Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной астме с использованием полиморфных маркеров генов-кандидатов

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной астме с использованием полиморфных маркеров генов-кандидатов"

На правах рукописи

003493640

ДМИТРИЕВА-ЗДОРОВА ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

" 4 МАР 20Ю

Москва - 2010

003493640

Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Орехозича РАМН (ИБМХ РАМН).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, Воронько Ольга Евгеньевна

ст.н.с. ИБМХ РАМН

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Журков Вячеслав Серафимович

ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. СЫСИНА

РАМН

кандидат биологических наук, Серегин Юрий Александрович

вед.н.с. ФГУП «ГосНИИ генетика»

Ведущая организация: ГУ Медико-генетический научный

Защита диссертации состоится « 16 я марта 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан <е/5"~» февраля 2010 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета,

центр РАМН, г. Москва

кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из наиболее сложных задач современной генетики является изучение молекулярно-генетических основ многофакторных заболеваний. Важное место среди многофакторных заболеваний бронхолегочной системы человека занимает бронхиальная астма (БА). В некоторых странах БА является главной причиной инвалидности и смертности населения, опережая даже сердечно-сосудистые и онкологические патологии, что характеризует БА как глобальную медико-социальную проблему (Даше е1 а1, 1997).

Эпидемиологические исследования последних лет говорят о том, что 4-8% населения страдают БА, в том числе 5-10% детской популяции и 5% взрослой (Чучалин, Баранов, 2006). В России данным заболеванием страдает примерно 10% взрослого и 15% детского населения. В последние десятилетия прогрессивно увеличивается заболеваемость и смертность от БА.

В основе развития БА лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды (Соокзоп \УО, 2002; УегсеШ Э, 2003). Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития БА связан с выделением группы генов, продукты которых прямо или косвенно могут быть вовлечены в развитие данной патологии, так называемых генов-кандидатов (Федосеев, 1998). В настоящее время известно более 100 генов-кандидатов БА (5Ыпса, 2007; Фрейдин, 2002). Гены предрасположенности к БА условно можно разделить на 5 групп: 1) гены врожденного иммунитета и гены иммунорегуляции; 2) гены, связанные с дифференцировкой клеток ТИ2 и эффекторными функциями иммунной системы; 3) гены, экспрессирующиеся в клетках эпителия бронхов; 4) гены, ассоциированные с перестройкой (ремоделингом) дыхательных путей и тяжестью заболевания; 5) гены предрасположенности к БА, открытые позиционным клонированием (УегсеШ Э, 2008).

Изучение ассоциации генов-кандидатов с заболеванием проводят с помощью полиморфных маркеров, которые могут располагаться внутри гена или рядом с ним. Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов основано на выявлении и сравнении частот встречаемости генотипов и аллелей в группах с наличием и отсутствием заболевания. Если различия в частотах аллелей и генотипов являются статистически достоверными, считают, что данный маркер ассоциирован с развитием заболевания. Установленные предрасполагающие или предохраняющие генетические маркеры в дальнейшем могут быть использованы для прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Поэтому анализ ассоциации полиморфных маркеров с атопической БА является актуальной задачей современной молекулярной генетики.

Цель ч задачи исследования. Цель настоящей работы - оценить уровень ассоциации двенадцати полиморфных маркеров восьми генов-кандидатов БА:

интерлейкина-13 (IL13), интерлейкина-5 (ILS), альфа-цепи рецептора интерлейкина-8 (IL8RA), toll-подобного рецептора 4 (TLR4), антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA4), G-белка, ассоциированного с астмой (GPRA), эотаксина-3 (CCL26) и регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (CCL5) с атопической БА.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, а также группу здорового контроля русского происхождения.

2. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(-1055)Т и R130Q гена IL13, С(-703)Т гена IL5, M3ÍR и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/Q гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26, A(-403)G гена CCL5 в группе больных атопической бронхиальной астмой и в группе здоровых индивидов.

3. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров в группах больных и здоровых индивидов для выявления их ассоциации с развитием БА и тяжестью течения БА.

4. Провести анализ ассоциации гаплотипов генов IL13, IL8RA, CTLA4, GPRA с БА и тяжестью течения БА.

Научная новизна работы. В данной работе впервые изучена ассоциация полиморфных маркеров генов 1113, 1L5, IL8RA, TLR4, CTLA4, GPRA, CCL26, CCL5 с атопической БА и тяжестью ее течения среди русского населения г. Москвы. Вышеизложенные результаты были получены впервые.

Практическая ценность работы. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов атопической БА могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления пациентов с повышенным риском развития заболевания, проведения донозологической профилактики и прогнозирования течения болезни.

Апробация работы. Результаты настоящей работы докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.), на II Всемирном форуме по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 2009 г.), на конференции «The 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference» (Орландо,

2008 г.), на 4-й интернациональной конференции «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine» (Москва, 2008 г.), на конгрессе «The World Asthma Meeting (WAM'2007)» (Стамбул, 2007 г.) и на ежегодном конгрессе Европейского респираторного общества (Стокгольм, 2007 г.; Берлин, 2008 г.; Вена,

2009 г.). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании межлабораторного семинара ИБМХ РАМН от 17 ноября 2009 г. и секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИ генетика» от 9 декабря 2009 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, включая 2 статьи и материалы международных конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и обсуждение, выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на МО страницах машинописного текста и содержат ¿Лтаблиц и рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы.

В исследовании были использованы образцы ДНК 283 больных атопической БА и 227 здоровых индивидов русского происхождения. Общая характеристика групп представлена в таблице 1. Образцы ДНК и клинические данные больных атопической БА были предоставлены лабораторией аллергодиагносгики НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. В контрольную группу были включены здоровые индивиды без клинически диагностированной БА, аллергических и бронхолегочных заболеваний. Образцы ДНК здоровых людей были предоставлены лабораторией молекулярно-генетической диагностики НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН. Выборки были этнически однородны и составлены из русских (на основании паспортных данных), проживающих в г. Москве. Для выявления ассоциации генетических маркеров с тяжестью течения заболевания больные атопической БА были разделены на две подгруппы согласно критериям GINA: больные с астмой легкой степени тяжести (п=139) и больные со средним и тяжелым течением заболевания (п=152) (Табл. 1).

Анализ нуклеотидных последовательностей интересующих нас хромосомных областей осуществляли с помощью системы NCBI в сети Интернет (www.ncbi.nlm.nih.gov), с использованием следующих разделов: MapView (расположение полиморфных маркеров на хромосоме), dbSNP (информация об однонуклеотидных полиморфных маркерах). Для подбора праймеров и специфических зондов использовали программу Primer Premier 5.0.

Идентификация генотипов полиморфных маркеров проводилась с использованием времяпролетной масс-спектрометрии с лазерно-десорбционной ионизацией образца в матрице (MALD1-TOF). Метод состоит из следующих стадий: 1) пробоподготовка, включающая в себя амплификацию участка ДНК, содержащего исследуемую нуклеотидную замену, и последующую реакцию удлинения праймера (минисиквенс); 2) разделение фрагментов ДНК (праймеров с присоединенным на 3'-конце куклеотидом, соответствующим аллелю искомого полиморфного маркера) по массе с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF.

Таблица 1.

Общая характеристика обследованных групп с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

«БА+» (п=283) «БА-» (11=227)

БА легкой степени тяжести(п=131) БА средней и тяжелой степени тяжести (п=152)

Пол, м/ж 71/60 65/87 103/124

Возраст, лет 34,4 ± 13,4 41,8 ± 16,2 38,5 ± 10,4

Длительность заболевания, лет 11,9 ±8,6 13,1 ±8,4 -

Возраст начала заболевания, лет 15,4 ±7,6 -

Общий 1{>Е, кЕ/л 230 (65; 620) 45 (23; 89)

Данные по возрасту и длительности БА представлены в формате М ± БЭ, где М - среднее, -стандартное отклонение. Данные по концентрации ^Е - в формате Ме (25%; 75%), где Ме - медиана, 2575% - интерквартильный интервал.

Для сравнения частот аллелей и генотипов исследуемых полиморфных маркеров в группах с наличием и отсутствием БА, а также в группах больных различной степени тяжести БА, нами использовался точный двусторонний критерий Фишера. Достоверными считали различия при р<0,05. Распределения аллелей и генотипов всех маркеров проверяли на соответствие закону Харди-Вайнберга. Относительный риск развития заболевания оценивали с помощью показателя соотношения шансов (odds ratio, OR). Значение OR и 95% доверительный интервал (confidence interval, CI) вычисляли с помощью программы Calculator for confidence intervals of odds ratio (http://vvww.hutchon.net/ConfidOR.htm). 0R=1 рассматривали как отсутствие ассоциации; 0R>1 - как положительную ассоциацию ("предрасположенность"), 0R<1 -как отрицательную ассоциацию аллеля или генотипа с заболеванием.

Анализ гаплотипов проводился с использованием программы Hapstat 3.0 (University of North Carolina, USA).

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(~1055)Т и R130Q гена IL13 с атопической БА.

Интерлейкин-13 (ИЛ-13) является одним из основных по значимости цитокинов в патогенезе атопической БА. ИЛ-13 - мощный индуктор эозинофильного, макрофагального и лимфоцитарного ответа, связанного с развитием фиброза дыхательных путей, активацией слизепродуцирующих клеток и повышенной бронхореактивносгью (Zhu et al, 1999). Воспалительный ответ реализуется через способность ИЛ-13 стимулировать выработку хемокинов и протеолитических ферментов, таких как металлопротеиназы матрикса. Установлено также, что развитие

фиброзных изменений в ткани бронхов - результат активации интерлейкином-13 фиброгенного цитокина TGF-pi через ММР-9 и плазмин-зависимый путь (Lee et al,

2001). Таким образом. ИЛ-13 является конечной точкой приложения Th2-опосредованных воспалительных эффектов.

Ген 1L13 локализован на хромосоме 5q3!.l. Последовательность гена содержит ряд однонуклеотидных замен (Рис. I), часть из которых ассоциирована с развитием БА и атопией. Наибольшее внимание исследователей в настоящее время привлекают два маркера в данном гене: С(-1055)Т в промоторной области гена и R1300 в кодирующей области.

Полиморфный маркер С(-1055)Т гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену С ^ Т в положении -1055 промоторной области гена (Рис. 1). Функциональное действие данного маркера может быть объяснено тем, что замена расположена непосредственно перед сайтом связывания Т-клеточного транскрипционного фактора NFAT, который регулирует экспрессию генов ILI3 и IL4. Ранее было показано, что наличие тимина в положении —1055 приводит к более активному связыванию NFAT с промотором и, таким образом, данный маркер может влиять на экспрессию гена IL13 (van der Pouw Kraan et al, 1999).

Полиморфный маркер RI300 гена IL13 представляет собой однонуклеотидную замену G -» А в положении +2043 в экзоне 4, приводящую к аминокислотной замене положительно заряженного аргинина на нейтральный глутамин в положении 130 а-спирали D-домена интерлейкина-13. Это участок, посредством которого происходит взаимодействие ИЛ-13 с рецептором. В последних исследованиях было показано, что замена аргинина на глутамин в положении +2043 не изменяет константу связывания ИЛ-13 с рецептором и не влияет на стабильность этого комплекса. В то же время, данная замена сопровождается повышенным уровнем экспрессии ИЛ-13 (Arima et al,

2002).

Рис. 1. Полиморфные маркеры гена IL13.

При исследовании распределения частот аллелей и генотипов больных атопической БА и группе здорового контроля отмечено преобладание аллеля С и генотипа СС (Табл. 2). Минорный аллель Т встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой - 2728%, что согласуется с частотами данного аллеля в европейских популяциях - 20-33% (Дания, Нидерланды, Германия) (Graves et al. 2000). В группе больных БА наблюдалось увеличение частоты аллеля С и генотипа СС с одновременным снижением доли аллеля

ШШШШШВШШШШШШШЯШШШ

¡■ШШШЯшШШШЙШШМШмтатаЮшШ полиморфного маркера С(-1055)Т в группе

Т и генотипов CT и TT по сравнению с контрольной группой. Такие различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Таблица 2.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(-1055)Т и RI30Q гена ILI3 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

В распределении частот аллелей и генотипов полиморфного маркера R130Q в обеих группах наблюдалось преобладание содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg (Табл. 2). Гомозиготный генотип Gln/Cln встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой (7-8%). Также было отмечено увеличение доли аллеля Gin и генотипа Arg/Gin и снижение частоты аллеля Arg и генотипа Arg/Arg в группе больных БА. Однако статистически достоверных различий не обнаружено, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Таблица 3.

Распределение аллелей и генотнпов полиморфного маркера C(-10SS)T гена IL13 у

В результате сравнения частот аллелей и генотипов маркера С(-1055)Т в группах, разделенных по степени тяжести БА, была выявлена выраженная ассоциация маркера С(-1055)Т с тяжестью БА, что отразилось в снижении частоты встречаемости генотипа СС в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, с одновременным увеличением встречаемости генотипа СТ в этой группе. Данные различия являются статистически достоверными, при этом носительство генотипа СТ связано с более тяжелым течением атопической БА

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» «БА-»

С(-1055)Т

Аллель С 0,731 0,722 >0,05

Аллель Т 0,269 0,278

Генотип СС 0,526 0,515 >0,05

Генотип СТ 0,410 0,414 >0,05

Генотип TT 0,064 0,071 >0,05

RI30Q

Аллель Arg 0,714 0,738 >0,05

Аллель Gin 0,286 0,262

Генотип Arg Arg 0,509 0,551 >0,05

Генотип Arg Gin 0,410 0,374 >0,05

Генотип Gin Gin 0,081 0,075 >0,05

больных с атопической БА разной степени тяжести.

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р OR и 95% CI

БА легкой степени тяжести БА средней и тяжелой степени тяжести

Аллель С 0,763 0,704 >0,05 -

Аллель Т 0,237 0,296

Генотип СС 0,611 0,461 0,025 0,54 [0,34-0,87]

Генотип СТ 0,305 0,487 0,001 2,16 [1,44-3,98]

Генотип 77' 0,084 0,052 >0,05 -

(Ой=2,16,95% CI [1,44-3,98]), а генотип СС, напротив, связан с легким течением астмы (0/?=0,54,95% CI [0,34-0,87]) у русских пациентов г. Москвы (Табл. 3).

Для полиморфного маркера R130Q гена IL13 ассоциации с тяжестью течения заболевания установлено не было.

Для того чтобы оценить комбинированный вклад маркеров С(-1055)Т и R130Q гена IL13 в патогенез БА, мы провели сравнительный анализ частот встречаемости гаплотипов в группе больных атонической БА и группе здорового контроля. Данный анализ не выявил достоверных различий в частотах встречаемости гаплотипов между группами. Также не было обнаружено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения БА.

Наши результаты для маркера С(-1055)Т гена 1L13 отличаются от большинства исследований, проведенных на европейских популяциях, в которых была обнаружена достоверная ассоциация полиморфного маркера С(-1055)Т с развитием БА (van der Pouvv Kraan et al, 1999; Howard, 2001). Ассоциация генотипа TT с заболеванием также была подтверждена в США на выборке афроамериканцев (Moissidis et al, 2005). Однако нами была установлена ассоциация маркера С(-1055)Т с тяжестью течения БА, что согласуется с важной ролью интерлейкина-13 в прогрессии аллергического воспаления и развитии фиброза бронхов.

