Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У ГРИБА [...] АКТИВНОГО ПРОЦЕНТА КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У ГРИБА [...] АКТИВНОГО ПРОЦЕНТА КИСЛОЙ ПРОТЕИНАЗЫ"

АКАДЕйИЯ НАУК АРМЯЖКОЙ ОСЗР

W ОТДЕЛЕНИЕ ШОЛСИЦЧЕСОТС НАТЕ

ИЗУЧЕНИЕ ИВДГЦИРСВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ 7 ГРИБА fßx^czc&rt, АКТИВНОЙ) ПРОДУЦЕНТА КИСІОЙ ПРОТВИНАЗД

03.00.07' »йікробаология

АВТО P.E.« Е Р А Т

диссертаций на соискание ученой oveness кандидата биологических наук

На цравах рукотаса

Д.Т.ГРИГОРЙЙ

EPKiAH- 1972

. І

f

I

, ■ і

АКАДЕМИЯ НАУК АРМЯНСКОЙ ССР

ОТДЕЛЕНИЕ ШШЮгаЧЕСКЙХ НАУК

На правах рукописи

Д.Т.ИОТОРЯН

ИЗУЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ У ГРИБА

АКТИВНОГО

ПРОДУЦЕНТА КИСЛОЙ ПРОТЕИНА ЕЫ 03.00.07' Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЕРШ АН- 1972

Работа выполнена во Всесоюзной ваучно-иссладоват ельском институте биосятеза белковых веществ в І968-І97І хт.

їіаучішїї руКОВОЛДТвЛЬ - доитор биологических шук крсОесеор С.А.КОНОВАЛОВ.

работа изложена на 159 стр., приложение на 8 ст]р. п иллюстрации на 33 сто*

Список литературы включает 206 названий, из которых 137 отечественных авторов.

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Э.Г.АЗШКЯН

Доктор биологических наук, профессор Б.П.АВАКЯН

Бедущее учреждение - Институт' микробиологии АН СССР.

Аьторейерат разослан " ' " - _1972 года

Защита диссертация состоится "^¿У" #_1<372 года.

іїа заседании ученого Совета № 2 отделения биологических наук АН АршнскоЙ ССР.

Отзыва прості направлять по адресу: 375200, Ереван, улица Варекацутян, 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке отделения биологических наук (улица Пушкина, 12).

УЧЕШІІ СЕКРЕТАРЬ СОВЕТА Т.Г.ЧУБАЕЯН

Ш> 04369

Зак. 1661

Тир.200

Готалрянт РИД при ЦСУ Армянской ССР, г.Ереван, пр. Орджоншшдзе,?

в в в д в ник

В настоящее врет в различных отраслях проишденнсюти используются препараты ферментов микробного происхождения, получаемое из активных шташов микроорганизмов, Еыдеяяешх методой индуцированной селекции.

Получение новых форм микроорганизмов позволило расширить не только сферу их применения, но и создать крупные производства, вырабатывающие рааличные высокоактивные ферментные препараты. Селекции микроорганизмов, продуцентов ферментов с применением ультрафиолетовых лучей и этилешпиша дает возможность выявить ряд индуцированных муталий с повышенной способностью к синтезу протеолитических ферментов, в том числе и кислых протеиназ.

Облучение кояцддй у грибов рода щщ спор у

бактерий и других микроорганизмов вызывает изменение многих признаков. В свою очередь предварительное или последовательное применение . химического мутагена подготавливает. дополнительно усиливает индуцированную изменчивость в повышает стойкость многих вновь приобретенных свойств. Воздействие на наследственную основу, обеспечивэпцее повышение ферментативной активности у плесневого гриба рода Jtspez^'SffS представляет не только практический, но и теоретический интерес. Тем более, если учесть,что исследования в области индуцированной селекции микроорганизмов -продуцентов кислой протеапазы, практически почти отсутствуют.

Задачей ваших исследований было получить селекционный путей »с применением вдтагенот химической и физической природы, мутант J&S/z&T^c &f/t s jfZf&efTSc&X с повышенной проте олитнче ской активность» и закрепить это свойство воздействием ыутагон-нше факторов по ступеням отбора с изучением индуцированной изменчивости новых агсашов на различных ступенях отборе. Исследовались такхе некоторое фазиолого-биохшдгчаские особенно ста мутантов и устанавливалось влияние условий культивирования на биосинтез внеклеточной протаинаэи с выделением вэ глубинной культуры аслергил-ла препарата протеиназы и его характеристикой*

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Методц исследования

В качестве исходного материала - продуцента кислой сротекта-ш послужила культура плесневого гриба ^^отіс^л

12« выделенная из природи. Дяя ее роста к размножения и проверки способности синтезировать кислую протеинаэу, в условиях глубинного культивирования, была использована синтетическая среда следующего состава (50: глюкоза - 5; пептон - 0,25; казеин- 0,1; КЙ2Р04 - 0,5; / -следи.

Начальная кислотность среда составляла 5,6, Среда стерилизовала при 0,5 атм в течение 30 минут. Опыты проводили в колбах Эрлен-мсйвра ш качалке дрг 180-200 об/ілш. (температура 29-30°С). Посевным ттервалои служила водная суспензия конидий 15-17 суточной культуры в количестве 3-5% среда. В процессе культивирования отбирали пробы >в которых определяли активность кислое про- , теина за, содержание биодассы, учитываемое по сухоцу весу, сахара или крахмала, азота и фосфора* Постоянно учитывали реакции ясходноЗ и яультуральноЙ среда путей измерения рН*

Метпя^пм ^блгёения ^ндрий. В качестве мутагенных факторов использовали ультрафиолетовые лучи а еталеяиынн. Кроме того,применялось комбинированное воздействие этиленштана и УФ—лучей, Источником Уф-лучей служили тря лампы БУВ-І5, расположенные параллельно и излучаищие свет с длиной волны 253? А. Конидии плео-яевото гриба, помещенные в чашки Петри, обяучаж ва расстоянии 40 см . Время облучения варьировали в зависимости от дозц. Каш , били использованы дозы УФ^лучей, соответствущве 7,0; 13,0; 25,0; 45,0 тыс. эрг/ям2. Водную о/спанзип конидий 5-ти суточной культуры готовили с расчетом содержания в I мл 10^ конадиалышх клеток. Высота слоя воднаЗ суспензии в чашке Петри составляла 4-5 ми. В процессе облучения водну» суспензию конидий постоянно

перемешивали.

