Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение культуры бактерии рода BLASTOBACTER продуцента антибиотика-амебоцида

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение культуры бактерии рода BLASTOBACTER продуцента антибиотика-амебоцида"

^ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Эль Сайад Мохамед Султан Бахнасави

ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИИ РОДА ВГЛЗГОЗиСХИ? ПРОДУЦЕНТА АНТИБИОТИКА -АМЕБСШШ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1993

Диссертационная работа наполнена в лаборатории микробиологии Биологического НИИ Санкт-Петербургского государственного университета.

Научный руководитель - доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Б.В.Громов.

Официальные оппоненты - доктор технических наук, профессор В.И.Оухаревич. кандидат биологических наук Ю.И.Маолов.

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский технологический институт.

Защита состоится 17 июня 1993 г. в час. на заседании Специализированного совета К 063.57.12 по присуждению ученой степени кандидата наук .>■ Санкт-Петербургском госуниверситете по адресу: 199034, г.Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9, в ауд. Б-1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Университета

Автореферат разослан " 3/ " (¿¿й 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО МКА РАБОТЫ

Актуальность проблему: Микроскопические водоросли являются перспективным источниками лицевого и кормового белка, биологически активных соединений, пигментов и т.п. При массовом выращивании водорослей в культурах цроисходит развитие вселин-дев, использующих водоросли в качестве пищи и значительно снижающих продуктивность культур. Особенно большой врэд приносят различные амебы. Использование для борьбы с амебами известных антибиотиков и других лекарственных препаратов является недопустимым, поэтому поиски новых амебоцэдов представляют значительную актуальность.' Некоторые амебы, кроме того, являются возбудителями опасных заболеваний человека, поэтому поиск антибиотиков с амебоццдным действием может представить интерес для медицины.

Цель и задачи исследования: Цэлыо данной диссертации явилось изучение биологических особенностей бактерии, выделенной в лаборатории микробиологии й обнаружившей ачебоцидный эффект в отношении амебы, поедающей клетки водоросли хлореллы. Бактерия на основе ее морфологических особенностей была определена как представитель рода почкующихся бактерий В1аэгоЬао1ег.

В соответствии о указанной целью в работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить морфологические особенности бактерки^образую-щей амеФцид.

2. Изучить культуральныв и биохимический свойства бактерии, и уточнить ее систематическое положение.

3. Определить условия образования антибиотика-амэбоцзда бактерией и определить специфичность его действия.

г

4. Разработать метода выделения антибиотика из культуры бактерии.

Научная новизна: Впервые изучена бактерия относящаяся к роду вlastoЪaoteг , образующая антибиотик. Охарактеризованы морфологические, культур альные в некоторые биохимические особенности шташа продуцента. Изученная форма по совокупности признаков не может быть отнесена к какому-либо из известных видов этого рода, возможно она представляет новый вид рода, однако, по мнению автора, для описания нозого вида наобходам дополнительные исследования.

Разработан метод выделения активного соединения из культуры бактерии. Установлено, что активное начало содержится в куль-туральной среде. Антибиотик-сырец обнаруживает активность в отношении исследованной амебы и некоторых грибов, однако неактивен в отношении испытанных водорослей ж бактерий.

Практическая ценность работы:' Показано, что амебоцид, образуешь исследованной бактерией, может способствовать улучшению роста водоросли хлорелла в культурах, зараженных амебой.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 2-х глав экспериментально^ части работы, выводов и описка литературы. Работа излсиена на 6 0 страницах машинописного текста, содержит Ю таблиц и 3 рисунка. Список литературы включает 5 8 источников, в том числе 3 9 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Культура бактерии была выделена Н.Н.Титовой из почвы хлопкового поля под Ташкентом (Узбекистан). Бактерию культивировали в стандартной среде №3 (Громов и Титова, 1988) цри температуре 25°С.

При шпфоскопировании культура было установлено, что бактерия размножается почкованием без образования гиф и на основе особенностей морфологии мотет быть отнесена к роду Biostobao-ter. Студенткой В.А.Влельяненко (1990) было обнаружено, что эта бактерия угнетает наделенную ею амебу, питающуюся клетками хлореллы. Было высказано предположение, что эта бактерия макет быть использована для борьбы.с развитием амеб в массовых культурах хяорелгш.

