Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск продуцентов новых антибиотиков среди актиномицетов почв Казахстана

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Поиск продуцентов новых антибиотиков среди актиномицетов почв Казахстана"

АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ'

На правах рукописи

РЬШЖАНОВА ЗАУРЕШ АЛЬМУХАНОВНА

ШИСК ПРОДУЦЕНТОВ НОВЫХ АНТИБИОТИКОВ СРЕДИ АКГШШЩЕТОВ ПОЧВ КАЗАХСТАНА

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1991

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии, Академии наук Казахской ССР

Научные руководители: доктор биологических наук Ветлугина Лилия Александровна кандидат биологических наук Хожамуратова Светлана Шарафедденовн

доктор химических наук Шенин Юрий Дмитриевич кандидат биологических наук Мамилов Шамиль Зайнилович

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательский

Защита диссертации состоится #£¿#£¿¿1991 г. в 14.ОС

С

на заседании специализированного совета (К.008.01.01) по защите кандидатских диссертаций при Институте микробиологии и вирусолс

Официальные оппоненты:

Института по изысканию новых антибиотиков АМН СССР

гии АН КазССР

Адрес: 480ЮО, Алма-Ата, у л. Кирова 103

о

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИМ и В

АН КазССР

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Актуальность темы. Антибиотики явлпптся мощными средствами лечения бактериальных и грибковых инфекции, онкологических заболеваний. Наряду о медицинским использованием антибиотики нптли применение в ветеринарии, я такте в, «швотноводотве кпк стимуляторы рпгтя кнпотнмх, в пищевой промышленности кпк консерванты, в растениеводство для бпрь^м г пяболеваннями растений и кпк ростгтимулирувдцие вещества. Они используются в нлучнюг лрборл-ториях кпк уникалышо ингибиторы опрепеленннх биохимических процессов П '»ИВОЙ КЛОТНР.

С яругой стороны широкое использование антибиотиков в медицине И РЛЗЛИЧНЫХ "Трполях НЯРОЦНОГО хозяйства создало прошлому устойчивости к птим веществом. Эффективность применяемых антибиотиков с каждым годом снижается.

Поотому иэнпконио и изучение новых -антибиотиков по-ирек-нему остается одной из лкт\'альнмх проблем современной нлуки.

Одним ио эффективных путей поиска является использование новых родов микопорганизмоп в качестве продуцентов-антибиотиков. В отом отношении большой интерес представляют редко встречающиеся и мало иоу«оннгр формч лктиномипетов, которые на обычных питательных 'т^п.чх выполяютоя о тр'/цом. Для их выделения применяются селективные среды о добавлением антибиотиков, подавляющих рост обы^чо"' почвенной микроФлоон и создающие условия для роста медленно рлегуиих лктиномипетов, относящихся к редким родам Порядка Л.: I 1 ионуее 1

Для кпч!Пот"1 региона характерны свои природно-климатические д'одопип, способствующие распространению определенных групп микрерппнипмор.

Казахстану приопце разнообразие географических вон и типов :.очв. Опнлко, почвенные лктпноминеты данного региона недос-

таточно изучены на предмет выявления продуцентов новых антибиотиков и других биологически активных веществ.

Использование новых подходов к выделении антагонистов с одной стороны и применение в качестве объектов исследования казахстанских почв и других природных источников с другой, мокет привести к выявлению оригинальных актиномицетов, редко встречающихся в природе, продуцентов новых антибиотиков с ранее неизвестным механизмом действия, представляющих интерес для медицинской практики и различных отраслей народного хозяйства.

Цель работы - поиск продуцентов антибиотиков среди стреп-томицетов и актиномицетов редких родов, выделенных из почв Казахстана.

В работе поставлены следующие задачи:

1. Выделение актиномицетов из почв на селективных средах с антибиотиками.

2. Расширение круга применяемых селективных агентов с целью повышения возможности обнаружения новых форм актиномицетов.

3. Изучение распространения редко встречающихся форм актиномицетов в различных типах почв и областях Казахстана.

4. Изучение антагонистических свойств и антибиотической активности отобранных штаммов актиномицетов.

5. Отбор культур, перспективных для изыскания новых антибиотиков и определение их видовой принадлежности.

6. Изучение условий формирования вторичного роста у отобранных культур актиномицетов и выявление их особенностей.

Научная новизна и практическая ценность. Расширен круг селективных агентов, применяемых для выделения из природных суб-

стратов редко встречающихся форм актиномицетов.

Впервые установлено, что тавромицетин способствует преимущественному выделения из почв актиномядур, микромоноспор, стреп-товерткцилл и культур нокардиального типа, канямицин - микромо- • носпор.

Впервые установлены некоторые особенности распространения редко встречающихся форм актиномицетов (микромоноспор,стрепто-вертицилл.нокардиоподобных организмов и др.) и их антагонистов в различных типах почв и областях Казахстана, что позволит проводить направленное выделение выше названных групп актиномицетов в данном регионе. Впервые выделены из почв нашего региона представители рода Kitasatosporia. Установлено, что они обла- . дают широким спектром действия и представляют интерес для дальнейшего изучения как возможные продуценты новых антибиотиков.