Литературные данные по ассоциации маркера R130Q с развитием БА противоречивы. Так, в нескольких работах демонстрируется связь данного маркера с БА и уровнем общего IgE (Heinzmann et al, 2000 и 2003). Однако другие исследователи не выявили никакой ассоциации данного маркера с развитием БА (Leung et al, 2001, Hummelshoj et al, 2003). Полученные нами данные также не демонстрируют ассоциации между маркером R130Q и развитием атопической БА. Подобная противоречивость результатов может быть объяснена влиянием различных популяционных факторов на частоты аллелей и генотипов данного маркера, а также разными критериями включения/исключения индивидов в выборки.

Отсутствие ассоциации маркера R130Q с развитием заболевания и его прогрессией объясняется, по-видимому, тем, что ИЛ-13 реализует свои эффекторные функции через взаимодействие со специфическим рецептором, а данная замена никак не влияет на кинетику связывания белка с рецептором и стабильность комплекса лиганд-рецептор.

2.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-703)Тгена IL5 с атопической БА.

Интерлейкин-5 (ИЛ-5) является мощным активатором эозинофилов, которые в свою очередь, провоцируют развитие воспаления, приводящего к обструкции и гиперреактивности дыхательных путей. ИЛ-5 - один из основных факторов, контролирующих созревание и функциональную активность эозинофилов (Campbell et а/, ¡987; Lopez et al, 1988). Также ИЛ-5 играет важную роль в дифференцировке В-

лимфоцитов, активированных специфическим антигеном или митогеном (Takatsu et al, 1988) и усиливает продукцию иммуноглобулинов этими клетками (Takatsu et al, 1988; Feghali, Wright, 1997).

Ген IL5 локализован на хромосоме 5q31.1 (Sutherland et al, 1988) в кластере 5q31-33 с другими генами интерлейкинов (Boulay et al, 1992). Обнаружено сцепление локуса 5q31.1 с атопической БА (Marsh et al, 1994), уровнем циркулирующих эозинофилов (Martinez et al, 1998) и аутосомно-доминантной семейной эозинофилией (Rioux et al, 1998). Исследованный в данной работе полиморфный участок С(-703)Т представляет собой однонуклеотидную замену С —• Г в положении -703 в промоторной области гена IL5.

Рис. 2. Пример спектра MALDI-TOF, по которому проводилась идентификация аллелей и генотипов маркера С(-703)Т (на спектре гетерозиготный Первый пик интактному

[ТраИнер 2 Ш Да

2779 Да Ллаел* С

2795Дч

iààJttM^&M

гена /£5 представлен генотип СТ). соответствует праймеру с массой 2482 Да, второй пик и третий пик -праймерам, удлиненным с 3'-

конца на ddA и ddG, соответственно.

Таблица 5.

Распределение аллелей н генотипов полиморфного маркера С(-703)Т гена ILS в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

В распределении генотипов в группе больных БА наблюдалось возрастание доли генотипа СС (0,528 против 0,485 в контрольной группе) и уменьшение содержания генотипа СТ (0,406 против 0,418 в контрольной группе) (Табл. 5). Генотип 7Т встречался очень редко как в группе больных, так и в группе здоровых индивидов. Частота аллеля Т в обеих группах составляет 27-30%, что согласуется с частотой данного аллеля в немецкой популяции -29% (Kabesch et al, 2007). В распределении аллелей в группе больных БА наблюдалось возрастание доли аглеля С (0,731 против 0,694 в контрольной группе), при уменьшении содержания аллеля Г (0,269 против 0,306 в контрольной группе). В обеих группах наиболее часто встречался аллель С (0,731 и 0,694 в группах «БА+» и «БА-», соответственно). Различия в частотах генотипов и аллелей между группами являются

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» «БА-»

Аллель С 0,731 0,694 >0,05

Аллель Т 0,269 0,306

Генотип СС 0,528 0,485 >0,05

Генотип СТ 0,406 0,418 >0,05

Генотип 77' 0,066 0,097 >0,05

статистически недостоверными. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфного маркера С(-703)Т гена IL5 с развитием атопической БА.

Также не было выявлено никакой ассоциации данного маркера с тяжестью течения БА.

Известно очень небольшое количество работ, связанных с поиском ассоциации полиморфного маркера С(-703)Т гена IL5 с БА. С помощью анализа сцепления на русских семьях из г. Томск была выявлена ассоциация аллеля С с БА, повышенной бронхореактивностью и атопией по данным кожных аллергопроб (Фрейднн и др., 2000 и 2002). В данной работе исследовалось наследование аллелей у больных БА, но не было проведено сравнительного анализа со здоровым контролем. Также известны две публикации, сфокусированные на роли маркера С(-703)Т гена IL5 в развитии и течении БА у детей. В одной работе показана ассоциация маркера С(-703)Т со снижением спирометрических показателей тяжести БА у корейских детей, однако ассоциации с БА получено не было (Hong et al, 2005). В другой работе был установлен пониженный риск развития атопической БА у носителей аллеля Г, а также данный аллель проявляет защитный эффект по отношению к атопии (Kabesch et al, 2007). В нашей работе распределение аллелей тоже показало возрастание доли аллеля С и уменьшение доли минорного аллеля Т у больных БА по сравнению со здоровым контролем, однако статистически достоверных различий получено не было.

Функциональная роль полиморфного маркера С(-703)Т на данный момент не известна, однако предполагают, что данная замена в промоторе гена может приводить к изменению экспрессии IL5 и опосредованно влиять на специфические процессы, имеющие место при БА, например, на рекрутинг эозинофилов. При этом сама по себе замена может не оказывать влияние на предрасположенность к развитию БА, что и нашло отражение в полученных нами результатах.

2.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена 1L8RA с атопической БА.

Интерлейкин-8 (ИЛ-8) вовлечен в процесс стимуляции, развития и поддержания острого воспалительного процесса (Harada et al, 1994). Важная роль ИЛ-8 в патофизиологии бронхиальной астмы человека была подтверждена во многих исследованиях (Remiclc et al, 2005; Hemzmann et al, 2004; Nocker et al, 1996). Взаимодействуя со своим рецептором IL8RA (CXCR1), ИЛ-8 приводит к активации и направленной миграции в очаг воспаления лейкоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма (Kunkel et al, 1991; Sarmiento et al, 2009). Рецептор IL8RA играет критическую роль в транедукции сигнала ИЛ-8 в нейтрофилах (Рис. 3), поэтому интересной задачей является изучение вклада гена 1L8RA в развитие БА.

SU \ [( \( kl)

Il S Uli {( \< 1С)

Vu-1 iiu.iuini

T \

MIK) ) 11 ni *

Рис. 3. Взаимодействие ИЛ-8 со своими рецепторами на

нейтрофилах.

Ген И8ЯА локализован на хромосоме 2ц35. Установлено, что

данный хромосомный регион связан с повышенным уровнем общего ^Е у больных БА (Хи е! а1, 2000). В этом гене обнаружен ряд полиморфных участков, в том числе маркер М31Я гена И8Р<Л, представляющий собой однонуклеотидную замену О —> Т в положении +92 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на метионин в положении 31 полипептидной цепи внеклеточного Ы-домена рецептора. Другой полиморфный маркер гена И8ЯА - Я335С, представляет собой однонуклеотидную замену С —> Г в положении + 1003 в экзоне 2, приводящую к аминокислотной замене аргинина на цистеин в положении 335 полипептидной цепи внутриклеточного С-домена рецептора.

Таблица 6.

Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров M3IR и R335C гена IL8RA в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атонической БА.

Для полиморфного маркера M31R в обеих группах отмечено преобладание

содержания аллеля Met и генотипа Mel/Mel (Табл.6). Гомозиготный генотип

Arg/Arg не был обнаружен ни в контрольной группе, ни в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера в группах отмечено увеличение частоты

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р OR и 95% CI

«БА+» «БА-»

M3IR

Аллель Mel 0,968 0,992 0,043 0,23 [0,08-0,67]

Аллель Arg 0,032 0,008 4,39 [1,48-13]

Генотип Mel Mel 0,936 0,985 0,004 0,22 [0,07-0,66]

Генотип Mel Arg 0,064 0,015 0,004 4,51 [1,51-13,43]

R335C

Аллель Arg 0,970 0,978 >0,05 -

Аллель Cys 0,030 0,022

Генотип Arg Arg 0,940 0,955 >0,05 -

Генотип Arg Cys 0,060 0,045 >0,05 -

встречаемости минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg в группе больных. Полученные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации маркера M3IR с развитием атопической БА у русских жителей г. Москвы. При этом носительство аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg связано с увеличением риска развития патологии более чем в 4 раза (OR=4,39, 95% CI [1,48-13] и ОД=4,51, 95% CI [1,51-13,43], соответственно). Наличие аллеля Mel

и генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания (ОЯ=0,23, 95% С[ [0,08-0,67] и OR=0,22, 95% CI [0,07-0,66], соответственно).

В распределении частот аллелей и генотипов маркера R335C в обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Arg и генотипа Arg/Arg (Табл. 6). Гомозиготный генотип Cys/Cys не был обнаружен ни в группе больных, ни в контрольной группе. Минорный аллель Cys встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой 2-3%. Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов маркера R335C не выявил статистически достоверных различий между группами, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием БА.

В результате сравнения частот генотипов и аллелей полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA в группах больных БА различной степени тяжести обнаружено, что данные маркеры не ассоциированы с тяжестью течения БА.

Анализ встречаемости гаплотипов по маркерам U3IR и R33SC не показал достоверных различий в их частотах между группами с наличием и отсутствием БА. Также не было получено ассоциации гаплотипов с тяжестью течения атопической БА.

На данный момент известно всего две работы, в которых проводилось изучение ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена 1L8RA с развитием БА. В одной публикации немецкими учеными было показано, что носительство аллеля Arg маркера M31R и аллеля Cys маркера R335C является фактором риска развития БА (Stemmler et al, 2005). В другом же исследовании не было установлено ассоциации данных маркеров с БА (Puthothu et al, 2006).

Показанная в нашей работе ассоциация маркера M31R гена IL8RA с атопической БА согласуется с результатом немецкой группы исследователей (Stemmler et al, 2005). Данный полиморфный маркер приводит к замене метионина на аргинин во внеклеточном домене рецептора, поэтому такая замена может влиять на связывание белка с IL8RA и стабильность комплекса лиганд-рецептор. Поскольку при взаимодействии ИЛ-8 с нейтрофилами посредством IL8RA происходит активация нейтрофилов и их направленная миграция в очаг воспаления, а также дополнительная выработка нейтрофилами ИЛ-8, возможно, данная замена в IL8RA увеличивает сродство рецептора к ИЛ-8 и приводит к последующей сверхэкспрессии ИЛ-8 нейтрофилами. В результате развивается воспалительный процесс, а в дальнейшем -хроническое воспаление дыхательных путей.

Отсутствие ассоциации маркера R335C гена 1L8RA с развитием БА было также ранее показано немецкими учеными (Puthothu et al, 2006). Поэтому можно предположить, что замена аргинина на цистеин во внутриклеточном домене IL8RA не влияет на передачу сигнала внутри клетки.

2.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с атопической БА.

В последнее время большой интерес вызывает гипотеза, согласно которой, длительный контакт с микробным антигеном или перенесенные в раннем возрасте инфекции играют защитную роль в предрасположенности к ТМ-опосредованным атопическим заболеваниям. Данные факты можно объяснить дисбалансом в образовании клеток Thl и Th2 из наивных Т-хелперов с последующим смещением равновесия в сторону ТН2-опосредованного иммунного ответа и развитием аллергических заболеваний. Следовательно, мутации в генах, продукты которых вовлечены в распознавание микробных антигенов, могут вносить серьезный вклад в предрасположенность к развитию аллергических заболеваний и БА (Yamada et al, 2005).

То11-подобный рецептор 4 (TLR-4) представляет собой рецептор, который связан с внеклеточным распознаванием липополисахарида (ЛПС) бактерий (Рис. 4).

Рис. 4. Клеточный рецепторный комплекс для ЛПС бактерий, основным компонентом которого является То11-подобный рецептор 4.

Ген TLR4 расположен на хромосоме 9q32-33. Полиморфный маркер Asp299Gly гена TLR4 представляет собой однонуклеотидную замену А —> G в положении +896 в экзоне 3, приводящую к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты на глицин в положении 299 полипептидной цепи во внеклеточном домене рецептора ■■НШН (Liang et al, 2005). Посредством данного домена

происходит прямое взаимодействие рецептора с лигандами микроорганизмов. Было обнаружено, что маркер Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован со снижением иммунного ответа на ЛПС бактерий, в результате уменьшения клеточной экспрессии TLR4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС (Arbour et al, 2000). В другом исследовании было показано, что данный полиморфный маркер является ответственным за подавление передачи сигнала рецептором и уменьшение воспалительной реакции на грамм-отрицательные бактерии (Kiechl S et al, 2002).

В нашей работе было отмечено преобладание в обеих группах содержания аллеля Asp и генотипа Asp/Asp полиморфного маркера Asp299Gly (Табл. 8). Частоты минорного аллеля Gly и гомозиготного генотипа Gly/Gly в контрольной группе практически не отличались от таковых в группе больных. При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного маркера между группами не было выявлено статистически достоверных различий, что свидетельствует об отсутствии прямой ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Таблица 8.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах с наличием (БА+) к отсутствием (БА-) атопической БА.

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» «БА-»

Аллель Asp 0,919 0,940 >0,05

Аллель Gly 0,081 0,060

Генотип Asp Asp 0,865 0,881 >0,05

Генотип Asp Gly 0,109 0,119 >0,05

Генотип Gly Gly 0,026 0 >0,05

После сравнения частот аллелей и генотипов маркера Asp299Gly гена TLR4 в группах, разделенных по степени тяжести БА, была обнаружена выраженная ассоциация данного маркера с тяжестью течения БА у русских индивидов г. Москвы. Снижение частоты встречаемости аллеля Asp и генотипа Asp/Asp было отмечено в группе больных со средней и тяжелой степенью астмы, а аллеля Gly и генотипов Asp/Gty и Gly/Gly - в группе больных с легким течением БА. Различия в частотах аллелей являлись статистически достоверными, носительство минорного аллеля Gly связано с более тяжелым течением атопической БА (ОД=2,12, 95% CI [ 1,08—4,18]), а аллеля Asp - с легким течением астмы (CIR=0,47, 95% CI [0,24-0,93]) (Табл. 9).

Таблица 9.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера А$р299ау гена Tl.fi4 у больных с атопической БА разной степени тяжести.

Частота аллелей и генотипов

Аллели и генотипы БА легкой степени тяжести БА средней и тяжелой степени Р OR и 95% CI

тяжести

Аллель Asp 0,948 0,895 0,035 0,47 [0,24-0,93]

Аллель Gly 0,052 0,105 2,12 [1,08-4,18]

Генотип Asp Asp 0,903 0,833 >0,05 -

Генотип Asp Gly 0,089 0,123 >0,05 -

Генотип Gly Gly 0,008 0,044 >0,05 -

Несмотря на то, что в некоторых работах была установлена ассоциация маркера А5р299ау с БА (Ра§егая е1 а1, 2004), в большом количестве исследований было показано отсутствие ассоциации (И.аЬу сг а1, 2002; Ыо§исЫ а! А1, 2004; Ес1ег й а1, 2005). Таким образом, наши результаты согласуются с данными большинства других исследователей. Только в одной работе исследовалась ассоциация маркера с тяжестью

БА, однако ассоциации обнаружено не было, но была показана ассоциация генотипов Asp/GIy и Gly/Gly с тяжестью атопии (Yang et al, 2004).

