Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение линейного дихроизма изоферментов аспартат-аминотрансферазы, ориентированных в полиакриламидном геле

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение линейного дихроизма изоферментов аспартат-аминотрансферазы, ориентированных в полиакриламидном геле"



академия наук ссср институт молекулярной биологии

На правах рукописи

РОЗЕПБЕРГ МИХАИЛ ВИКТОРОВИЧ

УДК 577.322.7

ИЗУЧЕНИЕ ЛИНЕЙНОГО ДИХРОИЗМА ИЗОФЕРМЕНТОВ АСПАРТАТ-АМИНОТРАНСФЕРАЗЫ, ОРИЕНТИРОВАННЫХ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ

(03.00.03 — Молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой стеяени кандидата химических наук

Москва — 1987

легшей

. : ;св:ка тд ел :ертаций

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ

На правах рукописи

РОЗГОБЕРГ Михаил Викторович

УДК 377.322.7

ИЗУЧЕНИЕ ЛИЮЯНОГО ДИХРОИЗМА И30ФЕРМЕНТ0В АСПАРТАТ-АМИНОТРАНОТЕРАЗЫ, ОРИЕНТИРОВАННЫХ В ПОЛИАКИШМИДНОМ ГЕЛЕ

(03.00.03 - Молекулярная биология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 1987

Работа выполнена в Лаборатории химических оонов биокатали-ва Института ыодекуляргой биологии Академии наук СССР.

Научные руководителиг доктор биологических наук

Ю.М.Торчннский

кандидат физико-математических наук В.Л.Макаров

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Б.И.Курганов

доктор физико-математических наук, ведущий научный сотрудник В.И.Иванов

Ведущее учреждение: Институт биохимии им.А.Н.Баха

Академии наук СССР

Защита соотоитая " ^" -^"¿утго. гдвв г. в часов

на эаоадании специализированного совета Д 002.79.01 в Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу; 1Г7984 Москва, ул.Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР.

Автореферат разослан * фн^^^Н 1988 г.

Ученый оекретарь специализированного совета ^ кандидат химических наук _ УУ

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аспартат-аминотрапофераза (ААТ, аопар-тат-трансачиназа) является одним из ключевых ферментов метаболизма азота в яивых организмах. Многочисленные исследования ААТ, выполненные со времени открытая в 1937 г. А.Е.Браунштейном и М.Г.Криц-ман ферлентативного трансамкнировапия, позволили вплотную приблизиться к выяснении молекулярного механизма каталитической реакции. Особый ттвроо представляют динамические аспекта этого механизма, т.е. изменения взаимного расположения кофердента, субстрата и доменов белка в ходе реакций.

Гипотеза о сопряженном о катализом изменении ориентации ко-фермента в активном центре ААТ была впервые предложена В.И.Ива-повым и М.Я.Карпейскш более 20 лет назад и впоследствии получила убедительное экспериментальное подтверждение* В последило годц для изучения: раориеятацпи коферлепта в активном центре ААТ бшш успешно использованы, наряду о рентгеноструктурным анализом, измерения спектров линейного дихроизма (ДД) монокристаллов фермента. При исследовании методом ДД кристаллов цптозольного п мито-хондриального изоферлентов ААТ (цААТ и мААТ, соответственно) курицы и цААТ свиньи былл получены несколько различающиеся данные. Эти различия могут быть обусловлена либо особенностями актив1шх центров изоферлентов, либо различной упакозкой их молэхсул в элементарной ячейка кристаллов.

В связи о этим представляло интерес провеотя в идентичных условиях измерение ЛД указанных вше фор.! ААТ. Такую возможность представляет метод измерения ЛД макромолекул, ориентированных в скатом блоке полиакриламлдного геля. Применение этого метода позволило выявить особенности динамики коферлента в активных центрах изоферлентов ААТ и уточнить представления о механизме реакции ферментативного трансаминирования.

Цель работы. Настоящая диссертационная работа посвящена разработке методик, позволяющих получать количественно воспроизводит,те спектры ЛД ферлентов, ориентированнее в скатом блоке

Принятые сокращения:

ААТ -ь-аспартат: 2-оксоглутарат - аминотрансфераза (КФ 2.6.1.1)} цААТ - цитозольная ААТ} мААТ - мнтохондриальная ААТ} II®} - пиридоксаль-5»-фосфат; ГО® - пиридоксамин-5»-фосфат; Щ - щтвйтгй дихроизм} ДЩ - дшголыщй момент перехода.

полиакраламидного геля, и сравнительному изучению о помощью этих методик трех взоформентов ААТ (цААТ свиньи и курицы и мААТ свиньи). Цаль работы состояла в изучении динамических аспектов механизма действия ААТ, а именно реориептацлй кофврлента в активном центре во время каталитического цикла.