Культура амебы выла выделена из пруда в парке Биологического института Санкт-Петербургского университета. Амеб выращивали В культуре водоросли Chlorolla vulgaris Beijar(CALU 157, на стандартной среде Л 10 в жидкой среде или на поверхности агара цри температуре 25°С на лшинестате при непрерывном освещении люминесцентными лампами при силе света около 1000 люкс. Амеба была определена Б.З.Громовым как Pilsmonba nolandi Page ( P»ge, 1976).Одиночные клетки амебы образуют многочисленные тонкие филоподии, обычно отходящие от светлых периферических зон ее цитоплазмы. Амебы захватывают многочисленные клетки водорослей, наевшиеся амебы малоподвижны и почти лишены филоподиЗ. Клетки одноядерны, размножаются бинарным делением. При развитии на газоне хлореллы амебы образуют отдельные зоны - бляшки, в которых не остается зеленых клеток водорослей и потому налет становится коричнево-бурым за счет

k

экокретируемых шефами недопераваранных остатков клеток водорослей. При нанесении на агар большого количества амеб вся поверхность среды со временем становится бурой. При неблагоприятных условиях амебы образуют круглые цисты с гладкой поверхностью. . •

При исследовании специфичности угнетающего аффекта бактерии были использованы культуры зеленых водороолай из коллекции культур водорослей лаборатории микробиологии Биологического КИИ Санкт-Петербургского университета (Громов и Титова, 1988). Цианобактерия и водоросли выращивали на поверхности агаризованной стандартной среды & 6 при температуре 25°С при непрерывной оовещении лхшиесцентными лампами при силе света около 1000 люкс.

Были использованы также культуры бактерий и грибов, имеющиеся на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского университета. Бактерий культивировали на мясо-пептонном агаре при температуре 30°С, грибы - на сусло агаре при той же температуре.

При изучении штамма бактерии были использованы традиционные микробиологические методы г приведенные в руководстве Ф.Изрхардта (1983), за исключением того, что в качестве минеральной основы использованных сред был использован раствор И (Громов и Титова, 1988). Бактерию культивировали в термостата при 30°С.

Стандартная среда ¡i I имеэт следующий состав мг/л: кяо3 6 100, кгнк>4 _66(7; MgS04- 7Н2о -33,3¡ микроэлементы - I мл/л.

Морфологические особенности бактерии изучали в прижиэ-

ненных или окрашенных препаратах в оветовом микроскопе или после негативной окраски препарата уранилацетатом (2$ водный раствор) в электронном микроскопе Teeia 5flo,s*.

О возможности использования бактерией тех ют иных веществ судили по росту бактерии в пробирках с соответствующий веществом при использовании в качестве основы среды й I. Бактерий выдерживали цри температуре 30°С в течение недели. О росте судили по помутнению среда, образованию пленки и осадка.

Для определения чувствительности бактерии к различным антибиотикам использовали стандартные бумажные диски с антибиотиками. Диски помещали на поверхность агаризованной среды №3 зараженной бактерией, о чувствительности судили по образованию зон отсутствия роста бактерии вокруг дисков.

Для определения содержания в ДНК бактерии гуанина+цито-зина (в молярных процентах) бактерию выращивали в колбах о жидкой средой №3, использовали культуру находящуюся на поздней логарифмической фазе роста. Извлечение ДИК из клеток осуществляли rio методу Мармура (капшг . 1961).

Состав оснований определяли методом тепловой денатурации { Karmur, Doiy, 1962 )• Определение состава оонованнй ДНК проводили В UaCl -ЦИТраТНОМ буфере (0,16 М NaCl -0,015 М цитрат lía , рН 7,0). ДНК плавили в термостатируемой кювете спектрофотометра на базе Института микробиологии РАН.

Определение биологической активности бактерии проводили методом агаровых блоков. Для выделения биологически активного вещества использовали культуру бактерии, выращиваемую в течение 14 дней в колбах с жидкой сродой J& 3. Клетки бакте-

б

рии отделяли от среды центрифугированием на центрифуге 0С-6М 15.мин при 5000 об/мин.

Для анализа брали: нативный раствор и осадок клеток.

