Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение индуцированной устойчивости культивируемых клеток Nicotiana sylvestris к высоким концентрациям солей

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ошмарина, Вера Ивановна

ВВЕДЕНИЕ 4 стр.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Реакция растений на засоление и физиологическая природа солеустойчивости

1.2. Действие солей на культивируемые клетки растений

1.3. Получение мутантов соматических клеток растений и их роль в изучении физиологических процессов

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материал и методы

2.1.1. Методика получения клеточной культуры

2.1.2. Клонирование суспензии клеток Ж. sylvestris

2.1.3. Обработка суспензии клеток N, sylvestris li-нитрозо-Н-метилмоче виной (НММ)

2.1.4. Подготовка пробы для анализа содержания ионов

2.1.5. Подготовка пробы для анализа аминокислот

2.2. Результаты и обсуждение

2.2.1. Получение культуры клеток К, sylvestris

2.2.2. Характеристика роста культуры клеток в стандартных условиях

2.2.3. Действие некоторых стрессовых факторов на рост культуры н# sylvestris

2.2.3.1. Рост культуры в присутствии ЖаС

2.2.3.2. Рост культуры N. sylvestris в присутствии этионина 52 СТр^

2.2.3.3. Рост культуры клеток К. sylvestris в присутствии путресцина

2.2.4. Получение индуцированных мутагеном соле-устойчивых клеточных линий F. sylvestris

2.2.4.1. Действие нитрозометилмочевины на клетки N. sylvestris

2.2.4.2. Получение индуцированных НММ КаС1 -резистентных клонов М. sylvestris

2.2.4.3. Получение индуцированных НММ этионин-резистентных клонов ж. sylvestris

2.2.4.4. Выделение клонов с двойной устойчивостью

2.2.5. Физиологическая характеристика клонов

2.2.5.1. Критерии для характеристики клонов

2.2.5.2. Дикий штамм

2.2.5.3. Клон ЖрЕз

2.2.5.4. Клон HrEs

2.2.5.5. Клон NrEs

2.2.5.6. Клон N^E —

2.2.5.7. Клон NrEp

2.2.5.8. Клон ИГЕГ

2.2.5.9. Клон UrEr-4

2.2.5.10. Клон МаЕг-1 Х

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение индуцированной устойчивости культивируемых клеток Nicotiana sylvestris к высоким концентрациям солей"