Описаны такие новые продуценты противоопухолевых антибиотиков дауномицинонгликозидов ( Bbreofcoriyces ashcftabadictts 668), аклавинонгликпэидов ( S.nriceorubi^inosus 601),родомицина А ( S.violacous 457). Доказано, что A.ctinonnöura bd. шт.65 является продуцентом нового индикаторного антибиотика-пигмента. Штамм ИМВ 425 отнесен к подвиду ¡J.Candidus subsD.almataoini pubiip.nov. и является продуцентом нового макролидного антибиотика, подавляющего в сильной степени рост Klebsiella pneu-i.'ioni-jo и других грамотрицательных бактерий.

Получены новые данные о вторичном росте у представителей подов iljtinoKiadura,!;treDtovorticillium и культур нокардиаль-ного типп. Впервые изучены условия формирования вторичных колоний у представителей рода f.;icromonospora. Вторичные колонии v них появляются в более поздние сроки культивирования по срав-

нению со стрептомицетами. При вторичном росте у штамма ИМВ Ь93 StreDtoverticillium получен мутант, заблокированный по биосинтезу продигиозина, а также наблюдается изменение локализации не-продигиозиноподобного антибиотика.

На защиту выносятся следующие положения:

особенности распространения редких форм актиномицетов в различных типах почв и областях Казахстана и возможность исполь зования полученных данных для направленного поиска продуцентов антибиотиков;

необходимость поиска новых антибиотиков из актиномицетов почв Казахстана;

возможность использования вторичного роста на первых этапах поиска продуцентов новых антибиотиков из актиномицетов.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены На I Советско-Американском симпозиуме по антибиотикам и химиотерапии, на 1,11 и III Всесоюзных семинарах "Актуальные наравления поиска антибиотиков", на 2/1 Международном с.имиозиуме по биологии актиномицетов в Венгрии.

Публикации. Результаты исследований опубликованы в 1ф научных работах.

Объем работы.Объем диссертации -т страницы. Текст иллюстрирован 2'1 таблицами, 10 рисунками. Список литературы включает 130 наименований. Диссертация состоит из введения, £ главы обзора литературы, Б глав экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов.

Материалы и методы исследования. Для выделения актиномицетов использ -вали почвенные образцы 9 пбластеГ» Казахстана и

Оренбургской области РСФСР. В качестве селективных агентов использовали яминогликозидныз (стрептомицин,каиамицин) и антра-цинлиновые антибиотики (рубомицпн,тавромицетин,антибиотик 1618 из группы пкрромицинонгликозидов), противогрибковый полиеновый-розеофунгин, а также комплексы канамицина с розеофунгином и та-вромицетинэ с розеофунгином; Антибиотики ¡вносили в концентрации 25,50 я ЮС мкг/мл. Для выявления оптимальных концентраций использованных комплексов, провели серию опытов по их подбору. Для контроля почзеннуя суспензии высевали на те те среды без антибиотика. Перед посевом почвенные образны растирали в ступке для разрушения комочков, а водную суспензию с почвенной навеской встряхивали в течении 15 минут для десорбции опор микроорганизмов. Посев почвенных пбтазцов и определение количества актиноннцетов п почве проводили по обиепринятой методике:.

Для определения антагонистических свойств выросших якти-нпр'ипетов культуры наносили в виде полоски нп чашки Петри с тпеп-яой органической средой 2 Гау.ае и культивировали п теченнн 3-;: отток. После отпг'\ ютпенлтр'лярно к выросшие кплосклм актиня-гпяютор ""гонхаг/и ияиосиди еуссензга тест-микроорганизмов. -В ка-<;?от:'з "гс<>"-тгт::!П?,"5< испгс.'Ооря.те вибрион '.'епникопп, •¡-•'ао^сЬс.

... , (,<.:'г. :;ч61, £1сЛ;::1<;.1.1'1 тчю!::-епа ;

\ - ;•„ .' !". V гсуХйопол а г 1;ичг111, '!'-;!у.1г-

1 -пи: - п:: -';; • ,/.л яиЫ111п Л'Г^ ! О .

пут,он? ГТЯ'Ь'-лгк-кка УФ-2. ¡.■••¿оЪ.чс ^Пип ,, ;. 1.;-ооооо'1г

'.■>:, И ^иоллго^еи Активность

РИР'ЧОЛЯЛИ НО рпцмч угнотенкл ТРСТ-ОрГПНКПМОП.

Псрртшуп игеитийткяцию проводили по культугпльнкм (срогч* : г ° Г/у.,:;'"> ' и ант'т" ннстич^окнч сройстзам. У отгбрялнкх актнн.

г-

мицетов изучали морфологические (форма спороносцев, поверхность спор) и культуральныв свойства (на восьми средах), определяли состав изомеров диаминопимелиновой кислоты (ДАПК) клеточных стенок и проводили анализ Сахаров целых клеток.