Культуральную жидкость разделяли на три части, в каждой доводили рН до 9,3; 7,1 и 3,1.

Для экстрагирования веществ из культуральной жидкости использовали органические растворители: этилацетат, хлороформ. Растворитель из органической фракции выпаривали на вакуумном испарителе досуха. Экстрагированное вещество растворяли в дистиллированной воде.

Клеточный осадок обрабатывали ацетоном, метанолом или этанолом. Растворитель выпаривали на вакуумном испарителе. Полученное вещество раотворяли в дистиллированной воде.

Активность экстрагированных фракций проверяли методом бумажных дисков и методом двукратных разведений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клетки бактерии палочковидные не вполне правильной формы, нередко изогнутые, одиночные или по 2. часто образуют розетки, состоящие из нескольких клеток соединенных полюсами, на которых почки не образуются. Концы клеток закруглены или слегка сужены. Иногда наблюдается ветвление клеток с образованием У подобных форм. Размеры клеток Ш- 0,8 х 3,1-4,5 мил, в среднем 1,5 х 4,0 мкм. Клетки грамотрицателъные, спор или капсул не образуют. Клетки подвижны, имеют 1-2 субполярных жгутика. Размножение происходит только за счет образования на одном из полюсов клеток-почек. Дочерние клетки-почки'меньше по размеру, чем материнские клетки.

При росте в жидких средах бактерия вызывает помутнение

среда, в старых культурах образуется осадок. На плотной среде образует точечные колонии около I ил диаметром, колонии кремового цвета, колонии круглые, гладкие с волнистым краем, выпуклые, блестящие, непрозрачные, по консистенции - мягкие, легко снимаются с агара.

При посеве уколом в столбик агара бактерия растет по всему уколу, т.е. являвтся факультативным анаэробом. Каталазо-полежительна. Гидролизует крахмал и слабо гидролизует желатину. В витаминах или аминокислотах не нуждается. Растет в среде с 2$ iiaci не растет при 4% nací.

Наилучший рост бактерии наблвдался при температурах 25-30°С, при 40°С отмечен очень слабый роот, а при 45 роста нет.

Наилучший рост бактерии наблвдается при значениях рН нейтральных или слабо щелочных. Хороший рост бактерии наблюдали в среде la I, к которой бола добавлена глюкоза, также хороший рост наблвдали в средах о метиловым или этиловым спиртами (0,5 объемных %'.. Выдерживает концентрации этанола до 4/5, растет, хотя и слабо, при 55» метанола в среде.

Из испытанных Сахаров и многоатомных спиртов хороший рост обеспечивают глюкоза, сахароза, рамноза и дульцит. В некоторых случаях наблюдается подкисленив среда и газообразование (табл.1).

Как мояно видеть из данных таблицы 2, бактерия хорошо растет на жирных кислотах пальмитиновой и олеиновой, в то время как низкомолекулярныэ кислоты используются слабо или не обеспечивают роста.'

Таблица I

Использование Сахаров и многоатомных спиртов штаммом В1аогоЬао1ег ер.

№ п/п Источник углерода Рост Образование кислоты Образованно газа

I. Глюкоза -и- - +

2. Галактоза - - -

3. Сахароза ++ + -

4. Ксилоза + + -

5. Арабиноза' + + -

6. Мальтоза - +

7. Ра "финоза - - -

8. Рамноза -и- + +

9. Машшт - - -

10. . "Инозит . ' + - +

II. Дульцит ■И: -

12. Сорбит — +

Примечание: + слабый рост или подкисление среды или образование газа; ■*•+ хороший рост; - отсутствие роста или подкисление среды или образование газа.

Таблица 2

Использование органических кислот штаммом в1аа1оЬвогег ер.

Ш п/п Источник углерода Характер роста

I. Повелевал кислота +

2. Лимонная кислота -

3. Глутаровая кислота +

4. Винная кислота -

5. Малеиновая кислота -

6, Пальмитиновая кислота -и-

7. Олеиновая кислота -Н-+

8. Слизевая кислота -

Примечание: использовали натриевые соли кислот, концентрация солей в среде соответствовала 0,1$; + слабый рост, ++ хороший рост, +++ очень хороший рост.

