают высказанную гипотезу, хотя и не могут быть признаны абсолютным ее доказательством. Наличие четкой корреляции между количеством мРНК гепатоцитарного ростового фактора и фенотипом клеток, а именно крайне высокое ее содержание у опухолевых клеток и практически полное отсутствие у ревертантов, безусловно говорит в пользу нашего предположения. С другой стороны, несколько типично неопухолевых клонов нашей модели отличаются крайне высоким, сравнимым с таковым у злокачественных клеток, содержанием данной мРНК. Мы предположили, что высокий уровень мРНК HGF является необходимым, но не достаточным условием наличия трансформированного фенотипа. Очевидно, что процесс трансформации связан с изменением очень большого набора клеточных характеристик, которые заключаются не только в усилении пролиферативных аутокринных сигналов, но и в ослаблении или полной потере антипролиферативных сигналов [Hanahan, Weinberg, 2000]. Таким образом, в рамках нашей теории первичная трансформация, сопровождаемая множественными изменениями, является более длительным и сложным процессом, чем реверсия или вторичная трансформация, которые могут быть результатом изменений значительно меньшего числа параметров.

Безусловно, рассматривать реверсию как простое снижение в уровне митогенных сигналов, опосредуемых ростовыми факторами, а в данном конкретном случае одним ростовым фактором, было бы несколько наивно. Очевидно, что формирование псевдонормального фенотипа является следствием более сложного, комплексного эффекта, который приводит, в частности, к восстановлению зависимости от внеклеточного матрикса. В этом плане интересно рассмотреть не митогенную, а мотогенную функцию ростовых факторов. Известно, что многие ростовые факторы в той или иной мере увеличивают подвижность клеток-мишеней [Rosen, Goldberg, 1989], однако только HGF и EGF обладают достаточно сильным эффектом и наиболее часто ассоциированы с инвазивным фенотипом [Wells, 2000]. Соответственно, подавление экспрессии HGF может приводить не только к снижению скорости пролиферации, но и к снижению подвижности клеток, которая регулируется посредством тех же механизмов, что и зависимость от внеклеточного матрикса и контактное торможение.

Анализ неопухолеродных клонов, различающихся по содержанию мРНК HGF, подтвердил, что клоны с высоким уровнем данной мРНК были неспособны к эффективному контактному торможению. Более того, мы показали, что при переходе у клеток в фазу G0, обусловленную контактным торможением, наблюдается значительное снижение в количестве белка HGF по сравнению с делящимися клетками. При этом, однако, достоверных отличий между активно пролиферирующими опухолевыми и неопухолевыми клетками по содержанию белкового продукта HGF обнаружено не было. Мы предположили, что указанный эффект связан с наличием неких механизмов, регулирующих эффективность трансляции мРНК HGF на разных этапах клеточного цикла. По-видимому, активно пролиферирующие клетки характеризуются достаточно высокой эффективностью трансляции указанной мРНК. В результате HGF нарабатывается в достаточных количествах не только в клетках с высоким содержанием соответствующей мРНК (опухолевые и некоторые неопухолевые клетки), но и в ревертантах, которые содержат ее на 1-2 порядка меньше. Однако когда клетки достигают конфлюэнтности, то запускаются определенные механизмы, блокирующие трансляцию соответствующих мРНК, в том числе и мРНК HGF. В результате клетки с низким содержанием данной мРНК начинают постепенно терять соответствующий белок и спокойно переходят в GO, а клетки с высоким содержанием продолжают нарабатывать HGF в количествах, достаточных для продолжения пролиферации.

Таким , образом, значительное снижение мРНК HGF представляется вполне достаточным для реверсии событием за одним исключением: все описанные эффекты HGF распространяются только на клетки эпителиального происхождения, в то время как фибробласты, являющиеся его источником, сами к нему практически нечувствительны [Stoker, Gherardi, 1989]. Однако данный феномен относится только к нормальным диплоидным фибробластам и некоторым неопухолевым линиям фибробластического происхождения типа ЗТЗ, хотя и на этот счет имеются достаточно противоречивые данные. С одной стороны показано, что нормальные человеческие фибробласты in vitro не экспрессируют HGFR вообще [Kawaguchi et al., 2002], а с другой стороны Vande Woude с сотрудниками показали изменение фенотипа клеток NIH ЗТЗ in vitro под'воздействием гельдамицинов (антибиотики из группы анизамицина), которые подавляют экспрессию с-Met (HGFR) [Webb et al, 2000]. Более того, Hirohashi с сотрудниками показали, что человеческие миофибробласты in vitro экспрессируют и HGF/SF, и c-Met не только на уровне мРНК, но и на уровне зрелого белка [Tokunou et al., 2000]. Результаты, полученные в нашей лаборатории также подтверждают, что эмбриональные фибробласты, как мышиные, так и человеческие, содержат и мРНК гена c-met, и его белковый продукт.