В В Е Д Е Н И Е Повышенное содержание солей в почве широко распространенный фактор, неблагоприятный для возделывания сельскохозяйственных растений. Огромные территории нашей планеты (25 поверхности суши) в той или иной степени засолены (Строгонов, 1973). У нас в стране засоление почв наносит серьезный урон сельскохозяйственному производству в ряде районов интенсивного земледелия. Содержащееся в почве избыточное количество солей угнетает рост и значительно снижает урожаи практически всех сельскохозяйственных культур. Одним из наиболее перспективных путей освоения засоленных почв, наряду с проведением мелиоративных мероприятий, является возделывание на них солеустойчивых сортов полезных растений. Получение форм с таким комплексным признаком, как солеустойчивость, возможно общепринятыми методами (мутагенез и гибридизация), однако в последние годы большое значение приобретают новые приемы и методы, которые облегчают и ускоряют селекцию экономически важных культур. Одним из таких приемов является селекция на клеточном уровне. Популяция культивируемых клеток генетически и физиологически гетерогенна и экспериментально полученное на ее основе растение может заследовать возникшие генетические изменения. Выращивание таких клеток ведется в специально оборудованных камерах фитотрона, где строго контролируются и дозируются состав питательной среды, температура, влажность, освещенность. Миллион посаженных на питательную среду растений может располагаться в небольшой оранжерее или камере фитотрона. Размножение культивируемых клеток, а также выращивание in vitro растений идет непрерывно и независимо от времени года, что существенно сокращает время получения форм с желаемым признаком. Кроме того, культура клеток и тканей растений позволяет изучить физиологические основы повреждающего действия солей и на основе этого моделировать условия, обеспечивающие защиту организма от солевого стресса и, используя эти знания, вести направленную селекцию резистентных к солям клеточных линий. Метод изолированных клеток и тканей дает возможность сочетать спонтанный и индуцированный ьгутагенез с широким спектром селективных систем и обеспечить выделение генетических вариантов с последующей регенерацией целого растения. В связи с этим задача данной работы заключается в получении солеустойчивых мутантов методом клеточной селекции и их характеристике. Для решения поставленной задачи необходимо иметь модельную биологическую систему, селективные системы, отработать условия получения спонтанных и индуцированных солеустойчивых клеточных линий, доказать их генетическую природу, установить возможные причины полученной резистентности.I. О Б З О Р Л И Т Е Р А Т У Р Ы I.I. Реакция растений на засоление и физиологическая природа солеустойчивости Непригодность засоленных почв для сельскохозяйственного производства связана с избытком водорастворимых солей в верхнем корнеобитаемом слое почвы. Состав легкорастворимых солей в почвенном растворе и твердой фазе почвы разнообразен. Эти соли в большинстве случаев представляют собой комбинацию катионов Fa Mg 2+ и Са и анионов С1 30 С On .Засоление почвы каким-либо одним видом соли в природных условиях не встречается. Обычно преобладающим компонентом засоленных почв является сульфат и хлорид натрия (в различных сочетаниях), в определенных районах также карбонат натрия. Многочисленными исследованиями показано, что отрицательное действие засоления обусловлено как высоким осмотическим давлением почвенного раствора, так и специфической токсичностью высоких концентраций засоляющих ионов (Строгонов, 1973; ITaas, Hoffman, 1977). Возможность использования засоленных земель для выращивания культурных растений определяется концентрацией солей в корнеобитаемом почвенном горизонте. При концентрации засоляющих ионов 0,1-0,2% от суммарного количества солей могут произрастать все культурные растения; такие почвы принято считать незаселенными (Ковда и др., I960). Сельскохозяйственное освоение почв, у которых содержание солей достигает 0,3-0,5%, требует подбора солеустойчивых культур и применения специальной агротехники, так как большинство возделываемых культур при такой степени засоления дает низкий урожай. Максимальная степень засоления свойственна солончакам (концентрация солей достигает 2,0 Такие почвы в сельском хозяйстве не используются, растительность на них скудна и ограничивается дикими видами. Однако концентрация ионов в почве не является константным показателем. Максимальное их количество в ризосфере обнаруживается в летний период, когда высокий уровень инсоляции резко усиливает испарение почвенной влаги, и вымытые почвенной влагой ионы ионы поднимаются в корнеобитаемые горизонты почвы. Осенью обиль но выпадающие дожди вновь снижают их концентрацию. С биологической точки зрения под солеустойчивостью вида или сорта следует понимать тот предел засоления, при котором растения еще способны завершать полностью онтогенетический цикл и сформировать всхожие семена (Строгонов, 1962). Однако величина солеустойчивости относительна и зависит от условий, при которых формируется урожай (температура, влажность, механический состав почвы, содержание органических веществ, подвижность ионов). По отношению к избытку солей в субстрате растения делят на галофиты и гликофиты. Большая группа дикорастущих видов галофиты способна произрастать в условиях почвенного засоления, а многие из них для своего развития требуют повышенной солености среды. Избыток солей стимулирует их рост по сравнению с пресным фоном. Изучение физиологических свойств галофитов показало, что приспособление к росту на солях достигается различными путями. "Истинные" галофиты накапливают огромное количество засоляющих ионов в клетке (до 7 сухого веса), при этом сохраняя нормальное ее функционирование (Келлер, I940;Waisel, 1972; Soxifi, Wallace,1982). Накопленные ионы могут быть локализованы в тканях и частях клетки, не несущих большой метаболической нагрузки. В условиях сильного засоления хлористым натрием у некоторых видов ионы CI" локализуются между верхним эпидермисом и клеточными стенками палисадной, столбчатой паренхимы, а также вдоль оболочек в клетках столбчатой паренхимы. Значительное количество хлора накапливается также в межклетниках губчатой паренхимы, вакуолях,наружной оболочки хлоропластов. Внутри хлоропластов ионы С1 заключены чаще всего в липидные капли (Лапина, I98I). Здесь они выполняют осмотические функции без значительного воздействия на ферментативную активность. Это позволяет галофитам развивать высокую сосущую силу и обеспечивать себя водой, таким образом преодолевая относительно легко осмотическое давление почвенного раствора. G другой стороны, пониженная интенсивность транспирации свидетельствует об экономном расходовании водных запасов. К этой группе относятся различные солянки сведа, солерос, петросимония. Метаболизм галофитов этой группы также отличается рядом приспособительных свойств к росту в условиях засоления. Предполагается связывание засоляющих ионов белками и органическими кислотами, что ведет к понижению количества свободных ионов в клетке и уменьшению их токсического действия (Генкель, 1954; Строгонов, 1962). Отмечена также меньшая скорость поглощения засоляющих ионов клетками корней галофитов (Абдыев, Касумов, I98I). Вторая группа галофитов не накапливает поглощаемые корнями соли, а выделяет их через особые морфологические образования (гланды) из тканей листьев и стеблей. Некоторые растения-галофиты характеризуются высокой интенсивностью фотосинтеза, что создает высокую концентрацию клеточного сока и дает возможность ликвидировать одну из сторон стрессового воздействия засоления осмотическую. лоху. Такой механизм свойственен кермику, тамариксу, франкении, У третьей группы галофитов накопление солей в надземных органах не происходит благодаря соленепроницаемости корней. Это полынь, некоторые виды кохии, у которых высокое осмотическое давление создается за счет повышения концентрации растворимых углеводов и других низкомолекулярных соединений (Строгонов, 1973). Среди культурных растений настоящие галофиты не встречаются. Можно выделить лишь более или менее солевыносливые формы. Так, повышенной толерантностью к засолению отличаются хлопчатник, сорго, ячмень, сахарная свекла, томаты, мягкие сорта пшеницы. Напротив, лен, овес, гречиха, кукуруза, картофель солечувствительны. У гликофитов приспособление к засолению очень ограничено, а чаще всего совсем отсутствует. Поэтому большинство культурных растений в условиях засоления испытывают ингибирующее влияние солей на рост. Высокий уровень KaCl во внешней среде вызывает у них некрозы, отмирание листьев, почернение корней. При этом изменяется интенсивность и направленность большинства обменных процессов фотосинтеза, водообмена, серного, азотного метаболизма вторичных соединений (Строгонов и др., 1970; Удовенко, 1977). Так, при повышении содержания хлорида натрия в субстрате наблюдается сначала изменение, а впоследствии и нарушение азотного обмена снижается содержание белкового азота, вследствие торможения синтеза белка накапливаются некоторые аминокислоты и амиды (Приходько, Клышев, 1964; Hatata, 1982). В условиях солевого стресса отмечено высокое содержание

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Ошмарина, Вера Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Культура клеток К. sylvestris использована как модель для изучения клеточной селекции и разработки схемы получения солеус-тойчивых клонов.

2. Изучена действие некоторых стрессовых факторов на культуру клеток Ж. sylvestris. Показано, что HaCl и этионин в концентрации 172 мМ и 1,5 мМ соответственно могут служить селективными агентами для выделения устойчивых вариантов, путресцин в широком диапазоне концентраций не оказывает ингибирующего действия.

3. Разработан метод для выделения спонтанных и индуцированных мутагеном клеточных линий, резистентных к селективным факторам. Изучено летальное и мутантное действие Н-шфозо-Н-метилмочевины. При одинаковом летальном эффекте мутагенное дйствие НММ различно при использовании различных селективных систем.

Используемая система отбора устойчивости к МаС1 относительно мягкая, она вызывает большое количество адаптивных, ненаследственных изменений. Величина индукции резистентных стабильных клонов 1,5.

Система отбора устойчивых к этионину клонов значительно жестче, около 50 % образовавшихся клонов являются мутангными. Величина индукции стабильных резистентных клонов 7,4.

4. Среди выделенных клонов отобраны генетически измененные варианты с различными фенотипами: а) резистентностью к КаС1 и этионину; б) резистентнотью к ЫаС1, но чувствительностью к этионину; в) чувствительностью к МаС1, но резистентностью к этионину.