Научная новизна работа. Разработай комплеко методик, позволяющих получать количественно воспроизводите спектр! ЛД ферлен-тов, ориентированных в полиакриламадном геле. Впервые в одинаков вых условиях измерены спектра ЛД трех изоферментов ААТ, а также их комплексов о аналогами субстратов, которые имитирует промежуточные стадии реакции траноаминирования. На основании данных ЛД в о использованием известных атомных координат пиридоксальфоофа-та (ГШ) и направлений диполышг моментов перехода (ДМП) в нем рассчитаны на ЭВМ углы поворота кофермента в активных центрах цААТ и мААТ на основных промежуточных стадиях реакции траноами-иирования.

Практическая ценность работы« Получены новые данные о подвижности ПИ, в ходо катшгитичеокой реакции траисамшшрования, позволяющие уточнить существующие представлошш о динамике активного центра и выявить особенности функционирования ивофа¡ментов ААТ, Разработан метод измерения ЛД ферментов, ориентированных в сжатом блоке полиакраламидаого геля» Этот метод может найти применение дня изучения не только ААТ, но и других фор«;аптов, со-деркащих хромофорную группу в активном центра,

Апррбавдя работц. Результаты работы докладывались на Международном симпозиуме по витамин В^-эависшому катализу (Афины, 1983), Конференции ОЕБО (Москва, ÎS84), Советско-итальянском симпозиуме "Макромолекулы в функционирующей клетке" (Киев, 1984), Всесоюзном симпозиуме "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва, IS87), Международном конгрессе по пиридоксала^ вому катализу (Турку, Финляндия, 1987), итоговой научной конференции Института молекулярной биологии АН СССР (1987).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ. Список публикаций приведен в конце автореферата.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение)0 заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 102 страницах машинописного текста и оодержит 21 рисунок я 7 таблиц.

- 5 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I» Разработка метода измерения линейного дихроизма аопартат-трансашшазы, оряенигрозанной в сжатом блоке полиакриламидного геля

В Ш78 г. И.А.Абдурашанов, А.О.Ганаго и Ю.Е.Ерохпн /I/ предлозшли для измерения ЛД биологических объектов новый способ ориентации: механическое вытяжение блока полиакршамвдного геля о включенным в него образцом. А.Ю.Сазшшн с соавторами /2/ показали, что этот метод маяно применять и для изучения ААТ{ однако гол не удалось получить количественно воспроизводимые результаты. Нами были разработаны методики п специальные приспособления, позволяющие измерять спектры ЛД аспартат-траноаминазн, ориентированной в полиакриламндном геле с воспроизводимостью величин приведенного ЛД ±3%. При помощи этого метода бшш изучены цААТ и мААТ из сердца свиньи и цААТ из сердца кур, а такяе комплексы этих ферментов с аналогами субстратов.

Приготовление гэлей. Полиакрилашднне гели готовили в поли-мерязационной ячейке, изображенной на рас.1. Центральная часть

сп о о о о !п

Рис.1. Полимвризационная ячейка.

ячейки изготовлена из шлифованного поливипплхлорида толщиной 6±0,05 ш, в ней фрезерованы 4 сквозных продольных паза шириной текке 6+0,05 ш. В нижнш часть каждого паза вкладывали вставки из поливинилхлорида, формирующие в гелях "карманы" для образца} сечение широкой части вставки 5,9x5,9 мм, узкой - 3,6x3,6 мм. Передняя и задняя станки ячейки образованы стеклянными плаотина-ыи. Для герметизации в и -образные пази по краям центральной части ячейки вкладывали мягкие силиконовые трубки (на рисунке не показаны) . Собранную ячейку зажимали струбищшаш.

Готовили раотвор мономеров, содержащий 15,45? акриламида, 0,1% метилен-био-акриламида, 0,1 Ы Трис-HCI СрН 8,3) и 0,03% ТШЕД. Для удаления нерастворимых примесей раотвор центрифугировали или фильтровали через нитроцелаюлозный фильтр в ячейке Miiiex-Gs (r.iiiiipore, (ЗЛА), дегазировали, добавляли раотвор пер-оульфата аммония в буфере до концентрации 0,05$, заливали в по-лимеризационную ячейку через отверстия в верхней части и наслаивали на поверхность воду. Через 2 часа гели переносили в раотвор, содержавший 20 Ш Трис-HCI (рН 8,3) и 0,02$ азид натрия, и оставляли не менее чем на трое суток при температуре 8-10°. За это время гели набухали от исходного размера 6,0x6,0 мм до конечного 8,0x8,0 (±0,1) мм; цри дальнейшем хранении никаких видимых изменений с ними не происходило, по крайней мере в течение I года. Приведенная методика позволяла получать однородные, оптически прозрачные гели; отепень полимеризации составляла не менее 97$ (судя по уменьшение оптической плотности пря 290 пм во время полимеризации).