Таким образом, резистентность к действию HGF представляется достаточно странным и спорным явлением даже в случае нормальных фибробластов, и тем более в случае трансформированных клеток. Так, например, показано, что c-met очень часто амплифицирован и/или отличается повышенной экспрессией в спонтанных трансформантах клеток NIH ЗТЗ [Cooper et al., 1986]. Аналогично, клетки нашей модели, и опухолевые, и неопухолевые, отличались достаточно высоким содержанием как мРНК с-met, так и его белкового продукта. Тем не менее, мы не обнаружили существенного эффекта экзогенного HGF на неопухолевые клоны в экспериментах по спасению клеток от апоптоза. Более того, антитела против c-Met также не вызывали ни апоптоза, ни заметного снижения скорости пролиферации исследованных клеток.

Для объяснения наблюдаемых эффектов мы предложили две альтернативные гипотезы. Одна: из них предполагает, что клетки нашей модели обеспечивают функциональную аутокринную "петлю" за счет повышенного синтеза HGF, а нечувствительность к антителам против c-Met объясняется тем, что данная петля реализуется через стимуляцию внутриклеточных форм рецепторов. Другая гипотеза предполагает отсутствие какой либо чувствительности исследованных клеток к HGF, а снижение количества соответствующей мРНК является лишь маркером процесса реверсии, а не ее причиной. Однако, в любом случае, полученные результаты представляются весьма ценными, т.к. в будущем могут помочь в идентификации факторов транскрипции, отвечающих за такой характер экспрессии HGF и, соответственно, других генов, чья экспрессия регулируется аналогично HGF.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ефремов, Ярослав Рейнгольдович, Новосибирск

1. Киселева Е.Г., 1988. "Гетерогенность опухоли и механизмы естественной резистентности при метастазировании." Эксп. Онкол. 10,3-8.

2. Лавровский В.А., Ефремов Я.Р., Пивоварова Е.Н., Мануйлов В.А., Хрипко Ю.И., 2002. "Случайное распределение уровня экспрессии ростовых факторов у злокачественных и ревертантных клонов мышиных и человеческих опухолей." Цитология 44, 702-711.

3. Afrakhte M., lleldin N.E., Westermark В., 1998. "Inhibition of G1 cyclin-dependent kinase activity in cell density-dependent growth arrest in human fibroblasts." Cell Growth Differ. 9,983-988.

4. Amstad P.A., Liu H., Ichimiya M., Berezesky I.K., Trump B.F., 1997. "Manganese superoxide dismutase expression inhibits soft agar growth in JB6 clone41 mouse epidermal cells." Carcinogenesis 18,479-484.

5. Aragona M., Maisano R., Panetta S., Giudice A., Morelli M., La Torre I., La Torre F., 2000. "Telomere length maintenance in aging and carcinogenesis." Int. J. Oncol. 17,981-989.

6. Bailey S.M., Meyne J., Chen D.J., Kurimasa A., Li G.C., Lehnert B.E., Goodwin Б.Н., 1999. "DNA double-strand break repair proteins are required to cap the ends of mammalian chromosomes." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96,14899-14904.

7. Bhargava M., Joseph A., Knesel J., Halaban R., Li Y., Pang S., Goldberg I., Setter E., Donovan M.A., Zarnegar R., 1992. "Scatter factor and hepatocyte growth factor: activities, properties, and mechanism." Cell Growth Differ. 3,11-20.

8. Beerli R.R., Wels W. and Hynes N.E., 1994. "Intracellular expression of single-chain antibodies reverts ErbB-2 transformation." J. Biol. Chem. 269,23931-23936.

9. Bejcek B.E., Li D.Y., Deuel T.F., 1989. "Transformation by v-sis occurs by an internal autoactivation mechanism." Science 245,1496-1499.

10. Ben Ze'ev A., Farmer S.R., Penman S., 1980. "Protein synthesis requires cell-surface contact while nuclear events respond to cell shape in anchorage-dependent fibroblasts." Cell 21, 365-372.

11. Ben-Ze'ev A., 1997 "Cytoskeletal and adhesion proteins as tumor suppressors." Curr. Opin. Cell Biol. 9,99-108.

12. Bernard O., Reid H.H., Bartlett P.F., 1989. "Role of the c-myc and the N-myc protoyoncogenes in the immortalization of neural precursors." J. Neurosci. Res. 24,9-20.

13. Berndt N., Dohadwala M., Liu C.W., 1997. "Constitutively active protein phosphatase lalpha causes Rb-dependent G1 arrest in human cancer cells." Curr. Biol. 7,375-386.

14. Bogler O., Nagane M., Gillis J., Huang H.J., Cavenee W.K., 1999. "Malignant transformation of p53-deficient astrocytes is modulated by environmental cues in vitro." Cell Growth Differ. 10,73-86.

15. Boudreau N., Sympson C.J., Werb Z., Bissell M.J., 1995. "Suppression of ICE and apoptosis in mammary epithelial cells by extracellular matrix." Science 267, 891-893.

16. Braun S., Pantel K., 1999. "Micrometastatic bone marrow involvement. detection and prognostic significance." Med. Oncol. 16, 154-165.

