Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение конформационных свойств белка А из Staphylococcus Aureus и его комплексов с иммуноглобулинами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение конформационных свойств белка А из Staphylococcus Aureus и его комплексов с иммуноглобулинами"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ВТОРОЙ МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА

На правах рукописи УДК 577.112.7:577.322.2

ЗИНОВЬЕВА Лариса Вадимовна

ИЗУЧЕНИЕ КОНФОРМАЦИОННЫХ СВОЙСТВ БЕЛКА А ИЗ STAPHyLOCOCCUS AUREUS И ЕГО КОМПЛЕКСОВ С ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ

03.00.04 — биохимия 03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Москва — 1988

Работа выполнена в Институте иммунологии Министерства медицинской и микробиологической промышленности.

Научные руководители: доктор биологических наук В. П. Завьялов, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник А. Г. Сухомудренко

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший научный сотрудник А. В. Карякин, доктор биологических наук А. П. Демченко

Ведущая организация: Институт биологической химии им. А. Н. Баха АН СССР

Защита состоится «_»_ 1988 г. в-часов на заседании специализированного совета К084.14.05 2-го Московского ордена Ленина государственного медицинского института им. Н. И. Пирогова по адресу: 117513, Москва, Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке 2-го МОЛГМИ им. Н. И. Пирогова.

Автореферат разослан «-»-- 1988 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

доцент В. Т. Савенкова

I овей ХШКШ^СТШ. РАБОТЫ

; ь , лг 1

Дуту лъкость проблемы. В последнее время достигнуты значительные успехив иазгчашв информации иммуноглобулинов, в понимании явхаготзмов ИХ взаимодействия с антигенами, инициации ряда, эффекторных функций, направленных на элиминацию, антигена, в том числе опосредованных через взаимодействие с ?о -рецепторами различных клеток. Одним та таких рецепторов, взаимодействующих

с Рс -субъедшицей иммуноглобулинов, является белок А (БД.) -9'

— компонент клеточной стенки большинства штаммов золотистого стафилококка. Важнейшим свойством, этого белка яшгяется его способность неспвцифичвсет. взаимодействовать с иммуноглобулинами класса & (1й&) а образовывать с ними псевдоиммунные комплексы.

Э&о свойство сделала белок ± универсальннм инструментом в „ иэдунодогичесних и биохимических■ исследованиях. Его широко ис-пользут>т дшгвнлвлени^ и очистки классов и подклассов иммуногяо—

булинов с помощью аффзнйой хроматографии, в ишунофврментном,

■ ® -

радиоиммунном методах, а также для разделения клеток. Белок А ^используют в качествемитогеваи в-эспецифического иммуностиму-» лятора, а также для очистки крови больных от иммунных комплексов. Езлыаое практическое значение имеет со здание фьюзов белка А, с бврлогически важными пептидами и ввделение этих продуктов генной инженерии' с-, помощьнг сорбентов.

Вняонеш® особенностей взаимодействия; белка А о иг^дуног^о-. Зулинами класса является актуальной задачей, имеющей большое теоретическое и практическое значение и представляющей интерес не только для биохимии и молекулярной иммунологии, но и для ме~ цициин.

Цздь -работы: Изучение тепловой и рН-завискмой устойчивости структуры балка А из staphylococcus aureus, а также кон&ор-кационноЁ и протеолитической стабильности иммуноглобулинов g ссстанс различных комплексов с белком А.

Задачи исследования:

1. Изучить ковфоркаяионнне свойства белка А (доступность хромофоров растворителю, полярность и хесткость иикроокруженкя),

2. Изучить устойчивость конформахда белка а из разных штамт мов St. aureus к тепловому воздействию при различных значениях рЫ.

S. Выявить конформациовные различия мекду igG „ входяяи-ш в состав различных комплексов с белком А (при относительном молярном избытка и недостатке последнего), л такке изучить про-теолитическус стабильность stzz комплексов.