5. Дана характеристика мутантных клеточных линий, позволяющая заключить, что одному фенотипу соответствуют различные генотипы, что обусловливает разные механизмы резистентности.

На основании полученных данных вццелены группы клонов со следующими возможными причинами устойчивости к НаС1: а) с измененным механизмом поступления ионов через мембрану (МгЕг-2); б) с повышенной метаболитной осморегуляцией (яуз -1); в) с суперпродукцией метионина, снимающего метаболический дефицит серы при избытке ЖаС1 в среде (МГЕГ-3,4; 11^ -1);

6. Изучен чувствительный к солям мутантный клон, повышенная чувствительность которого связана с созданием серного дефицита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследования, проведенные на модельной системе, характеризующейся интенсивным ростом на агаризованной и в жидкой питательной среде, отзывчивой на введение в среду селективных и стрессовых факторов (МаС1 , этионин, НММ, метионин, путресцин, маннит), хорошо клонируемой в нормальных и селективных условиях, позволили получить клеточные линии с четырьмя различными фенотипами - чувствительность к ИаС1 и этионину (дикий штамм, устойчивость к ЖаС1 и этионину, чувствительность к одному из этих двух факторов при наличии устойчивости к другому) и доказать генетическую природу резистентности.

В задачу данной работы не входило изучение механизма резистентности, это предмет специального исследования, но даже по реакции полученных клонов на предлагаемые тесты (рост в присутствии различных концентраций НаС1 , этионина, метионина, отношение к неионному осмотику, содержание засоляющих ионов и серосодержащих аминокислот) можно судить о генетическом разнообразии выделенных фенотипов.

Анализ ростовых кривых на среде с различным содержанием ЖаС1 позволил выделить несколько типов дозовой зависимости. У одной группы клонов характер роста был аналогичен дикому штамму, т.е. отмечалась стимуляция при малых дозах и последующее закономерное снижение роста при увеличении концентрации МаС1 в среде, но для этих клонов стимулирующие дозы были сдвинуты в сторону повышения концентрации МаС1 и стимулирующий эффект был выше. Это говорит о возможном изменении метаболизма в данных клонах по галофитному типу. Галофитоподобные линии были выделены в культуре клеток риса и люцерны ССгопеЬап et а1,1978;На1пз, 1980),

Галофитизм клеток риса выражался не только в реакции на действие солей - для оптимального роста им требуется присутствие значительного количества С1~в среде. Подобно галофитам в присутствии СГ"у этих линий отмечается аккумуляция нитратных ионов (СгоиеЬап ей а1, 1978)* Не исключено, что детальное изучение метаболизма полученных нами резистентных клонов вскроет еще ряд га-лофитных черт. Высокая интенсивность роста на средах с£ГаС1 может быть также связана с компартментацией засоляющих ионов. Мы не располагаем данными, чтобы судить о детоксикации солей путем пространственной изоляции их в клеточные вместилища, но возможность такого механизма реально существует, поскольку присутствие С1""в культуральной среде усиливает вакуолизацию протоплазмы 1978; Кулиева, Шамина, 1980). Стимуляция роста на ингибирующих рост дикого штамма концентрациях ГГаСГ может быть также связана и с возможным активированием транспортных систем и вследствие этого с лучшим проникновением питательных веществ в клетку.

Для другой группы клонов (вуЕв -I, 2, 3 и КГЕГ~4) внесение в среду малых доз НаС1 ингибирует рост, а при повышении концентрации обнаруживается стимулирующий эффект и равный контролю (росту' на основной среде) рост. Это не случайное явление, так как почти половина анализируемых клонов имеет такой характер кривых на ®аС1. Аналогичный тип дозовой зависимости отмечен и для других культур (Строгонов и др., 1970; Сго1бпег еЪ а1, 1977; Собко, Шамина, 1981). Одни авторы объясняют это наличием двух ферментных систем, активируемых при разных уровнях засоления. Другим объяснением такого характера роста культур в присутствии МаС1 может быть стериотипный ход формирования ответа на неблагоприятное воздействие, описанное для многих живых организмов и внутриклеточных систем (Штоккер, 1967; Генкель, 1971; Селье, 1972; Шевякова, Леонова, 1978 ).

Изучаемые: клоны на среде с этионином показали разные типы ростовых кривых. Степень устойчивости и характер роста мог быть аналогичен клеткам дикого штамма с большей или меньшей солечувст-вительностью к аналогичной дозе этионина в среде по сравнению с контролем. Другой тип дозовой зависимости характеризовался наличием стимулирующего эффекта и отсутствием летального действия этионина в испытанном диапазоне доз (клон ЖрЕг-I). У относительно большой группы анализируемых клонов ( Н^Е 3, 4) характер роста на среде с различной концентрацией этионина трудно назвать дозовой зависимостью, так как постепенное увеличение содержания аналога в среде практически не сказывалось на интенсивности их роста. Это характерно для трех клонов с двойной устойчивостью. Один их них, ИгЕг-2, дает такую же зависимость роста и наИаС1.

Анализ содержания ионов ГГа-4" и К* позволил идентифицировать этот У клон как "мембранный мутант", так как содержание ионов клона было ниже, чем у дикого штамма и других солеустойчивых клонов в условиях засоления. Причем отсутствие контрационной*зависимости роста на среде с этионином и метионином свидетельствует, что изменение мембран, приводящее к ограничению в поступлении засоляющих ионов, носит неспецифический характер. Возможно, в результате этого поглощение^ елективных и стрессовых агентов идет до какого-то определенного предела, который не повышается даже при значительных дозах.

Мембранные мутанты, характеризующиеся снижением поступления селективных агентов и способные благодаря этому к росту на среде с токсическими аналогами аминокислот, получены на культуре клеток моркови (Widholm, 1974-), явора (Gatercole, Street, 1976), Mico-tiana sylvestris (Breiman,1982)Мутанты пшеницы, устойчивые к осмотическому действию диметилсульфоксида, выделены в культуре клеток пшеницы. Изучение состава жирных кислот и соотношение фосфо-липидов и стеролов, а также снижение скорости поступления К* показало изменение мембранных свойств клеточных линий (Erdei et al, 1982).