Вторжение фетэята в гель. Для включения ферментов в гель попользовали электрофорез. Применявшийся Абдурахмановым п др. /1,3/ и Сазыкиным и др. /2/ способ, который заключался в полимеризации геля в присутствии исследуемого образца, в случае ААТ оказался непригодным, так как в процеооо полимеризации происходит частичная инактивация фермента. Об этом свидетельствуют изменения в спектре ААТ, а именно переход значительной части фермента в неактивную форму, характеризующуюся максимумом поглощения при 340 нм. Инактивация связана, по-видимому, о окислением ААТ свободными радикалами, образующимися во время полимеризации. Использование электрофореза позволяют проводить включе-. нно фермента в гель в мягких условиях н не вызывает изменений • в спектре ААТ.

Электрофорез проводила в сконструированном нами приборе, изобретенном на рио.2. Корпус прибора изготовлен из плексигласа, электрода из платиновой проволоки. Четыре стеклянные трубки для гелей закреплены в дне внутреннего резервуара при помощи силиконовых прокладок; диаметр этих трубок подобран так, чтобы гели свободно входили в него. Через отверстия в стенках натянуты капропо-выо нити, поддерживающие гели снизу. Особенность этого прибора заключается а том, что верхний и шшшй резервуары сообщится через окружающее гели пространство в трубках. При такой конструкции отпадает необходимость в герметизации гелей (в случае прямоугольных гелей это трудно сделать, не повредив поверхностей) и значительно улучшаются условия теплоотвода, поскольку вся поверхность геля находится в непосредственном контакта с электродным буфером.

Электрофорез куриной п свиной цААТ проводила в 20 глМ Трио-НС1 (рН 8,3) при 10 в/см, температуре 8-10° о непрерывней циркуляцией буфера, длительность электрофореза составляла 20 часов в • случае цААТ кур и 12 часов зз случае цААТ свиньи. Электрофорез свиной цААТ проводили в 20 кМ калий-ацетатном буфере (рН 5,5) при 4 в/см и комнатной температуре в течение 3 часов. На геля наносили по 70-100 тли раствора фермента в электродном буфере (2-2,5 мг фзрг'епта), содержавшем 10-20^ сахарозы.

После электрофореза вырезали участок геля длиной 25 ил, содержавший фермент п уравновешивали ого в течение суток о раствором соответствующего лиганда в Трио- 20 кМ какодилатпом буфере. ШЗ-фор?лу ААТ получали путем обработки 5 Ш цистевноульфанатсм при рИ 7,5. Восстановленную форму получали путем обработки фермой-, та боргидрлдом натрия до включения в Гель.

Измерение спектров. Гели о ферментом сжимали в специально сконструированной для этой цели кювете в двух взаимно перпендикулярных направлениях от исходного сечения 8,0x8,0 мм до конечного 6,35x6,35 мм} дайна гелей при этом увеличивалась в 1,6 раза (при большей деформации возникает опасность разрушения геля), В кювету (рзс.З) вкладывали нижнюю кварцевую пластину (I) п по одной стеклянной пластине (2), смачивали их буфером, и вносили гель. Между стенкой кюзетн л стеклянной пластиной вставляли спейсер (3). При этом гель сжимался в горизонтальном направлении и удлинялся в вертикальном и продольном. Затем вводили верхнюю кварцевую плао-тину, сжимали ею гель в вертикальном направлении и закрепляли крышку кюветы. Деформация являлась эластичной, так как после из-

- в -

Рно, 2. Схема прибора для электрофореза, а - поперечное сечение; б - вид сверху.

Рис. 3 Рис. 4

Рио.З. Кювета для сиатия голой.

I - кварцевые пластины} 2 - отеклягапга пластткш} 3 - спейсер} 4 - гель.

Рио.4. Зависимость ДЦ куриной цААТ, восстановленной боргидрядом натрия от длшы волны в области 380-600 пм*

влечения геля из кввоты его размеры но отличались от походных.

Спектры поглощения в непсляризовакном свете измеряли на спектрофотометре "Сагу-HS" (Varlan, США).

Спектры ДД для света, поляризованного параллельно я перпендикулярно направлению ватяаенпя геля, измеряли по методу, предложенному Давидсоном и Норденогл /4/, на дахрогрзфе »jobin-Xvcn Mark Iii" (Франция), снабкеинсм четвертьволновой кварцевой приставкой, которая преобразует циркулярно поляризованный свэт в линейно поляризованной, Хроматичность приставки била определена по методу о наклонной кварцевой- пластинкой /4/ и использовалась в качества поправочной функция к спектрам ДД.