Для обработки конидий ЭИ готовили рабочий раствор его в концентрации 1:100. Из этого раствора составлялись разведения ЇЇІООО, 1:2000, її4000. Контролем слухала суспензия конидий,необработанная мутагенами.

О***?)? ЯКТУ?ШП ДЛШ^атдд проводили путем переноса колоний.

получению: при росте обработан(шх и вншшпих конлдий. -аз чашек Петри на твердую агаризоваяну» среду, приготовленную в пробирках. После этого пробирка выдерживала в термостате в течение 5-ти суток при 30°. Активность вариантов, выраяенну» в процентах к контроля, располагали в вариационный рад. Для каждого вариационного ряда высчитывали следующие статастическае показатели: х—среднее арифметическое ряда; & - гсвадратическов огласке ние, СУ - коэффициент изменчивости (Рокицкий,196б).

Оценку ефективносте действия мутагенных факторов в степени изменчивости исходного вдгаыыа проводили путем сравнения количества в соотношения полученных 100 плюс- в-ыгнус вариантов.

Определение морфологической ц^менчиводтд проводила со Гаузе, 1957г.

Активность кистой шютаянааы определяли по метода Ансот а модификации Петровой /Х9в6/.

• Свободные внутриклеточные аминокислоты »кстрагировала этанолом С , 1955, Зайцева и др. 1969, Пошэкова о соав., 1970) А другие азотастне соединения, включая пептиды, экстрагировали 2-5% ТХУ/Зайцева, ЕолозерскнЯ.ІЗб?). Количественный я ка-чвотвешшЁ анализ в оббих фракциях проводшш ва ашнокиолотнем анализаторе марки МЬД-ЗВ ' по штсду. Мура я Штейаа,1951г. фговдв^еща обиего ^зо^д - какрометодом Къельдаля, релуотрутедге

/глюкоза/ - антроновым методом спектрофотоивтричбски при 1^570 ммк, дерргадіргадкдгр фодфдра - методом качественной реакции ва ионы ортофоофата /Р04 "3/ - щш 15(635 ш> Прддаоа^ тщо?. протеавааи исаздмся из культуральной хшюош дра температуре 4°, рН 3,0. В качестве осадктелл использовали 3-х кратный объем этанола, а также танпян а сульфат а»лгоыая. Рочвгавчтв в преп?о^в определяв методом Лоури {Х-о^ту 1951). Удельную .аятизпосту .Феомднта внракалн числом единиц активности ва X иг белка.

Д^годляз (гемоглобин, альоумия, казеин) препаратом

кислой протеиназы проводшш методам, предложенным [¿¡аховой с соав. (1970). Ашшшй азот - нвыгядрвновым методой по Штейну н Муру (1961г.>.

Датуї^1? зуяяркаадуг д чигтст а шшзздтад -

метолом Токмаля с соав. (1968).

результати следований

Многоступенчатый отбор по признаку образования кислой про-теияазы позволил нам получать наиболее активную монсколояиаль-ну» культуру № 12, конщции которой подвергали комбинированно^ воздействию ЭИ и УФ-лучей, а также отдельно одного ЭИ. На всех четырех ступенях отбора было выделено а проверено 2040 вариантов по схеме* представленной на рас. I. На всех этапах применяли одни и те же мутагены и их чередование позволило на какдом этапе селекции фиксировать наследственные изменения культуры. Начальным критерием, позволягвдш допускать, что в данных условиях мутагены проявляют эффективное действие явился летальный эффект, частота морфологических мутаций, частота плюс - а мщус-варнантов.

Первад ступень отбора активных эзрд^ОЧ*. Для изучения шщу-шрованной изменчивости ттаїма конидии обрабатывали различны»« дозами цутагенов. Изменчивость штамма Х2 по

признаку образования кислой протеиназы представлена серией гистограмм (ряс.2).

Как показывает полученные данные, при одной а той же концентрации ЭИ, но с увеличением дозы УФ-лучей, изменяется рааъих изменчивости как в стопону "штос-" вариантов, так и в сторону "мінус-* вариантов. Повышенное образование "плюс" вариантов, было отмечено пт действии ЭИ 1:2000 а, облучении УФ - 13,25 и 45 тыс. эрг/мцг. При таком рекиме обработки было получено 18-22$ мутантов с активностью кислой протеиназы, превышающей исходный штаым на 116-216$. Действие одного ЭИ в концентрации 1:1000 и 1:2000 почта не вызывает изменчивости исходного шташа. Образование вариантов с измененной активностью в зависимости от дози мутагена подчиняется определенной закономерности. Число "шюс"-вариантов при одной к той же концентрации ЭИ (1:2000), но с увеличением дозы УФ-лучей (до 45 тыс.эргЛм2) увеличивается, достигая своего максимума.

Однако щік и снижение кривой частоты возникновения плюо-ва-риантов соответствует различному уровню выяивазмости. Максимум образования актганшс вариантов совпадает о выживаемостью конидий при воздействия Уф-лучами - доза 13, Ю3эрг/м/^ а Эй -концентра-

С nena от Sopa вариантов Aipezg-ittu» Jí!/»a7ieus - axmaSttbix np&àsfUjtHitX't HÚC/ioá лрвтеиназы

/fumtzicnj

I cría и fiiJttt-

ta/ttt/a- J \котхгилиш>іі] ^полонии

PtMun oigaScMUr.