4. На основании проведенных исследований дать практические рекомендации по методике получения и использовании белка А г его Есмалексов с -les* ♦

Рзучн^р новизна. Впервые проведено исследование белка А из

Staphylococcus aureus Е ВТО КОИПлеКСОВ С ЕШфНОГЛОбуЛИНЙ-

ш ьь..'одами ди|фбрет;иаяьной адиабатической сканирующей гшфо-калориметрии и -температурно-пертурбацгонной диффвреныкшьвой сдектрофотодатрии. Еняяхвнн различав в характере славленая сек-рвтируемого' и несекретнруемото белка А, определена область наибольшей стабильности его структура. Впервые установлена высокая степень восстановлены катавной конфорявдии белгка А после тепловой денатурации z доказана незавЕстотсть яроцессов шгавлеяия его глобулярных доменов. Обнаружены существенные различия в кон-» ¿ориащюнных взканениях молекул 2gQ ' ж ж устойчивости к про-т

теолизу в составе различных комплексов с белком А.

Цпактичес-кад падкость -работы. Полученные э работе данные о конрормациошшх изменениях молекул IgC з составе различных комплексов с белком А и их устойчивости" к прстеолязу помогают понять механизма антифагоцктарного действия белка А. Сведения о диапазонах глаксшальной устойчивости структуры белка А к комбинированному действии рН и температуры и.высокой степени восстановления; его. конформации после нагревания до 100 0 зажни при решении, различных практических задач по- применению белка А и его комплексов с ' igG в препаративной биохимии, иммунохимии, медицине»

Результаты исследований по теме диссертации были использованы в лабораторном л опытно-промышленном регламенте получения белка А из Staphylococcus aureus и коншгатоз на его основе й 07-86» разработанном Институтом иммунология совместно с опнтно-прошшшенноЯ базой НПО "Бостск" йс-зледСло-прока. Яо данному регламенту, налажено производство опытных партий белка Ai

Положения заносимые на защиту

1. Прстлие экспериментальные доказательства высокой стелена обратимости тепловой денатурации белка, обеспечивающие возаоа-ноств тепловой стерилизации сорбентов на основе белка А.

2. Экспериментальные данные, обосновывающие диапазон рН,

в котором могут осуществляться технологические процессы по получению г применению белка А.

3» Экспериментальные доказательства в пользу увеличения стабильности структуры кроличьих и?9луноглобу ;шов с ъ. комалек.-се с белкой А в случае избытка последнего...что- позволяет реЕО-

«•> 4 «5$*'

мевдовать мочение кроличьих зязяуея ^збцтком белка А дав образования комплексов, устойчйЭДй к иретеолизу, для последующих да-мунохвглическЕх исследований.

Апробация -работы. Результата;, исследования, представленные в диссертации, доложены и рбсуждеш на 1У'и У Всесоюзных ковфе-

о

ренциях по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1981 г,,1954 г.). на У1 Всесоюзном сдадрзгуме "Хтшя белков а сецтцдов" (Рига, 1963 г.). Диссертайая «пробирована на иеклабораторном научной семинаре Института ддаунологии 24.05.87 и на совместной конференция кафедра биадааи и лаборатории эяздаолотии в биоэнергетики Ш 2-го шщк, лаборатории НИИ доихо^хдагческой медидивы. АМН СССР 29.01.88.

Дубликашк, По теме диссертант опубликовано € работ.

Стпткгупз диссертации. Диссертация изложена на 142 страницах и состоит из введения, 5 глав (из них 2г~авы- обзор литературы, I глава - материалы и метода исследовавдя, 2 тлави -- экспериментальные данные и их оссувдение), выводов, списка ли-« терз^рц (173 наименования) и црщахевля. Работа аглюстрироБаий. 8 таблицами н 29 рисункааи.

машшш и методы исагщювша

Объектами исследования били: Белок А (В.) из ^>гзнюс птаилоз редотистого стафилококка. Секретируемый белок А (ЕАо/ лодуздли из шхаима А-676, несекретируемый (БАнс) - кз иташов X и Со«ас. I Кроме того, исследовались раздгчше растворише кошлексы, обра»» зуемые БА с вфолика.