При помощи специальных держателей кювету с гелем устанавливали в дахрографе и спектрофотометре тая, что пучок света в обоих приборах проходил через один и тот яв участок геля (это необходимо, так как концентрация фзрлента меняется по длине геля). Во всех опытах спектры измеряли в учаотке геля о максимальной концентрацией фермента, которой находили путем сканирования геля в спектрофотометре. Для учета поглощения и дихроизма полиакрил-амида в кавдом геле измеряли также спектры в участке, не содер-

каваем фермент, и вычитали их из соответствующих спектров гелей с ферментом.

Мы обнаружили, что величина ЛД фермента отличны от нуля в области длин волн, где кофермент не поглощает. На рис.4 приведены зависимость ДЦ ( д А) от длины волны (Я) в области 380-600 нм для куриной цААТ, восстановленной боргидридом натрия. Из рисунка видно, что эта зависимость подчиняется закону Релея, то есть величина ДЦ обратно пропорциональна четвертой степени длины волны. Это позволяет предположить, что обнаруженный эффект связан с различным рассеянием белковыми глобулами света, поляризованного параллельно и перпендикулярно оси ориентации. Аналогичная зависимость была получена также для свиной цААТ и мААТ и использовалась в качестве поправочной функции к спектрам.ЛД.

Поскольку спектры АА.Т в видимой и близкой ультрафиолетовой области как правило представляют собой результат наложения нескольких перекрывающихся полос, мы проводили разложение полученных спектров ЛД и поглощения на индивидуальные полосы при помощи кривых логнормального распределения по методу, предложенному Метцле-ром и др. /5,6/. Компьютерные программы для разложения спектров были составлены нами совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии АН СССР Н.Б.Ульяковым и р.Б.Еуркиным.

По полученным данным рассчитывали величины приведенного ЛД, который представляет собой отношение ЛД к поглощению в максимумах соответствующих полос. Величины приведенного ДЦ изоферментов ААТ и их комплексов с лигандами представлены в таблице I.

2. Расчет углов поворота кофермента.

На основе модели одноосной ориентации в геле жестких макромолекул /7/ мы вывели следующие уравнения:

Р = Ах~ А" = I ( 1„зС05^) (I)

Ч 2

а = £ (з5ш(в)со«?0с£0 - 1 ) (2)

о

где А^, Ац и А0 - оптические плотности для света, поляризованного перпендикулярно направлению вытяжения геля, параллельно ему и для неполяризованного света соответственно; Р - приведенный ЛД; Л- угол между направлением дилольного момента перехода (ДМП) хромофора и длинной осью фермента; - степень ориентации моле-

Таблица I.

Величины приведенного ДД изоферментов аспартат-траисамиказн

форда фермента

(гол)

Р ж IV3 !

свиная • мААТ

свиная ЦААТ

430 9,9 11,0 14,0

Свободная ПЛФ-форла 360 6,7 3,3 15,0

330 -13,5 -12,6 -10,3

Комплекс ПЛФ-фореш о 440 14,4 11,6 16,1

глутаратом (0,1 М) 360 8,8 4,0 11,3

Ктлплеко ПЛФ-форгы о

2-оксоглутаратач (0,1 Ы) 440 14,4 - -

Комплеко Ш15-форл1 о 430 5,9 3,3 2,7

2-метиячд-аспартатом 360 6,7 5,7 И.4

(0,2 М)

Комплеко ПДФ-фор.ш о 490 8,9 9,7 4,9

эритро-З-окси-ь-аспартатом Ш 7,8 8,2 4,0

(ю ?;.0 440 7,1 10,0 2,8

Свободная Ш5-форла 330 -18,3 ■ -20,9 -23,5

феряент, восстановлений 330 -20,2 -19,9 -21,6

4

кул фэрлента}- о>{ 9 ) - плотность вероятности распределения углов меаду ооьа ориентации макромолекул и направлением вытяжения геля. ,

Степень ориентации в голе представляют собой интегральную величину, которая определяется размером пор геля, степенью деформация, размером л асимметрией белковых глобул. Из рентгено-структурннх данных известно, что при связывании лигандов внешняя форма молекулы ДАТ меняется незначительно; поэтому степень ориентации всех комплексов данного изофермента с лигандами можно считать одинаковой. Следовательно, если при образовании комплекса меняется величина приведенного ДД, то это означает, что меняется угол еС, то есть происходит либо поворот кольца кофермента, либо изменение направления ДМП в кольце.