/Aip.jumintcuK [JÎ-VCjrÛttM/V

емнио из ffovâtj

-г- ftpffoprHO

S/3

Mp

ІЛ/іі mt/ûOjt/Hû

тг »рг&рем 1 SSi Варианта

З»*

ßip. íumavicuif 38/,г

InpoStptxe .260 Sepaamtf

fçmeipaix^

f—íf/ГЛМ-

\тур ftsfi.ï ¿ияаыу!/

pacttS мв поноиошВиняьмые тюывуеы Режим cbaSsmxu -,

DU utT.r, цжгА*.

{1HO!tH<î>tlJW*0e ffpoifpnt attmu&Ar&tu

Резют efpotomw.

1 www» +y*

il»

ри*ге>(р*тная nptítftf щтчІтшо

H^peítM»« варианта

( syj*- \ \n>iffi Jl-ip)

12

ÍZ8-2

&ЖИМ tSaeSawmr.

з* М«ев; t-iW;t Ufte, /¿впия. JUI :шв, ивам». * ft

и Ыrum.* ** ts.t.lS.sMtmHj***1,

рис.1

ПИЯ 1:2000. При этом выживаемость составляет При одной в

той же концентрации ЭЯ (1:2000), но о повышением дози УФ-луче8, выживаемость конидий резко падает до 0,00235. Данные летального эффекта мутагенов и изменчивости по количеств енноцу признаку наряду с морфодогическида мутапвяш служили начальными критериями» позвалящима допускать» что в данных условиях мутагены проявляют эффективное действие. Полученные варианты по своим морфологическим признакам отличались между собой большим разнообразием. Прежде всего они отличались резко выраженной складчатостью, появлением олигсконидиальншс форм, размером и формой колоний. Морфологическая изменчивость возникала принизкой выживаемости конидий (0,003; 0,002^). В процессе первого этапа отбора получили 513 вариантов, из которых после юс ыногократяого культивирования и проверка выделали наиболее активный вариант .

38. Если ИСХОДНЫЙ ЕЛИ природний штамм № 12 при культивировании s состоянии синтезировать внеклеточную кислу» протеинаэу, соответствующую по активности 0,60 мг тирозива/мя, то вариант А 38 синтезировал протеинаау по активности превосходящую исходный штамм в 2 раза (1,3 мг тяроэина/мл), В дальнейшем из варианта Ji 33 путем дополнительного рассева и отбора бала получена моноконидиаяьная культура 33-2.

Втотет ступень отбора а^двшх взриащдв. Коиадии варианта 38-2 подвергали дальнейшей комбинированной обработке с дозой УФ-^лучей 25 и 13 тыс.эрг/мы2. ЭИ применяли при этом в двух концентрациях 1:2000 и 1:400С* На втором этапе относительно повысилась чувствительность конидий к мутагенам. Выживаемость конидий снизилась до (доза УФ^тучей 13 тыс.эрг/мм2 и ЭИ Х:2000). Изменчивость варианта индуцированная действием ЭИ и УФ-лучей по признаку ферментообразевания показана на рис.3 и в таблице I.

Наибольшая размах изменчивости в сторону образования длюс-заоиантов достигается при концентрацви ЭИ 1:2000 и дозе УФ-яучай ІЗ.Ю3 эрг/мм®. На данном этапе отбора проявит шгоо-вариаятов заметно увеличивается и достигает 4Q%* Увеличилось при этом и количество мануо-вараантов, достигнув 19,9^.

В наших опытах шкеиыум частоты возникновения минус-вариантов наблюдается вря той же дозе, при которой достигает максиму-ш частота морфологических вариантов. Вторая ступень, как и пер-

и

!" і *

¿t -w) »«J ta HC J If ¿J? 1+0 ¿so гва

te че бе ее ies\i¿t ¡se їм tee ¡i* г** гвапе гч

I 3

it ее te еенеПге¡te ае at teette г*е гее геееее

I iV-t'itet-M'

I 4

Ф* t* íémAte t+л n* t** ***tit где«** де

Па M Я m і

te Єє fwjiH /V tur tte tee tee Mort ¿ее ее* I гя-ùteee^e 'v ув^йг^уі^

» ff df «i iwijïr ut tee лее ww ¿#e гее tee fee

te it ее ее /üjiWM.Hi ы iettte nene гее

I iV-Vieee-ju' І ô

дд<

>* t'mUit

4+Ф І4+ Ш ¿Mtí* ********* 1**

9

w УМü»інw

Рис, 2 Гаетограш 1-ой обработка

1 KttfWpAtt

і 2 iV-riIt-u',

! í lí- J'iw -ta

I Л' 4

J ítí-í^w-wVí^jii.jí'J«^«*

і 5

ityf-zs-'istf.

~ii~4e it flit, foïttlb> IWÙi ЛнтиІне&яь , %

Рис. З Гистограмм 2-оЭ обработки.

вая, характеризуется высокой эффективностью комбинированного действия ЭИ и УФ-^лучей, выражавшейся в усилении признаков фер-ментообра зования.

Таблица 1

Эффект изменчивости вариантов ¿Ьъа г^^г,

подученных при комбинированном воздействии Ш и УФ-лучей на втором этапе отбора

Условия обработки Колнчест- Плюо-ва- Минуо- Выживае-Морфоло-

во прове- рианты вариан- мость плоские

ренных вариантов % Г ^ му^ащи

ЭИ 1:2000 * , -+ УФ 13, Ю-эрг/иг 1*0 48,0 19,9 0,9 21,6

Эй 1:2000 + , п УФ 25.10ээрг/1*Г 150 29,0 10,6 0,012 16,?