Выявленная ассоциация полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с тяжестью течения БА подтверждает теорию о том, что при нарушении взаимодействия человека с микробным антигеном усиливается развитие аллергии и БА. Известно, что данный маркер ассоциирован с уменьшением клеточной экспрессии TLR-4 с последующим прекращением взаимодействия TLR-4 с ЛПС. Вероятно, ухудшение взаимодействия TLR-4 с ЛПС в большей степени влияет на прогрессию атопической БА, а не на возникновение данного заболевания.

2.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА.

Ген CTLA4 расположен на хромосоме 2q33 и кодирует антиген 4, ассоциированный с цитотоксическими Т-лимфоцитами. Это Т-клеточный рецептор, трансмембранный гликопротеин, экспрессирующийся в течение 2-3 дней после активации Т-лимфоцитов. Через CTLA-4 подается сигнал к подавлению активации Th2 клеток, что приводит к смещению баланса в сторону развития ответа по ТЫ-зависимому типу (Oosterwegel et al, 1999).

Рис. 5. Полиморфные маркеры гена CTLA4.

В данной работе мы исследовали ассоциацию с БА двух полиморфных маркеров гена CTLA4. Полиморфный маркер С(-318)Т представляет собой однонуклеотидную замену С —> 7" в положении -318 промоторной области гена, другой маркер A(+49)G -однонуклеотидную замену А —> G в положении +49 в экзоне 1, приводящую к аминокислотной замене треонина на аланин в положении 17 полипептидной цепи (Рис. 5). В нескольких исследованиях было установлено, что аллель Т маркера С(-318)Т ассоциирован с повышенной промоторной активностью гена (Wang et al 2002). Показано, что носительство аплеля Т приводит к повышению экспрессии CTLA-4 на поверхности активированных клеток и повышению уровня мРНК CTLA-4 в нестимулированных клетках, что подтверждает потенциальную роль данной замены в регуляции экспрессии гена (Ligers et al, 2001). В других исследованиях было установлено, что CTLA-4 ингибирует образование П12-клеток из наивных хелперов

(ThO), поэтому аллель Т можно рассматривать как защитный фактор против заболеваний с аллергической компонентой. У носителей аллеля Tlir полиморфного маркера A(+49)G была обнаружена повышенная экспрессия CTLA-4 на поверхности активированной Т-клетки (Ligers et al, 2001). Также известно, что генотип Ala/Ala ассоциирован с уменьшением экспрессии CTLA-4 на поверхности Т-клеток с последующим ослаблением функции CTLA-4 (Kouki et al, 2000).

При изучении распределения аллелей и генотипов отмечено преобладание содержания аллеля С и генотипа СС полиморфного маркера С(-318)Т в обеих группах (Табл. 10). Наблюдаюсь увеличение частоты встречаемости аллеля Си гомозиготного генотипа СС в группе больных БА по сравнению с контрольной группой и одновременное снижение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и ТТ в этой же группе. При этом статистически достоверных различий в частотах выявлено не было, что говорит об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Таблица 10.

Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля Thr и генотипа AlaíThr маркера A(+49)G (Табл. 10). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Ala и гетерозиготного генотипа Ala/Thr в группе больных с одновременным снижением частоты встречаемости аллеля Thr и гомозиготных генотипов Thr/Thr и Ala/Ala в этой же группе. Данные различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации полиморфного маркера A(+49)G гена CTLA4 с развитием атопической БА.

Также не было выявлено ассоциации маркеров гена CTLA4 с тяжестью течения

БА.

Для оценки комбинированного вклада рассматриваемых маркеров гена CTLA4 в патогенез астмы нами был проведен анализ частот гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Наиболее частым гаплотипом в обеих группах был гаплотип дикого типа - C-Thr (Табл. 12). Можно отметить повышение частоты гаплотипов С-Ala и T-Thr у больных БА по сравнению со здоровым контролем, а также уменьшение частоты встречаемости гаплотипов C-Thr и Т-Ala в

Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» ' «БА-»

С(-31Я)Т

Аллель С 0,890 0,853 >0,05

Аллель Т 0,110 0,147

Генотип СС 0,788 0,716 >0,05

Генотип CT 0,205 0,275 >0,05

Генотип TT 0,007 0,009 >0,05

A(+49)G

Аллель Thr 0,644 0,649 >0,05

Аллель Ala 0,356 0,351

Генотип Thr Thr 0,385 0,410 >0,05

Генотип Ala Thr 0,517 0,478 >0,05

Генотип Ala Ala 0,098 0,112 >0,05

группе больных БА. Только для гаплотипа Т-Ala была обнаружена ассоциация с БА. Данный гаплотип связан с пониженным риском развития БА (0/?=О,О81, 95% CI [0,010,647]).

Таблица 12.

Распределение частот встречаемости гаплотипов гена CTLA4 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

Ассоциации гаплотипов гена CTLA4 с тяжестью течения БА обнаружено не было. Полученные результаты согласуются с данными других исследователей. В трех работах, в которых изучались польская, японская и корейская популяции, также не было найдено ассоциации данных маркеров (по отдельности) с атопической БА (Nakao et al, 2000; Yasek et al, 2006; Lee et al, 2002). Однако корейскими учеными установлена ассоциация аллеля Т маркера С(-318)Т с тяжестью течения БА (Lee et al, 2002). В этой же работе была найдена ассоциация гаплотипа С-А1а по маркерам С(~318)Т и A(+49)G с атопической БА (OR-0J02) (Sohn МН et al, 2007). Нами же получена ассоциация гаплотипа Т-А1а с развитием БА (0/?=0,081). Это можно объяснить тем, что частоты встречаемости аллелей и генотипов маркера A(+49)G широко варьируют в различных популяциях. Так, для корейцев было получено следующее распределение частот генотипов -Ala/Ala - 55-57%, AlafThr - 27-34%, Thr/Thr - 9-17% (Lee et al, 2002), которое сильно отличается от распределения частот генотипов у людей русского происхождения. Такая разница в частотах может влиять на различный вклад полиморфного маркера в генетическую предрасположенность к БА в зависимости от популяции.

2.6. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs324396 (ОТ) и rs740347 (G/C) гена GPRA с атопической БА.

GPRA (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility) - ген рецептора G-белка, открытый позиционным клонированием. Данный ген ассоциирован с развитием БА и повышенным уровнем общего IgE (Laitinen et al, 2004). Рецептор GPRA относят к классу А семейства трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCRs) (Vendelin et al, 2005).

В результате альтернативного сплайсинга образуется несколько изоформ GPRA. На данный момент обнаружено 7 альтернативных вариантов, из них две изоформы длинные, изоформа GPRA-A и GPRA-B, остальные - короткие (Laitinen et al, 2004; Vendelin et al, 2005). Изоформа GPRA-A, также известная как GPRAI54 и VRR1, в основном экспрессируется в гладкомышечных клетках дыхательных путей, как у

Частота

Гаплотипы гаплотипов Р OR и 95% CI

«БА+» «БА-»

С Thr 0,536 0,548 >0,05 -

C-Ata 0,349 0,308 >0,05 -

TThr 0,111 0,101 >0,05 -

T-Ala 0,004 0,043 0,01 0,08 [0,01-0,65]

больных БА, так и у здоровых индивидов. Изоформа СРЯА-В экспрессируется в большом количестве в эпителиальных и гладкомышечных клетках дыхательных путей больных БА, в отличие от здоровых людей. Таким образом, предполагают, что изоформа ОРЯА-В играет роль в функционировании эпителия дыхательных путей, (Оауюэ е1 а1, 2002), а также может вносить вклад в развитие бронхиальной гиперреактивности (РозЧпа е! а1, 2005).

Ген йРИЛ локализован на хромосоме 7р 14. Ряд однонуклеотидных маркеров в гене СРМ показал выраженную ассоциацию с БА, бронхореактивностью и повышенным уровнем ^Е в разных европейских популяциях (ЬаШпеп е1 а1, 2004; Когтапп е1 а1, 2005; Ме1еп е1 а1, 2005). При исследовании ассоциации 133 кб геномного сегмента, захватывающего ДНК с интрона 2 до интрона 5 гена йРЯА, обнаружили, что интрон 2 наиболее сильно ассоциирован с БА. Нами были изучены два полиморфных маркера в интроне 2. Первый маркер гэ324396 гена йРЯА представляет собой однонуклеотидную замену С —> Г, второй маркер гв740347 - однонуклеотидную замену

Таблица 13.

Распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров п324396 и п740347 гена СРЯА в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля С маркера г$324396. В группе больных БА чаще встречался гетерозиготный генотип СТ, а в группе здорового контроля -гомозиготный генотип СС (Табл. 13). При исследовании распределения частот аллелей и генотипов данного полиморфного маркера между группами отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля Т и генотипов СТ и 7Т в группе больных с одновременным снижением доли аллеля С и генотипа СС в этой же группе по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия носят статистически достоверный характер и свидетельствуют об ассоциации гена СРИ4 с развитием атопической БА у русского населения г. Москвы. При этом носительство аллеля Т и гетерозиготного генотипа СТ связано с увеличением риска развития БА (ОЯ=1,37, 95% С1 [1,05-1,78] и ОЛ=1,61, 95% С1 [1,14-2,29], соответственно;. Аллель С и генотип СС, напротив, являются протективными (ОД=0,73 95% С1 [0,56-0,95] и ОЯ=0,59 95% С1 [0,42-0,84], соответственно).

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р ОН и 95% С1

«БА+» «БА-»

п3243У6

Аллель С 0,639 0,708 0,02 0,73 [0,56-0,95]

Аллель Т 0,361 0,292 1,37 [1,05-1,78]

Генотип СС 0,376 0,504 0,004 0,59 [0,42-0,84]

Генотип СТ 0,526 0,407 0,008 1,61 [1,14-2,29]

Генотип 77" 0,098 0,089 >0,05 -

«740347

Аллель С 0,876 0,906 >0,05 -

Аллель С 0,124 0,094

Генотип СО 0,766 0,826 >0,05 -

Генотип СС 0,220 0,161 >0,05 -

Генотип СС 0,014 0,013 >0,05 -

В обеих группах отмечено преобладание содержания аллеля й к генотипа СС полиморфного маркера п740347. Гомозиготный генотип СС встречался в обеих группах примерно с одинаковой частотой (1,3-1,4%) (Табл. 13). При исследовании распределения аллелей и генотипов данного полиморфного маркера в группах отмечено увеличение частоты встречаемости аллеля С и генотипа СО с одновременным уменьшением частоты гомозиготного генотипа ОС в группе больных по сравнению с группой здорового контроля. Данные , различия не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Таблица 15.

Распределение частот встречаемости гаплотипов гена СРЛА в группах с наличием

(БА+) н отсутствием (БА-) атопической БА.

Для того чтобы оценить комбинированный вклад

маркеров г$324396 и п740347 гена СРЛЛ в патогенез БА нами был проведен анализ частот гаплотипов в группе больных атопической БА и группе здорового контроля. Наиболее часто встречающимся гаплотипом в обеих группах был гаплотип С-С (Табл. 15). Можно отметить повышение частоты гаплотипов Г-0 и Т-С у больных БА по сравнению со здоровым контролем, а также уменьшение частоты встречаемости гаплотипов С-С и С-С в группе больных БА. Только для гаплотипа Т-С была обнаружена ассоциация с БА. Данный гаплотип связан с повышенным риском развития атопической БА (СЖ=9,47, 95% С1 [1,21-73,94]) у русского населения г. Москвы.

Не было найдено ассоциации как для полиморфных маркеров г$324396 и гв740347 гена йРЯА, так и для их гаплотипов, с тяжестью атопической БА.

В нескольких работах обнаружена ассоциация полиморфного маркера гз32439б гена ОРЙЛ с БА. Было показано, что минорный аллель Т ассоциирован с сенсибилизацией (0й=0,88), с БА (ОЛ=0,83), а также с аллергической астмой (ОД=0,78) у 5-13 летних детей (Ме1еп е1 а1, 2005). В другой работе также было установлено, что минорный аллель Г проявляет защитный эффект по отношению к БА (0^=0,77) у немецких детей в возрасте 9-11 лет (Коппапп е! а1, 2005). В то же время в результате изучения ядерных мексиканских семей, состоящих из 4-17 летних детей, больных БА, и их родителей, не было обнаружено ассоциации маркера г$324396 с развитием БА. В нашем исследовании также показана ассоциация маркера гз324396 с БА, однако минорный аллель Г ассоциирован с повышенным риском развития БА (ОЯ= 1,37).

Несмотря на выявленную в некоторых работах ассоциацию маркера г$740347 с БА (Уе^ага е! а1, 2009; Коппапп м а1, 2005), другими авторами были получены и

Частота

Гаплотипы гаплотипов р ОН и 95% С1

«БА+» «БА-»

С-С 0,550 0,617 >0,05 -

С-С 0,081 0,087 -

Т-О 0,328 0,291 >0,05 -

Т-С 0,041 0,005 0,008 9,47 [1,21-73,94]

отрицательные результаты. Так, при изучении европейских детей не обнаружено ассоциации rs740347 ни с сенсибилизацией, ни с БА (Melen et al, 2005). Также в результате анализа мексиканских семей не было установлено ассоциации маркера с развитием БА и атопией у детей (Wu et al, 2008). Данные об отсутствии ассоциации маркера rs740347 с БА согласуются с результатом нашего исследования.

Подобные противоречивые результаты исследований могут быть получены вследствие применения различных подходов к формированию выборок больных и здоровых индивидов. Все исследования полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 были проведены на выборках, составленных из детей, в отличие от нашей выборки, состоящей из взрослых индивидов. Также выборки могут отличаться по полу, этническим признакам, факторам риска БА, что могло повлиять на полученный результат.

Ассоциация полиморфных маркеров rs324396 и rs740347 гена GPRA с тяжестью БА ранее не исследовалась. Также ни в одной работе не изучалась ассоциация гаплотипов рассматриваемых маркеров с развитием БА.

На данный момент не известны функциональные полиморфные маркеры гена GPRA, а роль данного гена в патогенезе БА не ясна. Возможно, что маркеры rs324396 и rs740347 гена GPRA, находящиеся в интроне, влияют на процесс сплайсинга. Можно также предположить, что изученные нами маркеры находятся в неравновесии, по сцеплению с другими неизвестными на данный момент функциональными маркерами, что служит причиной отсутствия информации о роли маркеров в патогенезе БА.

2.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера T(+2497)G гена CCL26 с атопической БА.

Эотаксин-3 относится к семейству СС хемокинов. Данный хемокин связан с хемотаксисом эозинофилов, базофилов, ТЬ2-лимфоцитов и тучных клеток (Garcia et al, 2005; Pease, 2006). Продуцируемые клетками Th2, ИЛ-4 и ИЛ-13 увеличивают экспрессию эотаксина-3 (Yamamoto et al, 2004; Shinkai A et al, 1999), который в свою очередь, взаимодействуя со своим рецептором CCR3, приводит к направленной миграции эозинофилов в очаг воспаления (Zimmermann et al, 2000). Большое количество макрофагов, лимфоцитов, эозинофилов, которые накапливаются в месте воспаления, могут стать значительными источниками эотаксина-3 и CCR3 рецепторов. Далее активированные эозинофилы вносят вклад в поддержание воспаления, продуцируя медиаторы - ИЛ-4 и ИЛ-13, а также эотаксины (Rothenberg, 1998).