Для установления систематического положения выделенных актиномицетов использованы следующие диагностические среда: минеральная среда I Гаузе, среда Чапека с сахарозой, среда Крас-ильникова I с глюкозой, глюкозо-аспарагиновая, синтетический агар Линденбайна с глицерином, овсяной агар, органическая среда 2.Гаузе, среда Треснера с лимонно-кислымРе. На диагностических средах отмечали цвет, характер и степень развития воздушного мицелия, окраску субстратного и наличие растворимых пигментов. Для объективной оценки использовали шкалу цветов А.С.Бондарце-ва (1954). Для установления типа клеточной стенки определяли форму (мезо- или ы>- )диаминопимелиновой кислоты методом нисходящей бумажной хроматографии по методу В.Beeker е.а.(1964), а состав дифференцирующих Сахаров в гидролизатах целых клеток по методу H.A.Lechevalier, li.P.Xeclievalier (1970).Морфологию спороносцев смотрели в световом микроскопе МБИ-6 на 'рвердых питательных средах (1Гаузе,Чапека с сахарозой,овсяной), поверхность спор - в электронном микроскопе "Тесла" В 250 при увеличении Х8000. Для приготовления образца слегка прикасались сеткой с кол-лодиевой или формваровой пленкой к поверхности спороносящего воздушного мицелия или к капельке воды, в которую предварительно внесли воздушный мицелий.

Штаммы актиномицетов с высокими антагонистическими свойствами, отобранные на стадии первичной идентификации, выращивали на органических средах А4,6339,Сахарозлая,6613, применяемых во Всесоюзном научно-исследовательском институте по изысканию новых

антибиотиков АМН СССР (ИНА АМН СССР). Ферментацию вели в течение 4-х суток .на круговых началках при ъ-28°С в колбах со 100 мл среды. Мицелий отделяли от нультуральной жидкости, заливали 3-х кратным количеством ацетона и экстрагировали в течении суток .

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар на среде 2 Гауэе в отношении ряда грамполочительных,грамотрицательных и кислотоустойчивых бактерий (Дмитриева,Семенов, \ 1965).

С целью выявления возможностей исследуемых штаммов актиномицетов, использовали рекомендации Б.Т.Никитиной и др.(1989) о целесообразности индукции вторичного роста у исследуемых культур на первом зтапе их изучения. Фоновой средой Тз этом разделе работы была среда Предхэма-Готтлиба. Источником углерода служили : лактоза,глюкоза,ксилоза,сахароза,галактоза,арабиноза,мальтоза, фруктоза,расМмноза. 40$ растворы Сахаров стерилизовали теку чим паром и вносили в расплавленную среду Предхзмя-Готтлиба перед посевом. Согласно рекомендации посевы выдергивали не 5-7 суток, как обычно, а в течении 4-х нелель, периодически просматривая и отмечая появление вторичных колоний.

Для опенки продуктивности культур из вторичных колоний ис-пользозпли слодую'аие показатели: биомассу (г/л),величину антибиотическое активности первичных концентратов из мицелия и куль-турятгьной жидкости (мкг/мл) ч накопление антибиотика по сухому весу (г.?г).

Препараты новых антибиотиков хроматографиропали на пластинах " 1Ц.ЦИ'|'1 "марок И и 07 254 ( (ХуаПег ЧССР) и "ДС- Л1иГо11е': К):.'.I>;•■:.1 (Ч)"( к1 в сиотемо хлороформ-метанол (9:1,20:1).

Биологически активный компонент антибиотика 65 накапливали методом ТСХ на пластинах " йИи£ о1 " в системе хлороформ-бензол-метанол (30:20:7). Зону, окрашенную в голубой цвет, снимали с пластинки вместе с основой, элюировали спиртом и фильтровали. Спектры поглощения антибиотиков в УФ и видимой областях измеряли в 96° этаноле на спектрофотометре " Вресога «.

Выделение актиномицетов-продуцентов новых антибиотиков

из почв Казахстана. Идентификация актиномицетов.

Выделено 20448 штаммов актиномицетов, отсеяно для дальнейшей работы 6816, из них антагонистор -4609 (67,6$), редких форм 4881 (70,155), из них антагонистов - 2442 (50,5%).

Изучено распространение редких форм в различных типах почв и областях Казахстана.(Тзбп.I) Редко встречающиеся акти-номицеты распространены в «лах Чимкентской области (24,,се-роземно'-лугоеых сильноаасоленных почвах Джамбулекой области (22,1%), Довольно много их в такыровидно-солонцеватых и серо-бурых почвах Джамбулекой области (13,9% и 13,3%), в черноземных почвах Целиноградской области (13,7%). Очень мало редких

о

форм обнаружено в луговых почвах Оренбургской области (1,4%), в соленых почвах Северо-Кааахстанской (1,6%) и Джезказганской (1,9%) областях. Одаако следует отметить, что антагонисты из, редких форм выявлены в почвах, где они не получили широкого распространения. Так, например, больше всего антагонистов обнаружено в лугово-болотннх почвах Кзыл-Ординской области (80,0%) и в соленых почвах нвлодарской области (86,6%), где количество редких форм составило соответственно 4,4% и 4,2%. В луговых почвах Оренбургской области, горно-луговых Алма-Атинской и солон-

Таблица I

Распространение редко встречающихся форм актиномицетов в различных типах почв и областях

Область

Типы почв

! I

т

I Общее ,

¡количе-'_

ство |

'"и* 'чест- , % ¡тиноми- „„ т ! '

•^цетов у"" ,

Редкие род»