17. Brouty-Boye D., Gresser J., Baldwin C., 1979. "Reversion of the transformed phenotype to the parental phenotype by subcultivation of x-ray-transformed C3H/10T1/2 cells at low cell density." Int. J. Cancer 24,253-260.

18. Brugarolas J., Bronson R.T., Jacks Т., 1998. "p21 is a critical CDK2 regulator essential for proliferation control in Rb-deficient cells." J. Cell Biol. 141, 503-514.

19. Bryan T.M., Englezou A., Gupta J., Bacchetti S., and Reddel R.R., 1995. "Telomere elongation in immortal human cells without detectable telomerase activity." EMBO J. 14, 42404248.

20. Bryan T.M., and Cech T.R., 1999. "Telomerase and maintenance of chromosome ends." Curr. Opin. Cell Biol. 11,318-324.

21. Cabrera-Vera T.M., Vanhauwe J., Thomas Т.О., Medkova M., Preininger A., Mazzoni M.R., Hamm H.E., 2003. "Insights into G protein structure, function, and regulation." Endocr. Rev. 24,765-781.

22. Calabretta В., Kaczmarek L.t Selleri LM Torelli G., Ming P.M., Ming S.C., Mercer W.E., 1986. "Growth-dependent expression of human Mr 53,000 tumor antigen messenger RNA in normal and neoplastic cells." Cancer Res. 46,5738-5742.

23. Chakrabarty S., Jan Y., Levine A., McClenic В., Varani J., 1989. "Fibronectin/laminin and their receptors in aberrant growth control in FR3T3 cells transformed by Ha-ras oncogene and epidermal growth factor gene." Int. J. Cancer 44,325-331.

24. Chen P.L., Scully P., Shew J.Y., Wang J.Y., Lee W.H., 1989. "Phosphorylation of the retinoblastoma gene product is modulated during the cell cycle and cellular differentiation." Cell 58,1193-1198.

25. Chen C.S., Mrksich M., Huang S., Whitesides G.M., Ingber D.E., 1997. "Geometric control of cell life and death." Science 276,1425-1428.

26. Classon M., Salama S., Gorka C., Mulloy R., Braun P., Harlow E., 2000. "Combinatorial roles for pRB, pl07, and pl30 in E2F-mediated cell cycle control." Proc. Natl. Acad. Sci: USA. 97,10820-10825.

27. Comoglio P.M., 1993. "Structure, biosynthesis and biochemical properties of the HGF receptor in normal and malignant cells." EXS 65, 131-165.

28. Cooper C.S., Tempest P.R., Beckman M.P., Heldin C.H., Brookes P., 1986. "Amplification and overexpression of the met gene in spontaneously transformed NIH3T3 mouse fibroblasts." EMBOJ. 5,2623-2628.

29. Crepin M., Gamby C., Salle V., Souttou В., Tamboise A., Tamboise E., Hamelin R., 1993. "Phenotypes of human epithelial cell lines immortalized from benign mastopathies." Anticancer Res. 13,497-506.

30. Cutbill S., 1994. "Cellular epigenetics and the origin of cancer." Bioessays 16,393-394.

31. D'Ambrosio C., Hongo A., Li S., Baserga R., 1996. "The role of Grb2 in the growth and transformation of mouse embryo cells." Oncogene 12,371-378.

32. Dannenberg J.H., van Rossum A., Scbuijff L., te Riele H., 2000. "Ablation of the retinoblastoma gene family deregulates G(l) control causing immortalization and increased cell turnover under growth-restricting conditions." Genes Dev. 14,3051-3064.

33. Darnbrough C., Slater S., Vass M., MacDonald C., 1992. "Immortalization of murine primary spleen cells by v-myc, v-ras, and v-raf." Exp. Cell Res. 201,273-283.

34. Dedhar S., 1995. "Integrin mediated signal transduction in oncogenesis: an overview." Cancer Metastasis Rev. 14,165-1 72.

35. Deffie A., Hao M., Montes de Oca Luna R., Hulboy D.L., Lozano G., 1995. "Cyclin E restores p53 activity in contact-inhibited cells" Mol Cell Biol. 15,3926-3933.

36. Dodson M.G., Gelder F.B., Slota J., Lange C., 1983. "Fibronectin and anchorage-independent and anchorage-dependent growth of benign and malignant cell lines." Int. J. Cancer 32,211-217.

37. Dong Z., Lavrovsky V., Colburn N.H., 1995. "Transformation reversion induced in JB6 RT101 cells by AP-1 inhibitors." Carcinogenesis 16,749-756.

38. Ducray C., Pommier J.P., Martins L., Boussin F.D., Sabatier L., 1999. "Telomere dynamics, end-to-end fusions and telomerase activation during the human fibroblast immortalization process." Oncogene 18,4211-4223.

39. Dunaief J.L., King A., Esumi N., Eagen M., Dentchev Т., Sung C.H., Chen S., Zack D.J., 2002. "Protein Phosphatase 1 binds strongly to the retinoblastoma protein but not to pi07 or p 130 in vitro and in vivo." Curr. Eye Res. 24,392-396.