- 12 -

Степень ориентации можно рассчитать по уравнение (I), если хотя бы для одного комплекса известна величина приведенного ЛД я угол «С . Угол Л можно определить, зная положение длинной оси молекулы фераэнта и направление ДЩ в хромофоре. Направления ДМП в шгрздннозои кольце дет разных форл коферлента были определены Езшсентш и др. /8/. Из соображений симметрии очевидно, что длинная ось молекулы ААТ расположена в плоскости, перпендикулярной оси второго порядка» Поэтому га длинную ооь принимали наиболее длинное направленна в проекции ферлента на эту плоскость, а именно пряыую, проходящую через точки, соответствующие проекциям атшог остатков 344 двух субъединиц на молекулярную плоскость хг. В случае куриной цААТ направление ДШ в молекулярной системе координат рассчитывали для комплекса о 2-оксоглутаратом (полоса поглощения при 440 нм) по координатам атомов кольца коферлента (предотавлены В.Н.Малашковнчем, Институт молекулярной биологии АН СССР) и данный о положении ДМП в пиридиновом кольце /8/. Степень ориентации куриной цААТ оказалась равной 3»4£. Поскольку рентгеноотруктурные данные по свиной мААТ отсутствуют, для расчета степени ее ориентации попользовали координаты атомов кольца коферыента в комплексе куриной мААТ с малеатом (предоставлены проф. Г.йнооЕиуоом, Бавельский университет, Швейцария). Учитывая, 410 степень гдаовопш первичных структур втнх ААТ составляет 86!?, мн считаем такса допущашэ приемлемым. Кроме того, мц предполагали, что наклон коферлента в коыплексо о малеатом и глутаратом различается незначительно и использовали для расчета величину приведенного ЛД, найденную для комплекса с глутаратогл. Рассчитанная таким образом отепонь ориентации мААТ оказалась равной 4,156.

Зная степень ориентации ферлента в геле, по уравнению /I/ определяли углы между ДШ и длинной ооыз. Величины углов о/ для • различных форл куриной цААТ и енкной мААТ и их комплексов о ли-гандами приведены в табл.2.

По известным углам X можно рассчитать углы поворота кольца коферлента. Расчет проводили следующим образом. Исходя из рент-геноотруктурных данных о положении ПЛФ в комплексе о 2-оксоглу-таратоы в случае цААТ и в комплексе о малеатом в случае мААТ? моделировали на ЭВМ поворот пиридинового кольца вокруг оои вращения о интервалом в 1° и для каждого шага рассчитывали углы ыеаду длинной осью ферлента и векторами ДМП, известными из рабо-

Таблица 2.

Углы между направлением ДМП в пиридиновом кольце кофврменга и длинной осью молекулы ААТ

Форма ферлента | | ^Г

Свободная ШЭ-форма» непротонированная 63° 58°

То яе, прогонированная 68° 67°

Комплекс ШГО-форлы о глутаратом, 0 0

непротонированный 66" 59

То же, протонированный 77° 68°

Комплекс ШГФ-форлы о 2-метиласпартатом, _ 0

непротонированный 63 61

То. яе, протонированный 62° 58°

Комплекс ШГФ-форлы о эритро-3- „ 0

оксиаспартатом 67" 65

Свободная Ш.И-форла 34° 35°

ты Винсента и др. /8/. Осью вращения во всех случаях, кроме комплекса о глутаратом, считали направление С2-С5 /9/; в случае комплекса с глутаратом, учитывая данные Янсониуса и Винсента /10/, за ооь вращения принимали направление н1-С4. По полученным данным находила такие положения кольца коферлента, при которых угол между направлением ДЩ и длинной осью совпадал с углом и. Таким образом были определены углы поворота коферлента в активных центрах ААТ на основных промежуточных стадиях реакции трансамширования. Результаты этих расчетов приведены в табл.3} положение коферлента в свободной непротонирозанной форме принято за исходное, положительные величины углов соответствуют повороту пиридинового кольца по часовой стрелке, если смотреть с вершины оси вращения (то есть со стороны атомов С-4 шш С-5), отрицательные величины углов соответствуют повороту против часовой стрелки.

3. Изменение ориентации кофермента в ходе реакции ферментативного трансакции рования

. Свободная пишдоксалэвая Фотхла. Различив величин ДД у протони-рованной и но протоки рованной формы внутреннего альдимина ШЕ5 было обнаружено ранее в ряде исследований ДД монокристаллов ААТ. Это

Таблица 3.

Углы поворота кофермента в различных формах цитозольной и митохондриальной ААТ

Форма фермента

Кружная

Т

Свиная мААТ

Свободная ПЛФ-форма, -

непротонированная О

То же, протонированная ., 27°

Комплекс ПЛФ-формы о глута- _ «

ратом, напротонированныЁ -17 или 17

То же, протонированный -10°

Комплекс ПЛФ-формы о

2-метиласпартатом, п

непротонированный О

То же, протонированный 44°

Комплекс ПЛФ-формы о па)

эритро-3-оксиаопартатом 14 или 63

13°

-49,5° или 2,5° -38°

16° 39° а)

84° или 53й

В расчете использованы данные Винсента и др. о положении ДМП в кольце хиноноида /8/.