Только немногие аминокислоты могут служить бактерии источником углерода. Это алашш, аргинин и тирозин. Многие аминокислоты могут быть использованы в качестве источника азота.

Бактерия не растет в средах без связанного азота, не использует мочевину и нитриты. Рост наблюдается в средах с нитратом, лучший рост обеспечивает пептон пли гидролизаг казенна. Могут быть использованы некоторые аминокислоты.

Бактерия оказалась устойчивой к пенициллину, отроптомици-

ну, бензшшенициллину, эритромицину, оксадиллину, слабо чувствительно к ристшицину, левомицетину, ингибируется мономи-цином, полимиксином, гентамщином.

Содержание гуанина+цитозина в ДНК бактерии по данным определения температуры плавления соответствует 50,6 1$. Эта величина значительно меньше, чем соответствующие значения указанные для описанных ввдов Blastobaoter (табл.4).

В таблицах 3 и 4 представлены данные, пзволяющне сравнить свойства исследованной культуры со свойствами описанных в литературе влдов бластобактера. Очевидно, что наш организм не может быть отнесен ни к одному из известных видов. Особенно существенным является низкое содержание Г+Ц оснований в ДНК (табл.4). Правда, и у описанных видов этот показатель различается примерно на 10 С учетом наших данных варьирование содержания Г+Ц в ДНК бластобактеров достигает 20 "»$, что для представителей одного рода недопустимо ( staley et al., 1989). По нашему мнению, исследованная культура, вероятно, должна быть описана в качестве самостоятельного вида, однако предварительно следует провести дополнительные иссл-цования.

Шли испытаны и оказались устойчивыми к действию бактерии культуры грамотрицательных и граммполояительных бактерий, зеленые водоросли, бактерия угнетала развитие испытанных культур дрожжей.

В вариантах, где биологически активное вещество угнетало развитие амеб, вокруг бумажного дизка наблюдалась четкая зона роста клеток Chlorella . В вариантах, где не было амебоцвд-ного действия, почти все клетки водоросли вокруг диска были съедены амебами.

Как видно из табл.5, наибольшим аыебоцидным действием обладает фракция ЕАВ, полученная экстрагированием хлороформом при рН 9,3 из культуральной жидкости. При экстрагировании БАЗ из клеток метанолом, этанолом и ацетоном вокруг бумажных дисков, смоченных раствором соответствующей фракции, появились стерильные зоны, что указывает ка сильное подавление роста амеб и клеток хлореллы.

Таблица ¡5

Размер зон угнетения роста амеб вокруг бумажных дисков

О Экстрактами ИЗ Культуры В1ав1;оЬас*ег вр.

Способ получения экстракта Диаметр зон мм

Этилацетат рН 3,4 11,2

Хлороформ рН 7,1 6,5

Хлороформ рН 9,3 12,8

Этилацетат рН 7,1 10,5

Этилацетат рН 9,3 10,2

Примечание: в таблице приведены только варианты, в которых наблюдалось угнетение амебы.

Антибиотик-сырец, полученный из культуральной среды экстракцией хлороформом,представлял собой очень рыхлый порошок белого цвета с резким запахом. Вещество хорошо растворяется в воде.

О влиянии добавления различных количеств антибиотика-сарца на развитие водороолей и аглеб з жидкой культуре можно судить по данным,приведенным в таблице б. Как видно из табли-

цы,значительный эффект наблюдается уде при содержании антибиотика в среде 0,02 мг/мл, а цри его содержании 0,04 мг/мл наблюдается полное угнетение развития амебы.