•Дри-работе'-'-со шташомА-676, лродуццрушш только ЬАс, -использовали еупернатант, полученный после удаления бак^рий центрифугированием, ■ из которого выделяли ЕАс с помвдыэ аффинной здэо-

ыатографии на IgG -сефарозе ( Hjeim at al. . 1972). Для выделения БАнс, ковалентно связанного с клеточной стенкой бактерии, биомассу предварительно обрабатывали лизоцимом ( sjoquiat

et al. , 1972). Протеолитические фрагменты БА, образующиеся в процессе выделения, а также следовые количества igG , смываемых с сорбента, удаляли с помощью гель-фильтратрта на се-фадексе G -75. Препарат ЕА (М.м.42000) имел характерный спектр поглощения с максимумом при 275 нм, указывающим на отсутствие в белке триптофанддов, что также было подтверждено более чувствительным методом флуоресценции. По данным КД препараты ЕА содержали около 50 % сС. -спиральной конформации. В дамунодиффуз-ном тесте в агаре с нормальным IgG человека БА давал зоны преципитации, свидетельствупдае об образовании псевдоишуншх комплексов.

Кроличьи ige выделяли на сыворотки крови кроликов с по цощыо ионнообыенной хроматографии на ДЕАЗ-52 целлияозе по стандартной методике ( Levy . Sober , I960). IgM и агрегаты IgG удаляли с помощь» гель-фильтрации на АсА-34 ультрагеле.

В работе были исследованы комплексы ЕА с ige кролика двух типов: при относительном молярном избытке (BA/igG =7:1) г недостатке ЕА (EA/lgG> 0.5:1) по отношению к IgG , полученные по методике, описанной Hota с соавторами (1981).

Температурно-пертурбационные дифференциальные спектры (ТЦЦС) записывали в спектральном интервале 250-350 ш с пошщыэ спектрофотометра Hitachi -200-20 СЗйвщщ) в тердастатируемых кюветах с длиной оптического пути' % fit температурах от 13 0 до 42 Количество пертурбщ)уемапвв<8г5>атурой тирозияов ( а) и триптофанилов ( в ) рассчитывали во фора?улам:

■V = ¿> ' эе'(л*\ - ЗР*глЛ ■ Х>т'Улл]

<< [«'"/л) • хпМ - • ae^at) J

£ tp° ««

а "Ы - ¿efoO •

s^fjuy ^Ut) жтсло

5 cTwp ß трп

с , с , с молярные коэ^рицазнты экстинкции бежа, тирозина и триптофана соответственно. , Э?т£»)- температурные инкременты экстинкции белка, тирозша и трпптофана на длшо волкы -л , характеризующие прирост молярной экстинкции на длине волны J. к молярному коэффициенту экстиккцлл в максимуме спектра поглощения при изменения температура на I Значение изменения оптической плотности корректировали на лзменедае объема раствора при нагревании (ДемченкЬ, 1981}.

Сольвентно-пертурбацпе"кыо дифференциальные спектры (СПДС) записывали на спектрофотометре Hitachi -200-20 (Япония), ис-* пользуя систему из четырех кювет с длиной оптического'пути I см, э диапазоне длин волн 250-350 нм. В качестве тМ^данта использовали 20 % раствор дтлетилсульфоксида. Для EVi1^ котором отсутствуют триптофащцш, процент пертурбируемнх тирозилоз рас- . считывали по формуле:

А 8.

% парт, тир.,» ( ) "100'%, где п = 4 - общее коли-

чество тирозвдов в ЕД.*

Круговой дихроизм водных растворов R и igQ регистрировали с помощью дшгрографов J -20 и J -500 (Япония) в термо-статяруедазс кюветах с данной оптического пути X ш в диапазоне дан волн 200-250 ем»: Кривые плавления белков получены в виде зависимости молярной эллиптичности на остаток.: [0] \ от температура ка дявде граны «А е. 220 ни для Ей. н Л = 217,'т для -дпсищка. Константу равдозесгя вычасашлп по форглуле:

¡0}[д]^, [В] т - молярные эллиптичное™ образца на дашгсЦ ее волны до плавления, после и при температуре Т, соответственно.