В расчете использованы данные Савина о положения ДМП в кольце хиноноида /II/.

различие может объясняться либо поворотом плоскости ПЛФ, либо изменением ориентации ДМП в кольце кофермента. Расчеты, проведенные В.Л.Макаровым и др. /12/, показывают, что в случае куриной цААТ протонирование атома шинного азота приводит к повороту ПЛФ на 33° вокруг оси С2-С5. Эта величина хорошо согласуется о нашими данными, согласно которым при протонировании происходит поворот на 27° (табл.3, рис.5). У мААТ, плоскость кофермента поворачивается при протонировании на 13°, Наличие поворота, вызванного протонированием внутреннего альдимина, было недавно подтверждено при рентгеноструктурных исследованиях куриной мААТ /13/.

Нековаленгный комплекс Млхаэлиса. Образование нековаленгного комплекса Михаэлиса с глутаратом сопровождается увеличением приведенного ЛД у трех изученных изоферментов (табл.1). Поскольку при образовании зтого комплекса электронная структура хромофора не меняется, направление ДШ также не может измениться значительно. Следовательно, увеличение приведенного ЛД однозначно свиде-

о

О

Рис. 5. Спектры ЛД и поглощения свободной ШЮ-форьм свиной цААТ, рН 6,3. Тонкими линиями показаны индивидуальные полосы; тарной - их суша; крестами - экспериментальные точки.

тельотвует о реориантацин кофермента. Поворот плоскости пиридинового кольца при образовании нековалентного комплекса Михаэлиоа был недавно обнаружен (уже после опубликования наших данных) при реитгеноструктурных исследованиях куриной мААТ, причем осью вращения оказалось направление И1-С4 /10/. Наши расчеты показывают, что величинам приведенного ЛД, • найденным для протонированной формы комплекса о глутаратом, соответствует поворот вокруг оси ц1-С4 иа -10° и -38° в случае цААТ и мААТ, соответственно. В случае непротонированного комплекса о глутаратом расчет дает два возможных полевения кофермента; по данным ЛД выбор между ними сделать невозможно.

Внешний алышмин. Образование внешнего альдимина о 2-меткл-аопартатом приводит к уменьшению величины приведенного ЛД в 2-5 раз (табл.1). Как и в случае комплекса о глутаратом, изменение приведешого ЛД может объясняться только реориентацией кофермента. Приняв, что осью вращения является направление С2-С5 /9/, мы нашли, что угол поворота равен 44° для цААТ и 39° для мААТ (табл.3)| этот результат хорошо согласуется о рентгеноструктурными данными, по которым угол поворота составляет 30-35° /9/. Сравнение углов поворота коферлента в комплексе о глутаратом и 2-метилаопартатам позволяет предположить, что при образовании нековалентного комплекса Михаэлпса коферлент отклоняется от субстратной площадки, а при образовании внешнего альдампна поворачивается в сторону оуб-отрата.

Резкое различие ориентации кольца коферлента у протонированной и непротонированной форл комплекса о 2-метиласцартатом не вызывает удивления. Из спектральных и рентгоноструктурпых данных известно, что в протонированной форме этого комплекса сохранена внутренняя альднминная связь между ПЛФ и белком, а протонирован-ная форла представляет собой внешний альдимин.

Хиноноидннй интеп-ютптат. В случае хиноновдного комплекса о зрятро-З-оксиаспартатом наши расчеты были затруднены ввиду отсутствия надежных экспериментальных данных о положении ДЩ в кольце кофермента. При расчете по данным Виноента и др. /8/, в случае цААТ было найдено, что коферлент занимает промежуточное положение мееду внутренним и внешним альдимином, а в случае мААТ угол поворота кофермента оказался равным 84°. Однако данные Виноента и соавторов о направлении ДМП в хиноноиде не надежны, так как рентгеноструктурный анализ этого интерледаата не проводился.

Направление ДМП в хиноноиде, определенное Ф.Савиным при помощи квантовомеханических расчетов /II/, совпадает о осью и 1-С4 и отличается от направления, найденного Винсентом и др. на 24°. Принимая за основу данные Савина, мы нашга, что в комплекое о эрит-ро-3-оксиаспартатом кольцо коферлента повернуто на 63° и 54° у цААТ и мААТ, соответственно (табл.3). Таким образом, переход от внешнего альдимина к хиноноиду сопровождается дополнительным наклоном кольца в сторону субстратной площадки. Этот результат удовлетворительно согласуется с данными Кирша и др. /9/, полученными методом компьютерной графики.