ЭИ 1:4000+ 0

УФ 13ЛЬ3эрг/ьвГ 75 13,9 9,6 1.2 нв^^явля-

Ш 1:4000 + УФ 25.10 эрг/мм2 63 II,2 9,2 0,003 9,2

31 1:2000 55 2,1 1.1 2,6 яе проявлялись

ВСЕГО: 523 21,8 10,0 0,94 16,5

Всего на второй ступени селекции было выделено 523 варианта. Из них наиболее высокой способностью к биосинтезу кислой протеиназы обладал штамм 334, который по активности превышал предыдущий мутант та 177$. Данный вариант был использован дня дальнейшей индуцированной селекции.

Третья отудз*г> отбррд активных ваоиддурв. Новый активный вариант ^^гег-гс'се^ 334 подвергали рассеву. Конидии моноко-нздаальчой культуры обрабатывали сначала 31, а затем облучали УФ-лучада. Данные, характеризующие эффективность воздействия на конидии плесневого гриба одних и тех же мутагенов, приведены в таблице 2 и на рис.4, представляющих серию гистограмм.

Частота морфологических мутаций на данной ступени отбора составляет 14-16$, т.е. она понизилась, в то же время она осталась практически без изменений яра использовании высокой дозы

УФ—лучей (25 ты с. эрг/мм2) по сравнена» с морфологической изменчивостью, полученной после второй ступени отбора.

Таблица 2

Изменчивость мутанта Л^/э **334

после третьей ступени отбора

Условия обработки

Количв-Шдас Шву о- Выяи- Морфо- Актив- Сухой ство вари-вари- паз- лога- ность вес прове- анта анты шсть ческве кислой баомас-рениых" % % % иута- проте- см вапиаа- * * щк иназы_ г/100 ^

тов

%

мг тирозина

2И 1:2000 + УФ 13.103эрг/шг 150

Ж 1:2000 +

уф гб.ю'эрг/мм3 по

Всего

260

18 21 1,3

14 2,5 1,1000

17 16,5 0,018 16 17,5 18,2 0,659 15

2.3 1,1900

2.4 1,1450

. **

5. N

о

^ *

а

1*

I и £ «

г*

4

I

I зи-ггя

• лшИш Шц ||

г* « ы н» и»

гш *а ее в* ми до

ДхтиЬест*, %

Рис.4 Гистогракшы 3-ей обработки.

- ІЗ -

Выживаемость же конидий на третьей ступени отбора несколько повысилась (1,355). Частота плюс-вариантов снизилась примерно в 2 раза и составляет 185?. Следовательно, со мере увеличения кратности воздействия на конидии мутагенами последовательно уменьшается частота появления плюо-вариантов и, в конечно« итоге» меньше оказывается и активных по синтезу кислой прстеинази мутантов. Однако в сумме количество измененных форм не претерпевает изменений на разных этапах отбора.

В итоге третьей ступени селекции было выделано 260 вариантов, из которых отделыша мутанты па; активности превышали лишь ва 12-14$ активность вариантов, полученных после второй ступени отбора.

Наиболее активным и стабильным оказался вариант 128,который был использован на четвертой ступени отбора.

Четвертая ступень, отбора активных вдтеантрв. Моноконидааль-ная культура ^/»а'й'с^ І23-2 была обработана мутагенами в четвертый раз. При этом конидии облучали УФ-лучами (13,25 . и 45 тнс.зрг/юг), а затем гицерживали в растворе ЭИ (1:1000, 1:1000, 1:4000). В отдельных ва.тиантах опытов кокидхи обрабатывали только Ш. Выживаемость конидий при повышении дозы УФ-лу-чей падает до 0,015?, ъ то время как при обработка только ЗИ (1:1000, 1:2000, 1:4000 - ЭО, €0 а 120 мин.) она значительно каше. Что же касается уровня морфологической изменчивости, то он повышается только при комбинированной обработке кощдай ЭИ, а затем УФ-дучаш, причем более эффективное действие проявляют Уф-лучн, чем Зі! (Табл.3).

Частота возникновения индуцированных вариантов па четвертой ступени селекции относительно снизилась и прежде всего ори раздельном действии мутагенов ва конидпальаые клетки (таблица 3). На четвертом этапе селекции ото выделено и проверено 744 ва- . рианга. Ряд полученных мутантов устойчиво сохранял високу» способность к биосинтезу внеклеточной кислой протеяазы. Однако активность мутантов, полученных ва четвертой ступени отбора повысилась только на 10-125$ по сравнению с ранее полученшша. ІГаккм образом, по мере обработки втаю® и промежуточных вариантов одними и теш хе мутагенами в процессе длительного ступенчатого отбора образуются мутанте, измененные признаки которых со мере

Изменчивость вариантов jSsP &sf*>crfc-¿c¿*s, полученных при воздействии Зйа УФ-лучей

Дозы УФ-яучей тыс. Эрг/щ2 Концентрация ЭИ Частота шгос-ва- ри^нтов Частота мгауо-ва- PE|ST0B Выживав— ис^гь Морфологические му-таци^,

1:1000 10,2 18,7 0,3 8,0

13,0 1:2000 10,0 29,2 11,0

1:4000 9,5 17,9 2,5 -

IîIOOO 7.5 22,2 4,2 -

25,0 1:2000 6,5 18,9 0*003 12,0

1:4000 9,2 10,2 0,00В 2,0

1:1000 6,6 6,6 1,6 1.0

45,0 1:2000 . 4,6 10,6 0,002 п.о

1:4000 8,0 12,0 0,002 1.0

13,0 - 2,2 5,7 0,09 6,8

25,0 - 3,6 3,6 0,05 8,5

45,0 - - 6,7 0,01 8¿0

1:1000 3,0 3,0 4,2 —

- 1:2000 4,7 4,7 9,0 _

1:4000 2,9 2,5 9,8

давторностк использования мутагенов закрепляется при ушньтенот коэффициента изменчивости. (Таблица 4).

На четвертей ступени селекции отобран кутает -tfsp ^"^аа 128-2, который отличался от других наиболее высокой способность» к синтезу внеклеточной кислой протеяназы.