■Анта-гонис !тн

<7

А>

Кзыл-Ординская Лугово-болотная 225 ' 10 4,4 8 80,0

Чимкентская Рекультивируе-

■ иыГ'1 лёсовкдный 2,8 53,3

суглинок 540 15 8

Илы 10338 2569 24,8 8 4,9

Дшзмбулсняя Светло-кашта- 1272 59 13,5

новая 4,6 8

Серозем 4875 254* 5,2 72 28,3

Сероземно-лугг-

вая.сильноз'аео-

ленная 213 47 22,1 12 25,5

Сазово-луговая, II 5,6 I 9,1

болотная 190

Такнровидная 468 60 12,8 13 21,6

Такьтровндно- 56,8

солонцеватая 315 44 13,9 25

Серо-бурая 165 22 13,3 3 13,6

Алма-Атинская Горно-луговая 324 7 2,2 5 71,4

Чернозем 33 I 3,0 I -

Дчеэнааганская Бурая пустынная 1260 40 3,2 18 45,0

Серо-бурая 1461 146 9,9 9 6,23

Такнр солончаковый 13 68,4

1008 19 1,9

Серозем северный 141 . II 7,8 3 27,3

Целиноградская Чернозем 60 2 3,3 I 50,0

Чернозем южный, 138 19 13,7 3 15,7

карбонатный

Кустанайская Чернозем 108 18 16,6 6 33,3

Павлодарская Солончак 354 15 4,2 13 86,6

Каштановая 327 17 6,1 7 41,2

Сепепо-Клая'хетянокяя Солончак 120 2 И I '50,0

Лчгово-болотная 483 16 3,3 II ■68,7

Оренб\'Г)ГСКая тЬтовне 207 3 1,4 2 66,6

чаковом такыре Джезказганской области-при сравнительно малом количестве редких форм отмечена высокая антагонистическая активность в отношении испытанных тест-организмов. Редко встречающиеся актиномицеты, выделенные из чернозема Алма-Атинской области, не обладают антагонистическими свойствами. Самое большое количество редких форм актиномицетов выделено иэ илов Чимкентской области (24,8%), однако антагонистов среди них мало (4,9%).

Иа выделенных 4885 актиномицетов редких родов 2442 штамма (50,5%) оказались антагонистами, иэ них 896 - отнесены к роду Асипотайига, 3 ШТ. -К Б-Ъгер1;озрогап511Ш, 22 шт.-к роду Шсго-топоврога, 5 шт.-к Б-ЬгетЛоуагЫсИПша, 102 шт. - к нокардиопо-добным организмам, 4 шт. -к роду К1Ьаеа1;озро14а (табл.2).

Для выделения редко встречающихся форм актиномицетов хорошо зарекомендовали себя тавромицетин, канамицин. Однако наилучшие результаты получены при применении канамицина и канамицина с роэеофунгином, особенно для актиномадур, культур нокардиаль-ного типа (1У тип клеточной стенки) и китазатоспор. Максимальное количество стрептоеертицилл выделено при использовании тав-ромицетина и тавромицетина с роэеофунгином. о ■

Таблица 2

Распространение актиномицетов иэ редких родов и их антагонистов в различных типах почв

Роды

1Селек- | .тивный -По ч в ы агент 5

,Общее |Количество •количе-'антагонис-

1СТВО (ТОВ

АсЪ1пота<1ига 31;гер'Ь0Б1Э0гап21ша

Шоготоповрога

к,т,

К+Р Т+Р

К+Р, Т+Р

к,т,

к;р

Т+Р

Светло-каштановая, такыровидно-солон-цеватая.илы 896 70

Светло-каштановая, сероземы 3

Сероземы,серозем-0 но-луговые,сильно-э асоленные,бурые, пустынные 22 10

Культуры нокардиаль- К,Т,

ного типа (1У тип К+Р,

клеточной стенки) Т+Р

Т,

Б-Ьгер-ЬоуегЫсШзиш Т+Р

КИгава'Ьозрога К+Р

Выделено всего К,Т,

(включая неопреде- К+Р,

ленные рода) Т+Р

Сероземы 102 78

Светло-каштановые 5 5 Илы 4 4

4885 ' 2442

Первичная идентификация выделенных стрептомицетов показала, что наиболее распространены представители серий А1Ъиз (26,2$), Chromogenes ( 12,8%), АсЬтоио^епез (11,9%), Ilelvolus (6,7%). Для северных почв характерно широкое распространение еще и акти-номицетов серий Lavendulae-Roecuc для южных ЛХЪосрогеиа, Соо-.rulescens,Violaoeus. В илах Чимкентской области встречаются представители серий AlbosporcusjInDerfeotus рода- StrcTitoEiyces, а такте актиномадур.

Из 24 изученных культур актиномицетов штамм 65 отнесен к роду Actiiioiaauura, штаммы 264 и 593 - к роду Strcptoverticillium, штаммы 696 и 1415 - к культурам со II типом клеточной стенки, штаммы 531 и 913 - к нокврдиоподобным организмам, штаммы 557, 2916,2918,2921 - к роду Krtac-atosporia , остальные к различным видам рода ;;trepfco:-.yoon.

Наиболее интересные культуры выделены при использовании в качестве селективного агента различных концентрации антрациклино-вого антибиотика тавромицитина. Три штамма выделены с антибиотиком 1618 из этой же группы (Табл.3).