Изменение мембран, позволяющее расти на селективной среде -универсальный тип создания устойчивости. Однако неспецифическое изменение мембран создает возможность отбора клеточных линий с пониженной жизнеспособностью, у которых может быть нарушена система поглощения питательных веществ в условиях засоления и вследствие этого ингибирован рост. Такой факт, возможно, имеет место и у клона НгЕг-2, поскольку его рост в присутствии BaCI менее интенсивен, чем на основной среде.

Помимо идентификации мембранного мутанта при определении содержания ионов Ма+ и К4* в клетке выделен резистентный к ШаС1 клон жгЕг-з, у которого при значительном накоплении натрия в клетках понижено содержание калия, т. е. помимо устойчивости к токсическому действию солей,у этого клона имеет место устойчивость к калийному дефициту. Мы не располагаем данными, чтобы установить, каким образом клетки этого клона выходят из состояния калийной недостаточности. Возможность коррекции серного дефицита клетками этого клона вряд ли может компенсировать недостаток калия. Хотя данные об обратной корреляционной зависимости обеспеченности серой и калием в литературе имеются (Шевякова, 1979).

Как уже отмечалось, КаС1 оказывает как токсическое, так и осмотическое действие на культивируемые клоны, поэтому на среде с Had возможно выделение осмоустойчивых мутантов. Проверка клонов показала, что только один клон МрЕ3-1 имеет повышенную осмо-регуляцию. Ингибирование его роста на среде с маннитом составило 45%. Как известно, осморегуляция определяется сложным комплексом осмотически активных веществ - ионами неорганических солей, са-харами, а также низкомолекулярными соединениями (Rains et al, 1980). Клон N^E -1 в присутствии NaCl аккумулирует На1", а в пуле аминокислот в значительном количестве присутствует осморвгулиру-ющая аминокислота - пролин, т.е. относительная осмоустойчивость этого клона может достигаться коррекцией внутриклеточного осмотического давления как за счет поступающих ионов, так и за счёт синтеза осморегулирующих веществ. Устойчивость других клонов в разной степени связана с изменением осмотических свойств клетки и обусловлена резистентностью метаболизма к токсическому фактору засоления. Однако имеется корреляция степени осмоустойчивости с системой отбора. Клоны, выделенные на среде с этионином и проявляющие высокую степень солеустойчивости, были более чувствительны к осмотическому действию, чем клоны, полученные на среде с Mad . Этот факт дает основание предполагать, что Had -селективная система, включающая отбор устойчивых клеток как к токсическому, так и к осмотическому фактору, позволяет отбирать более сложный комплекс солеустойчивых изменений, чем однофакторная система с этионином. Этим можно объяснить и меньшую величину индукции Mad -устойчивости.

Таким образом, проведенные исследования показали, что основная часть клонов имеет метаболическую причину устойчивости, т.е. способность к нейтрализации токсического действия Mad.

Известна гипотеза о возникновении в клетках растений в результате токсического действия хлористого натрия метаболического дефицита серы (Шевякова, 1979). Мы предполагали, что селективная система с этионином позволит отобрать резистентные к этионину клетки с повышенным содержанием метионина, у которых при росте на среде с НаС1 будет в какой-то мере компенсироваться метаболический дефицит серы. Действительно, накопление свободного метионина в клонах создавало возможность компенсации метаболического дефицита серы при культивировании их на среде с МаС1. Причем это были не только этионин-устойчивые, но и чувствительные к нему (клон

Ж Е -1 ). Изучение механизма создания высокого пула свободного получения метионина в клетках резистентных клонов очень важно для солеус-тойчивых вариантов. Это может быть достигнуто и без помощи этио-нина. Однако требуются специальные исследования метаболизма всех клонов с повышенным содержанием метионина, чтобы определить локализацию мутации, продукт измененного гена, т. е. с изменением какого фермента связано накопление метионина, а следовательно и солеустойчивость каждого клона. Такие исследования требуют испольвыделения зования меченых предшественников и'ферментов. Это не входило в задачу нашей работы. Однако анализ свободных аминокислот позволил предположить, на каком участке биохимических реакций возможно изменение, обусловливающее резистентность к НаС1#

1. Значительное накопление серина (И.рЕд-1 и мгЕ3-2 ) может быть следствием изменений в функционировании о-ацетилсульфгидра-зы, контролирующей включение серина в синтез цистеина, одного из предшественников метионина.

2. Уменьшение количества серина в клонах -I, 2, 3, 4 и Н Е -1 ' при увеличении содержания метионина может говорить в пользу повышенного использования его в синтезе метионина при изменении АТФ-сульфурилазы.

3. Уменьшение лизина (клоны KrEr~I> 2» 3, 4) может свидетельствовать о блоке на пути образования лизина из аспартата при нарушении в функционировании аспартат-киназы.

4. Повышение количества треонина и изолейцина может быть связано с изменением а) гомосерин-о-трансацетилазы (клоны NrEs-I» 2, 3); б) гомосерин-о-трансацетилазы и гомосериндегидрогеназы

Ж Е -4. Ж Е -1), 4 Г Г * S г

5. Уменьшение лизина и аспартата может быть результатом изменений в путях синтеза аспарагиновой кислоты (клон ж&Ег-1).

Кроме культивирования для получения кривых на различных концентрациях селективных факторов, клоны культивировали на среде с различным содержанием метионина. Можно бцло предположить, что эккак ' зогенный метионин будет ингибировать рост, резистентных к другим аналогам аминокислот клетки, у которых нарушена регуляция их синтеза конечным продуктом CWidfoolm, 1972,1978; Palmer, Widbolm, 1975; Каранова и др., 1981). Рост на среде с метионином показал отсутствие корреляции между содержанием.свободного метионина в клонах и чувствительностью к введению экзогенного метионина. Большинство клонов (MrEs - I, 2, 3; ЖГЕГ- I, 3, 4), несмотря Há значительные варьирования внутриклеточной концентрации свободного метионина в клетке (от его отсутствия до 4,3 мкмоль/г сухого вещества), при росте на среде с различным содержанием метионина показали значительное ингибирование роста во всем диапазоне выбранных доз, что может говорить об избытке в этих условиях внутриклеточного свободного метионина и угнетении вследствие этого метаболических процессов. Повышенная чувствительность этой группы клонов к введению в среду метионина может также служить показателем предельной обеспеченности их серой и наличием серных компонентов для компенсации серного дефицита в условиях засоления. Отличный от всех других клонов тип измененного метаболизма свойственен клону При наличии высокого уровня свободного метионина этот клон в отличие от других клонов-суперпродуцентов метионина проявляет высокую чувствительность к действию НаСХ. Однако интенсивный рост данного клона в присутствии экзогенного метионина свидельствует о повышенной потребности в сере для поддержания процессов роста, а следовательно и невозможностью ликвидировать серное голодание, возникшее при засолении. Рост этого клона на среде с метионином в широком диапазоне стимулируется и лишь при 2 мМ становится ниже контроля.