Таблица 6

Влияние антибиотика-сырца на развитие водорослей и амеб в жидкой среде

№ Концентрация Количество клеток в I мл, на 14-е сутки п=4

вещества, мг/мл —■-ет-?—;-и-

Хлорелла, 1-10° Амебы, 1-Ю4 Цисты, 1.10*

т 46,3 ± 3,5 0 - 0 43,3 ± 3,5

2 0,165 • 63,0 ± 6,4 0 - 0 15 ± 5,0

3 0,083 22,3 ± 1.3 0 - 0 . 35,0 ± 5,0

4. 0,041 14,5 ± 0,9 0± 0 55,0 * 20,0

5 0,021 12,5 ± 0,6 2,5 ± 0,8 26,3 ± 10,1

6 0,010 8,54 ± 1.3 2,5 ± 0,8 70,0 ± 27,0

7 0,005 8,01 ± 0,9 2,5 ± 0,8 26,2 ± 9,2

8 0,003 6,12 * 0,8 2,5 ± 0,8 83,75 ± 18,5

3 0,С01 6,54 ± 0,5 1,25 ± 0,05 30,0 15,0

10 контроль 6,05 ± 1,5 2,5 ± 0,8 185,08 ± 20,0

Антибиотик^добавленный в незараженную культуру хлореллы в концентрациях полностью угнетающих развитие амебы не вызывает

угнетения водоросли.

Полученные данные, несомненно, представляют интерес, так как использование ирепаратов, применяющихся в медицине, в массовых культурах водорослей (главным образом, идущих на службу

сельскому хозяйству) запрещено, и для защити культур от микроскопически;! хяцников оправдан поиск новых антибиотических веществ направленного аыабоцидного действия.

Таблица 3

Сравнительная характеристика известных видов Blaetoba?tsr ( ПО Trotsenko et nl., 1989) и оригинальной культуры Blaotobaoter ар.

Организм

Признак

о §

■а

Я

m я

О о й о

ю +* 5 •н VI

3 а 0 -н

•н ы гН и

а +» V ь g р. •А

W « о

й а о •О

я я я я

4. 5 6 7

■1

р

Д яййо "йД

(Р (Ч pq и я я я«

I 2

- - - - + - + -

+ + + ' + - + - +

- + + - + - ■ -

+ - - + + - - +

- - - + + - + +

НО + + + - - - -

НО + - но - + +

НО . + + - + - + +

НО + - + + + - +

НО но но - - + + +

но + + - - + +

но + + но + + • - +

но - но но - - + +

но - - но + - - *

но - но но + - +

но но но - — + -

ко - но - + - + -

но 30 но но НО 27 41 SO

но 6,8 но но но 7,3 7,3 7,4

Почки палочковидные

Почки ифуглне или овальные

Наличие капсулы

Образование розеток

Подвижность

Желтые колонии

Рост на метаноле

Роот на этаноле

Образование кислоты из глюкозы

Редукция нитрата энергетическая

Редукция нитрата ассимиляционная

Рост на сахарозе

Рост на глютарате

Использование аргинина

Использование пролина

Образование кислоты из маннита

Использование мочевины

Оптимальная температура °С

Оптимальное значение рН

Примечание: НО - не определено; + признака.

наличие признака, -огсутстаие

Таблица 4

Размеры клеток и содержание Г+Ц в ДНК у известных видов В1ав^ьас1эг (по тгогеепко et а1., 1989 ) и оригинальной культуры В1аа1;оЪа^ег ар.

Организм Признак м ■н и •п 3 о а •н о ё ш ® -н Я > я га о •а и о о С! .1 Я B.natatoгius B.aggregatus т 3 4* <1 >-) 3 ш о. Й о я га Й о •н ■н •н ■н О <и •о я о, а и в* -р с {С а о ^ а в 3

Размеры клеток мкм 1 0,6 - 0,8 х 0,5-0,9 х 1,5 - 2,3 1,0-3,2 0,8-1,0 х 1,5-3,0 1 ■ 0,5-0,8 х 1-3 0,6-0,8 X 1,5-2,3 0,7-0,9 х 1,5-2,3 0,6-0,8 х 1,5-2,3 0,5-0,8 х 3,1-4,5

Г+Ц 1$ НО 66,3 69,0 65,0 60,4 58,9 64,5 50,5

Примечание: НО - не определено.

выводы

1. Изучена бактерия, подавляющая развитие амебы, поедающей клетки водоросли хлореллы.

2. Бактерия, угнетающая амебу относится к роду вгаэгоЬао-*ег ( но не мсжет быть отнесена к какому-либо из известных видов этого рсда.

3. Бактерия образует антибиотик-амебоцид^который накапливается в культурзльной среде и может быть экстрагирован хлороформом при рН 9,3.

4. Антибиотик-сырец в концентрации 0,04 мг/мл полностью подавляет развитие амебы в культуре водоросли,при этом не оказывая эффекта на рост водоросли.