Активность мутантов -^г/3 полученных ш разных ступенях отбора

ялчапа Способ обработки Активность кио-Коэффи-А ктив-

конидий вдтаге- лев протеина за шент ность вариантов наья типоавти изыев- ваоиая-

ыг ыэкэ чивоо-та тоа по отноте-шш к исходной, %

12 исходный конидии без обработки 0,6 0,27 0,0 100

38-1 ступень селекпии . + Эй 1:2000,ЗОшн. УФ 13.103ерг/мл2 1,3 0,74 26,0 216

384 - П ступень селекции то же 2,3 1,2 27,0 звз

123 - Ш ступень селекции то же 2,5 1.4 10,2 416

128-2 - ХУ ступень селекции то же 2,8 1,7 12,5 487

й^у^ениа удлрддй баосч^тдэз ки<дой тютеицазы

Полученный мутант ^и^п&тосяз 138-2, гара кт еразупвдЯ-ся высокой способностью к биосинтезу кнелей протеиназы, подвергала подробному исследованию условий его культивирования. При это» установили действие отдельных ингредиентов питательной среда на образована внеклеточной кислой протеиназы.

Ъщящд щеточников углерода. В качество источников углерода быта испытана глюкоза« фруктоза* галактоза* лактоза, араби-ноза, ксилоза* сахароза, мальтоза, многоатомные спирты Сдулыщт, шннит), крахмал.

Полученные данные сведены в таблице 5.

Влияние источников углерода на синтез кислой протеиназн у мутанта и исходного таиш

-As/з ¿bsncrz¿ct*f і. мутант {исходный ¿тами) f^ucuA28-;

Источник углерода

2

рИ вес су— " активной био- ность

шсся г/ІООмл

кггслой протовна ан мг ти-позана /мг ' культу-радьноя жидкое^

рН вес су- активность

ХОЙ био- КИСЛОЙ Цро-

иэссы г/ІООмл

теиназы мг едрозн-па /мл культу— ральвой жидкости

^Глюкоза (контроль) 2,9 0,9210 0,60 2,9 1,1000 2,60

д-Фруктойа 3,05 1,1000 1,20 2,95 1,2020 2,80

д^Галактоза . 3,0' 0,9910 о,ао 3,0 1,0100 2,20

/№пЛактоза 5,5 0,2960 0,20 5,5 0,4250 0,40

дьПЛалътоз& 3,05 0,8720 0,60 3,05 1,0900 2,20

^Аі-Сахароза 2,8 0,7700 0,50 2,8 1,0100 2,00

Крахмал 2,96 1,1400 0,80 2,95 1,3000 2,30

¿^рабаноза 3,4 0,5300 0,30 3,4 0,9260 1,00

Д-Ксилоза 3,25 0,4120 о,х 3,2 0,4900 0,30

Д -Шянит 3,9 0,5200 0,20 3,96 0,4700 0,30

L -Дулыцгт 3,25 .1,0120 1,20 3,35 0,9980 2,20

Примечание: питательная среда содержала пептона 0,25%, казеина 0,1С$, KHgK^ - 0^5% z минеральные сола. Количество сахара в 100 ші было 5 г.

Для мутанта и походного штамма лучшими источниками углерода оказались фруктоза, крахмал, мальтоза или галактоза, гдхжоза, дулышт. Максимальное накопление биодассы у обоих штаммов проно-ходит на среда с крахмалом.

Лактоза, арабиноза, ксилоза, ьяикит практически угнетают

реет гриба и синтез фермента.

Общие закономерности роста а биосинтеза внеклеточной кислоД цротвиназы, вьивяенше в процессе культивирования на разных средах исходного и мутантного штамма, в пршшвле между собоЯ не отличаются. Однако количественные показатели определяющие интенсивность биосинтеза кислой протешизы я накоплена^ биомассы» говорят о том, что отселакшюяироваюшй гриб

отличается относительно повышенной "приспособляемостью" к некоторым сахарам, а именно лактозе, арабинозе и сахарозе.

Таким "образом, для получения высокоактивной кислой протеина-за шяото рекомендовать в качестве источника углеродного питания глюкозу, Фруктозу, мальтозу, галактозу и крахмал.

Вдияяие п^годчкф щеточников азота. При изучении влияния форм азота и их концентраций на рост и биосинтез фермента использовала аммонийные соли различных минеральных п органических кислот (в количестве 0,1, 0,2 и 0,в% по азоту) ы некоторые органические источники азота (пептон, аминокислоты). Выяснело, что введение пептона в питательную среду (концентрация 0,20-0,35^, рис.5}повышает активность фермента, что составляет 2,6 иг тиро-зина/шЕ.

ц*0 ¿¿г 4** А**

Менцгн/п^аииб ггелгпог % / - акти&еос/** яислои г - с у хои /тииеяия.

Гис-^-Вдаяша^пептона на биосинтез кислой протеиназы.

Цгатглльпя? р.мдлг'игекг

НМКигпс 1 «V. ,к".

/^лзгва

Влияние различных источников азота на биосинтез кислой цротеинаэы мутантом М^р. ^^вг^^/х

Источники азота Концентрации азота, % рн Активность Вес кислой про- сухого теиназн.мг мице-тироэина.мгг л^я в

А/а ОД 0,2 . 0,6 3.5 3.6 5,5 1,30 1,20 0,96 1,3100 1,3250 1,4250

. 0,1 0,2 0,6 3,7 3,85 3,5 1,02 1,02 1,02 1,2210 1,2560 1,2360

ОД 0,2 0,6 2,2 2,2 2,0 1,20 1,20 1,30 1,0100 0,9670 1,0010

ОД 0,2 0.6 2,9 2Д 2,9 ' 1,50 Г,50 1.60 Г,2000 1,3560 Х.3560

0,1 0,2 0,6 2,85 2,8 2.9 2,00 1,50 1,50 0,8265 0,9200 0,8900

0,1 0,2 0,6 зд зд 2,35 1,70 1,40 1,20 1,1500 1Д250 1,1500

////^ - щавелевокислый од 0,2 0,6 2,75 2,8 2,85 1,90 1,80 ■1,75 1,4520 1,5500 1,5520