Зависимость теплопоглоцеши растворов белков от тешерату-.рк регистрировали с помощью дагЗДеренциального адиабатического сканирующего шкрокалориметра ЛДС1Й—1М в температурном интервале 5 °-100 Образец прогревали со скоростью I °/шн в ячейках с рабочим объемом I ил. Энтальпию перехода находили из уравнения; г т г

С,«,Г

Тц

ревая его Кетсдом последовательных приближений, используя гра~ щиное условие: е6- (Тк)=1, где (Т) - деля денатурированного белка, Ср (Т) - избыточная теплоемкость, А В - полная энтальпия перехода, Л Ср - разность теплоеикостей денатурированного ц дативного состояния белка,

- ШШ.ТАЗЫ И Ш ОШШШ КогеЬотн.спия и теп'озая- стабильность белка А той пезличных- т)Н сре-Ш ■

Еаки была лсатедована устойчивость структуры БД к тепловозу воздействию з широком даагазоне значений рй. Как видно из рзс.1 в пределах погредаости намерений значения температура перехода зз наганного.в денатурированное состояние, полученные с яошцья. кетодоз агазфокалорииеишг (Ж1 я кругового дахроизш (КД). сзвдадаюг. Область наиболШзГ ^достабяльностн как БАе, так я ЕАнс находится в диапазоне 'ш^^шй рН от 4.0 до8.0. При других значениях рЯ . сС -ехшральцая :-сон'5ормация 1& дестабили-ззруетсяСпрз сохранении обиого ссдер-т&ния оС -спирали в белке

Г

70 -

60

10 ■ < II»

PH

Рис.Х. I) Зависимость температуры перехода БА от .Д по данным ЧД,'. д - БАнс, - БАс 2> Зависимость температуры максимума тедпопог-лощения БА от pH по данишШ, о - БАнс, *-ЕАс

«¿1,0

0,5 ■

Рис.2. Зависимость константы равновесий: (доли денатурированного белка) от pH для БА /'.■:;v.. \ ; —-pH X.V -—-рЕ 3.5¿ .—0-*рН 7.4,----pH 9.8

6

-50 %), причем для разных доменов, по-видимому, в разной степени, что проявляется з увеличении ширины я г* о перехода (рис.2). Полуширина перехода лежят в пределах 24-29 Однако основная часть cL -спиральных участков белковой глобулы плавится в достаточно узком интервале, полуширина которого ке превышает 10-15°. Плавление вторичной структуры - Ei характеризуется высокой степенью обратимости. Так, а диапазоне значений pH от 3.5 до 8.5 после нагревания ЕА до 100 0 я последугйэго охлаждения до 20 0 восстанавливается ICO % упорядоченной структура молекулы белка (таблица 1). 3 более кислой а челочкой областях степень обратимости тепловой денатурации ЕА уменьшается: при pH 1.4 - 78 %, а при pH ГГ.4 - 42 По данный ыикрокалориметрии степень обратимости денатурация £4 на 20-40 % меньше; чем по данным Щ (таблица I). Сравнивая эти данные конно сделать зьшод, что часть непериодической структуры Е4 плавится необратило..

По данным КД во фрагментах ЕА. с М.м.. 15000 после нагрева-ш до 100 0 л последующего охлаждения до 20 0 восстанавливается лишь 50 % спиральной структуры, при этом </- -спираль иска-яается (рис.3). Поскольку ige -связывающие центры Ък образованы tL- -сшграякшглл: участкйали-матекулц ( Delsenhofer et al. IS78)эти результата лк-за?: существенное значение при использовании Е& и ого Фрагментов з аффинной зфоматографии.

Зависияость теплоемкости от температура по данным г,отрока-лориттрна разлива-дая ВАс и ЕИяс (рнс.4). Процесс плавленая ЕАнс более 'каопвраяазея. По-зкдймоггу, ■ это связано со стабилизирующие действием гликопептида з С-концовом домене Вк, что обусловлено способом получения Eine с помощью обработки биомассы ля-зоцшдом. Из сравнения значений калориметрической и эффективной энтальпий тергэдшка'етческих переходов (таблица I) моано сделать

Таблица I;

Стелейь "оврагвиости структуры бзлка А после тепловой/ денатурации по данным КД и Ж, значение эффективной и калориметрической энтальпии переходов при различных значениях ой

Степень обрати-рН моста тепловой ■ денатурации по даннш КД Ы .

■ | .1«! 1| I —»»ДЧ ■ I . »I ■ ||| I. ГИ

Степень Обрати-

юсти тепловой

денатурс: да по 1®ал/шль

данным Ж {%У

ДНкал, ккап/шль

1.4

2.4 3.15

3.5 4.5

5.4 1Л

8.5 9.85

10.85 11.4

78 90 98 100 100 100 100. 100 В5 72 42-

65+ 60 68+

• 70

75+ 75

8СГ 75

0е,,' 93

65*" 60-

55 49

•50

54;

58

6?