Ген CCL26 локализован на хромосоме 7ql 1.2 (Guo et al, 1999; Kitaura et al, 1999). Полиморфный маркер T(+2497)G гена CCL26 представляет собой однонуклеотидную замену Г—• G в положении +2497 З'-нетранслируемой области гена (Chae et al, 2004). На данный момент функциональная роль полиморфного маркера не ясна, однако

полагают, что рассматриваемая замена может влиять на стабильность мРНК и эффективность трансляции мРНК (Macdonald, 2001).

Таблица 16.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного маркера T(+2497)G гена CCL26 в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

При сравнительном анализе распределения аллелей и генотипов маркера T(+2497)G гена CCL26 наблюдали увеличение содержания ачлеля Т и генотипов GT и 7Т в обеих группах. Минорный аллель С и гетерозиготный генотип GT встречались в группе больных БА чаще, чем в группе здорового контроля. При этом носители ачлеля Т и гомозиготных генотипов GG и ТТ встречались чаще в контрольной группе, чем в группе больных БА. Однако статистически достоверных различий в частотах аллелей и генотипов между двумя группами выявлено не было, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Также не было выявлено ассоциации маркера T(+2497)G гена CCL26 с тяжестью атопической БА.

На данный момент известно всего две научных публикации, в которых были представлены результаты анализа ассоциации маркера T(+2497)G с развитием БА. В одной работе установлена ассоциация данного маркера с БА, количеством эозинофилов в периферической крови и уровнем общего IgE у китайцев (Gao et al, 2006), в другой работе обнаружена статистически достоверная связь маркера с БА у корейцев (Chae et al, 2004). Показано, что аллель G является фактором риска развития БА (OR=2,12), а генотип GT ассоциирован с пониженным риском развития БА (0й=0,44). Наличие генотипа ТТ ассоциировано с пониженным уровнем общего IgE и низким количеством эозинофилов в периферической крови, из чего было сделано предположение о ключевой роли эотаксина-3 в накоплении эозинофилов и поддержании уровня IgE (Chae et al, 2004). Если сравнить частоты генотипов и аллелей между корейцами и русскими, то можно увидеть сильную разницу в значениях частот. Так, у корейцев генотип GG не встречался в обеих группах, в русской же выборке содержание данного генотипа 8,5-10,4%. Как в группе больных, так и в группе здоровых у русских индивидов содержание генотипов GT и ТТ примерно одинаковое 41-49%, в корейской же популяции число лиц с генотипом ТТ составляет 80-90%, а с генотипом GT-9-20%. В настоящее время не известны подобные работы по определению ассоциации маркера T(+2497)G гена CCL26 с БА у европейцев, что не дает возможности сопоставить частоты. Как мы видим, частоты встречаемости аллелей и генотипов данного полиморфного маркера широко варьируют в различных популяциях, что, возможно,

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» «БА-»

Аллель Т 0,676 0,691 >0,05

Аллель С 0,324 0,309

Генотип ТТ 0,438 0,485 >0,05

Генотип СГ 0,477 0,411 >0,05

Генотип СС 0,085 0,104 >0,05

говорит о различном вкладе гена CCL26 в генетическую предрасположенность к БА в зависимости от исследуемой популяции.

Есть данные, указывающие на то, что эотаксин-3 является первым хемокином у человека, который обладает широкой антагонистической активностью, вследствие чего можно предположить, что эотаксин-3 имеет больше модулирующую функцию, чем воспалительную (Petkovic et al, 2004; Abonyo et al, 2005).

2.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера A(-403)G гена CCLS (RANTES) с атопнческ-он БА.

CCL5 (RANTES) - регулятор активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток. RANTES является модулятором многих аллергических и воспалительных реакций, а также медиатором ангиогенеза. RANTES участвует в миграции и накоплении клеток воспазения, таких как лимфоциты, эозинофильные гранулоциты и моноциты, в воспалительных и патологически поврежденных участках тканей и органов (Campbell et al, 1998; Bradley et al, 1999; Beyan et al, 2007; Mehrad et al, 2007). Описано значительное увеличение уровня RANTES в плазме крови человека при БА, субклиническом хроническом воспалении, опухолях, а также при СПИДе (Ardigo et al, 2005; Nomura et al, 2007). Эпителиальные клетки дыхательных путей являются главным источником RANTES (Stellato et al, 1995).

Ген CCLS расположен на хромосоме 17ql 1.2-12 (Donlon et al, 1990). Полиморфный маркер A(—)03)G гена CCL5 представляет собой однонуклеотидную замену G —• Л в положении -403 промоторной части гена.

Таблица 18.

Распределение аллелей п генотипов полиморфного маркера A(-403)G гена CCLS в группах с наличием (БА+) и отсутствием (БА-) атопической БА.

В обеих исследованных группах отмечено преобладание содержания аллеля G (Табл. 18). Генотип GG встречался наиболее часто как в группе больных, так и в контрольной группе (0,554 и 0,570, соответственно). При этом можно заметить снижение частоты встречаемости аллеля А и генотипов АА и GG с одновременным возрастанием в группе больных доли аллеля G и генотипа AG по сравнению с группой здорового контроля. Данные различия в частотах аллелей и генотипов между двумя группами не являются статистически достоверными, что свидетельствует об отсутствии ассоциации данного маркера с развитием атопической БА.

Аллели и генотипы Частота аллелей и генотипов Р

«БА+» «БА-»

Аллель С 0,759 0,748 >0,05

Аллель А 0,241 0,252

Генотип СС 0,554 0,570 >0,05

Генотип АО 0,410 0,355 >0,05

Генотип А А 0,036 0,075 >0,05

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного маркера А (-403)G в группах различной степени тяжести БА показал отсутствие ассоциации маркера с тяжестью течения БА.

В нескольких аналогичных работах, исследующих маркер A(-403)G гена CCL5, не было обнаружено ассоциации данного маркера с БА и атопией (Yao et al, 2003; Moissidis et al, 2005; Muro et al, 2007). Так, в исследовании Yao et al было установлено отсутствие ассоциации маркера A(-403)G с БА, атопией, количеством эозинофилов в крови и бронхиальной гиперреактивностью у азиатских детей. В Великобритании были проведены два исследования, где была показана ассоциация данного маркера с атопической БА и атопией (Fryer et al, 2000; Al-Abdulhadí et al, 2005). Вполне возможно, такую разницу в результатах можно объяснить различиями в выборках, воздействиях окружающей среды и аллергенов, которые могут быть вовлечены в патогенные механизмы.

В двух исследованиях изучалась ассоциация маркера с тяжестью БА, однако такой ассоциации найдено не было (Yao et al, 2003; Muro et al, 2007).

Функциональный анализ показал, что замена —403 G—vf увеличивает транскрипционную активность промотора, в результате чего повышается продукция RANTES Т-клетками, мегакариоцитами и тучными клетками (Nickel et al, 2000). Однако в этом же исследовании было установлено, что полиморфный маркер A(-403)G не влияет на экспрессию RANTES эпителиальными клетками, которые являются главным источником RANTES в дыхательных путях. Так как не все клетки продуцируют повышенное количество RANTES, возможно такое изменение количества белка не приводит к обострению воспалительных процессов, приводящих к развитию БА.

Обобщая полученные результаты, можно сделать следующие предположения о роли исследованных генов-кандидатов в развитии атопической БА у русских пациентов:

• В большинстве случаев БА является атопическим заболеванием, что обуславливает ее развитие через IgE-зависимый механизм. Активированные аллергеном Т-хэлперы 2-го типа продуцируют цитокины, которые стимулируют пролиферацию В-лимфоцитов, вызывают переключение синтеза в В-клетках на IgE и активируют развитие воспаления в бронхах. Поэтому ассоциацию с заболеванием можно, прежде всего, ожидать от генов, связанных с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы. Установленная в нашей работе ассоциация маркера С(-1055)Т в промоторной области гена 1113 с тяжестью течения БА подтверждает предположение о важности ИЛ-13 в прогрессии аллергического воспаления, повышенной бронхореактивности и развитии фиброза бронхов.

• В патогенезе БА важную роль играют также продукты генов врожденного иммунитета и генов иммунорегуляцин. Показанная в данной работе ассоциация полиморфного маркера M3IR гена IL8RA с развитием БА подтверждает тот факт, что изменение количества мигрирующих в очаг воспаления иммунокомпетентных клеток, например, нейтрофилов и лейкоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма, может приводить к развитию воспалительного процесса, а в дальнейшем - к хроническому воспалению дыхательных путей. Дисбаланс в образовании клеток Thl и Th2 из наивных Т-хелперов может привести к смещению равновесия в сторону ТЬ2-опосредованного иммунного ответа и развитию аллергических заболеваний. Данную теорию подтверждают полученные нами данные об ассоциации маркера Asp299Cly гена TLR4 с тяжестью атопической БА и гаплотипа Т~А1а по маркерам С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4 с атопической БА.

• В настоящей работе показана ассоциация двух маркеров в интроне гена GPRA, открытого позиционным клонированием и ассоциированного с БА, а также их гаплотипа Т-С с развитием БА. На данный момент роль данного гена в патогенезе БА не ясна, однако можно предположить, что маркеры находятся в неравновесии по сцеплению с другими неизвестными функциональными маркерами.

• Эозинофилы играют важную роль в развитии аллергического воспаления при БА. Интерлейкин-5 и эотаксин-3 являются ответственными за активацию и направленную миграцию эозинофилов в очаг воспаления. Установленное в нашем исследовании отсутствие ассоциации маркеров С(-703)Т гена IL5 и А(-403)G гена CCL26 с атопической БА и ее тяжестью позволяет сделать предположение о том, что гены, ответственные за активацию и хемотаксис эозинофилов, не играют значительной роли в предрасположенности к развитию БА, и, возможно, опосредованно могут влиять на специфические процессы, имеющие место при БА.

• Нами показано, что маркеры в генах CCL26 и CCL5 не ассоциированы с развитием и тяжестью БА. Вероятно, мутации в генах, экспрессирующихся в клетках эпителия бронхов, не оказывают заметного влияния на патологические процессы, происходящие при БА.

выводы

1. Изучено распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(-703)Т гена IL5, С(-1055)Т и RI30Q гена IL13, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/Q гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26 и A(-403)G гена CCL5 в группе больных атопической БА и в группе здоровых индивидов русского происхождения.

2. Для полиморфных маркеров генов ILS, CTLA4, CCL26 и CCL5 показано отсутствие ассоциации с развитием атопической БА и тяжестью ее течения.

3. Установлено, что носители минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg полиморфного маркера M3IR гена 1L8RA имеют повышенный риск развития атопической БА. Наличие аллеля Met и гомозиготного генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания. Обнаружено, что наличие минорного аллеля Т и гетерозиготного генотипа CT полиморфного маркера rs324396 (С/Т) гена GPRA в геноме связано с повышенным риском развития БА, а носительство аллеля С и генотипа СС ассоциировано с пониженным риском.

4. Показана ассоциация гаплотипа Т-С гена GPRA по маркерам rs324396 (С/Т) и rs740347 (С/С) с повышенным риском развитием БА. Обнаружено, что гаплотип Т-Ala маркеров С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4 ассоциирован с пониженным риском развития БА.

5. Для полиморфного маркера С(-Ю55)Т гена IL13 показана ассоциация с тяжестью атопической БА. Носительство генотипа CT связано с более тяжелым течением БА, а генотипа СС - с легким течением заболевания. Установлено, что минорный аллель Gly полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован с тяжелым течением БА, а аллель Asp - с легким течением заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. С.А. Мазурина, Е.В. Зайцева (Дмитриева-Здорова), O.E. Воронько, Н.В. Бодоев, В.А. Казначеев, Ю.В. Гервазиев. Влияние полиморфизма гена ИЛ13 на основные маркеры атопии у больных бронхиальной астмой. // Российский аллергологический журнал. 2007. 2. стр. 27-31.

2. Дмитриева-Здорова Е.В., Воронько O.E., Аксенова М.Г., Бодоев Н.В. Ассоциация полиморфных маркеров генов интерлейкина-13 с атопической бронхиальной астмой. // Генетика. 2010. 1. том 46. №1. стр. 111-117.

3. О. Voronko, Е. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Y. Gervaziev, N. Bodoev. Polymorphisms in 1L5, IL8RA and IL 13 genes contribute to asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of WAM' 2007, June 22-25, Istanbul, Turkey.

4. 0. Voronko, Е. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Y. Gervaziev, N. Bodoev. Study of association of polymorphisms in IL5, IL8RA and ILI3 genes with asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 1519,2007, Stockholm, Sweden, P. 625s.

5. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Yu. Gervaziev, N. Bodoev .Polymorphisms in cytokine genes are associated with asthma and asthma severity in Russian patients. // Abstracts of 6th Annual Cytokines & Inflammation Conference, January 28-29,2008, Orlando, USA.

6. Дмитриева-Здорова E.B., Воронько O.E., Мазурина СЛ., Гервазиев Ю.В., Бодоев

H.В. Полиморфизм в гене GPRA ассоциирован с атопической бронхиальной астмой и тяжестью ее протекания у русских пациентов г. Москвы. // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 11-15 мая 2008 г., Новосибирск.

7. Olga Е. Voronko, Elena V. Dmitrieva-Zdorova, Nikolai V. Bodoev, Alexander I. Archakov. Analysis of genetic susceptibility for bronchial asthma in Russians. // Abstracts of 4th international conference «Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanobiotechnologies for Medicine», June 1-7, 2008, Moscow-Nizhny Novgorod-Moscow, Russia.

8. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova) E., Voronko O., Latysheva E., Bodoev N., Storozhakov G.

I., Archakov A. I Polymorphisms in CC16 and CCL26 genes and atopic bronchial asthma in Russian patients. // Abstracts of Annual ERS Congress, October 4-9, 2008, Berlin, Germany.

9. O. Voronko, E. Zaytseva (Dmitrieva-Zdorova), S. Mazurina, Yu. Gervaziev, N. Bodoev. G-protein coupled receptor gene polymorphism is associated with asthma and asthma severity in Russian patients.// Abstracts of Annual ERS Congress, October 4-9, 2008, Berlin, Germany.

10. O.E. Воронько, E.B. Дмитриева-Здорова, E.B. Латышева, C.A. Мазурина, Ю.В. Гервазиев, Н.В. Бодоев, Г.И. Сторожаков, А.И. Арчаков Анализ генетической предрасположенности к атопической бронхиальной астме у русских пациентов. // II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии, 25-28 апреля 2009, Санкт-Петербург, Россия.

11. Olga Е. Voronko, Elena V. Dmitrieva-Zdorova, Elena A. Latysheva, Marina G. Aksenova, Nikolai V. Bodoev, Gennady I. Storozhakov, Alexander I. Archakov Analysis of polymorphism of immune response genes in Russian patients with atopic asthma. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 12-16,2009, Vienna, Austria.

12. Elena Dmitrieva-Zdorova, Olga Voronko, Svetlana Mazurina, Marina Gabaeva, Yuri Gervaziev, Nikolai Bodoev PDCD1 PD-1.3 polymorphism is associated with total IgE and IL-4 levels in Russian patients with atopic asthma. // Abstracts of Annual ERS Congress, September 12-16,2009, Vienna, Austria.

Подписано в печать 11.02.2010 г.

Заказ № 3563 Тираж: 100 экз.

Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш.. 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дмитриева-Здорова, Елена Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Однонуклеотидные полиморфные маркеры (8№). Использование полиморфных маркеров в исследовании генетики многофакторных заболеваний.