Свободная пиридоксаминовая форма. Из проведенных наш расчетов следовало, что у свободной ГОй-форлы кольцо коферлента повернуто на 74° и 92° в случае цААТ и мААТ, соответственно (табл. 3). Геометрия активного центра не допускает такого поворота. Это, по-видимому, означает, что в .панном случае ось вращения кольца не совпадает о осью С2-С5. Это предположение, содержащееся в опубликованной нами статье (см.й 5 списка работ по теме диссертации), било недавно подтверждено при рентгеноструктурном анализе мААТ /13/. Обращает на себя внимание близость величин приведенного ЛД ПШ-формы у трех изоферментов (табл.1). Это позволяет предположить, что ПШ занимает сходное положение в активных центрах изученных нами ААТ.

4. Разложение полосы при 420-440 нм в спектре внутреннего альдимина ПЛФ

В большинстве случаев положение максимумов в спектрах ЛД и поглощения совпадает или различается незначительно. Заметное различие в положении максимумов наблюдается только в полосе при 420-440 нм. Это различие, а также наличие небольшого плеча на длинноволновой стороне данной полосы в опектре ЛД указывают на ее неоднородность. Асимметрия полосы особенно сильно выражена в опектрах ЛД свободной свиной мААТ и ее комплексе с глутаратом; в последней случае удалось достоверно разложить эту полосу на индивидуальные полосы с максимумами при 4Г7 и 450 нм (рис.6), возможно, что сложная структура полосы щж 420-440 го» объясняется существованием в активном центре изомеров протонированной формы внутреннего альдимина ПЛФ.

Рис. 6. Спектры ДД в поглощения комплекса свиной мААТ с глута-ратом, рН 6,0 (см. пояснение к рис. 5).

Рас. 7. Спектры ЛД и поглощения.свободной Шй-фэруи куриной . ШХ в области 250-325 нм.

5. Линейный дихроизм остатков ароматических аминокислот в белке

Спектр куриной цААТ в области поглощения остатков ароматических аминокислот представлен на рио.7. Обращает на себя внимание резкое различие спектров поглощения и ЛД в этой области. Широкая полоса поглощения при 280 нм расщепляется в спектре ЛД на ряд узких полос с максимумами при 275, 281, 287 и 295 нм. Разрешение этих полос связано, очевидно, с влиянием ориентации остатков ароматических аминокислот на величину их вклада в спектр ЛД. Это наблюдение открывает в принципе возможность применить метод ЛД для изучения конформационных переходов в белках, не содержащих таких удобных хромофоров как' ПЛФ.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики, позволяющие получать количественно воспроизводимые спектры линейного дихроизма аспартат-трансаминазы, ориентированной в сжатом блоке полиакриламидного геля.

2. Измерены и проанализированы спектры линейного дихроизма и поглощения'трех аспартат-трансаминаз (цитозольных изоферментов свиньи и курицы и митохондриального изофермента свиньи) и их комплексов с аналогами субстрата.

3. Проведен анализ модели ориентации макромолекул "в сжатом геле и выведена зависимость величины приведенного линейного дихроизма от угла между направлением дипольного момента перехода в хромофоре и длинной осью молекулы,фермента. •

4. Разработай метод расчета на ЭВМ угла.поворота плоскости кофермента по данным линейного дихроизма, и рентгеноструктурного анализа. При помощи этого метода рассчитаны углы поворота кофермента в активных центрах цитозольной и митохондриальной.аспартат-трансаминаз на основных промежуточных стадиях реакции трансами-нирования. Обнаружены различия в углах поворота кофермента между цитозольным и митохондриальяым изоферментами, которые, по-видимому, связаны с их каталитическими и структурными особенностями.

5. Обнаружена неоднородность полосы при 420-440 нм в спектрах линейного дихроизма и поглощения протонированной формы аспартат-трансаминазы и ее комплекса с глутаратом; определены параметры индивидуальных полос..

- 21 -Список литеоатурн

1. Абдурахманов И.А., Ганаго А.О., Ерохин Ю.Е. Линейный дихроизм ориентированных хроматофоров и пигмент-белковых комплексов из фотосинтезируюдей бактерии Chromatiua Mlnutlssimua. Докл. АН СССР. 1978, т.242. с.1197-1199.

2. Сазыкин А.И., Макаров В.Л.. Торчинский Ю.М., Браун-птейн А.Е. Исследование спектров линейного дихроизма аспартат-трансаминазы, ориентированной в полиакриламидном геле. - Докл. АН СССР, 1981, т.256, с.1018-1021.

3. Abdourakhmanov I.A., Ganago А.О., Erokhin Yu.E.. So-lov'ev A.A., Chugunov V.A. Orientation and linear dichroista of the reaction centers from Rhodopseudcmonas Sphaeroldes R-26. -Blochlm. et Blophys. Acta, 1979, v.546.' p.183-186.

4. Davldsson A., Norden B. Aspects of the conversion of Legrand-Grosjean circular dtchrolsm spectrometers to linear dl-chroisn detection. - Chera. Scripts, 1976, v.9, p.49-53.