45+ 52^

52+ 53* 47+ /63+

бЭ4"

• • 220+ 216 194+ 260. 210 220+

240+ *>

' „ 212+ 204 : 2054210

216^

240.

+ - относится к БАне, степень обратимостЕ по данный КД совпадает для ЕАс я ЕАнс.' ■■•'•

вывод о сложности, многостадийносгя процесса плавления ЕА. Об этой ха свидетельствует к ассшетричный характер кривых плавления ЕА, подученных методой КД,: а также качественные результаты Ж (форш процесса, плавленая) ,. свздетелъствузздие" О той,что тепловая дена-. гурацня БА состоит из нескольких перекряваицихся по температурное интервалу процессов. Нам удалось ааделить по крайней мере

т'П-*

';5ис.4„ Зависимость фг=^7оч«?ой- тепзоевддсзж.

' .-температур-:!., i??, :';>{'/,4 . w■

Eec.5. ТешжаоЕлшвЕве Мне дри ^-7.4 за secaoeiacocïE»

не связанной :с денатурацией белка ■ -—-о—- " Разложение кривой дендрпогдоаакан БАво на составляЕше переходы--

'."•• Таблица 2. Параметры переходов., составлюзда цррдесс; , .плавления БАнс цри рй -7.4.

J'

дт /¿ÎH^-.T

•-.4н®®®- -.д'йпойн.-: (по площади)

т 3S . и« / 0 2В.5 .21

г4. л 4? ' г г: 25.5'

о 1.4 3b

ii г 3.5 -i-U.U 61

с • • -t. С4 'оО

27 32 35 59

СГ4

,21' ' 28 ,34 61: . 64

- 13 -

йять элементарных переходов, удовлетворяющих требованиям5 Едеального (одностадийного) нперехода (рис.5). Для каждого такого перехода эффективная энтальпия совпадает с калориметрической, а суша эффективных энтальпий этих переходов с хорошей точностью совпадает с полной.калориметрической энтальпией перевода ЕА: Айкал = 205 ю'лл/иоль, £ & В3^ = 210 хкал/моль (таблица 2). Первый переход с температурой максимума Tj=3S °,по-вккяисму, lícsEO отнестй к плавлению С-концевого Х-домена ЕА. Такой. вывод иэяно сделать из сопоставления констант равновесия,по-лученных методами КД н Щ,

Как видно из рисунка 6, до данный Ж плавление молекулы ЕА начинается yse,c 20 тогда как по данный КД периодическая структура белка намякает разрушаться при более высоких значениях те'-шератури - с 34*35 Четыре последующих перехода с шк-саиумаин при- температурах 4? 62.5 71 77.5 °,по-видизло-му, ао&но стис-та к плавлению четырех igG -связывающих доые^ов. Анализ аяшгокисл'отннх последовательностей этих доменов ЕА,каждый . из которых оостоят из трех ¿ -спиралей ( sjodahi , 1Э77) показал, что участки подипептшдаоа цепа, соответствующие первым двум. оС -спаграляы (начиная о • н -конца) практически идентичны. : В частности,, гидрофобные радаада щтошсяат, участвущих в об* разованип хС -спиралей», консервативны.. Наиболее существенные различия мезду четырьмя домснаш найлгдакся в участках йолнпеп-уидно2 деда, соркнрушзз третьи, С-яонцевую v¿ -спираль в каздом ^онене. Так, Дсмейы Д а С содерват две спаралеобразувдшс скобы %-5, а домена А я В - по З. Налпчие дополнительной скобы у доменов А й В на участке полипептидной цепи, формирующем третью сС --спираль, повьшает ее стабильность и усаливает иедспяралыше контакта- Назшие zs треотта ж глшдаа в Д - дамане иогет при-

?вс,6. Ь&васшость дши жеаагурированкого БА от mme~ рахущ по данным йЦ (—>и мвдэ окахоримггши

•Рис .7. Тшгшразэтно-тр1,урбадионные даф$еранцгаяьяне çbôKîpa ЕА. цра pH Тешэдрах^ кюветы - I3û, iCDaeTa с образцом: I - 22°, .2 ~ 3 - 37°, 4 - 42° : ' " •

водить к ианьшей . стабильности С-концево2 сшгрйли по сравнению с доианои С Xспиралеразрушающие аминокислотные остатки). Таким образом, существует структурная основа различной термостабильности -спиралышх доменов БА.