1.2. Масс-спектрометрия МА1Л)1-ТОР.

1.2.1. Основные принципы.

1.2.2. Применение масс-спектрометрии МА1Л)1-ТОР для анализа ЭИР.

1.3. Атопическая бронхиальная астма (БА).

1.3.1. Основы патогенеза атопической БА.

1.3.2. Генетические факторы развития БА.

1.4. Характеристика исследованных вфаботе генов и полиморфных маркеров.

1.4.1. Ген интерлейкина-13 (1Ь13).

1.4.2. Ген интерлейкина-5 (1Ь5).

1.4.3. Ген альфа-цепи рецептора интерлейкина-8 {1Ь8ЯА).

1.4.4. Ген 1:о11-подобного рецептора 4 (ТЬЯ4).

1.4.5. Ген поверхностного антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими

Т-лимфоцитами (СТЬА4).

1.4.6. Ген О-белка, ассоциированного с астмой (ОРЛА).

1.4.7. Ген эотаксина-3 (ССЬ2б).

1.4.8. Ген регулятора активности нормальной экспрессии и секреции

Т-клеток (ССХ5).

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Формирование групп больных и здоровых индивидов.

2.2. Генотипирование.

2.2.1. Амплификация ДНК.

2.2.2. Электрофоретическое разделение ДНК.

2.2.3. Добавление щелочной фосфотазы.

2.2.4. Реакция удлинения праймеров.

2.2.5. Очистка продуктов реакции удлинения праймеров.

2.2.6. МА1Ю1-ТОР МБ измерения.

2.3. Статистическая обработка результатов.

2.3.1.Сравнение выборок по частотам аллелей и генотипов. Точный критерий Фишера.

2.3.2. Оценка относительного риска. Показатель соотношения шансов

Odds ratio, OR). Доверительный интервал.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение ассоциации полиморфных маркеров ряда генов-кандидатов с атопической БА.

3.1.1. Исследование ассоциации полиморфных маркеров С(—1055)Т и R130Q гена IL13 с атопической БА.

3.1.2. Исследование ассоциации полиморфного маркера С(-703)Т гена/£5 с атопической Б А.

3.1.3. Исследование ассоциации полиморфных маркеров M31R и R335C гена IL8RA с атопической БА.

3.1.4. Исследование ассоциации полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 с атопической БА.

3.1.5. Исследование ассоциации полиморфных маркеров C(-318)TnA(+49)G гена CTLA4 с атопической Б А.

3.1.6. Исследование ассоциации полиморфных маркеров rs324396 и rs гена GPRA с атопической БА.

3.1.7. Исследование ассоциации полиморфного маркера T{+2497)G гена CCL26 с атопической БА.

3.1.8. Исследование ассоциации полиморфного маркера A(—403)G гена CCL5 с атопической Б А.

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной астме с использованием полиморфных маркеров генов-кандидатов"

Важное место среди многофакторных заболеваний (МФЗ) бронхолегочной системы человека занимает бронхиальная астма (БА). В некоторых странах БА является главной причиной инвалидности и смертности населения, опережая даже сердечно-сосудистые и онкологические патологии, что характеризует бронхиальную астму как глобальную медико-социальную проблему (Jarvis D, Burney Р, 1997).

Эпидемиологические исследования последних лет говорят о том, что от 4 до 8% населения страдают БА, в том числе 5-10% детской популяции и 5% взрослой. Распределение по степени тяжести больных БА, выглядит следующим образом: 70% — легкая степень, 25% — средняя и 5% - тяжелая (А.Г. Чучалин, A.A. Баранов, 2006). По данным международной программы GINA - «Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы» (пересмотр 2006), бронхиальной астмой в мире болеют около 300 миллионов человек. В России данным заболеванием страдает примерно 10% взрослого и 15% детского населения. В последние десятилетия прогрессивно увеличивается заболеваемость и смертность от БА. Среди хронических заболеваний у детей БА занимает одно из первых мест по распространенности.

Чаще всего БА носит атопический характер, т.е. развивается через Th2-опосредованный механизм. Активированные аллергеном клетки Th2 продуцируют цитокины (ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-9, ИЛ-13, ИЛ-16, ГМ-КСФ), которые вызывают переключение синтеза в B-клетках на IgE и активируют развитие воспаления в бронхах.

В основе развития БА лежит взаимодействие различных генетических факторов с факторами внешней среды. Проблема исследования генетических механизмов БА является достаточно сложной и до конца не изученной (Cookson WO, 2002; Vercelli D, 2003), и связана с разработкой адекватных методов анализа. Один из эффективных подходов к изучению роли генетических механизмов развития БА связан с выделением группы генов, продукты которых прямо или косвенно могут быть вовлечены в развитие данной патологии, так называемые гены-кандидаты. В настоящее время известно более 100 генов-кандидатов БА (Scirica, 2007; Фрейдин, 2002). Гены предрасположенности к Б А условно можно подразделить на 5 групп: 1) гены врожденного иммунитета и гены иммунорегуляции; 2) гены, связанные с дифференцировкой клеток Th2 и эффекторными функциями иммунной системы; 3) гены, экспрессирующиеся в клетках эпителия бронхов; 4) гены, ассоциированные с перестройкой (ремоделингом) дыхательных путей и тяжестью заболевания; 5) гены предрасположенности к БА, открытые позиционным клонированием (Vercelli D, 2008).

Исследование ассоциации полиморфных маркеров генов-кандидатов основано на выявлении и сравнении частот встречаемости генотипов и аллелей в группах с наличием и отсутствием заболевания. Если различия в частотах аллелей и генотипов являются статистически достоверными, значит, данный маркер ассоциирован с развитием заболевания. Установленные предрасполагающие или предохраняющие генетические маркеры в дальнейшем могут быть использованы для прогнозирования заболевания у человека на основе исследования индивидуальных особенностей его генома. Поэтому анализ ассоциации полиморфных маркеров с атопической БА является актуальной задачей современной молекулярной генетики.

Цели и задачи работы

Цель настоящей работы - оценить уровень ассоциации двенадцати полиморфных маркеров восьми генов-кандидатов БА: интерлейкина-13 (IL13), интерлейкина-5 (1L5), альфа цепи рецептора интерлейкина-8 (IL8RA), toll-подобного рецептора (TLR4), антигена 4, ассоциированного с цитотоксическими Т-лимфоцитами (ÇTLA4), G-белка, ассоциированного с астмой (GPRA), эотаксина-3 (CCL26) и регулятора активности нормальной экспрессии и секреции Т-клеток (CCL5/RANTES) с атопической БА.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Сформировать группы больных БА различной степени тяжести, а также группу здорового контроля русского происхождения.

2. Определить частоты аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(-1055)Т и R130Q гена IL13, С(-703)Т гена ILS, M31R и R335C гена IL8RA, Asp299Gly гена TLR4, С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/7) и rs740347 (G/Q гена GPRA, T(+2497)G гена CCL26, A(-403)G гена CCL5 в группе больных атопической бронхиальной астмой и в группе здоровых индивидов.

3. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов выбранных полиморфных маркеров в группах больных и здоровых индивидов для выявления их ассоциации с развитием БА и тяжестью течения БА.

4. Провести анализ ассоциации гаплотипов генов IL13, IL8RA, CTLA4, GPRA с БА и тяжестью течения БА.

Научная новизна и практическая значимость работы

В данной работе впервые изучена ассоциация полиморфных маркеров генов IL13, IL5, IL8RA, TLR4, CTLA4, GPRA, CCL26, CCL5 с атопической БА и тяжестью ее течения среди русского населения г. Москвы.

Для полиморфного маркера С(-1055)Т гена IL13 показана ассоциация с тяжестью атопической БА. Носительство генотипа СС связано с легким течением БА, а генотипа CT - с более тяжелым течением заболевания. Нами показано, что носители минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg полиморфного маркера M31R гена IL8RA имеют повышенный риск развития атопической БА. Наличие аллеля Met и гомозиготного генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания. Для полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 установлено, что минорный аллель Gly ассоциирован со среднетяжелым и тяжелым течением БА, а аллель Asp - с легким течением заболевания. Нами была обнаружена ассоциация гаплотипа Т—А1а по маркерам С(-318)Т и A(+49)G гена CTLA4 с пониженным риском развития БА. Для полиморфного маркера rs324396 гена GPRA показано, что наличие минорного аллеля Т и гетерозиготного генотипа CT в геноме связано с повышенным риском развития БА, а носительство аллеля С и генотипа СС, напротив, ассоциировано с пониженным риском. Также была установлена ассоциация гаплотипа Т—С гена GPRA по маркерам rs324396 и rs740347 с повышенным риском развития БА.

Вышеизложенные результаты были получены впервые.

Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов атопической БА могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления пациентов с повышенным риском развития заболевания, проведения донозологической профилактики и прогнозирования течения болезни.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Дмитриева-Здорова, Елена Викторовна

выводы

1. Изучено распределение аллелей и генотипов полиморфных маркеров С(—703)Т гена IL5, С(-1055)Т и R130Q гена IL13, M31R и R335C гена IL8RA, T(+2497)G гена CCL26, Asp299Gly гена TLR4, C(-318)TuA(+49)G гена CTLA4, rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) гена GPRA и A(-403)G гена CCL5 в группе больных атопической БА и в группе здоровых индивидов русского происхождения.

2. Для ряда полиморфных маркеров генов IL5, CTLA4, CCL26 и CCL5 показано отсутствие ассоциации с развитием атопической БА и тяжестью ее течения.

3. Установлено, что носители минорного аллеля Arg и гетерозиготного генотипа Met/Arg полиморфного маркера M31R гена IL8RA имеют повышенный риск развития атопической БА. Наличие аллеля Met и гомозиготного генотипа Met/Met в геноме, напротив, связано с пониженным риском развития заболевания. Обнаружено, что наличие минорного аллеля Т и гетерозиготного генотипа CT полиморфного маркера rs324396 (С/Т) гена GPRA в геноме связано с повышенным риском развития БА, а носительство аллеля С и генотипа СС ассоциировано с пониженным риском.

4. Показана ассоциация гаплотипа Т-С гена GPRA по маркерам rs324396 (С/Т) и rs740347 (G/C) с повышенным риском развития БА. Обнаружено, что гаплотип Т—А1а маркеров C(-318)TkA(+49)G гена CTLA4 ассоциирован с пониженным риском развития БА.

5. Для полиморфного маркера С(-1055)Т гена IL13 показана ассоциация с тяжестью атопической БА. Носительство генотипа CT связано с более тяжелым течением БА, а генотипа СС — с легким течением заболевания. Установлено, что минорный аллель Gly полиморфного маркера Asp299Gly гена TLR4 ассоциирован с тяжелым течением БА, а аллель Asp - с легким течением заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дмитриева-Здорова, Елена Викторовна, Москва

1. Асанов А.Ю., Намазова Л.С., Пипелис В.Г., Журкова Н.В., Вознесенская Н.И. Генетические основы бронхиальной астмы. // Педиатрическая фармакология. 2008. Т. 5. №4. С. 31-37.

2. Гриппы М.А. Патофизиология легких. // М.: Восточная книжная компания. 1997. С. 344.

3. Дранник Г. Н. Клиническая иммунология и аллергология. // М.: ООО «Медицинское информационное агентство». 2003. С. 468-472.

4. Иванов В.И. Геномика медицине. // М.: Академкнига. 2005. С.392.

5. Ильина E.H., Говорун В.М. Масс-спектрометрия нуклеиновых кислот в молекулярной медицине. // Биоорганическая Химия. 2009. Т. 35. № 2. С. 149-164.

6. Ляхович В. В., Вавилин В. А., Макарова С. И. Роль ферментов биотрансфорации в предрасположенности к бронхиальной астме и формировании особенностей ее клинического фенотипа. // Вестн. РАМН. 2000. № 12. С. 36-41.

7. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета программ Statistica M. // МедиаСфера. 2006. С. 64-69.

8. Сафронова О.Г., Вавилин В.А., Ляпунова A.A. Взаимосвязь между полиморфизмом глутатионовой S-трансферазы PI и бронхиальной астмой и атопическим дерматитом // Бюл. эксперим. биол. мед. 2003. Т. 136. № 1. С. 73—75.

9. Симбирцев A.C., Громова А.Ю. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления. // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 3-10.

10. Суздалъцева Т. В. Иммунопатологические аспекты аспирин-индуцированной бронхиальной астмы. // Аллергология. 1999. № 4. С. 16-18.

11. Украипцева C.B., Сергеев A.C. Популяционный риск возникновения бронхиальной астмы в Москве. // Генетика. 1995. № 2. С. 264-267.

12. Фрейдин М. Б., Кобякова О. С., Огородова Л. М. и др. Наследуемость уровня общего интерлейкина-5 и полиморфизм С-703Т гена IL5 у больных бронхиальной астмой // Бюлл. эксп. биол. мед. 2000. Т. 129. Прил. 1. С. 50-52.

13. Фрейдин М.Б., Пузырев В.П., Огородова Л.М., Кобякова О.С., Кулманакова ИМ. Полиморфизм генов интерлейкинов и их рецепторов: популяционнаяраспространенность и связь с атопической бронхиальной астмой. // Генетика. 2002. Т. 38. № 12. С. 1710-1718.

14. Царегородцева Т.М., Серова Т.И. Цитокины в гастроэнтерологии. // М.: Анахарсис. 2003. С. 50.

15. Чучалин А.Г. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы. // Издательский дом «Атмосфера». 2007.

16. Чучалин А.Г., Баранов А.А. Национальная программа "Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика". // Второе издание. — М.: Издательский дом «Русский врач». 2006. С. 100.

17. Akira S. Bacterial infections and toll-like receptors. // Kekkaku. 2001. Vol. 76(8). P. 593-600.

18. Al-Abdulhadi S.A., Helms P.J., Main M„ Smith O., Christie G. Preferential transmission and association of the -403 G --> A promoter RANTES polymorphism with atopic asthma. // Genes Immun. 2005. Vol. 6(1). P. 24-30.

19. Arbour N.C., Lorenz E., Schutte B.C., Zabner J., Kline J.N., Jones M., Frees K., Watt J.L., Schwartz D.A. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. //Nat. Genet. 2000. Vol. 25(2). P. 187-191.

20. Arroyo-Espliguero R., Avanzas P., Jeffery S., Kaski J.C. CD14 and toll-like receptor 4: a link between infection and acute coronary events? // Heart. 2004. Vol. 90(9). P. 983-988.

21. Azzawi M., Pravica V., Hasleton P.S., Hutchinson I. V. A single nucleotide polymorphism at position -109 of the RANTES proximal promoter. // Eur. J. Immunogenet. 2001. Vol. 28(1). P. 95-96.

22. Baggiolini M., Dewald В., Moser B. Interleukin-8 and related chemotactic cytokines CXC and CC chemokines. // Adv. Immunol. 1994. Vol. 55. P. 97-179.

23. Banwell M.E., Tolley N.S., Williams T.J., Mitchell T.J. Regulation of human eotaxin-3/CCL26 expression: modulation by cytokines and glucocorticoids. // Cytokine. 2002. Vol. 17(6). P. 317-323.

24. Barlic J., Khandaker M.H., Mahon E., Andrews J., DeVries M.E., Mitchell G.B., Rahimpour R„ Tan C.M., Ferguson S.S., Kelvin D.J. beta-arrestins regulate interleukin-8-induced CXCR1 internalization. //J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274(23). P. 16287-16294.