/УМ/ - ламоннокясляй ОД 0,2. 0,6 2,85 2,8 2,95 1.80 1,80 Г.75 1,5500 1.4ДЮ 1,360б

/КЧ, - уксуснокислый од 0,2 2,95 ' 3,05 1,80 1,75 1.75 1,4300 1,4310 1.4310

контроль среда о не Итоном я казеином 0,25 од 2,75 2,6 1,1200

Данные, представленные в таблице в показывав?, что при культивировании мутанта на средах с ашначными солями минеральных кислот, а также азотнокислым натрием тормозится синтез фермента, хотя рост мицелия в этих условиях осуществлялся интенсивно. Количественное содержание биоодссы, в пересчете на ее сухой вес, составляло 1,220 - 1,425 г/100 мл, т.е. оно превосходило на 10-155? бноюссу контрольного опыта. Аммонийные соли ортофосфорної кислоты также тормозят синтез фермента, за исключением (//РОг , который в концентрации 0,1% по азоту обеспечивает относительно високий уровень кислой протеиназы (2 мг. тироэияа/мл). При росте мутанта на средах о аммонийными солями органических кислот также получены низкие показатели, несмотря на то, что в процессе роста эти соли обеспечивают поддержание кзслг^-оти среды, благоприятной для синтеза кислой протеиназы.

Получены некоторые данные, характеризующие действие аминокислот на биосинтез кислой1 протеиаазы, Результаты обобщены в таблице 7.

Таблица 7

Влияние аминокислот на синтез кислой протеина зы и рост мицелия при культивировании Яїр.Ж/-тоъсс^я 128-2

Вид и штамі плесневого граба

Я5р. ¿игпаъссиз

128-2*7

(мутант)

Аминокислоты - стимула- Аминокислоты - реп_ЗДШ___веского_

синтез кис- рост маце- синтез кис- рост малой протеи- лия гриба лой протеи- целия назы наш гриба

лизин, аспараги- аопарагин цистеин

норяайцин, новая к-та, аргинин,

фенилала- аспарагин, серии,лей-

нин, щетин глюташно- шш,тршгго-

вая кисло- фан. трео-

та,изолей- нин цин,лизин, цистин

Нексгеошз фцзздддго-биокдищчдддид .ордЗенц&дтд мутанта

Физиологические изменения кутаита в сопоставлении о исхода ным штаммом нашла свое отражение в различной скорости накопления биошсш, в различном потреблении основных компонентов среда - углеводорода, азота и фосфора. (Рис.6).

ЧУ— ■ V» •ЧГ «ь ' V» 1

Бом

Характерно, что по скорости роста, учитываемой по накоплению биоьиссы, а также по уровня биосинтеза внеклеточное кислой протеиназы мутант заметно опережает природный штамм. Так, вариант 128-2 превышает исходный штамм по активности протеина зы в 4-4,5 раза. Подобная закономерность наблюл дается и в отношении накопления биомассы. Процессы ассимиляции основных ингредиентов среды, роста «леток мицелия и биосинтеза-кислой протеина зы взаимообусловлены. Анализируя полученные давние, можно констатировать, что под влиянием мутагенов удалось существенно усилить функцию биосинтеза кислой протеина зы к повысить уровень накопления биошссы.

Особенности аминокислотного обмета у мутантного и исходного дргаммов . Как известно, в клеточном метабо-

лизме важную роль играют свободные аминокислоты, которые принимают, по-видимому, участие в регуляции синтеза ферментов и азотистом обмена у микроорганизмов Л/от**»" 1964, Агатов 1961, Дорохов, Коновалов, 1969). Однако до сих пор мало ' внятная уделяется связи мезду аминокислотным составом и физиологическим состоянием плесневых грабов.

Анализ свободных внутриклеточных аданокислот на разных стадиях развития грибов (12,18,24,43,72 часов), включая и конидии показал, что коотдиальные клетки содержат в своем составе 13-14 свободных аминокислот. Количественное содержание отдельных аминокислот изменяется в зависимости от времени роста нонвддалькых и мицелиалькнх клеток гриба. (Табл.7). Биохимические превращения, происходящие в клетках конвдий и в значительной степени предопределяющее их прорастание и развитие, сводятся, как это вытекает из полученных данных, к образованию отсутствующих и накоплению уже имеющихся аминокислот, но содержащихся в микаэдльяых количествах. Так, например, еоли конидга содержали в сумме 1,621,32% свободных аминокислот, то в 12-часовом мицелии юс количество составило уже 12,04-9,40^ на вес сухой биомассы. У мутанта проявляются индивидуальные особенности, он отличается от исходного более высоким содержанием глуташновой кислоты и аланаиа, т.е. аминокислот, синтез которых осуществляется путем прямого аминирования соответствующих кетокислот - шровиноградной и ке-тоглутаровой, что возможно и обеспечивает высокую его способность к биосинтезу кислой протеиназы.

Содержание свободных у мутантного и (% на сухой вес '

Аминокислоты ПродолшатальноотьI

Мутант 123-2

конидии 12 18 | 24 43 | 72 96'

Лизин

Аргинин

Аспарагиновая каслотз

Трзонин

Серии

Глутажновая кислота

Цролин

Глшшн

Алании

Еалин

Метиокзн

[■Ізолейцин

.¡¡СЙШШ

Тирозин

Фелилалавдн

СУША

0,99 0,60

0,40 0,64

0,00 0,70 0,00 0,00

0,00 ОДЗ 0,00 0,00

0,1Г 0,60 0,35 0,26

0,13 0,53 0,57 0,54

0,15 0,47 0,50 0,40 0,60

0,49 3,16 2,70 2,70 1,20

0,09 0,00 0,00 0,60 0,60

0,03 0,56 0,40 0,30

0,04 2,67 2,10 1,40

0,12 0,31 0,60 0,74 0,70

0,02 0,44 0,30 0,00 0,00

0,07 0,45 0,27 0,20 0,40

ОДЗ 0,59 0,60. 0,30 0,50

0,10 0,36 0,40 0,15 0,20

0,09 0,57 0,35 0,20 0,30

1,62 12,04 .9,14 7,49 8,96

0,45 1,40

1,00 0,57

0,35 0,50 0,66

0,30 0,70 0,50 1,50 0,60 0,00 0,39 0,50 0,20 0,3О 8,57.