. ,ЗЕ иглеется 4атярозпла, го одному в каждом активком аз:«"-;. Находясь вбйкзх активного центра, тярозилк играют сузцестзеяитг роль во взаимодействии Ы.с 130. гЛы.изучали состояние тирса:«-лов Ж. (полярность идасткость шкроокрукения) метрдом./ЩЦС. ТЛГ:.Г Е*-.характеризуется тирозиновыы максимумом при 288 ш (рис.7), •щюзелы Ш находятся в достаточно гидрофобном окружении (спекг;: моделируется раствором тирозина з 25-40 % этиленгликоле). Расчет. показываютг что (55±3) % тирозилов в ЕА пертурбируется температурой. Йэтод СПДС дает значение (68+5) % пертурбации тирозилов 20 ДЦСО Такш: образом,: эти хдоиофорн частично доступны растворители. Вентгенструктурнкй анализ показал поверхностное расположена---тарозилов I Ое18ехйи£ег , 1978). Яо-видшому, в растворе существует, два равновесйых конформалдонных состояния молекулв ЕА. В; ОДНОМ Ш НИХ.ТИрОЗШЕГ полностью доступны растворителю, з другой - полностью экранировали,,г.

Изучений влияния белка А на . коюютаадионные. свойства и стабильность ктюлтеа большинства,видов зивотннг образует с БА нерастворгшв кошлвксн^ Особенностью взаимодействия ЕА с 1фОЯнка является образование стабильных растворимых комплексов. Пра. избытка Щ: (кащщэе о "ношение ЕА/ =г 7:1) образуются комплекса с формулой ~ БА,. а прз недостатка (молярное отношение БА/ЗвО. = 0.5:1) образуются, комплекса с: формулой- ТеР^ - Е^ ,( ЙЛй^-. аХ.» 1978, 'Яапзоп. , ЗЬитакег ,, 1984). Ш изучали влияние ЕА- на. ковфсргадшв к протеалитяческую устойчивость (5 кролика*; вгодвшзх в составэтих комплексов.

- те -

Методом Т1ЩС было зафиксировано изменение микроокруаения хромофоров хеа в рззультате кокформациошых перестроок молекулы (рис.8-9, таблица 3). Поскольку в БЛ-евязываадем центре тршто^анилы отсутствуют, неаддитивность спектров ИЩС в области трштофакового максимума (294,5 нм) свидетельствует об увеличении жесткости микроокругссния гриптойанзглов вдали от центра связывания БА, Коншормационные изменения- в составе комплекса , образованного при избытке £4, существенно больше, чек э составе комплекса, образованного при его недостатке. Этот знвод подтверждают данные по ыикрокалориыетрии. На рис.10-11 приведены кр1шые плавления свободного а и в составе кокплек-. сов с БА при относительном молярном избытке и недостатке послед него. Низкотемпературный пик теплопоглощения связан с плавлением структуры, относящейся к области контактов ыезду- Сц2 и Сн3 доменами, высокотемпературный пик - с плавлением-остальной стру* туры (Завьялов и соавт, 1981). При -бразовгийк комплекса в избытке ЕА температура перехода низкотемпературного пика теп-лопоглощения возрастает с 67.5 0 до 70.5 в то время

как температура перехода высокотемпературного шжа не меняется. Это означает, что в этом комплексе существенно стабилизируются структуры только в области С^З и Сн3 контактов. Ери образования Ш/длекса в. недостатке БА температуры обоих пиков Фешгапоглоще-аня возрастают на X Это означает,, что при образовании комплекса в одинаковой степеш стабилизируются все участки дюлекулы

. Таким образом, стабилизация низкотемпературного пика тепло поглощения существенно больше в едучае избдака БА пб отношен® к 1в& .