Описаны новые продуценты доуномицинонгликоэидов ( S.ashcha-baaiouc.niT.HMB 6681, аклавинонгликозидов ( S.sriceorubiriinoGus гат.ИМВ 6011,родомициня А ( P.. viol-tceus гат.ИМВ 457)), Штамм УМ

Таблица 3

Продуценты антибиотиков, выделенные из почвы на селективных средах

Продуцент

Образуемый антибиотик

! Селективный ! агент

StreptoKycee Candidus subsp. almatacini eubsp.nov.,щт.ИМВ 425

Культура нокардиального типа шт.ИМВ 531

Streptomyces griseorubiginosus,

шт.ИМВ 601,712

Streptoayces resistomyceticus, шт.ИМВ 210

Streptoverticillium rubrireti-culi, шт.ШВ 593

Actinomadura sp.fшт.ШВ 65

Культура со II типом клеточной стенки,шт.ИМВ 696

Культура со II типом клеточной стенки, шт,ИМВ 1415

Streptomyces sp,,шт.ИМВ 697 Streptomyces sp.,шт.ШВ 1783 Streptomyces sp.,шт.ИМВ 1761

Streptomyces ashchabadicus., шт.ШВ 668

Strexitomycea albovinaceus., шт.ШВ 689 '

Культура нокардиального типа, шт.ИМВ 913

Алматецин

Стрептомицин

Антибиотик

типа иламицина Стрептомицин Аклавинонгли-

козид Тавромицетин

Гелиомицин Тавромицетин

Продигиозины

Новый голубовато-зеленый антибиотик-пигмент

Тетраены

Неидентифици-рован

Родомицинонгли-коэид

Пирромицинон-гликозид

Пирромицинон-гликозид

Дауномицинон-гликозид

Комплекс гри-

эеородиновых

антибиотиков

Тавромицетин

Неидентифици-.рован

Тавромицетин Тавромицетин Тавромицетин Тавромицетин

Тавромицетин

^дарациклино-антибиотик 1618

Антрациклино-вый антибиотик 1618

Антрациклино-вый антибиотик 1618

Смесь канами-цина с роэео-фунгином

\

425 наиболее близок К виду S.Candidus (ex Kxassilnikov,1970) nom.rev.comb.nov., но отличается рбразованием нового антибиотика. На основании этого считаем возможным отнести его н новому подвиду S.candidas subsp.almatacini subsp.nov.

Actinßmadura sp. шт.ИМВ 65 образует новый антибиотик-пигмент, который по спектру поглощенйя ( А макс.242,322,765 нм в этаноле) и кислотно-основным индикаторным свойствам отличается от всех известных антибиотиков, что было доказано с помощью компьютерной базы данных биологически активных веществ, разработанной 1}.Верди (Венгрия).

Антагонистические свойства выделенных актиномицетов

Большинство стрептомицетов, выделенных из почв Казахстана, характеризуются высокой антагонистической активностью. Среди них больше всего антагонистов в отношении как грвмотрицательных, так и грамположительных бактерий выявлено из серий Achromo'gsnes, Albus,Chromoeenes,Tmperfectu3(Helvolus меньше - у

представителей серии Fradiae.

Результаты определения антагонистических свойств актиномицетов редких родов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Количество и процент антагонистов из редких родов актиномицетов

! Общее !_Антагонисты_

Р 0 Д ы_| количеству КодиТ,ество , %

Actinomadura 896 • 70 30,2

Культуры нокардиального

типа 102 78- 76,5

I.Iicroi:;ononpora 22 10 45,4 1

Strsptosporansiura 3 - -

Streptoverticillium б 5 100

Kitasatospora 4 -

Иа 896 штаммов антиномадур только 70 обладали антагонистическими свойствами (табл.4). Из них 33 штамма проявили активность в отношении ряда микроорганизмов, 17 шт. -только к Sacoh. cerevisiae, 3 - к мутанту стафилококка, I -к Hyc.citreum и

I -к Staph.aureus 209 Р. Актиномадуры, в основном, проявляли

антагонизм к грамположительным бактериям, что согласуется с дан-

ными (Чормонова,1978; Галатенко,1983). Выявлены антагонисты в от-

ношении KLebs,pneumoniae, Oom.terrigena, oi.coli K-15.

У культур, отнесенных к роду Streptosporanyium (3 шт.), Kitasatospora (4 шт.) антагонистические свойства не обнаружены (табл.4).

Почти половина выделенных микромоноспор (45,4%) оказались антагонистами (табл.4)., в основном, к грамположительным бактериям, Ыус.citreiim,Com.terrigena , слабее Я Klobs.pneumoniae и дрожжам.

Наибольший процент антагонистов (76,5%) выявлен среди нокардиоподобных организмов (табл.4), активных преимущественно в отношении гря^положительных бактерий, f.tyc.citreum, слабее к Com.tex'riGcna, ICLebs .pneumoniae.

Стрептовертициллы проявляют антагонизм и антибиотическую , активность к дрожжам, грамположительным и к jom.tcrri;;eua из грамотрицательных бактерий, что соответствует уже известным данным (Конев,1981;Гаузе и др.,1983).