40. Durfee TV, Becherer K., Chen P.L., Yeh S.H., Yang Y., Kilburn A.E., Lee W.H., Elledge S.J., 1993. "The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type 1 catalytic submit." Genes Dev 7,555-569.

41. Duncan E.L., Wadhwa R., Kaul S.C., 2000. "Senescence and immortalization of human cells." Biogerontology 1, 103-121.

42. Dykhuizen D., 1974. "Evolution of cell senescence, atherosclerosis and benign tumours." Nature 251,616-618.

43. Dyson N., 1998. "The regulation of E2F by pRB-family proteins." Genes Dev 12, 22452262.

44. Finlay C.A., 1993. "The mdm-2 oncogene can overcome wild-type p53 suppression of transformed cell growth." Mol. Cell. Biol. 13,301-306.

45. Folkman J., Moscona A., 1978. "Role of cell shape in growth control." Nature 273, 345349.У

46. Foulds L., 1954. "The experimental study of tumor progression." Cancer Res. 14,327-339. Foulds L., 1965. "Multiple etiologic factors in neoplastic development." Cancer Res. 25, 1339-1351.

47. Frisch S.M., Francis H., 1994. "Disruption of epithelial cell-matrix interactions inducesуapoptosis." J. Cell Biol. 124,619-626.

48. Frisch S.M., Ruoslahti E., 1997. "Integrins and anoikis." Curr. Opin. Cell Biol., 9, 701706.

49. Fusenig N.E., Boukamp P., 1998. "Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes." Mol. Carcinog. 23, 144-158.

50. Fushimi K., Iijima M., Gao C., Kondo Т., Tsuji Т., Hashimoto Т., Mihara K., Namba M., 1997. "Transformation of normal human fibroblasts into immortalized cells with the mutant p53 gene and X-rays." Int. J. Cancer 70, 135-140.

51. Gao Q., Hauser S.H., Liu X.L., Wazer D.E., Madoc-Jones H., Band V., 1996. "Mutant p53-induced immortalization of primary human mammaiy epithelial cells." Cancer Res. 56, 3129-3133.

52. Garbe J., Wong M., Wigington D., Yaswen P., Stampfer M.R., 1999. "Viral oncogenes accelerate conversion to immortality of cultured conditionally immortal human mammary epithelial cells." Oncogene 18,2169-2180.

53. Gendron R.L., Liu C.Y., Paradis H., Adams L.C., Kao W.W., 2001. "MK/T-1, an immortalized fibroblast cell line derived using cultures of mouse corneal stroma." Mol. Vis. 7, 107-113.

54. Gershey E.L., D'AIisa R.M., 1980. "Characterization of a CV-1 cell cycle. П. The role of cell-substrate attachment." J. CellSci. 42, 357-365.

55. Gherardi E., Sharpe M., Lane K., Sirulnik A., Stoker M., 1993. "Hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF), the c-met receptor and the behaviour of epithelial cells." Symp. Soc. Exp. Biol. 47,163-181.

56. Giancotti F.G., Ruoslahti E., 1990. "Elevated levels of the a5pl fibronectin receptor suppress the transformed phenotype of Chinese hamster ovary cells." Cell 60,849-859.

57. Gregoire L., Rabah R., Schmelz E.M., Munkarah A., Roberts P.C., Lancaster W.D., 2001. "Spontaneous malignant transformation of human ovarian surface epithelial cells in vitro." Clin. Cancer Res. 7,4280-4287.

58. Greulich H., Hanafusa H., 1996. "A role for Ras in v-Crk transformation." Cell Growth Differ. 7,1443-1451.

59. Grobelny J.V., KuIp-McEIiece M., Broccoli D., 2001. "Effects of reconstitution of telomerase activity on telomere maintenance by the alternative lengthening of telomeres (ALT) pathway." Hum. Mol. Genet. 10,1953-1961.A

60. Hall P., Coates P., Ansari В., Hopwood D., 1994. "Regulation of cell number in the mammalian gastrointestinal tract: the importance of apoptosis." J. CellSci. 107, 3569-3577.

61. Hart J.R., Fidler J.I., 1981. "The implications of tumor heterogeneity for studies on the biology and therapy of cancer metastasis." Biochem. et Biophys. Acta 651,37-50.

62. Hayflick L., Moorhead P.S., 1961. "The serial cultivation of human diploid cell strains." Exp. Cell Res. 25,585-621.

63. Hayflick L., 1997. "Mortality and immortality at the cellular level. A Review." Biochemistry 62, 1180-1190.

64. Hanahan D., Weinberg R., 2000. "The Hallmarks of Cancer. Review." Cell 100, 57-70. Harvey D.M., Levine A.J., 1991. "p53 alteration is a common event in the spontaneous immortalization of primary BALB/c murine embryo fibroblasts." Genes Dev. 5,2375-2385.

65. Heinicke Т., Radziwill G., Nawrath M., Rommel C., Pavlovic J., Moelling K., 2000. "Retroviral gene transfer of dominant negative raf-1 mutants suppresses ha-ras-induced transformation and delays tumor formation." Cancer Gene Ther. 7, 697-706.