При исследовании устойчивости комплексов к протеолкзу падежам при рН 4.5 (отношение фермент/субстрат 1:50), оказалось,

4B-I0"3

8

4 О

-4 -8

Рис.8.

Температурно-пертурба- . ционные дифференциальные спектры Хев кролика (—), БАс(- - -) и их комплекса (—) цри молярном отношении ЕА/1ев =7:1. Температура в кювете образца - 38°, в кювете сравнения - 13°»

AE.-IO

:'i320hm"

Рис.9.

Температурно-пертурба-ционные дифференциальные спектры 180 кролика (—) и комплекса БАс с 1в<* (_•».} цри молярном отношении Бк/1& = 0.5:1.

Таблица 3.

Количество пергурбируемых температурой тирозилов и триптофанилов в молекуле Хеа кроликав комплексах© ЕА. Общее количество тирозилов в молекула iga кролика - 52, триптофанилов - 22.

Исследуемый образец

Молярное отношение EA/Igo

7:1. 0.5:1

Количество дарггурбируемнх тирозадов У:

Количество партурбцру емых 'грипгофаншгов. :

• 36 ± 2

12 ±г

га ± 2

9ÎI-

33 ± 2 II11

Ггс.Ю. Теилопоглощеаие годных растворов кроличьего

{——), БАс (---) и их комплекса (-«-О црк

молярном отношении ЕАЛбО = 7:1.

Рис. -I. >3-бдаог.сгдгцеа:е водтас; рас.ао.ссз гссгачьегс

что IgG в составе комплекса, образованного при избытке ЕА. суцсственно устойчивее к протеолизу, чем свободный igG и igG в составе комплекса, образованного при недостатке ЕА.

Одним из всзмозашх объяснений полученных результатов может сл.у^ть модель организации ксмплсксов , предложенная Hanson. (1984), согласно которой в случае образования юттлекса -

- ЕА (в избытке ЕА) задействованы оба|центра связывания ЕА на IgG - при этсм молекула ЕА "обвивается" зокруг ?с -субтс-дкницы и двутля своими доменами взаимодействует о обо'лми Е\ -

- связцзэеезями центрами. Большая стабилизация молекулы ige; по сравнении с ко?.шлексом igG^ -ЕА2 (в; недостатке Ек) объясняется' большим числом. контактов с;молекулой ЕА, "обвивающей" ¿'с ~ -субьединицу. При этом должна стабилизироваться упорядоченная структура С-концевой части шар1шрного участка IgG , чем и-объясняется повышенная устойчивость к протеолизу - связь, гвд-ролизуемал пепсином, .становится недоступной действию фермента.

■ Таким образом, при образовании комплексов ЕА с igG происходят ковдзормациояные изменения,. сопровождающиеся увеличением жесткости мищюокружения тирозилов и триптофанилсв по отношению к тепловой пертурбации ¿.увеличением термостабильнссти-структуры IgG.. и ее устойчивости к протеолизу пепсином. В ¿сом-•шгексе, образующемся при молярнбм: избытке ЕА относительно IgG. перечисленные изменения, больше. ■: Г"

Известно, что под* действием кйслшс гидролаз из иммуноглсбу-линоз. вшмпляется ряд. биологически активных пептидов- (стчмулз-рущи фагоцитоз,, секрецию антител и т.д.) (Завьялов и еоавт. 1984).. Условия дог действия кислых гядролаз з ерганизмг усгут осуткестзляться в фагодизосомаХ. В принципё", нрк фагоцитоза комплексов антиген-шгезтела ЕА, взаимодействуя с IgG "может препятствовать их. протеолизу и таким образоьг блокировать-ссрз-гонг-; r.in- ячл/ас^гудаетс г тле пептидов.

вывода

1. Конформация белка А характеризуется относительно низкой . термостабилььостыо п, в то ке время, высокой степенью восстановления нативной структуры после тепловой денатурации.

2. Процессы плавления белка А секретируеыого и несекретируемого различается: плавление последнего более кооперативно, при этом его конформация устойчивее при комнатной температуре.

3. Область наибольшей термостабильности структуры белка А находится в диапазоне значений рН среда 4,0-8,0.