Таким образом, практически не отличающиеся друг от друга по росту на основной среде, выделенные клоны генетически разнообразны, о чем свидетельствует комплексная характеристика полученных фенотипов (табл. 30).

На основании полученных данных можно выделить группы клонов, отличающиеся по возможным причинам устойчивости к НаСХ:

1) с измененным механизмом поступления ионов через мембрану (КгЕг-2);

2) с повышенной метаболитной осморегуляцией и.суперпродукцией метионина, что возможно обеспечивает устойчивость клеток к засолению );

3) с суперпродукцией метионина, снимающего метаболический дефицит серы при избытке МаСХ в среде ОуЕ -3,4-)* Это может быть сопряжено с устойчивостью к калийному дефициту С^ГЕГ-3);

4) не отличающиеся от дикого штамма по количеству серосодер

Сводная характеристика резистентных клонов

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ошмарина, Вера Ивановна, Москва

1. Абдыев В.Б., Касумов Н.А. Кинетика транспорта ионов С1 в корнях различных галофитов. В кн.: Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Тез. докл. Ленинград, I98I, ч. I, с. I0I-I02.

2. Азизбекова З.С, Аллахвердиева С Р Действие внезапного и постепенного засоления на рост ткани и целого растения табака. Изв. АН АзССР. Сер. биол. н., 1977, 2, с. 24-25.

3. Азизбекова З.С, Рзаев Г.А., Зейгалова Э.М, Влияние разнокачественного засоления на содержание

4. Бабаева Ж.А., Бутенко Р.Г., Строгонов Б.П. Влияние засоления на рост культуры тканей моркови. Физиология растений, 1968, т. 15, I, с. 93-103.

5. Бабаева Ж.А., Строгонов Б.П. Влияние высоких концентраций NaCI. и Na2S0j на соотношение К и Na в культуре изолированной ткани моркови. В кн.: Культура изолированных органов, тканей и клеток растений. М., 1970, с. 224-227.

6. Бабаева Ж.А., Бутенко P.P. Взаимовлияние некоторых катионов на накопление их в культуре тканей моркови и баклажана и рост культур. В кн.: Культура клеток растений. Киев, Наук. думка, 1978, с. 337-341. 7. By Дык Куанг, Шамина З.Б. Действие мацерирующих ферментов на культуру клеток кукурузы. Физиология растений, т. 30, 3, с. 616-621.

7. Генкель П.А. Солеустойчивость и пути ее направленного повышения. XII Тимирязевские чтения. М., 1954, изд-во АН СССР.

8. Долгих Ю.И., Шамина З.Б. Фракционирование клеточной суспензии диоскореи. Физиология растений, 1978, т. 25, вып. 6.

9. Каранова Л., Шамина З.Б., Рапопорт И.А. Влияние N-нитрозо- N-метилмочевины на изменчивость клеточной популяции Diosсогеа deltoidea Wall in vitro 35.

10. Каранова Л., Шамина З.Б. Изучение суспензионной культуры клеток Dioscorea deltoidea Wall т. 24, 3, с. 486-491.

11. Каранова Л., Макарова Р.В., Гуськов А.В., Кефели В.И., Бутенко Р.Г., Кутачек М. Характеристика прототрофной по ауксину клеточной линии диоскореи. В кн.; материалы 1-го Всесоюзного совещания по генетике соматических клеток в культуре. М., I98I, с. 16.

12. Келлер Б.А. Явления крайней солеустойчивости у высших растений в дикой природе и проблема приспособления. В кн.: Растения и среда. М.-Л., изд-во АН СССР, 1940, с. 193-217.

13. Ковда В.А. Происхождение и режим засоленных почв. М,-Л,, изд-во АН СССР, I946-I947.

14. Комизерко Е.И. Действие NaGL и Fa2S0/,. на рост тканей разных экологических групп в культуре in vitro- Физиология растений, 1969, т. 16, 4, с. 632-637.

15. Комизерко Е.И., Строгонов Б.П. Солеустойчивость изолированных тканей разных экологических групп. В кн.: Тр. Всесоюзн. конференции по культуре органов, тканей и клеток растений. М., 1970, с. 220-

16. Физиология растений, 1977, Генетика, 1975, т. II, 5, с.

17. Комизерко Е.И., Хретонова Т.И. Действие NaCI на процесс соматического эмбриогенеза и регенерацию растения в культуре ткани моркови. Физиология растений, 1973, т. 20, 2, с. 268276.

18. Кулиева Ф.Б., Шамина З.Б,, Строгонов Б.П. Действие высоких концентраций NaCI. на размножение клеток Crepis. capillaris in vitro Физиология растений, 1975, т. 22, I, с. I3I-I35.

19. Кулиева Ф.Б., Шамина З.Б. Цитологическая характеристика популяции Crepis capillaris in vitro при росте на средах, содержащих NaCL Известия АН АзССР, Сер. биол. н., 1980, 2, с. 28-36.

20. Лапина Л.П. Локализация солей в клетках как один из механизмов приспособления растений к условиям засоления. В кн.: Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Ленинград, I98I, с. 92-93.

21. Левенко Б.А., Прилюк Л.В., Чигирь В.Н. Получение солеустойчивых линий картофеля в изолированной культуре. Тр. по прикладной ботанике, генетике, селекции, 1980, т. 67, 3, с. 80-83.

22. Липский А.Х. Глубинное культивирование клеток высших растений. Культура клеток растений. М., I98I, с. 51-68.