5. Johnson R.J., Metzler D.E. Analysing spectra of vitamin Be derivatives. - Meth. In Enzymol., 1970. V.18A, p.433-470.

6. Metzler D.E., Harris C., Yang l.-Y., Slano D., Thomson J.A. Band-shape analysis and display of fine structure In protein spectra: a new approach to perturbation spectroscopy. -Biochea. and Biophys. Res. Conmuns., 1972, v.48, p.1588-1597.

7. Ганаго A.O., Фок M.B., Абдурахманов И.А., Соловьев А.А.. Ерохин Ю.Е. Анализ линейного дихроизма реакционных центров, ориентированных в полиакриламидном гело. - Мол. биология, 1980,

т. 14, с.381-389.

8. Vincent M.G., Plcot D., Elchele С., Jansonlus J.N.. Klr-sten H., Christen P. Linear dlchrolsn measurements on single crystals of mitochondrial aspartate aminotransferase. - Ins Chemical and Biological Aspects of Vitamin B6 Catalysis, Part B,

N.Y., Alan R. L'ss. 1984, p.233-243.

9. Klrsch J.F., Elchele C,.. Ford G.C., Vincent M.G., Jansonlus J.N.. Cehrlng H-, Christen P. Mechanism of action of aspartate aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure. - .;. Mo 1. Biol.. 1984, v.174, p.497-525,

10. Jansonlus J.N., Vincent M.C. Structural basis Tor catalysis by aspartate aminotransferase. - In: Biological Macroaolt-cules and assemblies. N.Y.. Wiley. 1987, v.3. p.187-285.

П. Саьин Ф.А. Поляризаиия переходов в электронных спектре*

модельных молекул группы витамина В6- - В кн.: Физико-химические проблемы ферментативного катализа, М.: Наука, 1984, с.69-83.

12. Makarov V.L., Kochklna V.M., Rosenberg M.V., Torchlnsky Yu.M. Reactions ol coenzyme In the active site of chicken cytosolic aspartate aminotransferase. - In: Chemical and Biological Aspects of Vitaaln B6 Catalysis, Part B, N.Y., Alan R. Llss, 1984, p.213-221.

13. McPhalen C.A., Vincent M.G., Plcot D., Jansonlus J.N. Recent studies on mitochondrial aspartate aminotransferase: structure and mechanism. - Biochemistry of vitamin B6, Basel, Blrkhauser Verlag, 1987, p.99-102.

Список опубликовавших работ по теме диссертации-

1. Makarov V.L., Kochklna V.M., Rosenberg M.V., Torchln-sky Yu.M. Reorlentatlns of Coenzyme In the Active Site of Chicken Cytosolic Aspartate Aminotransferase; - In: Chemical and Biological Aspects of Vitamin B6 Catalysis, Part B, N.Y., Alan R. Llss, 1984, p.213-221.

2. Rosenberg M.V., Makarov V.L., Torchlnsky Yu.M. Linear Dlchroisa.of Aspartate Aminotransferase Oriented In Polyacryl-amlde Gel. - In: Abstracts of 16th FEBS Meeting, Moscow, 1984, p.152.

3. Розенберг M.B., Макаров В.Л., Механик М.Л., Торчинский Ю.М. Исследование подвижности кофермента в активном центре аспартат-аминотрансферазы путем измерения линейного дихроизма, ориентированного в геле фермента. - В сб.: Тезисы докладов и стендовых сообщений 4 советско-итальянского симпозиума "Макромолекулы в функционирующей клетке", Киев, Наукова думка, 1984,

с.102.

4. Розенберг М.В., Макаров В.Л., Торчинский Ю.М. Линейный дихроизм цитозольной куриной аспартат-аминотрансферазы, ориентированной в полиакриламидном геле. — Мол. биология, 1985, т.19,

с.1669-1676.

5. Розенберг М.В., Макаров В.Л., Босса ф., Торчинский Ю.М. Линейный дихроизм изоферментов аспартат-аминотрансферазы, ориентированных в полиакриламидном геле. - Докл. АН СССР, 1987,

Т.294, с.492-496.

6- Rosenberg M.V., Makarov V.L., Bossa F>, Torchlnsky Yu-M. Reorlentatlns of the Coenzyne In the Active Sites of Aspartate

Anlnotransferase Isoenzymes Studied by Linear Dlchrolsm Method. - In: Abstracts of International Congress on Chemical and Biological Aspects of Vitamin Bg Catalysis, Turku, 1987, p.69.

7. Rosenberg M.V., Makarov V.L., Bossa F., TorchlnsVy Yu.M. Coenzyme Reor1 en tat 1ns In the Active Sites of Aspartate Aminotransferase Isoenzymes. - in: Biochemistry of Vitamin B6, Basel, Blrkhauser Verlag, 1987, p.129-133.