25. Barnes P.J., Chung K.F., Page C.P. Inflammatory mediators of asthma: an update. //Pharmacol Rev. 1998. Vol. 50(4). P. 515-596.

26. Beasley R. The Global Burden of Asthma Report, Global Initiative for Asthma (GINA). Available from http://www.ginasthma.org; 2004.

27. Beghe B., Hall I.P., Parker S.G., Moffatt M.F., Wardlaw A., Connolly M. J., Fabbri L.M., Ruse G, Sayers I. Polymorphisms in IL13 pathway genes in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. // Allergy. 2009.

28. Berkman N., Ohnona S., Chung F.K., Breuer R. Eotaxin-3 but not eotaxin gene expression is upregulated in asthmatics 24 hours after allergen challenge. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2001. Vol. 24(6). P. 682-687.

29. Boulay J.L., Paul W.E. The interleukin-4 family of lymphokines. // Curr. Opin. Immunol. 1992. Vol. 4(3). P. 294-298.

30. Brookes A. J. The essence of SNPs. // Gene. 1999. Vol. 234(2). P. 177-186.

31. Brown D.L., Gorin M.B., Weeks D.E. Efficient strategies for genomic searching using the affected-pedigree-member method of linkage analysis.// Am. J. Hum. Genet. 1994. Vol. 54. P. 544-552.

32. Busse W.W, Lemanske R.F. Jr Asthma. // N. Engl. J. Med. 2001. Vol. 344(5). P. 350-362.

33. Campbell J.J., HedrickJ., Zlotnik A., Siani M.A., Thompson D.A., Butcher E.C. Chemokines and the arrest of lymphocytes rolling under flow conditions. // Science. 1998. Vol. 279(5349). P. 381-384.

34. Carty M., Goodbody R„ Schroder M., Stack J., Moynagh P.N., Bowie A.G. The human adaptor SARM negatively regulates adaptor protein TRIF-dependent Toll-like receptor signaling. //Nat. Immunol. 2006. Vol. 7(10). P. 1074-1081.

35. Chae S.C., Park Y.R., Oh G.J., Lee J.H., Chung H.T. The suggestive association of eotaxin-2 and eotaxin-3 gene polymorphisms in Korean population with allergic rhinitis. // Immunogenetics. 2005b. Vol. 56(10). P. 760-764.

36. Chae S.C., Park Y.R., Shim SC., Lee I.K., Chung H.T. Eotaxin-3 gene polymorphisms are associated with rheumatoid arthritis in a Korean population. // Hum. Immunol. 2005a. Vol. 66(3). P. 314-320.

37. Chen G., Goeddel D. V. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. // Science. 2002. Vol. 296(5573). P. 1634-1635.

38. Chihara J., Yasuba H., Tsuda A., Urayama O., Saito N., Honda K., Kayaba H., Yamashita T., Kurimoto F., Yamada H. Elevation of the plasma level of RANTES during asthma attacks. //J. Allergy Clin. Immunol. 1997. Vol. 100. P. 52-55.

39. Chung K.F., Barnes P.J. Cytokines in asthma. // Thorax. 1999. Vol. 54(9). P. 825857.

40. Coffman R.L., Seymour B.W., Hudak S., Jackson J., Rennick D. Antibody to interleukin-5 inhibits helminth-induced eosinophilia in mice. // Science. 1989. Vol. 245(4915). P. 308-310.

41. Collins P.D., Weg V.B., Faccioli L.H., Watson M.L., Moqbel R., Williams T.J. Eosinophil accumulation induced by human interleukin-8 in the guinea-pig in vivo. // Immunology. 1993. Vol. 79(2). P. 312-318.

42. Cookson W.O. Asthma genetics.// Chest. 2002. Vol. 121. P. 7-13.

43. Covert M.W., Leung T.H., Gaston J.E., Baltimore D. Achieving stability of lipopolysaccharide-inducedNF-kappaB activation. // Science. 2005. Vol. 309(5742). P. 18541857.

44. Crow J.F. Spontaneous mutation as a risk factor. // Exp. Clin. Immunogenet. 1995. Vol. 12(3). P. 121-128.

45. Davies D.E., Holgate S.T. Asthma: the importance of epithelial mesenchymal communication in pathogenesis. Inflammation and the airway epithelium in asthma. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2002. Vol. 34(12). P. 1520-1526.

46. De Lucca C.V. Recent developments in CCR3 antagonists. // Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2006. Vol. 9(4). P. 516-524.

47. Desreumaux P., Janin A., Dubucquoi S., Copin M.C., Torpier G., Capron A., Capron M., Prin L. Synthesis of interleukin-5 by activated eosinophils in patients with eosinophilic heart diseases. //Blood. 1993. Vol. 82(5). P. 1553-1560.

48. Donlon T.A., Krensky A.M., Wallace M.R., Collins F.S., Lovett M., Clayberger C. Localization of a human T-cell-specific gene, RANTES (D17S136E), to chromosome 17ql 1.2-ql2. // Genomics. 1990. Vol. 6(3). P. 548-553.

49. Donnadieu E., Jouvin M.H., Rana S., Moffatt M.F., Mockford E.H., Cookson W.O., Kinet J.P. Competing functions encoded in the allergy-associated F(c)epsilonRIbeta gene. // Immunity. 2003. Vol. 18(5). P. 665-674.

50. Eder W., von Mutius E. Genetics in asthma: the solution to a lasting conundrum? // Allergy. 2005. Vol. 60(12). P. 1482-1484.

51. Edfors-Lubs M.L. Allergy in 7000 twin pairs. // Acta. Allergol. 1971. Vol. 26(4). P. 249-285.

52. Jenkins M.A., Hopper J.L., Giles G.G. Regressive logistic modeling of familial aggregation for asthma in 7,394 population-based nuclear families. // Genet. Epidemiol. 1997. Vol. 14(3). P. 317-332.

53. Fenton M.J., Golenbock D.T. LPS-binding proteins and receptors. // J. Leukoc. Biol. 1998. Vol. 64(1). P. 25-32.

54. Foster P.S., Hogan S.P., Ramsay A.J., Matthaei K.I., Young I.G. Interleukin 5 deficiency abolishes eosinophilia, airways hyperreactivity, and lung damage in a mouse asthma model. //J. Exp. Med. 1996. Vol. 183(1). P. 195-201.

55. Furie M.B., Randolph G.J. Chemokines and tissue injury. // Am. J. Pathol. 1995. Vol. 146(6). P. 1287-1301.

56. Galli S.J., Kalesnikoff J., Grimbaldeston M.A., Piliponsky A.M., Williams C.M., Tsai M. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. // Annu. Rev. Immunol. 2005. Vol. 23. P. 749-786.

57. Gao G.M., Wu J.M., Cui T.P., He Z.Q. The research on the correlation between eotaxin-3 gene polymorphisms and allergic asthma. // Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2006. Vol. 23(2). P. 169-172.

58. Gao J.M., Lin Y.G., Qiu C.C., Liu Y.W., Ma Y., Liu Y Beta2-adrenergic receptor gene polymorphism in Chinese Northern asthmatics. // Chin. Med. Sci. J. 2004. Vol. 19(3). P. 164-169.

59. Gao P.S., Huang S.K. Genetic aspects of asthma. // Panminerva. Med. 2004. Vol. 46(2). P. 121-134.

60. Garcia G., Godot V., Humbert M. New chemokine targets for asthma therapy. // Curr. Allergy Asthma Rep. 2005. Vol. 5(2). P. 155-160.

61. Gauvreau G.M., Watson R.M., O'Byrne P.M. Kinetics of allergen-induced airway eosinophilic cytokine production and airway inflammation. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999. Vol. 160(2). P. 640-647.

62. Govindaraju V., Michoud M.C., Al-Chalabi M., Ferraro P., Powell W.S., Martin J.G. Interleukin-8: novel roles in human airway smooth muscle cell contraction and migration. // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 2006. Vol. 291(5). P. 957-965.

63. Greenfeder S., Umland S.P., Cuss F.M., Chapman R. W, Egan R. W. Th2 cytokines and asthma. The role of interleukin-5 in allergic eosinophilic disease. // Respir. Res. 2001. Vol. 2(2). P. 71-79.

64. Guo R.F., Ward P.A., Hu S.M., McDuffie J.E., Huber-Lang M., Shi M.M. Molecular cloning and characterization of a novel human CC chemokine, SCYA26. // Genomics. 1999. Vol. 58(3). P. 313-317.

65. Hajeer AH, al Sharif F, Oilier WE A polymorphism at position -403 in the human RANTES promoter. // Eur. J. Immunogenet. 1999. Vol. 26(5). P. 375-376.

66. Hamid Q., Boguniewicz M., Leung D.Y. Differential in situ cytokine gene expression in acute versus chronic atopic dermatitis. // J. Clin. Invest. 1994. Vol. 94(2). P. 870-876.

67. Harada A., Mukaida N., Matsushima K. Interleukin 8 as a novel target for intervention therapy in acute inflammatory diseases. // Mol. Med. Today. 1996. Vol. 2(11). P. 482-489.

68. Harada A., Sekido N., Akahoshi T., Wada T., Mukaida N., Matsushima K. Essential involvement of interleukin-8 (IL-8) in acute inflammation. // J. Leukoc. Biol. 1994. Vol. 56(5). P. 559-564.

69. Hashimoto C., Hudson K.L., Anderson K.V. The Toll gene of Drosophila, required for dorsal-ventral embryonic polarity, appears to encode a transmembrane protein. // Cell. 1988. Vol. 52(2). P. 269-279.

70. Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kappaB. // Genes Dev. 2004. Vol. 18(18). P. 2195-2224.

71. He J.Q., Chan-Yeung M., Becker A.B., Dimich-Ward H., Ferguson A.C., Manfreda J., Watson W.T., Sandford A.J. Genetic variants of the IL13 and IL4 genes andatopic diseases in at-risk children. // Genes Immun. 2003. Vol. 4(5). P. 385-389.

72. Heiman A., Abonyo B„ Darling-Reed S„ Alexander M. Cytokine-stimulated human lung alveolar epithelial cells release eotaxin-2 (CCL24) and eotaxin-3 (CCL26). // J. Interferon Cytokine Res. 2005. Vol. 25(2). P. 82-91.

73. Hershey G.K., Friedrich M.F., Esswein L.A., Thomas M.L., Chatila T.A. The association of atopy with a gain-of-function mutation in the alpha subunit of the interleukin-4 receptor. //N. Engl. J. Med. 1997. Vol. 337(24). P. 1720-1725.

74. Hirano T., Teranishi T., Onoue K Human helper T cell factor(s). III. Characterization of B cell differentiation factor I (BCDF I). // J. Immunol. 1984. Vol. 132(1). P. 229-234.

75. Hobbs K, Negri J., Klinnert M., Rosemvasser L.J., Borish L. Interleukin-10 and transforming growth factor-beta promoter polymorphisms in allergies and asthma. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998. Vol. 158(6). P. 1958-1962.

76. Hoebe K., Janssen E.M., Kim S.O., Alexopoulou L., Flavell R.A., Han J., Beutler

77. B. Upregulation of costimulatory molecules induced by lipopolysaccharide and double-stranded RNA occurs by Trif-dependent and Trif-independent pathways. // Nat. Immunol. 2003. Vol. 4(12). P. 1223-1229.

78. Hofjjan S., Ostrovnaja I., Nicolae D., Newman D.L., Nicolae R., Gangnon R., Steiner L„ Walker K„ Reynolds R., Greene D„ Mirel D., Gem J.E., Lemanske R.F.Jr., Ober

79. C. Genetic variation in immunoregulatory pathways and atopic phenotypes in infancy // J.

80. Allergy Clin. Immunol. 2004. Vol. 113(3). P. 511-518.

81. Hogan S.P. Recent advances in eosinophil biology. // Int. Arch. Allergy Immunol. 2007. Vol. 143. P. 3-14.

82. Holgate S.T. Genetic and environmental interaction in allergy and asthma. // J. Allergy Clin. Immunol. 1999. Vol. 104(6). P. 1139-1146.

83. Holloway J. W., Beghe B, Holgate S.T. The genetic basis of atopic asthma. // Clin. Exp. Allergy. 1999. Vol. 29(8). P. 1023-1032.

84. Horng T., Barton G.M., Flavell R.A., Medzhitov R. The adaptor molecule TIRAP provides signalling specificity for Toll-like receptors. //Nature. 2002. Vol. 420(6913). P. 329333.

85. Hong J., Leung E., Fraser A.G., Merriman T.R., Vishnu P., Krissansen G.W. TLR2, TLR4 and TLR9 polymorphisms and Crohn's disease in a New Zealand Caucasian cohort. //J. Gastroenterol. Hepatol. 2007. Vol. 22(11). P. 1760-1766.

86. Hopkin J. Molecular genetics of the high affinity IgE receptor. I I Monogr. Allergy. 1996. Vol. 33. P. 97-108.

87. Hoshino K, Kaisho T., Iwabe T., Takeuchi O., Akira S. Differential involvement of IFN-beta in Toll-like receptor-stimulated dendritic cell activation. // Int. Immunol. 2002. Vol. 14(10). P. 1225-1231.

88. Howard T.D., Koppelman G.H., Xu J., Zheng S.L., Postma D.S., Meyers D.A., Bleecker E.R. Gene-gene interaction in asthma: IL4RA and IL13 in a Dutch population with asthma //Am. J. Hum. Genet. 2002. Vol. 70(1). P. 230-236.

89. Huber A.R., Kunkel S.L., Todd R.F. 3rd, Weiss SJ Regulation of transendothelial neutrophil migration by endogenous interleukin-8. // Science. 1991. vol. 254(5028). P. 99102.

90. Hutchon D.J.R. Calculator for confidence intervals for odds ratio unmatched case control study, http://www.hutchon.net/ConfidOR.htm.

91. Humbert M. Pro-eosinophilic cytokines in asthma. // Clin. Exp. Allergy. 1996. Vol. 26(2). P. 123-127.

92. Hwang E.S., Szabo S.J., Schwartzberg P.L., Glimcher L.H. T helper cell fate specified by kinase-mediated interaction of T-bet with GATA-3. // Science. 2005. Vol. 307(5708). P. 430-433.

93. Hysi P., Kabesch M., Moffatt M.F., Schedel M., Carr D., Zhang Y., Boardman B., von Mutius E., Weiland S.K., Leupold W., Fritzsch C., Klopp N., Musk A. W., James A., Nunez

94. G., Inohara N., Cookson W.O. NODI variation, immunoglobulin E and asthma. // Hum. Mol. Genet. 2005. Vol. 14(7). P. 935-941.

95. Immervoll T., Loesgen S., Dutsch G., Gohlke H., Herbon N. Klugbauer S., Dempfle A., Bickeboller H., Becker-Follmann J., Ruschendorf F., Saar K., Re is A., Wichmann

96. H.E., Wjst M. Fine mapping and single nucleotide polymorphism association results of candidate genes for asthma and related phenotypes. // Hum. Mutat. 2001.Vol. 18(4). P. 327336.

97. James A. Airway remodeling in asthma. // Curr. Opin. Pulm. Med. 2005. Vol.11(1). P. 1-6.

98. Jarvis D., Burney P. Epidemiology of atopy and atopic diseases. // Allergy and allergic diseases / Ed. A. B. Kay. Blackwell Science. 1997. P. 1208-1224.

99. Jenkins M.A., Hopper J.L., Flander L.B., CarlinJ.B., Giles G.G. The associations between childhood asthma and atopy, and parental asthma, hay fever and smoking. // Paediatr. Perinat. Epidemiol. 1993. Vol. 7(1). P. 67-76.