23. Майсуркян А.Н., Хадеева Н.В. Выделение клеточных линий табака устойчивых к высоким концетрациям аминокислот. Физиология растений, I98I, т. 28, 4, с. 774-778.

24. Матухин Г.Р. Физиология приспособления культурных растений к засолению почв. Ростов-на-Дону, изд-во Ростовского гос. университета, 218 с.

25. Никитина Т.Н. Влияние NagSO на активность АТФ-сульфурилазы у генетически чистой линии и хлорофильного мутанта подсолнечника, В кн.: Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Ленинград, I98I, ч. I, с. 13-14.

26. Ошмарина В.И., Шамина З.Б. Использование метода культуры клеток растений для создания новых генотипов и изучения устойчивости к абиотическим стрессам. В кн.: Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Ленинград, I98I, с. 96-97.

27. Прилюк Л.В., Левенко Б.А., Чигирь В.Н. Отбор.на солеустойчивость в суспензионной культуре картофеля Solamim. tuberosim. В кн.: Культура клеток растений. Тез. докл., М., "Наука", 1979, с. 177-178.

28. Приходько Л С Кльппев Л,К. Об азотистом обмене проростков гороха при разнокачественном засолении субстрата. Тр. ин-та ботаники АН КазССР, 1964, т. 20, 2, с. 166-182.

29. Приходько Л.С. Обмен окси- и кетокислот у проростков гороха и кукурузы в условиях засоления субстрата. Физиология растений, 1968, т. 15, вып. 5, с. 806-812.

30. Селье Г. На уровне целого организма. М,, "Наука",

31. Смирнов A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре, М., "Наука", 1970, 455 с,

32. Собко В.Г., Шамина З.Б., Строгонов Б.П. Получение адаптированной к МаСГ клеточной линии Crepis capillaris, Физиология растений, I98I, т. 28, 6, с. I198-1203.

33. Строгонов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений. М., изд-во АН СССР, 1962.

34. Строгонов Б.П., Шевякова Н.И. Диамины в азотистом обмене растений. -Успехи совр. биол., 1962, т.54, вып.1(4), с. 44-56,

35. Строгонов Б.П., Кабанов В.В., ШевяковдН.И., Лапина Л.П., Комизерка Е.И., Попов Б.А., Достанова Р.Х., Приходько Л.С. Структура и функции клеток растений при засолении, М., 1970, 318 с.

36. Строгонов Б.П., Шевякова Н.И., Кабанов В.В.,Диамины в обмене веществ у растений в условиях засоления. Физиология растений, 1972, т. 19, вып. 5, с. I098-II03.

37. Строгонов Б.П. Метаболизм растений в условиях засоления. XXXIII Тимирязевские чтения. М., "Наука", 1973

38. Тимощенко А С Казуто О.Н., Гордеева Е.Е. Количественное определение путресцина в ра;стительном материале в присутствии свободных аминокислот. Физиология растений, 1980, т. 27, б, с. I308-I3I3.

39. Удовенко Г.В. Солеустойчивость культурных растений. Ленинград, изд-во "Колос", 1977, 215 с.

40. Шамина З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro В кн.: Культура клеток растений, Киев, Наук, думка, 1978, с. 80-93.

41. Шевякова Н.И., Леонова Т.Г. О фазности ответных реакций как составной части механизма солеустойчивости растений. Журнал общей биологии, 1978, т. 34, I, с. 97-110.

42. Шевякова Н.И. Метаболизм серы в растениях. М., изд-во "Наука", 1979.

43. Шевякова Н.И. Метаболизм и физиологическая роль ди- и полиаминов в растениях. Физиология растений, I98I, т. 28, 5, с. I052-I06I.

44. Шевякова Н.И. Отбор хлорофильных мутантов подсолнечника по признаку солеустойчивости. В кн.: Устойчивость растений к экстремальным условиям среды. Ленинград, I98I, ч. I, с. 84-85.

45. Шевякова Н.И. Солеустойчивость пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника. Физиология растений, 1982, т. 29, 2, с. 317.

46. Школьник М.Я. Микроэлементы и солеустойчивость растений.В кн.: Физиологическая устойчивость растений, М,, I960, с. 742746.

47. Штоккер О, Растения и вода. Ленинград, Гидрометеоиздат, 1967, с. 128.

48. Фролова Л.В., Шамина З.Б. Кинетика искусственно культивируемой клеточной популяции бобов in -edtro- Цитология, 1978, т. 20, 5, с. 551-556.

49. Фролова Л.В. Особенности популяций культивируемых клеток. Культура клеток растений, М,, I98I, с. 5-16,

50. Bagni Ш,, Calzoni G.L., Speranza А. Polyamines as sole nitrogen sources for Heliantus tuЪerosus explants. Hiew Phytol. 1978, 80, N 2, p. 317-321.

51. Berlin J, Para-fluorophenylalanine resistant cell lines of tobacco. Z. planzenphysiol. 1980, v. 97, N 4, p. 317-324. 52- Berlin J. Formation of putrescine and ciimamoyl putrescines in tobacco cell cultures. Phytochemistry, 1981, v. 20, N 1, p. 53-55

52. Berlin J., Kukoschke K.G., Khobloch K.H. Selektion of tobacco cell lines with, high yields of cionamoyl putrescines. Pianta med., 1981, 42, F 2, p. 173-180.

53. Berlin J., Witte Ь,, Hammer J., Kukoschke K.H., Zimmer A., Pape D. Metabolism of p-fluorophenylalanine in p-fluoropbenylalanine sensitive and resistant tobacco cell cultures. Pianta, 1982, V. 155, H 3, p. 244-250.

54. Bode R., Bimhaum D. Charakterisierung von 5- Fluorund 5-Methyltryptophan-resistenten mutanten von Hansenula henricii. Biochem. Physiol. Pflanzen, 1981, 176, Ж 2, S. 182-190.

55. Bourgin J, B, Taline-resistant plants from in vitro selected tobacco cells. Molec. gen. 1978, 161, H 3, p« 225-230. I 56. Bourgin J.P, Isolement de mutants apartir de cellules vegetales en culture in vitro. Physiol, veget, 1978, 16, Ж 3, p. 339-351.