. Таким образом, можно сказать, что д^я почв Казахстана ха-

рантерно большое разнообразие редких родов актиномицетов. Акти-номадуры обладают относительно сла.бым антагонизмом. У микромо-носпор, нокардий, стрептовертицилл - антагонистические свойства более выражены.

Антибиотическая активность отобранных штаммов актиномицетов

С целью выявления продуцентов новых антибиотиков изучена антибиотическая активность культуральных жидкостей и ацетоновых экстрактов иэ мицелия в отношении грамотрицательных,грамположи-тельных,кислотоустойчивых бактерий И дрожжей,

Иэ пяти ферментационных сред, применяемых для синтеза антибиотических веществ, благоприятными оказались среда А^,Б339 и Сахарозная.

507 штаммов стрептомицетов обладали широким спектром действия, подавляя рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий и дрожжей, III шт. -узким спектром, подавляя рост только одного тест-организма. Стрептомицеты (152 шт.) обладали антибиотической активностью в отношении грамотрицательных бактерий - E.colüi-13(I9 ит), Kleba.pneumoniae (Ю6 шт.)» Com.-terrigena (72 ШТ.).

Активность как культуральной жидкости, так и ацетонового экстракта из мицелия изученных штаммов стрептомицетов колебалась от 81 до 2187 ед.разведения/мл.

Антибиотическая активность определена у всех культур, содержащих в клеточной стенке мезо- форму диаминопимелиновой кислоты (ДАПК), так как предполагали, что она может проявиться при росте на жидкой среде.

Из 27 штаммов актиномадур подавляли рост нескольких

тест-организмов 20 штаммов, 2 шт. -только Sacch.cerevisiae,! ШТ. - Staph.aureus 209РД ШТ. - Com.terrigena, I ШТ. - Klebs. pneumoniae. У некоторых культур рода Actinomadura (шт. 374, 1207,2086) антибиотическая активность выявлена на жидких средах, хотя антагонистическими свойствами они не обладали.

Культуры рода Streptospo-rangium , не обладающие антагонистическими свойствами, также проявили антибиотическую активность.

Микромоноспоры подавляли рост грамположительных, грамот-рицательных и кислотоустойчивых бактерий. Эти результаты согласуются с литературными данными, согласно которым большинство микромоноспор продуцируют антибиотики с широким спектром действия (Ивашщкая и др.,1978;Бибикова и др.,1986). Штаммы 1074, 1640 и 1187 не обладали антагонистическими свойствами, но проявили активность на жидких средах.

Из 36 нокардиолодобных организмов 21 шт. подавлял рост большинства тест-организмов, шт.945 - рост только i<l.luteus,a шт.1902 - Mye.citreun. Обнаружена антибиотическая активность у 7 шт. (531,1158,1728,2072,2016,2077,998), которые не проявляли антагонизм на твердых средах. Большая часть штаммов актино-мицетов с 1У типом клеточной стенки проявляет антибиотическую

активность к грамположительным, слабее к кислотоустойчивым и м

грйЪтрицательным (^актериям. Известно,что актиномицеты роли cardia образуют антибиотики как с узким, так и с широким спектром действия ( Kordarnka, 1977; Лристархова,1989), что выявлено и у выделенных штаммов.

Впервые культуры, содержащие в клеточной стенке ит<- и мезо форму ДАПК, описаны японскими исследователями ( Oir>ura rv\.,T9R?i.

Авторы отнесли их К новому роду порядка Actinomyeetales.'

У 4 шт. актиномицетов (557,2916,2918,2921), отнесенных нами к роду Kltasatosporia обнаружена антибиотическая активность только на жидких средах, причем активными оказались, в основном, пак культуральные жидкости, так и'ацетоновые экстракты из мицелия. Наличие широкого спектра действия и высокой антибиотической антивности у выделенных актиномицетов рода Kita satosporia дает основание считать их перспективными для выявления продуцентов новых антибиотиков. Поэтому работа по изучению этих культур будет продолжена.

Исследование условий формирования вторичного роста у отобранных культур актиномицетов и изучение их особенностей

Основанием для выполнения этого раздела работы было то, что сведений о вторичном росте представителей родов Actinoma-dura,Streptoverticillium,Nocardia мало, у рода Micromonospora отсутствуют, а о представителях редких родов, выделенных из почв Казахстана, вообще нет.

Нами испытаны актиномицеты из родов Streptooyces (Ишт.), Actinomadura (Зшт.), Micromonospora (3, шт.), Streptoverticil-lium (2 шт.) и культуры нокардиального типа (2 шт.). Однако не все испытанные культуры образуют на поздних стадиях онтогенеза вторичные колонии. Различаются также и сроки формирования вторичных колоний. Общим отличием от ранее испытанных культур (Никитина и др.,1982) является то, что вторичные колонии у представителей родов Aotinoznadura,lIi3roiaoiiospora,Streptovorcicilliu2i и нокардиоподобиых актиномицетов появляются в более, позднне сроки культивирования - на 2-3 неделе.

-ГО -

Большинство культур не предъявляют специфических требова-, ний и формируют вторичные колонии в присутствии различных источников углерода. Это дает основание считать вторичный рост у испытанных актиноыицетов более вероятным событием, чем предполагалось ранее.

Вторичные колонии у испытанных культур хорошо различимы на поверхности первичного роста высоким профилем (1-3 мм), часто мягкой консистенцией, различиями в пигментации и рельефом поверхности.