0,00 0,00

0,22 0,30 0,35

0,80

следа 0,24 Г,10 0,34 следы 0,24 -0,30 . О,И 0,12 4,12 .

Примечание: лизин был установлен лишь е То яв самое было отмечено и

шцелвд мутанта за в отношении аргинина.

Таблица 7

внутриклеточных аминокислот

исходного штзммов л ¿р. дитсысих

биомассы)

роста, час

Исходный 12

кони- 1 дог 1 12 Т8 ] 24 т 72 96

0,09 0,60 0,50 0,30 0,30 0,2С 0,12

0,И 1,20 0,80 0,40 0,40 0,50 0,20

0,13 0,70 0,70: 0,30 0,50 0,60 0,30

0,25 2,10 4,20 2,80 1,40 1,40 0,50

0,09 0,00 0,00 0,50 0,00 0,30 следы

0,03 0,60 0,50 0,20 0,30 0,40 0,20

0,03 0,20 2,20 1,40 2,00 1,10 1,00

0,09 1,00 0,70 0,40 0,60 0,50 0,40

0,03 0,40 0,30 0,00 0,00 0,00 следы

0,07 0,50 0,40 0,30 0,40 0,30 0,20

0,15 1,00 0,70 0,30 0,30 0,50 0,40

0,17 0,50 0,30 0,10 0,10 0,20 0,20

0,08 0,60 0,20 0,20 0,30 0,20 0,19

1,32 9,40 11,50 7,20 7,20 6,10 3,71

12 чао. (0,7£), 43 час. (0,9Э#) а 72 час. (1,0{2) роста.

Синтез кислой протеиназы наиболее интенсивно осуществляется именно молодвгмк растущий клетками мицелия с 12 по 24 час. культивирования. За этот период образуется не менее 50% всей кислой протеиназы с даксималькам содержанием в растущей клетке аспарагиновой, глутаминовоЗ аминокислот и аланииа.

SsQîiCTba гсслоЦ .щдат^тпизд „wre»^3 ' -

133-Й

1]олуч<31ие препарата. Препарат кислой протенназы toi получен путем осаадешя ферментативного белка 4 объемам! 965S этзлового спирта при 4°С, рН реакшонной смеси равной 3,0. Выход препарата составлял 1,0 г cl литра культуральноЛ падкости* Выход фермента по активности равнялся 88,6?. Активность кислой протеиш-зы била 2000 иг тирозина. Удельная .активность равнялась 20 мг тирозина в пересчете ш мг белка. Препарат содержал 28# белка. Оптимальной.температурой действия кислой протеиказы на субстрат является 40-50°, при рН 2,5; - одтишльное значение рН действия фермента лежит в пределах 2,5-3,0 (рас. 7).

Рис. 7 Влияние температуры и рН m активность кислой протеина ты.

-Изучена термостабильность и рН-стабильвость протеиназы.Фермент териостабилен при 50°С в течение одного часа, а при 70°С он в течение одного часа полностью инаятивируется. Препарат рН-стабилея в течение 24 часов при рН 2,0-3,5 ж температуре 30°С. При более кислых та щелочных значениях рН он долее лабилен«

РДОНЦЗ спепиЕичесртзг ингибиторов на действие препарату. Применение спецификеских j>еагентов, так называвшее "ферментных. ядов", имеет большое значение для определения активных функциональных групп в молекуле фермента, а также при каде$вфикашш ферментных систем, которые по характеру действия та различные субстраты могут быть похожими а в то же время сильно отличаться между собой по химической структура. Мы проверяла наиболее типичные ингибиторы, проявляющие действие на многие ферменты. Анализируя, полученные данные можно сказать, что некоторые сульф» гидрильше группы в молекуле фермента предопределяют механизм . его действия. Серил не участвует в каталитических свойствах действия кислой протеиназы, так как ДШФ почти не инактивнрует фермент. Тирозин в триптофан включаются, по-видимому, в активные центры молекулы фермента, вследствие чего t/MnO^ и

кристаллический йод полностью инактивнруют протеинаэу. А так как аон ртути почта не ингибирует фермент, то, следовательно, можно косвенно предполагать, что роль металлов для действия кислой протеиназы не существенна; в косвенно судить о длине цепи белковой молекулы. Кислая протеиназа не является металлоэнзяыом, так как относительно^большие концентрации ЭДТА этилендиаминтет-раацетат (10 XCf5 м ) не оказывают действия на ее активность.

Гияроли? казеину, дльбушна. гемоглобина кислой протеща-30%. Препаратом кислой протеиназн производили гидролиз наиболее распространенных в доступных белков: казеина, личного альбумина и гемоглобина. При этом установлено, что фермент расщепляет в белковой молекуле до 55-60$ связей, а у казеина - 37$, Основными продуктами гидролиза белков кислой цротвиназой являются пептиды. В ферментативных гидролизатах данных белхш количество свободных аминокислот составляет только 7,1-12,2??. Следовательно, при действии кислой дрот енна зы ва бедки осуществляется специфический разрыв пептидных связей с образованием, главный образом. пептидов и небольшого количества свободных аминокислот.