57. Bourgin J.P,, Hommel M.C., Missonier C M Expression of resistance to valine in protoplast derived cells of tobacco mutant. In: Plant cell cultures: resuilts and perspectives, Amsterdam, Biomedical Press, 1980, p. 167-171.

58. Breiman A., Vumsh R,, Galun E. Chsiracterization of resistance to the proline analog azetidine carboxylic acid in Nicotiana sylvestris cell line. Zeitschr. Pf lanzenphysiol., 1982, Ed. 105, 1 5, S 383-394. 61*Caboche M.R,, I«!uller J.P. Use of a medium allowing low cell density growth for in vitro selection experiments. In: Plant cell cultures: results and perspectives. Biomedical Press. Amsterdam, 1980, p. 133-138.

59. Carlson J.E., Widholm J.M. Separation of two forms of anthranilate synthetase from 5-methyltryptophan-susceptible and -resistant cultured Solanum tuberosum cells. Physiol, plantarum, V. 44, Ж 3, p. 251-263, 1978.

60. Cavalieri A.J, Huang A.H.C. Evaluation of proline accumulation in the adaptation of diverse species of marsh halophytes

61. Chen Г., Zahavi E., Barat P., Umiel K, Effect of salinity stresses om tobacco. I The grov/th of Nicotiana tabacum callus cultures under sea v/ater, IfaCl and manndtol stresses. Zextschr. EElanzenphysiolog., 1980, 98, К 2, p. 141-153.

62. Colion CM,, Koo.l A.J., Nijkamp H.J.J. An effective chemical mutagenesis procedure for Petunia hybrida cell suspension cultures. TheorBt, app. genet., 1979» 55» N 3-4, p.101-106.

63. Dioivedi Д.З., Joshi Y.C., Qadar A., Bal A.R. Developing, the parameters for salt tolerance in the case of wheat crop, In: Intern, symposiiim on salt effected soils. New Delhi, 1980, p. 494.

64. Epstein E., Norlyn J.D. Scawaterbased crop production: a feasibility study. Science, 1977, v. 197, N4300, p. 249-251.

65. Erdei L,, Vigh L,, Dudits D. Isolation of wheat cell with oitered membrane properties, Plant Physiol., 1982, v.69,

66. Gathercole R.W.E., Street H.E. A P-fluorophenylalanineresistant cell line of sycamore with Increased contents of phenylalanine, tyrosine and phenolics. Pflanzenphysiol,, 1978, v. 89, К 4, S. 283-287.

67. Goldner R., Umiel Ж., Chen Y. The growth of Carrot callus Cultua?es at various concentration and composition of Saline water. Pflanzenphysiolog, 1977, v. 85, H 4, S. 307-319.

68. Green C.E., Phillips R.L. Potential selection system for mutants with increased lysine, threonine and methionine in cereal crops. Crop Sci. 1974, v. 14, N 6, p. 827-830. 81, Handa A.K., Hasegawa P.M. Populations of cultured higher plant Cells resistant to salt. In vitro, 1980, v, 16, H 3, p. 231-232.

69. Hasegawa P.M., Bressan R,A,, Handa A.K. Growtb characteristics of FaCl-selected and nonselected cells of Eiicotiana taЪасит Ъ, Plant and Cell Physiol. 1980, v. 21, I 8, ir. 1347I 1355. 86, НеЪег U., Santarius K.A. Cell death from cold and heat, and resistance to extreme temperatures. In: Temperature and Life, Springer-Verlag, Berlin, p. 232-263. 87* Hedenstrom S,, Breckle H. Ohligate halophytes? A test with tussue culture methods, Pflanzenphysiol. 1974-, B. 74-1 S. 183-185.

70. Helmer Y.M., Filner p. Regulation nitrate assimilation pathway of cultured tobacco cells. II properties of a variant cell line. Biochem. Biophys. acta, 1970, v. 215, Ж 1, p, 152160.

71. Heyser J.W,, Eahors M,W. Osmotic Adjustment of cultured tolaacco cells (licotiana tahacum var. samsum) grown on sodium Chloride. Plant Physiol. 1981, v. 67, N 4,,p. 720-727.

72. Isaacs C.E., Fisher K.W. Tryptophan analogue resistant cells of Solanum stenotomum in vitro, In: Alistrs Anmi Meet Amer, Soc, Microhiol, Atlantic City, Hi,J, 1976). Washington, 1976, p. 109.

73. Lawyer A.Z., Berlin M.B., Zelitch P. Isolation and charscterization of glycine hydroxamate-resistant cell lines of licotiana tahacum, Plant Physiol. 1980, v. 66, П 2, p. 334-341. 96, Ьелгепко B.A,, Tkatchuk Z,Y, Chlorate and chloridae resistance in tohacco and alfalfa cells. Ahstr,

74. Intern, Congr, of plant tissue and cell culture, Tokyo, 1982, p. 88.

75. Maas E.V., Hoffman G,Y, Crop salt tolerance -Corrent assessment, Journal of the irrigation and drainage ditrision, V. 103, N iE2, June 1977. 98, Maliga P. Isolations of mutants from cultured plant cells In: Cell genetics in higher plants. Eds: Duties, G. Par-

76. Maliga P. Isolation, characterization and utilization of mutant cell lines in Higher plants. In: International ReTriew ofcytology, New-Yourk, London, Academie Press, 1980.

77. Matthews B.F., Shye S.C.H., Widholm J.M. Mechanism of resistance of a selected carrot cell suspension culture to S(2-aminocthyl)-L-cysteine. Zeitschrifz pflanzenphysil., 1980, v.96, H 5, S. 453-63. 102.ffi-shraВ., Bhaltacharyya R.K. Limits of varietal tolerances to sodicity in rice. In: Intern, symposium on salt effected soils. Hew Delhi, 1980, p. 502.

78. Nahors M.W., Daniels A., Madolny L., Brown С Sodium chloridae tolerant lines of tobacco cells. Plant Sci, Let. 1975, v. 4, N 3, p. 155-159.

79. Kabors M.W., Gibbs S.E., Bernstein C.S., Meins M.E. laCltolerant tobacco plants from cultured cells, Zeitschrift Pflanzenphysiol. 1980, VT 97, H 1, p. 13-17.