66. Heldin C., Westermark В., 1989. "Growth factors as transforming proteins." Eur. J. Biochem. 184,487-496.

67. Hirano M., Hirano K., Nishimura J., Kanaide H., 2001. "Transcriptional up-regulation of p27(Kipl) during contact-induced growth arrest in vascular endothelial cells." Exp. Cell. Res. 271, 356-367.

68. Holley R.W., Kiernan J.A., 1974. "Control of the initiation of DNA synthesis in 3T3 cells: serum factors." Proc Natl Acad Sci USA. 71,2908-2911.

69. Holley R.W., 1975. "Control of growth of mammalian cells in cell culture." Nature 258, 487-490.

70. Hsu T.-Ch., Young M.R., Cmarik J., Colburn N.H., 2000. "Activator protein 1 (AP-1)-and nuclear factor kB (NF-kB)-dependent transcriptional events in carcinogenesis.^' Free Radical Biology and Medicine 28, 1338-1348.

71. Huang R.P., Liu С., Fan Y., Mercola D., Adamson E.D., 1995. "Egr-1 negatively regulates tumor cell growth via the DNA-binding domain." Cancer Res. 55, 5054-5062.

72. Humphries M.J., 2000. "Integrin structure." Biochem. Soc. Trans. 28,311-339.

73. Jannot C.B., Beerli R.R., Mason S., Gullick W.J., Hynes N.E., 1996. "Intracellular expression of single-chain antibody directed to the EGFR leads to growth inhibition of tumor cells." Oncogene 13,275-282.4

74. Jazayeri A., McGee J., Shimamura Т., Cross S.B., Bejcek B.E., 2000. "SHP-2 can suppress transformation induced by platelet-derived growth factor." Exp. Cell Res. 254,197-203.

75. Kastan M.B., Onyekwere O., Sidransky D., Vogelstein В., Craig R.W., 1991. "Participation of p53 protein in the cellular response to DNA damage." Cancer Res. 51, 63046311.

76. Katakura Y., Alam S., Shirahata S., 1998. "Immortalization by gene transfection." Methods Cell Biol. 57,69-91.

77. Kataoka II., Gohda E., Matsunaga Т., Ishii Т., Нага H., Yamamoto I., 1993. "Stimulation of DNA synthesis in skin fibroblasts by human hepatocyte growth factor/scatter factor." Cell Biol Int. 17,65-73.

78. Kaul S.C., Wadhwa R., Sugihara Т., Obuchi K., Komatsu Y., Mitsui Y., 1994. "Identification of genetic events involved in early steps of immortalization of mouse fibroblasts." Biochim BiophysActa. 1201,389-396.

79. Kelekar A., Cole M.D., 1987. "Immortalization by c-myc, H-ras, and El a oncogenes induces differential cellular gene expression and growth factor responses." Mol. Cell. Biol. 7, 3899-3907.

80. Kieser A., Seitz Т., Adler H.S., Coffer P., Kremmer E., Crespo P., Gutkind J.S., Henderson D.W., Mushinski J.F., Koich W., Mischak H., 1996. "Protein kinase C-zeta reverts v-raf transformation of NTH-3T3 cells." Genes Dev. 10,1455-1466.

81. Kirkham P.A., Lam E.W., Takamatsu Eft, Parkhouse R.M., 1998. "Transcription factor E2F controls the reversible gamma delta T cell growth arrest mediated through WC1." J. Immunol 161, 1630-1636.

82. Kirsch M., Schackert G., Black P.M., 2000. "Angiogenesis, metastasis, and endogenous inhibition.'V. Neurooncol. 50, 173-180.

83. Keating M.T., Williams L.T., 1988. "Autocrine stimulation of intracellular PDGF receptors in v-sis-transformed cells." Science 239,914-916.

84. Krimpenfort P., Quon K.C., Mooi W.J., Loonstra A., Berns A., 2001. "Loss of pl6INK4a confers susceptibility to metastatic melanoma in mice." Nature 413, 83-86.

85. Kuerbitz S.J., Plunkett B.S., Walsh W.V., Kastan M.D., 1992. "Wild-type p53 is a cell cycle checkpoint determinant following irradiation." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,7491-7495.

86. Y., Basilico C., Mansukhani A., 1994. "Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors." Mol Cell Biol. 14, 76607669.

87. Ma L., Gauville C., Berthois Y., Millot G., Johnson G.R., Calvo F., 1999. "Antisense expression for amphiregulin suppresses tumorigenicity of a transformed human breast epithelial cell line." Oncogene 18,6513-6520.

88. Martinez J., Georgoff I., Martinez J., Levine A.J., 1991. "Cellular localization and cell cycle regulation by a temperature-sensitive p53 protein." Genes Dev. 5,151-159.

89. McGill G., Shimamura A., Bates R.C., Savage R.E., Fisher D.E., 1997. "Loss of matrix adhesion triggers rapid transformation-selective apoptosis in fibroblasts." J. Cell Biol. 138, 901911.