Изучение стабильности культур из вторичных колоний показало, что не все культуры сохраняют свои признаки при пересевах. Наиболее стабильными являются культуры из вторичных колоний шт. 593,1101,1670 и 1723.

"Известно, что у вторичных колоний из стрептомицетов меняется не.только структура, но и антибиотическая активность.

У всех изученных вторичных вариантов, за исключением шт. 1723, повышен выход биомассы. Величина антибиотической активности антибиотика, полученного из мицелия у шт.503 увеличилась более, чем в 2 раза, а у шт. 65 примерно в 1,5 раза (табл.5).

Таблица 5

Накопление биомассы и антибиотическая активность культур из вторичных колоний при глубинном культивирпвпнии

!Вари-!Вес !Минимальная по- Í

К V л ь т V V а.анты мииелия давляющая кон- |Тест_0рГЙНизм п У Jl *> 1 У *> V г/л !центрация препа- ut __^_'рата,мкг/мл_!_

Aatáncnadura штамм 65

Et-optovcrticil-Iíuíj шт. 593

Культура нокпрдп ильного типа тптпг.1 531

Исх. В.К.

Исх. В. К.

Исх:.

11,7 14,9

16.7

20.8

16,5 25,0

8,7 5,9

6,1,

2,Ь

2,0 '>,2

1.1CDÜ1CX-LO un СШ.ЧО IL i'1С!

RicilJ un Lubú.Ll'.n

i ro'.o:

1 ч ',c-ur;

Ll"

Культуры из вторичных колоний шт. 1101 И 1723 не были активны, как и их исходные варианты. Что касается шт.531, то здесь величина антибиотической активности препарата из культуральной жидкости и иэ мицелия, оказалась намного меньше, чем у исходного варианта. Выход суммарного антибиотического препарата у вторичного шт.593 в 2,5 раза выше по сравнению с исходным. У вторичного варианта шт.593 наблюдается нарушение биосинтеза продигио-зинов. В культуральной жидкости и мицелии вторичного варианта накапливается бесцветный антибиотик идентичный антибиотику, полученному из культуральной жидкости исходного штамма. Причем в мицелии вторичного варианта выход антибиотика в 2 раза выше, чем в культуральной жидкости. Таким образом, нами получен мутант заблокированный по биосинтезу продигиозинов.

При сравнительном изучении биосинтеза шт. 1670 и 1723 и их вторичных вариантов наблюдается появление в мицелии вторичных вариантов малинового пигмента, спектр поглощения которого, характеризуется максимумами при 256,273,471 нм в этаноле.

Антибиотик, продуцируемый вариантом шт. 531, также одно-компонентен ( П£ 0,73 в системе хлороформ-метанол, 20:3), как и у исходного штамма. По химической природе он близок к илами-цинам.

В литературе имеются противоречивые сведения о типе клеточной стенки у проактиномицетоподобных вариантов. Так Захарова и соавт.(1980) наблюдали способность стрептомицетов изменять о конфигурацию ДАПК в сторону сходства с проактиномицетами. В клеточной стенке с.цаШаеиз из вторичных колоний вместо ЬЬ-ДАПК, содержащейся в клеточной стенке исходной культуры, обнаружена мезо-ДАПК. В.Д.Кузнецов и соявт.(19741, С.Сабиров (1934)

показали стабильность изомеров ДАПК у проантиномицетоподобных вариантов и исходных культур. У изученных нами культур из вторичных колоний из родов St-reptom¿-ces,f;ricronionospora, Actino- . madura, Streptoverticilliuia и у нокардиоподобных актиномицетов изомер ДАПК также не изменился.

ВЫВОДЫ

1. Из различных почв Казахстана выделено 20448 штаммоь актиномицетов, из них 4881 штамм - представители редких родов. В исследуемых почвах чаще встречаются актиномадуры, реке культуры нокардиального типа и еще реже микромоноопоры. Актинома-дурами наиболее богаты светло-каштановые и такыровидно-солон-цеватые почвы и, особенно,илы. Микромпноспоры изолированы из серозема, сероземно-луговой снльнозасоленной и бурой п.устын-

• пой почв; гкжярдиоподобные организмы - из серозема, стрептосмо-рангии и стрептоиертициллы - из светло-каштановой,. китазатоспо-ры из илов. Впервые изучено распространение редко встречающихся форм актиномицетов и их антагонистов в различных ткпго: почв и областях Казахстана. Впервые в почвах Казахстана обнаружены представители рода Ki tasa to.^ noria.

2. Показано преимущественное выделение иг, почв актином,-дур, мииромоноепор. культур нокардиального типа г. пр?п<-тпрч-:-лей рода íii-tnoatoovoria при иепольэокунии гян.*>м«п;гиг и г.-».-мнцша с розеофунпшом. Максимальное количеств" сгроптол.-о:

цилл выделено при использовании тяг^тшотиня i; ,?rtnpnvwri'w с розеофунгииом.