100. Johansson S., Wennergren G., Aberg N., Rudin A. Clara cell 16-kd protein downregulates T(H)2 differentiation of human naive neonatal T cells. // J. Allergy Clin. Immunol. 2007. Vol. 120(2). P. 308-314.

101. Kabesch M., Carr D., Weiland S.K., von Mutius E. Association between polymorphisms in serine protease inhibitor, kazal type 5 and asthma phenotypes in a large German population sample. // Clin. Exp. Allergy. 2004. Vol. 34(3). P. 340-345.

102. Kaisho T., Takeuchi O., Kawai T., Hoshino K, Akira S. Endotoxin-induced maturation of MyD88-deficient dendritic cells. // J. Immunol. 2001. Vol. 166(9). P. 56885694.

103. Karas M., Bachmann D., Bahr D. and Hillenkamp F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. // Int. J. Mass Spectrom. Ion Proc. 1987. № 78. P. 53-68.

104. Karas M., Hillenkamp F. II Anal. Chem. 1988. V. 60. P. 2299-2301.

105. Kawai T., Adachi O., Ogawa T., Takeda K, Akira S. Unresponsiveness of MyD88-deficient mice to endotoxin. // Immunity. 1999. Vol. 11(1). P. 115-122.

106. Kay A.B., Phipps S„ Robinson D.S. A role for eosinophils in airway remodelling in asthma. II Trends Immunol. 2004. Vol. 25(9). P. 477-482.

107. Kelvin D.J., Michiel D.F., Johnston J.A., Lloyd A.R., Sprenger H., Oppenheim J.J., Wang J.M. Chemokines and serpentines: the molecular biology of chemokine receptors. //J. Leukoc. Biol. 1993. Vol. 54(6). P. 604-612.

108. Kiechl S., Lorenz E., Reindl M., Wiedermann C.J., Oberhollenzer F., Bonora E., Willeit J, Schwartz D.A. Toll-like receptor 4 polymorphisms and atherogenesis. // N. Engl. J. Med. 2002. Vol. 347(3). P. 185-192.

109. KimataH., YoshidaA., Ishioka C„ Fujimoto M„ Lindley I., Furusho K RANTES and macrophage inflammatory protein 1 alpha selectively enhance immunoglobulin (IgE) and IgG4 production by human B cells. // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183(5). P. 2397-2402.

110. Kita H., Gleich G.J. Chemokines active on eosinophils: potential roles in allergic inflammation. // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183(6). P. 2421-2426.

111. Kita IL, Sur S., Hunt L. W, Edell E.S., Weiler D.A., Swanson M.C., Samsel R. W, Abrams J.S., Gleich G.J. Cytokine production at the site of disease in chronic eosinophilic pneumonitis. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1996. Vol. 153. P. 1437-1441.

112. Kolbe J., Garrett J., Vamos M., Rea H.H. Influences on trends in asthma morbidity and mortality: the New Zealand experience. // Chest. 1994. Vol. 106. P. 211-215.

113. Koppelman G.H., Reijmerink N.E., Colin Stine O., Howard T.D., Whittaker P.A., Meyers D.A., Postma D.S., Bleecker E.R. Association of a promoter polymorphism of the CD 14 gene and atopy. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2001. Vol. 163(4). P. 965-969.

114. Krieger M., Brunner T., Bischoff S.C., von Tscharner V., Walz A., Moser B., Baggiolini M., Dahinden C.A. Activation of human basophils through the IL-8 receptor // J. Immunol. 1992. Vol. 149(8). P. 2662-2667.

115. Kuna P., Reddigari S.R., Schall T.J., Rucinski D., Viksman M.Y., Kaplan A.P. RANTES, a monocyte and T lymphocyte chemotactic cytokine releases histamine from human basophils. // J. Immunol. 1992. Vol. 149(2). P. 636-642.

116. Kuipers H., Lambrecht B.N. The interplay of dendritic cells, Th2 cells and regulatory T cells in asthma. // Curr. Opin. Immunol. 2004. Vol. 16(6). P. 702-708.

117. Kunkel S.L., Standiford T., Kasahara K, Strieter R.M. Interleukin-8 (IL-8): the major neutrophil chemotactic factor in the lung. // Exp. Lung. Res. 1991. Vol. 17(1). P. 17-23.

118. Lai E. Application of SNP technologies in medicine: lessons learned and future challenges. // Genome Res. 2001. Vol. 11(6). P. 927-929.

119. Laitinen A., Altraja A., Kampe M., Linden M., Virtanen L, Laitinen L.A. Tenascin is increased in airway basement membrane of asthmatics and decreased by an inhaled steroid. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. Vol. 156. P. 951-958.

120. Lane S.J., Arm J.P., Staynov D.Z., Lee T.H. Chemical mutational analysis of the human glucocorticoid receptor cDNA in glucocorticoid-resistant bronchial asthma. // Am. J. Respir .Cell Mol. Biol. 1994. Vol. 11(1). P. 42-48.

121. Larche M., Robinson D.S., Kay A.B. The role of T lymphocytes in the pathogenesis of asthma. // J. Allergy Clin. Immunol. 2003. Vol. 111(3). P. 450-463.

122. Larsen C.G., Anderson A.O., Appella E., Oppenheim J.J., Matsushima K. The neutrophil-activating protein (NAP-1) is also chemotactic for T lymphocytes. // Science. 1989. Vol. 243(4897). P. 1464-1466.

123. Lee J., Horuk R., Rice G.C., Bennett G.L., Camerato T., Wood W.I. Characterization of two high affinity human interleukin-8 receptors. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267(23). P. 16283-16287.

124. Lee J.H., Moore J.H., Park S.W., Jang A. S., Uh ST., Kim Y.H., Park C.S., Park B.L., Shin H.D. Genetic interactions model among Eotaxin gene polymorphisms in asthma. // J. Hum. Genet. 2008. Vol. 53(10). P. 867-875.

125. Leung T.F., Tang N.L., Chan I.H., Li A.M., Ha G., Lam C.W A polymorphism in the coding region of interleukin-13 gene is associated with atopy but not asthma in Chinese children//Clin. Exp. Allergy. 2001. Vol. 31(10). P. 1515-1521.

126. Leung T.F., Tang N.L., Wong G.W., Fok T.F. CD 14 and toll-like receptors: potential contribution of genetic factors and mechanisms to inflammation and allergy. // Curr. Drug Targets Inflamm. Allergy. 2005. Vol. 4(2). P. 169-175.

127. Li W.H., Ellsworth D.L., Krushkal J., Chang B.H., Hewett-Emmett D. Rates of nucleotide substitution in primates and rodents and the generation-time effect hypothesis. // Mol. Phylogenet. Evol. 1996. Vol. 5(1). P. 182-187.

128. Li W.H., Sadler L.A. Low nucleotide diversity in man. // Genetics. 1991. Vol. 129(2). P. 513-523.

129. Liang X.H., Cheung W, Heng C.K, Wang D.Y. Absence of the toll-like receptor 4 gene polymorphisms Asp299Gly and Thr399Ile in Singaporean Chinese.// Ther. Clin. Risk Manag. 2005. Vol. 1(3). P. 243-246.

130. Litonjua A.A., Tantisira KG., Lake S„ Lazarus R., Richter B.G., Gabriel S„ Silverman E.S., Weiss S. T. Polymorphisms in signal transducer and activator of transcription 3 and lung function in asthma. // Respir. Res. 2005. Vol. 6. P. 52.

131. Liu L.Y., Coe C.L., Swenson C.A., Kelly E.A., Kita II., Busse WW. School examinations enhance airway inflammation to antigen challenge. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2002. Vol. 165(8). P. 1062-1067.

132. Liu S.F., Chen Y.C., Wang C.C., Fang W.F., Chin C.H., Su M.C., Lin M. IL13 promoter (-1055) polymorphisms associated with chronic obstructive pulmonary disease in taiwanese. // Exp. Lung Res. 2009. Vol. 35(10). P. 807-816.

133. Loetscher P., Seitz M., Clark-Lewis I., Baggiolini M„ Moser B. Monocyte chemotactic proteins MCP-1, MCP-2, and MCP-3 are major attractants for human CD4+ and CD8+ T lymphocytes. // FASEB J. 1994. Vol. 8(13). P. 1055-1060.

134. Lopez A.F., Sanderson C.J., Gamble J.R., Campbell H.D., Young I.G., Vadas M.A. Recombinant human interleukin 5 is a selective activator of human eosinophil function. // J. Exp. Med. 1988. Vol. 167(1). P. 219-224.

135. Luger T.A. Cytokine regulation in the skin. // XV International congress of allergology and clinical immunology. 1994. P. 26-34.

136. Makki R.F., al Sharif F, Gonzalez-Gay M.A., Garcia-Porrua C., Oilier W.E., Hajeer A.H. RANTES gene polymorphism in polymyalgia rheumatica, giant cell arteritis and rheumatoid arthritis. // Clin. Exp. Rheumatol. 2000. Vol. 18(3). P. 391-393.

137. Malerba G., Pignatti P.F. A review of asthma genetics: gene expression studies and recent candidates. //J. Appl. Genet. 2005. Vol. 46(1). P. 93-104.

138. Marenholz I., Nickel R., Ruschendorf F„ Schulz F, Esparza-Gordillo J., Kerscher T., Gruber C., Lau S., Worm M., Keil T., Kurek M., Zaluga E., Wahn U., Lee Y.A.

139. Filaggrin loss-of-fimction mutations predispose to phenotypes involved in the atopic march. // J. Allergy Clin. Immunol. 2006. Vol. 118(4). P. 866-871.

140. Martinez F.D. Maturation of a hypothesis. // Mediators Inflamm. 2001. Vol. 10(6). P. 306-307.

141. Martinez F.D., Solomon S., Holberg C.J., Graves P.E., Baldini M„ Erickson R.P. Linkage of circulating eosinophils to markers on chromosome 5q. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1998. Vol. 158(6). P. 1739-1744.

142. Marty C., Misset B., Tamion F, Fitting C., Carlet J., Cavaillon J.M. Circulating interleukin-8 concentrations in patients with multiple organ failure of septic and nonseptic origin. // Crit. Care Med. 1994. Vol. 22(4). P. 673-679.

143. Masoli M, Fabian D„ Holt S., Beasley R„ Global Initiative for Asthma (GINA) Program The global burden of asthma: executive summary of the GINA Dissemination Committee report. // Allergy. 2004. Vol. 59(5). P. 469-478.

144. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A.Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity. // Nature. 1997. Vol. 388(6640). P. 394-397.

145. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Kopp E., Stadlen A., Chen C., Ghosh S., Janeway C.A.Jr. MyD88 is an adaptor protein in the hToll/IL-1 receptor family signaling pathways. //Mol. Cell. 1998. Vol. 2(2). P. 253-258.

146. Michel G., Kemény L„ Peter R. U., Beetz A., Ried C„ Arenberger P., Ruzicka T. Interleukin-8 receptor-mediated chemotaxis of normal human epidermal cells. // FEB S Lett. 1992. Vol. 305(3). P. 241-243.

147. Miggin S.M., O'Neill L.A. New insights into the regulation of TLR signaling. //J Leukoc. Biol. 2006. Vol. 80(2). P. 220-226.

148. Migita M., Yamaguchi N., Mita S., Higuchi S., Hitoshi Y., Yoshida Y., Tomonaga M., Matsuda I, Tominaga A., Takatsu K. Characterization of the human IL-5 receptors on eosinophils. // Cell Immunol. 1991. Vol. 133(2). P. 484-497.

149. Milburn M. V., Hassell A.M., Lambert M.H., Jordan S.R., Proudfoot A.E., Graber P., Wells T.N. A novel dimer configuration revealed by the crystal structure at 2.4 A resolution of human interleukin-5. //Nature. 1993. Vol. 363(6425). P. 172-176.

150. Miyajima A., Mui A.L., Ogorochi T., Sakamaki K. Receptors for granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, interleukin-3, and interleukin-5. // Blood. 1993. Vol. 82(7). P. 1960-1974.

151. Moffatt M.F., Cookson W.O. Tumour necrosis factor haplotypes and asthma. // Hum. Mol. Genet. 1997. Vol. 6(4). P. 551-554.

152. Moffatt M.F., Schou C., Faux J.A., Cookson W.O. Germline TCR-A restriction of immunoglobulin E responses to allergen. // Immunogenetics. 1997. Vol. 46(3). P. 226-230.

153. Mollen K.P., Levy R.M., Prince J.M., Hoffman R.A., Scott M.J., Kaczorowski

154. D.J., Vallabhaneni R., Vodovotz Y., Billiar T.R. Systemic inflammation and end organ damage following trauma involves functional TLR4 signaling in both bone marrow-derived cells and parenchymal cells. //J. Leukoc. Biol. 2008. Vol. 83(1). P. 80-88.

155. Morahan G„ Huang D„ Wu M., Holt B.J., White G.P., Kendall G.E., Sly P:D., Holt P.G. Association of IL12B promoter polymorphism with severity of atopic and non-atopic asthma in children. // Lancet. 2002. Vol. 360(9331). P. 455-459.

156. Murata Y., Takaki S., Migita M., Kikuchi Y., Tominaga A., Takatsu K Molecular cloning and expression of the human interleukin 5 receptor. // J. Exp. Med. 1992. Vol. 175(2). P. 341-351.

157. Muro M., Marin L., Torio A., Pagan J.A., Alvarez-Lopez M.R. CCL5/RANTES chemokine gene promoter polymorphisms are not associated with atopic and nonatopic asthma in a Spanish population. // Int. J. Immunogenet. 2008. Vol. 35(1). P. 19-23.

158. Nakamura H., Luster A.D., Nakamura T„ In K.H., Sonna L.A., Deykin A., Israel

159. E., Drazen J.M., Lilly C.M. Variant eotaxin: its effects on the asthma phenotype. // J. Allergy Clin. Immunol. 2001. Vol. 108(6). P. 946-953.

160. Nelson P.J., Kim H.T., Manning W.C., Goralski T.J., Krensky A.M. Genomic organization and transcriptional regulation of the RANTES chemokine gene. // J. Immunol. 1993. Vol. 151(5). P. 2601-2612.

161. Nomiyama H„ Osborne L.R., Imai T., Kusuda J., Miura R., Tsui L.C., Yoshie O. Assignment of the human CC chemokine MPIF-2/eotaxin-2 (SCYA24) to chromosome 7qll.23. // Genomics. 1998. Vol. 49(2). P. 339-340.

162. O'Neill L.A., Bowie A.G. The family of five: TIR-domain-containing adaptors in Toll-like receptor signaling. //Nat. Rev. Immunol. 2007. Vol. 7(5). P. 353-364.

163. Ober C. Perspectives on the past decade of asthma genetics. // J. Allergy Clin. Immunol. 2005. Vol. 116(2). P. 274-278.

164. OshiumiH., Sasai M., ShidaK, Fujita T., Matsumoto M., Seya T. TIR-containing adapter molecule (TICAM)-2, a bridging adapter recruiting to toll-like receptor 4 TIC AM-1 that induces interferon-beta. //J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278(50). P. 49751-49762.

165. Park Y.J., Chung H.K, Park D.J., Kim W.B., Kim S.W., Koh J.J, Cho B.Y. Polymorphism in the promoter and exon 1 of the cytotoxic T lymphocyte antigen-4 gene associated with autoimmune thyroid disease in Koreans. // Thyroid. 2000. Vol. 10(6). P. 453459.