90. Mercer W.E., Shields M.T., Amin M., Sauve G.J., Appella E., Romano J.W., Ullrich S.J., 1990. "Negative growth regulation in a glioblastoma tumor cell line that conditionally expresses human wild-type p53." Proc Natl Acad Sci USA. 87,6166-6170.

91. Meredith J., Schwartz M., 1997. "Integrins, adhesion and apoptosis." Trends Cell Biol. 7, 146-150.

92. Messerle K., Schlegel J., Hynes N.E., Groner В., 1994. "NIH/3T3 cells transformed with the activated erbB-2 oncogene can be phenotypically reverted by a kinase deficient, dominant negative erbB-2 variant." Mol. Cell. Endocrinol 105,1-10.s

93. Mignatti P., Rifkin D.B., 1993. "Biology and biochemistry of proteinases in tumor invasion." Physiol Rev. 73, 161-195.

94. Mondal S., Embleton M.J., Marquardt H., Heidelberger C., 1971. "Production of variants of decreased malignancy and antigenicity from clones transformed in vitro by methylcholantrene." Int. J. Cancer 8,410-420.

95. Morris V.L., Schmidt E.E., MacDonald I.C., Groom A.C., Chambers A.F., 1997. "Sequential steps in hematogenous metastasis of cancer cells studied by in vivo videomicroscopy." Invasion Metastasis, 17,281-296.

96. Nakayama K., Ishida N., Shirame M., Inomata A., Inoue Т., Shishido N., Horii I., Loh D.Y., Nakayama K., 1996. "Mice lacking p27 (Kipl) display an increased body size, multiple organ hyperplasia, retinal dysplasia and pituitary tumors." Cell 85, 707-720.

97. Nelson P.J., Daniel Т.О., 2002. "Emerging targets: Molecular mechanisms of cell contact-mediated growth control." Kidney Int. Suppl. 61 Suppl.l, 99-105.

98. Nickoloff B.J., Chaturvedi V., Bacon P., Qin J.Z., Denning M.F., Diaz M.O., 2000. "Id-1 delays senescence but does not immortalize keratinocytes." J. Biol Chem. 275,27501-27504.

99. Nicolson G.L., 1987. "Tumor cell instability, diversification, and progression to the metastatic phenotype: from oncogene to oncofetal expression." Cancer Res. 47,1473-1487.

100. Noda M., 1993. "Mechanisms of reversion." FASEBJ. 7, 834-846.

101. Noltenius С., Noltenius H., 1985. "Dormant tumor cells in liver and brain. An autopsy study on metastasizing tumors." Pathol. Res. Pract. 179,504-511.

102. Nowell P.C., 1976. "The clonal evolution of tumor cell populations. Acquired genetic liability permits stepwise selection of variant sublines and underlies tumor progression." Science 194,23-28.

103. Onishi Т., Machida Т., Masuda F., Iizuka N., Shirakawa H., Hatano Т., 1992. "Clinical study of patients with renal carcinoma surviving for more than 10 years after nephrectomy." Br. J. Urol. 70,483-487.

104. Ossowski L., Reich E., 1983. "Changes in malignant phenotype of a human carcinoma conditioned by growth environment." Cell 33,323-333.

105. Pantel K., Braun S., 2001. "Molecular determinants of occult metastatic tumor cells in bone marrow." Clin. Breast Cancer 2, 222-228.

106. Park N.H., Guo W., Kim H.R., Kang M.K., Park N.H., 2001 "c-myc and Spl/3 are required for transactivation of hamster telomerase catalytic subunit gene promoter." Int. J. Oncol. 19,755-761.

107. Parreno ML, Garriga J., Limon A., Mayol X., Beck G.R. Jr., Moran E., Grana X., 2000. "ElA blocks hyperphosphorylation of pi30 and pi07 without affecting the phosphorylation status of the retinoblastoma protein." J. Virol. 74,3166-3176.

108. Peeper D.S., Shvarts A., Brummelkamp Т., Douma S., Koh E.Y., Daley G.Q., Bernards R., 2002. "A functional screen identifies hDRILl as an oncogene that rescues RAS-induced senescence." Nat. Cell Biol. 4,148-153.

109. Plantefaber L.C., Hynes R.O., 1989. "Changes in integrin receptors on oncogenically transformed cells." Cell 56,281-290.

110. Polakowska R., Piacentini M., Bartlett R., Goldsmith L., Haake A., 1994. "Apoptosis in human skin development: morphogenesis, periderm and stem cells." Dev. Dyn. 3,176-188.

111. Pollack R., Wolman S., Vogel A., 1970. "Reversion of virus-transformed cell lines: hyperploidy accompanies retention of viral genes "Nature 228, 938-970.

112. Polyak K., Kato J., Solomon M.J., Sherr C.J., Massague J., Roberts J.M., Koff A.,1994. "p27Kipl, a cyclin-Cdk inhibitor, links transforming growth factor-beta and contactfinhibition to cell cycle arrest." Genes Dev. 8,9-22.