3. Лктпногшд^ш, р основном, проявили антибиотическую активность f гго»чюлпги7сльшк.' f)nvтcvl■^■l■:. ?,;mrj. -глоно-норп и en-

кардиоподобные организмы подавляли рост грамположительных, кислотоустойчивых, слабее грамотрицательных бактерий, последние -также дрожжей. Стрептовертициллы обладали антибиотической активностью к дрожжам, грамположительным и некоторым грамотрицатель-ным О'актериям, Kitasatosporia ко всем испытанным тестам, кроме E.eoli К-13 u Sacch.cerevisiae. 1

4. Установлено, что у представителей редких родов вторичные колонии появляются в более поздние сроки культивирования, чем у стрептомицетов. У некоторых культур повышен выход биомассы, у Actinomadura шт.65 и Strep-fcoverticillium шт.593 увеличена активность. Получен мутант шт.593, заблокированный по биосинтезу продигиозинов, а также изменена локализация его антибиотика. Таким образом, получены новые данные о вторичном росте у родов Actinomadura,Streotoverticillium и у нокардиоподобных вк-тиномицетов. Впервые изучены условия формирования вторичного рос-" та у представителей рода Liicromonoapora,

5. Из Actinomadura sp. шт.65 получен новый голубовато-зеленый антибиотик-пигмент, отличающийся от всех известных антибиотиков. На основании образования антибиотика алматацина шт. 425 описан как новый подвид S.candidus subsp.alKatacini cubsp. nov. Впервые описаны новые продуценты дауномицинонгликозидов (S.asjichabudicus 668), аклавинонгликозидов ( 8.griseoi-ubigino-sus 601), родомицина А ( S.vlolaceus 457).

Работы, опубликованные по теме диссертации

I. Рцмжанова З.А.,Хожамуратова С.!П.,Адиятова Н.Ф. Видовой состав культур порядка Actinoaycetiales,. выделенных из почв Павлодарской, Кустанайскпй и Кокчетавской областей // Тезисы докл.

УН съеэд ВМ0.1985.ТЛ.С.4Э.

2. Khozhamurafcova S.SH. .Adiyatova Zh.F.»Rymzhanova Z.A., Vetlugina L.A. Distribution of actlnomycotes antagonists in soils of Northern Kazakhstan // XI International Symposiums on the Biology of Actinomycetes. Hungary.DebrecenTl985rP.249.

3. Хожамуратова С.Ш.,й>шжанова З.А.,Лучинин Ю.Д. Изучение антагонистических свойств культур порядка Actmomycetaies, выделенных из различных типов почв Северного Казахстана. // Труды ИМиВ АН КазССРг1986тТ.ЗОгС.99-102.

4. Хожамуратова С.Ш. ,Ветл,угина Л.А.,Шакиев СЛУ. .Рымжанова 3.А..Музапбаров Б.Дучинин Ю.Д. Выделение почвенных актиномицетов на селективных средах с рубомицином и антибиотиками группы цинерубина // Тезисы докл. 1У симпозиума соц. стран по биотехнологии .БолгвриятВарна.1986.С Л13.

. 5. Адиятова'Ж.Ф.,Шакиев С.Ш.,Хожамуратова С.Ш..Рымжзно-ва З.А..Музапбаров Б.,Ветлугина Л.А. Антибиотические свойства редко встречающихся форм актиномицетов, выделенных из почв Казахстана.// Известия АН КазССР,сер.биолг1988г№ 4тС.53-54.

6. йшжанова З.А., Хожамуратова С. Ш., Музапбаров Б.,Ветлу-гина Л.А. Распространение редких родов актиномицетов в почвах Джамбулской области // Труды ЙМиВ АН КаэССРг1989тТ.35тС.З-7.

7. Kozhamuratova S.Sh..Adiytova Zh.F.,fiymzhanova Й.А., Vetlugina L.A. Л directional search i'or new antibiotics i'roa actinomycetes isolated from Kazakhstan soils // .".event}, international Symposium on Biolocy of Actinomycetes. ¿"van. T.olcyor1988rP:i39-

8. Vetlugina L.A.,. Iíozhamuratova S.Sh..Adiyatova Zh.F., Rymzhanova Z .A. ,LIuzapbarov B.,Trenpzhnikova L.P. ,Kopytina П.П. Hiyazgalieva R.Iu, Distribution rarely spread actinomyces genera in the soils of Kazakhstan // In: Y Inter.Symposium on microbia ecology.Abstracts.Japan.Kyoto-;1989TP.191.

9. Ветлугина Л.А..Адиятова Ж.Ф.Дожамуратова С.Ш.,Рышса-нова З.А.,Треножникова ЛЛ1,Копытина М.Н, Выделение актиномице-тов из почв Казахстана на селективных средах с антибиотиками // Антибиотики и медицинская биотехнологияг1990т№2тС.З-5.

10. Рымжанова З.А.Дожамуратова С.Ш..Адиятова Ж.Ф..Ветлугина Л.А. Антагонистические и антибиотические свойства актино-мицетов редких родов, выделенных из почв Казахстана // В кн.: Поиск продуцентов антибиотиков среди актйномицетов редких родов. 1991.Изд-во "Наука".Алма-АтатС.54-66.

11. Компанеец Т.В.,Рымжанова З.А.Дожамуратова С.Ш. Видовая приналлежность актиномицетпв с повышенной антибиотической активностью // Известия АН КазССР.сер.биолгТЭЭ!-^ ЗгС.51-53.