80. Negrutiu J,, Jacobs M., Gattoir A« Arabidopsis Thaliana L. espece modele en genetique cellulaire. Physiol, veget, 1978, v. 16, N 3, p. 365-379. 81. Kevins D.J., English P.D., Albersheim P. The specific nature of plant cell wall polysaccharides. Plant Physiol. 1967, V. 42, N 7, p. 9OO-9O6.

82. Nielsen E., Amileni A.R., Ronchis S,, Parisi B. A carrot

83. Orton T.Y, Comparisioni of salt tolerance detween Hordeum vulgare and H, jubatum in whole plants and callus cultures. Zeitschrift Pflanzenphysiolog. 1980, v. 98, F 2, S. 105-118.

84. Palmer J.E., Widholm J. Characterization of carrot and tohacco cell cultures resistant to p-fluorophenilalanine, Plant physiol, 1975, v. 56, H 2, p 233-240.

85. Pollard A,, Wyn J.R. Enzyme activites in concentrated solutions of plicinebetaine and other solutes, Planta, 1979, V. 144, p. 291-298.

86. Siegel S.M., Siegel B.Z., ISasaej J, Laime P., Claen J. Growth of c o m in saline v/ater. Pbysiol, plantarum. 19S0, \r, 50, Ж 1, p. 71-76.

87. Smith T,A. Putrescine, spermitine and spermine in highes plants. Phytochemistry. 1970, v. 9, M 7, P. 14-79-186.

88. Smith M.K., McComb J.A. Effect of MaOl on growth of whole plants and their corresponding callus caltures, Aust. J, Plant Physiol. 1981, v. 8, Ы 3, p. 267-275.

89. Smith M.K., McComb J.A. ITse of Callus cultures to detect HlaCl tolerance in cultivars of three species of pasture legumes. Aust. J. Plant. Physiol. 1981, v. 8, И 4 and 5, p. 437-4-4-2.

90. Soufi S.M., Wallace A. Sodium relations in desort plants

91. Differential effects of IlaCl and Ka2S0 on growth and compositions of Atriplex hymenelytra (Dsert Holly), Soil Scien. 1982, T. 134-, H 1, p. 69-70. i

92. Storey K., Jones K.G,W. Betaine and choline levels in plants and their relationship to sodium chloride stress, Plant Scien, Lett. 1975, v. 4, p. 161-166.

93. Storey K,, Jones K.G.W, Responses of Atriplex spongiosa and suaeda monioca to salinity. Plant Physiolog. 1979, v. 63, p. 156-162.

94. Sung Z.R, Mutagenesis of cultused plant cells. Genetics. 1876, V. 84, И 1, p. 51-57. 124. Tal M., Heikin H., Dchan K., Salt toleranse in the wild relatives of the cultivateol tomato responses of callus tissue of Lecopersicon esculentum, L. peruvianum and Solanum pennelii tohigh salinity. Zeitschrift Pflanzenphysiologie. 1978, v. 86, M 3, p. 98-102.

95. Tissue culture for crops. Stress resistant plants from culture. Producing Tissue culture Techniques for use by plant Breeding and Agriculture, October, 1, 1982.

96. Tyagi A.K., Rashid A. Maheshwari S.C. Sodiiim chloride resistant cell line from haploid Datura innotia Mill, A resistanse trait carried from cell to plantlet and vice versa in vitro, Protoplasma. 1981, v. 105, M 3-4, p. 327-332.

97. Vunsh R., Aviv D., Galum E. Taline resistant plants derived from mutated haploid and diploid protoplasts of Kicotiana sylvefftris and Ж, tahacum. Theor. and appl. genet, 1982, v. 64, N 1, p. 51-58.

98. Vunsh R,, Breiman A,, Galum E. Characterization of resistance to the proline analog azetidine carhoxylic acid in a Mi, sylvestris cell line. Intern, Congress of plant tissue and cell, culture. Ahstr.

100. Waisel Y. Biology of halophytes. New York London, Acad. Press, 1972.

101. Wallner S. J., Nevins D.J, Formation and dissociation of cell agregates in suspension cultures of Pauls scarlet rose. Amer. J, Bot. 1973, v 60, N 3, p. 255-261.

102. Weber G., Lark K.G. Quantative measurment of the alility of different mutagens to induce an inheritied chauce in phenotipe to allouv maltose utilization in suspension cultures of the

103. Widholm J.M. Cultured Ж. tahacum. cells with an altered anthranilate synthetase which is less sensitive to feedback inhibition. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v. 261, Ж 1, p. 52-58. 13. V/idholm J.M, Antranilate syntetase from 5-iiietyltryptophan phan-suseptible and -resistant cultured Daucus carota cells. Biochimica et hiophysica acta (general subjects). 1972, vr, 279, К 1, p. -4-8-57.

104. Widholm J.M. Cultured carrot cell mitaBts: 5iDt-resistance trait carried from cell to plant and hack, Plant Scienij. Let. 1974, V. 3, N 5, p. 323-330. 1

105. Widholm J.M. Selection and characterization of cultured carrot and tobacco cells resistant to lysine, miethionine, and proline analogs. Can. J. Bot. 1976, тт. 5, H 13, P. 1523-1529» i

106. Widholm J.M. Selection and characterization of amino acid analog resistant plant cell cultures Crop Science. 1977, v. 17, H 4, p. 597-600. 138. ?/idholm J.M. The Effect of Increased free proline on Plant Cell growth in the presence of osmotic and salt stress. In vitro. 1980, V. 16, Ж 3, P» 231.

107. Widholm J.M. Differential Expression of amino Acid Bio- synthetic Control Isoenzymes in Plants and Cultured Cells. In: Cell Cultures: results and perspectives. Amsterdam Biomedical Press. 1980.

108. Wink M., Hartmami T. Cadaverine piruvate transamination The principal step of enzymatic quinolezidine alkoloid biosynth thesis in Lupinus polyphyllus cell suspension cultures. FEBS

109. Wong C.H., Jager H.J. Salt -induced vesiculation in mesophyll cells of Atrlplex species. Plant Scient. Let, 197Sf v. 12 (1), p. 63-68. 142, Zenk М.ЕГ. Haploids in physiological and hiochemical research. In: Haplooids in higher plants. Guelth, 1974, p. 339-353»