113. Rabinowitz Z., Sachs L., 1968. "Reversion of properties in cells transformed by Polyoma virus." Nature 220, 1203-1206.

114. Re F., Zanetti A., Sironi M., Polentarutti N., Lanfrancone L., Dejana E., Colotta F., 1994. "Inhibition of anchorage-dependent cell spreading triggers apoptosis in cultured human endothelial cells." J. Cell Biol. 127,537-546.

115. Redpath N.T., Proud C.G., 1994. "Molecular mechanisms in the control of translation by hormones and growth factors." Biochim. Biophys. Acta 1220,147-162.

116. Reich N.C., Levine A.J., 1984. "Growth regulation of a cellular tumour antigen, p53, in nontransformed cells." Nature. 308,199-201.7 x

117. Riley D.J., Lee E.Y.-H.P., Lee W.-H., 1994. "The retinoblastoma protein: more than a tumor suppressor." Annu Rev Cell Biol 10,1-29.

118. Ritt M.G., Mayor J., Wojcieszyn J., Smith R., Barton C.L., Modiano J.F., 2000. "Sustained nuclear localization of p21/WAF-l upon growth arrest induced by contact inhibition." Cancer Lett. 158,73-84.

119. Roques C.N., Boyer J.C., Farber R.A., 2001. "Microsatellite mutation rates are equivalent in normal and telomerase-immortalized human fibroblasts." Cancer Res. 61, 8405-8407.

120. Rosen E.M., Goldberg I.D., 1989. "Protein factors which regulate cell motility." In Vitro Cell Dev. Biol., 25, 1079-1087.

121. Rosenmuller Т., Rydh K., Nanberg E., 2001. "Role of phosphoinositide ЗОН-kinase in autocrine transformation by PDGF-BB." J. Cell. Physiol. 188,369-382.

122. Rubin E., Tamrakar S., Ludlow J.W., 1998. "Protein phosphatase type 1, the product of the retinoblastoma susceptibility gene, and cell cycle control." Front Biosci 3, D1209-1219.

123. Sage J., Mulligan G.J., Attardi L.D., Miller A., Chen S., Williams В., Theodorou E., Jacks Т., 2000. "Targeted disruption of the three Rb-related genes leads to loss of G(l) control and immortalization." Genes Dev. 14,3037-3050.л

124. Schwartz M.A., Lechene C., Ingber D.E., 1991. "Insoluble fibronectin activates the Na/H antiporter by clustering and immobilizing integral alpha 5 beta 1, independent of cell shape." Proc Natl Acad Sci USA. 88, 7849-7853.

125. Shamah SM, Stiles CD, Guha A., 1993. "Dominant-negative mutants of platelet-derived growth factor revert the transformed phenotype of human astrocytoma cells." Mol Cell Biol. 13, 7203-7212.

126. Sharpless N.E., Bardeesy N., Lee K.H., Carrasco D., Castrillon D.H., Aguirre A.J., Wu E.A., Horner J.W., DePinho R.A., 2001. "Loss of pl6INK4a with retention of pl9ArfУpredisposes mice to tumorigenesis." Nature 413,86-91.

127. Sharpless N.E., Alson S., Chan S., Silver D.P., Castrillon D.H., DePinho R.A., 2002. "pl6(INK4a) and p53 deficiency cooperate in tumorigenesis." Cancer Res. 62,2761-2765.

128. Shay J.W., and Bacchetti S., 1997. "A survey of telomerase activity in human cancer." Eur. J. Cancer 33,787-791.

129. Sherr C.J. and Roberts J.M., 1995. "Inhibitors of mammalian Gi cyclin-dependent kinases." Genes Dev. 9, 1149-1163.

130. Selkirk J.K., He С., Merrick B.A., 1994. "Mouse cells with null p53 mutation have all p53 isoforms deleted and lose negative growth control." Appl. Theor. Electrophor. 4, 89-93.у

131. Simm A., Halle J.P., Adam G., 1994. "Proliferative and metabolic capacity of rat embryo fibroblasts immortalized by c-myc depends on cellular age at oncogenic transfection." Eur. J. Cell Biol. 65,121-131.

132. Sonoda H., Nishida K., Yoshioka Т., Ohtani M., Sugita K., 1996. "Oxamflattin: a novelуcompound which reverses malignant phenotype to normal one via induction of JunD." Oncogene 13,143-149.

133. Sporn M.B., Roberts A.B. 1985. "Autocrine growth factors and cancer." Nature 313, 745747.

134. Stoker M.G., and Rubin H., 1967. "Density dependent inhibition of cell growth in culture." Nature 215,171-172.

135. Stoker M., O'Neill C., Berryman S., Waxman V., 1968. "Anchorage and growth regulation in normal and virus-transformed cells." Int. J. Cancer 3,683-693.a

136. Stoker M., Gherardi E., Perryman M., and Gray J., 1987. "Scatter factor is a fibroblast-derived modulator of epithelial cell mobility." Nature 327,239-242.