166. Paul W.E., Seder R.A. Lymphocyte responses and cytokines. // Cell. 1994. Vol. 76(2). P. 241-251.

167. Pease J.E. Asthma, Allergy and Chemokines // Curr. Drug. Targets. 2006. Vol. 7(1). P. 3-12.

168. Pease J.E., Williams T.J. Chemokines and their receptors in allergic disease. // J. Allergy Clin Immunol. 2006. Vol. 118(2). P. 305-318.

169. Peters-Golden M. The alveolar macrophage: the forgotten cell in asthma. // Am J Respir. Cell Mol. Biol. 2004. Vol. 31(1). P. 3-7.

170. Petkovic V., Moghini C., Paoletti S., Uguccioni M., Gerber B. Eotaxin-3/CCL26 is a natural antagonist for CC chemokine receptors 1 and 5. A human chemokine with a regulatory role. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279(22). P. 23357-23363.

171. Postma D.S., Koppelman G.H. Confirmation of GPRA: a putative drug target for asthma. // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2005. Vol. 171(12). P. 1323-1324.

172. Pulkkinen V., Majuri M.L., Wang G., Holopainen P., Obase Y., Vendelin J., et al. Neuropeptide S and G protein-coupled receptor 154 modulate macrophage immune responses. //Hum. Mol. Genet. 2006; Vol. 15. P. 1667-1679.

173. Puthothu B., Krueger M., Heinze J., Forster J., Heinzmann A. Impact of IL8 and IL8-receptor alpha polymorphisms on the genetics of bronchial asthma and severe RSV infections. // Clin. Mol. Allergy. 2006. Vol. 4. P. 2.

174. Quan S.F., Sedgwick J.B., Nelson M.V., Busse WW. Corticosteroid resistance in eosinophilic gastritis—relation to in vitro eosinophil survival and interleukin 5. // Ann. Allergy. 1993. Vol. 70(3). P. 256-260.

175. Raby B.A., Van Steen K, Lazarus R., Celedon J.C., Silverman EK, Weiss S.T. Eotaxin polymorphisms and serum total IgE levels in children with asthma. // J. Allergy Clin. Immunol. 2006. Vol. 117(2). P. 298-305.

176. Regamey N., Obregon C., Ferrari-Lacraz S., van Leer C., Chanson M., Nicod L.P., Geiser T. Airway epithelial IL-15 transforms monocytes into dendritic cells. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2007. Vol. 37(1). P. 75-84.

177. Remick D.G. Interleukin-8. // Crit. Care Med. 2005. Vol. 33 P. 466-467.

178. Ritz T„ Steptoe A., De Wilde S., Costa M. Emotions and stress increase respiratory resistance in asthma. // Psychosom. Med. 2000. Vol. 62(3). P. 401-412.

179. Rosenstiel P., Till A., Schreiber S. NOD-like receptors and human diseases. // Microbes Infect. 2007. Vol. 9(5). P. 648-657.

180. Rosenwasser L.J., Klemm D.J., DresbackJ.K., Inamura H., Mascali J.J., Klinnert M., Borish L. Promoter polymorphisms in the chromosome 5 gene cluster in asthma and atopy. // Clin. Exp. Allergy. 1995. Vol. 25. P.74-8.

181. Rothenberg M.E. Eosinophilia. //N. Engl. J. Med. 1998. Vol. 338(22). P. 15921600.

182. Saito H., Shimizu H, Akiyama K. Autocrine regulation of eotaxin in normal human bronchial epithelial cells. // Int. Arch. Allergy Immunol. 2000. Vol. 122. P. 50-53.

183. Schrezenmeier H., Thome S.D., Tewald F., Fleischer B., Raghavachar A. Interleukin-5 is the predominant eosinophilopoietin produced by cloned T lymphocytes in hypereosinophilic syndrome. // Exp. Hematol. 1993. Vol. 21(2). P. 358-365.

184. Schumann R.R., Leong S.R., Flaggs G. W, Gray P. W, Wright S.D., Mathison J.C., Tobias P.S., Ulevitch R.J. Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. // Science. 1990. Sep 21; Vol. 249(4975). P. 1429-1431.

185. Schwartz D.A. Inhaled endotoxin, a risk for airway disease in some people. // Respir. Physiol. 2001. Vol. 128(1). P. 47-55.

186. Schweizer R.C., Welmers B.A., Raaijmakers J.A., Zanen P., Lammers J.W., Koenderman L. RANTES- and interleukin-8-induced responses in normal human eosinophils: effects of priming with interleukin-5. // Blood. 1994. Vol. 83(12). P. 3697-3704.

187. Scirica C.V., Celedon J.C. Genetics of asthma: potential implications for reducing asthma disparities. // Chest. 2007. Vol. 132. P.770-781.

188. Severinson E., Naito T„ Tokumoto H., Fukushima D., Hirano A., Hama K., Honjo T. Interleukin 4 (IgGl induction factor): a multifunctional lymphokine acting also on T cells. // Eur. J. Immunol. 1987. Vol. 17(1). P. 67-72.

189. Shapiro S.D. Animal models for chronic obstructive pulmonary disease: age of klotho andmarlboromice. //Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. Vol. 22(1). P. 4-7.

190. Sherry S.T., Ward M.H., Kholodov M., Baker J., Phan L„ Smigielski E.M., Sirotkin K. dbSNP: the NCBI database of genetic variation. // Nucleic Acids Res. 2001. Vol. 29(1). P. 308-311.

191. Shiina T„ Inoko H., Kulski J.K. An update of the HLA genomic region, locus information and disease associations: 2004. // Tissue Antigens. 2004. Vol. 64(6). P. 631-649.

192. Shin H.D., Park B.L., Jung J.H., Wang H.J., Park H.S., Choi B.W., Hong S.J., Lee Y.M., Kim Y.H., Park C.S. Association of thromboxane A2 receptor (TBXA2R) with atopy and asthma. // J. Allergy Clin. Immunol. 2003. Vol. 112(2). P. 454-457.

193. Shin H.D., ParkKS., Park C.S. Lack of association of GPRA (G protein-coupled receptor for asthma susceptibility) haplotypes with high serum IgE or asthma in a Korean population. //J. Allergy Clin. Immunol. 2004. Vol. 114(5). P. 1226-1227.

194. Shirakawa T., Li A., Dubowitz M., Dekker J. W, Shaw A.E., Faux J.A., Ra C., Cookson W.O., Hopkin J.M. Association between atopy and variants of the beta subunit of the high-affinity immunoglobulin E receptor. //Nat. Genet. 1994. Vol. 7(2). P. 125-129.

195. Shirakawa T„ Mao X.Q., Sasaki S., Enomoto T., Kawai M., Morimoto K., Hopkin J. Association between atopic asthma and a coding variant of Fc epsilon RI beta in a Japanese population. // Hum. Mol. Genet. 1996. Vol. 5(8). P. 1129-1130.

196. Shute J. Interleukin-8 is a potent eosinophil chemo-attractant. // Clin. Exp. Allergy. 1994. Vol. 24(3). P. 203-206.

197. Sibbald B., Barnes G., Durham S.R. Skin prick testing in general practice: a pilot study. // J. Adv. Nurs. 1997. Vol. 26(3). P. 537-42.

198. Sim T.C., Reece L.M., Hilsmeier K.A., Grant J.A., Alam R. Secretion of chemokines and other cytokines in allergen-induced nasal responses: inhibition by topical steroid treatment. //Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1995. Vol. 152(3). P. 927-933.

199. Snowden N. Hajeer A., Thomson W., Oilier B. RANTES role in rheumatoid arthritis. // Lancet. 1994. Vol.343(8896). P. 547-548.

200. Srivastava P., Helms P. J., Stewart D., Main M., Russell G. Association of CCR5 A32 with reduced risk of childhood but not adult asthma. // Thorax. 2003. Vol. 58. P. 222226.

201. StavnezerJ. Immunoglobulin class switching. // Curr. Opin. Immunol. 1996. Vol. 8(2). P. 199-205.

202. Strachan D.P. Family size, infection and atopy: the first decade of the "hygiene hypothesis". // Thorax. 2000. Vol. 55. P. 2-10.

203. Strachan D.P. Hay fever, hygiene, and household size. // BMJ. 1989. Vol. 299(6710). P. 1259-1260.

204. Sutherland G.R., Baker E., Callen D.F., Campbell H.D., Young I.G., Sanderson C.J., Garson O.M., Lopez A.F., Vadas M.A. Interleukin-5 is at 5q31 and is deleted in the 5q-syndrome. // Blood. 1988. Vol. 71(4). P. 1150-1152.

205. Tajima K., Yamakawa M., Inaba Y., Katagiri T., Sasaki H. Cellular localization of interleukin-5 expression in rectal carcinoma with eosinophilia. // Hum. Pathol. 1998. Vol. 29(9). P. 1024-1028.

206. Takada T., Suzuki E, Ishida T., Moriyama H., Ooi H., Hasegawa T., Tsukuda H., Gej'yo F. Polymorphism in RANTES chemokine promoter affects extent of sarcoidosis in a Japanese population. // Tissue Antigens. 2001. Vol. 58(5). P. 293-298.

207. Takatsu K, Tominaga A., Harada N., Mita S., Matsumoto M., Takahashi T., Kikuchi Y., Yamaguchi N. T cell-replacing factor (TRF)/interleukin 5 (IL-5): molecular and functional properties. // Immunol. Rev. 1988. Vol. 102. P. 107-135.

208. Tang C., Rolland J.M., Ward C., Quan B., Walters E.H. IL-5 production by bronchoalveolar lavage and peripheral blood mononuclear cells in asthma and atopy. // Eur. Respir. J. 1997. Vol. 10(3). P. 624-632.

209. Taranenko N.J., Tang K, Allman S.L., Chang L.Y., Chen C.H. II Rapid. Commun. Mass Spectrom. 1994. Vol. 8. P. 1001-1006.

210. Tattersfield A.E., Hall I.P. Are beta2-adrenoceptor polymorphisms important in asthma-an unravelling story. // Lancet. 2004. Vol. 364(9444). P. 1464-1466.

211. Tattersfield A. E., Knox A. J., Britton J.R., Hall LP. Asthma. //Lancet. 2002. Vol. 360(9342). P. 1313-1322.

212. Temann U.A., Ray P., Flavell R.A. Pulmonary overexpression of IL-9 induces Th2 cytokine expression, leading to immune pathology. // J. Clin. Invest. 2002. Vol. 109(1). P. 29-39.

213. Teran L.M., Noso N., Carroll M., Davies D.E., Holgate S„ Schroder J.M. Eosinophil recruitment following allergen challenge is associated with the release of the chemokine RANTES into asthmatic airways. //J. Immunol. 1996. Vol. 157(4). P. 1806-1812.

214. Terwilliger J.D., Ott J. Handbook of human genetic linkage. // Baltimor: John Hopkins University Press, 1994.

215. Vercelli D. Discovering susceptibility genes for asthma and allergy. // Nat. Rev. Immunol. 2008. Vol. 8(3). P.69-82.

216. Vercelli D. Genetic polymorphism in allergy and asthma. // Curr. Opin. Immunol. 2003. Vol. 15(6). P. 609-613.

217. Vignola A.M., Mirabella F., Costanzo G., Di Giorgi R., Gjomarkaj M., Bellia V, Bonsignore G. Airway remodeling in asthma. // Chest. 2003. Vol. 123. P. 417-422.

218. Vogel S.N., FitzgeraldK.A., Fenton M.J. TLRs: differential adapter utilization by toll-like receptors mediates TLR-specific patterns of gene expression. // Mol. Interv. 2003. Vol. 3(8). P. 466-477.

219. Walley A.J., Chavanas S., Moffatt M.F., Esnouf R.M., Ubhi B., Lawrence R., Wong K, Abecasis G.R., Jones E.Y., Harper J.I., Hovnanian A., Cookson WO. Genepolymorphism in Netherton and common atopic disease. // Nat. Genet. 2001. Vol. 29(2). P. 175-178.

220. Wang M., Xing Z.M., Lu C., Ma Y.X., Yu D.L., Yan Z., Wang S.W., Yu L.S. A common IL-13 Argl30Gln single nucleotide polymorphism among Chinese atopy patients with allergic rhinitis. // Hum. Genet. 2003. Vol. 113(5). P. 387-390.

221. Wang T.N., Chiang W, Tseng H.I., Chu Y.T., Chen W.Y., Shih N.H., Ko Y.C. The polymorphisms of Eotaxin 1 and CCR3 genes influence on serum IgE, Eotaxin levels and mild asthmatic children in Taiwan. // Allergy. 2007. Vol. 62(10). P. 1125-1130.

222. Weiss S.T. Eat dirt—the hygiene hypothesis and allergic diseases. // N. Engl. J. Med. 2002. Vol. 347(12). P. 930-931.

223. Wells T.N., Proudfoot A.E., Power C.A. Chemokine receptors and their role in leukocyte activation. // Immunol. Lett. 1999. Vol. 65(1-2). P. 35-40.

224. White M.V., Yoshimura T., Hook W, Kaliner M.A., Leonard E.J. Neutrophil attractant/activation protein-1 (NAP-1) causes human basophil histamine release. // Immunol. Lett. 1989. Vol. 22(2). P. 151-154.

225. Wiesch D.G., Meyers D.A., Bleecker E.R. Genetics of asthma. // J. Allergy Clin. Immunol. 1999. Vol. 104(5). P. 895-901.

226. Wright S.D., Ramos R.A., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Mathison J.C. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. // Science. 1990. Vol. 249(4975). P. 1431-1433.

227. WuB., LiuJ.L., Chen M., Deng R.Q., Wu D. Correlation of interleukin-13 gene-1112C/T polymorphism with asthma and total plasma IgE levels. // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2004. Vol. 27(10). P. 668-671.

228. Wu K.J., StedingA., Becker C.H. // Rapid Commun. Mass Spectrom. 1993. Vol. 7. P. 142-146.

229. Xu J., Postma D.S., Howard T.D., Koppelman G.H., Zheng S.L., Stine O.C., Bleecker E.R., Meyers D.A. Major genes regulating total serum immunoglobulin E levels in families with asthma. // Am. J. Hum. Genet. 2000. Vol. 67(5). P. 1163-1173.

230. Yamada R., Ymamoto K. Recent findings on genes associated with inflammatory disease. //Mutat Res. 2005. Vol. 573(1-2). P. 136-151.

231. Yao T.C., Kuo M.L., See L.C., Chen L.C., Yan D.C., Ou L.S., Shaw C.K., Huang J.L. The RANTES promoter polymorphism: a genetic risk factor for near-fatal asthma in Chinese children. //J. Allergy Clin. Immunol. 2003. Vol. 111(6). P. 1285-1292.

232. Zimmermann N. Dougherty B.L., Stark J.M., Rothenberg M.E. Molecular analysis of CCR-3 events in eosinophilic cells. // J. Immunol. 2000. Vol. 164(2). P. 10551064.

233. Zurawski S.M., Vega FJr., Huyghe B., Zurawski G. Receptors for interleukin-13 and interleukin-4 are complex and share a novel component that functions in signal transduction. // EMBOJ. 1993. Vol. 12(7). P. 2663-2670.

234. Zuyderduyn S., Hiemstra P.S., Rabe K.F. TGF-beta differentially regulates TH2 cytokine-induced eotaxin and eotaxin-3 release by human airway smooth muscle cells. // J. Allergy Clin. Immunol. 2004. Vol. 114(4). P. 791-798.