4. Тепловая денатурация белка А является сложил^ процессом, в котором моашо гвдвллть по крайней мере пять независимых сос-тавлякшх переходов. Первый из них (низкотемпературной) соответствует плавлентз неупорядоченной структуры белка. Существует структурная основа различной теркостабильностп четырех. еС- спиральных глобулярных доменов белка А, что позволяет сделать теоретическое отнесеше остальш ' переходов к вдавлснио этих доменов.

5. Тирозилы белка-А не полностью доступны растворителе г находятся в достаточно гщфо^обнш скругении.

6. В результате взаимодействия белка А с иммуноглобулинами Б в молекулах последних происходят существенные ковфоргетиов-ные изменения: увеличивается гссткосуь ковфордации и ее устойчс« вость к тепловой денатурации.

7. Степень ковфориационных изменений в молекулах зхыу.ногло* булинов й и их устойчивость к протеолизу пепсином зависят от структуры комплексов с белком А: в составе комплексов, образу»-вшхся прг стносптельнс:.; избнтке белка А изменения кон-

формации значительнее, а устойчивость к протеолизу выше, чем I случае относительного молярного недостатка белка А.

"8. Научно-практические рекомендгоии: а) в прикладных целях предпочтительнее использовать несек-ретируемый белок А, т.к. его^труктура более устойчива при т*гэ»тно2 температуре

тб) сорбенты, изготовленные tía основе натавного белка А, цоено подвергать пастеризации и кипячении при значв1шях рН

- 8,5; сорбенты, изготовленные на основе фрагментов белка А, яе долети подвергаться тепловой обработке

в) используя белой А качестве вторых антител при работе

с кроличьими антискворгткаш! рекомендуется иетить антитела с по-, цоцыз молярного избытка меченого белка А (по отношении к iga j путец непосредственного добавления последнего к антисквороткэ, при этом будут образовываться комплексы, .устойчивые íc протеолизу,.

i . 9

сократится £ре:гя анализа,

г) при обработке ывкрокалоршезрических кр 1зых (особенно кеяшчвых, как у белка А) можно использовать^предлозенный нaim метод 2 соответствующею програилу расчета для ЗВЦ.

Список работ, опубликованные по теме диссертации

1. Ьлнавьева Л.В.,Сухомузшейко А.Г. ,Абрамов В.М., Завьялов В.П. Изучение конгаорцадасншлг свойств балка А золош?.. стого с?афшгок®кка.. Тезисы докладов 1У Всесоюзно! конференции по cnesvpocKQCTB биополимеров - Харьков, 1981, с.38.

2. Зиновьева Л.В.,Савва В.Д. .Сухомудренко А.Г.,Абрамов В.М., Суровцев'З.Я. ,Вас@гьев 1.1.5. .Штатченко н.а.,Исаев й.С.,БурдшгС.а.(

Сенченко В.Н. Структурно-функциональные свойства белка А стафилококка - универсального инструмента в иммунологических исследованиях. Тезисы докладов D" Всрсоюзного симпозиума ".Химия бежоа и пептидов" Рига,. IS83, с.45-46.

3. Зиновьева I.B..Сухоыудренко А.Г..Абрамов В.М., Завьялов В.П. Конфоркация пшуноглебулинов кролика в дсевда-иммуккых комплексах с белком А" из Staphylococcus aureus . / Тезисы докладов у Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров - Харьков, 1984, С.94-Э6.

4. Зиновьева Л.В.,Сухомудрекко А.Г..Абраг-юв В.!Л.,Саввэ З.Д*. Завьялов В.Г1. Тепловая и рН-зависиыая устойчивость белка А золотистого стафилококка -Иммунология, IS86, JS 2, с.19-22.

5. Зиновьева I.B. .Сухоцудренко А.Г. .Абрамов В.М.,

Завьялов В.П. Изучение влияния белка А из staphylococcus aureus

■ ■ ■ ■ i на кокТюрмационнуи и цротеолитическув стабильность шлмуногло— ;

буликов G нролщса. - Депонировано во БНйИСЭНШ ГЗ.06.86,. й 332'

MB деп, 86, 24 с.

6. Зшгозьева £.В.,Сухомудренко А.Г. »Денесвк А.Й., Завьялов В.П. Проявление доменной организация белка A staph,

aureus пра. тепловом разрушении его структуры - Украинский биохимический журнал, 1987, т.59, J5 2, с.18-21.