KvimnmfptpAw,ta мутяшэд я тмдав од ответах условиях. Производственные опыта культивирования мутанта проводил в ферменте--pax емкость» I м3 при различном расходе воздуха! на заводе "Хим-реактивы" г, Олайнв; среда оря втом гнела следующий состав (£): ржавая чука - 2% Иуо^ - 0,5\ Jfp-SO^ - 0,01. Максишдьное накопление активности кислой протегназн наступает через 38-42 часа при скорости мешалки 180 ой/мин и подаче воздуха в количестве I объели на объем среды в минуту. Нам удалось в производственных условиях сократить срок культивирования до 36 час. о обеспечением максимального выхода фермента. Максимальная актив» ность фермента в этих условиях равнялась 2,6 мг тирозина/мл.

ВЫВОДИ

1. Индуцированная селекция Лз/эег^&'Л использованием этилешцсша и УФ-лучеЙ позволила экспериментально получить мутант с измененными количественными признаками, обеспечи-вапщш повышенный биосинтез внеклеточной кислой протеина за.

2. Экспериментально показано, что при комбинированном действии на конидии плесневого гриба этиленишна, а затем ультрафиолетовых лучей « достигается' сумгаршЗ эффект индуцированной изменчивости: последовательная обработка конидий мутагенными факторами оказалось наиболее эффективной для получения активного цутанта.

3. Установлены наиболее эффективные дозы мутагенных факторов, вызыващие максимальное накопление мутаций. Обработка конидий плесневого гриба раствором этвленидана в концентрации 1:2000, 1:4000 при экспозиции 30 мал.и дозой УФ-лучей 13,0 и 25,0 тыс. эрр/ии2 при ступенчатом отборе позволила получить устойчивый мутант, активный продуцент кислой протекнази. Одновременно при. этом показано, что возникновение плюс- и мэлус-вараантов всецело зависит от доз мутагенных факторов.

4. Индуцированная изменчивость получаемых вариантов хорошо-рагистрнруетея яа питательных средах, содержащих в качестве источника углерода моносахариды (глскоза, фруктоза, галактоза), дисахариды (шльтоэа) или многоатомный спирт дульцят,обесцечи-

ваетсл хороший рост мутанта « интенсивный савтеэ им квелей протеина зы. Другая группа Сахаров (лактоза, арабиноза,ксилоза нот) практически угнетает рост гриба и репрессирует сайтез фермента.

Питательные среды с органическими форгода азота обеспечивают интенсивный синтез внеклеточной кислой протеяпазы. Восстановленные Форш азота - соли ашония - подавлявт синтез фермента* Из 19 испытанных аминокислот индушруют синтез кислой протеинази только фекидалаяин, лизин, норлейшш, цаетин. Другие аминокислоты, я прежде всего аспарагшь аргинин, серии, продан, лейцин, треонин репрессирует синтез фермента и тормозят рост мутанта.

5. Активней мутант Jfspezft&ss t^¿<^123-2 обеспечивает при оптажльных условиях культивирования синтез внеклеточной кислой оротвивазы, превосходящей по активности в 4,0-4,5 раза исходный штамм, а именно 2,4-2,7 мг тирозина/мл вместо 0,50,7 мг тирозана/ил культурольпой жидкости. Максимальная активность кастой протеиназы проявляется при рН 1,8 - 3,0. ■

Шоскнтез кислой ^ротвяназы плесневой гриб осуществляет щи рН среда 3,3-2,9. Тем сашм отметается в значительной мэре соответствие между оптимумом рй среды, о бе сп е чивапщим синтез про-тенназы и оптимумом *ее действия вне клетки.

6. Из культуральной ЖИДКОСТИ 128-2 вцделен препарат кислой протеиназы. Выход по активности состав-, ляет 88,6$, удельная активность - 20 мг тироаина/мг белка. Цре-парат содержит 28% белка; проявляет стабильность при рН 2,5-3,0 ■ температуре 50°С.

7. фи гидролазе белков кислой протеиназой спорость ж глубина протеолиза осуществляется по-разному в зависимости от природы бедка. При гидролизе альбутаа освобождается около 80S? пептидных связей, гемоглобина - 55Jt ж казеина * 37%. Основншв продукташ при этом являют пепгшды; свободные аминокислоты образуются лшь в количестве 7,1-12,2%.

8* Условия культивирования мутанта, обеспечивавщае синтез внеклеточной кислой протешшзы, уточнены в заводских условдях. -Ыаксиыальшй синтез протеиназы отмечается пра пропускания одного объема воздуха на равный объем среды в минуту и перемещгаа-

k

иЕбк ее со скоростью 180 об/мин. При таком режиме куяьтквгрова-ш граба активность кислой протеииазн составляет 2,4-2,6 иг тирозюта/мл; продолжительность ферментации 38-42 час.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации (соавтор С•А.КОНОВАЛОВ)

1. Экспериментальная изменчивость штампе

¿итоньсиз продуцента кислой протеинаэн. Микробиологическая цро-шшленность, иг49У-1.

2. Селекция &^¿/^г ^/»оыс.^?- продуцента кислой протеиназы. Микробиология, т.40, в&, 1083, 1371.

3. Использование ультрафиолетовых лучей и этиленимина в селекции ^^ шташ 12-продуцента кислой протеина зы. Труда Ф0 ин-та БШИсантезбзлок.в.1,1971.

4. Влияние источников углерода и азота ш синтез внеклеточной КИСЛОЙ дротедвазя мутантом ^Ьта1 ш Прикл. ¿иохлмия а микробиология, 7, 4, 437.1971.

5. Некоторые фкзиолого-биохимические особенности мутанта

123-2, продуцента кислой протеина зы. Пршсладкая баохим. и кисробиоя. в 5, 1972.

С. Свойства внеклеточной кислой протеиназн кртанта ^¿¿еу ^г^егшси^ 123-2, Прикл. биохимия у, микробиология, Е лечатг. 1972.

7. Исследование динамики гидролиза некоторых белков кислой протеиназой мутанта ^потлсг*.г 128-2. Прикл.

биохимия и микробиология, ё печати. 1972.