137. Stoker M. and Gherardi E., 1989. "Scatter factor and other regulators of cell mobility." Br. Med. Bull. 45,481-491.

138. Stupack D.G., Cheresh D.A., 2002. "Get a ligand, get a life: integrins, signaling and cell survival."J. CellSci. 115,3729-3738.

139. Sun C., Antonionio R.J. and Redpath J.L., 1996. "Reversion of UVC-induced tumorigenic human hybrid cells to the non-tumorigenic phenotype." Europ. J. Cancer 32A, 322327.

140. Suzuki Т., Murakami M., Onai N., Fukuda E., Hashimoto Y., Sonobe M.H., Kameda Т., Ichinose M., Miki K., Iba H., 1994. "Analysis of AP-1 function in cellular transformation pathways." J. Virol 68,3527-3535.у

141. Thompson R.A. Jr., Campbell E.W. Jr., Kramer H.C., Jacobs S.C., Naslund M.J.,1993. "Late invasive recurrence despite long-term surveillance for superficial bladder cancer." J. Urol. 149,1010-1011.

142. Tobey R.A., Ley K.D., 1970. "Regulation of initiation of DNA synthesis in Chinese hamster cells. I. Production of stable, reversible G1-arrested populations in suspension culture." J. Cell Biol 46,151-157. f

143. Valentinis В., Reiss K., Baserga R., 1998. "Insulin-like growth factor-I-mediated survival from anoikis: role of cell aggregation and focal adhesion kinase." J. Cell Physiol. 176,648-657.

144. Valentinis В., Morrione A., Peruzzi F., Prisco M., Reiss K., Baserga R., 1999. "Anti-apoptotic signaling of the IGF-I receptor in fibroblasts following loss of matrix adhesion." Oncogene 18,1827-1836.

145. Varner J.A., Emerson D.A., Juliano R.L., 1995. "Integrin alpha 5 beta 1 expression negatively regulates cell growth: reversal by attachment to fibronectin." Mol Biol Cell. 6, 725740.

146. Vassbotn F.S., Andersson M., Westermark В., Heldin C.H., Ostman A., 1993. "Reversion of autocrine transformation by a dominant negative platelet-derived growth factor mutant." Mol Cell Biol. 13,4066-4076.

147. Voorhoeve P.M., Hijmans E.M., Bernards R., 1999. "Functional interaction between a novel protein phosphatase 2A regulatory subunit, PR59, and the retinoblastoma-related pi07 protein." Oncogene 18, 515-524.

148. Webb C.P., Taylor G.A., Jeffers M., Fiscella M., Oskarsson M., Resau J.H., Vandef

149. Woude G.F., 1998. "Evidence for a role of Met-HGF/SF during Ras-mediated tumorigenesis/metastasis." Oncogene 17, 2019-2025.

150. Wells A., 2000. "Tumor invasion: role of growth factor-induced cell motility." Adv. Cancer Res. 78,31-101.у

151. Whittenberger В., Raben D., Glaser L., 1979. "Regulation of the cell cycle of 3T3 cells in culture by a surface membrane-enriched cell fraction." JSupramol Struct 10,307-327.

152. Wieser R.J., Faust D., Dietrich C., Oesch F., 1999. "pl6INK4 mediates contact-inhibition of growth." Oncogene 18,277-281.

153. Yamamoto M., Ueno Y., Hayashi S., Fukushima Т., 2002. "The role of proteolysis in tumor invasiveness in glioblastoma and metastatic brain tumors." Anticancer Res. 22, 42654268.

154. Young J.S., 1959. "The invasive growth of malignant tumours: an experimental interpretation based on elastic-jelly models."./ Pathol. Bacteriol. 77,321-339.

155. Yuan В., Sun Z., 1997. "Transformation of rat hepatocytes in an in vitro primary culture by aflatoxin Bl." Zhongguo YiXue KeXue YuanXue Bao 19,6-10.

156. Zhan Q., Carrier F., Fornace A.J., 1993. "Induction of cellular p53 activity by DNA-damaging agents and growth arrest." Mol. Cell. Biol. 13,4242—4250.

157. Zhang H., Serrero G., 1998. "Inhibition of tumorigenicity of the teratoma PC cell line by transfection with antisense cDNA for PC cell-derived growth factor (PCDGF, epithelin/granulin precursor)Г Proc Natl Acad Sci USA 95,14202-14207.

158. Zindy F., van Deursen J., Grosveld G., Sherr C.J., Roussel M.F., 2000. "INK4ddeficient mice are fertile despite testicular atrophy." Mol. Cell. Biol. 20, 372-378.

159. Zutter M.M., Santoro S.A., Staatz W.D., Tsung Y.L., 1995. "Re-expression of the a2pl integrin abrogates the malignant phenotype of breast carcinoma cells." Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 741 1-7415.t

Информация о работе

Ефремов, Ярослав Рейнгольдович
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2004
ВАК 03.00.25

Диссертация

Изучение механизмов спонтанных реверсий злокачественных клеток к неопухолеродному фенотипу - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы