Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение функционирования генов гомосеринкиназы и треонинсинтетазы, изолированных из треонинового оперона Е. coli, под контролем про- и эукариотических регуляторов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение функционирования генов гомосеринкиназы и треонинсинтетазы, изолированных из треонинового оперона Е. coli, под контролем про- и эукариотических регуляторов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

На правах рукописи УДК 578.832.1:577:213:3

МАНУЧАРЯН КАРЕН ГРИШАЕВИЧ

Изуч&ние функционирования генов гоиосеринкинаэы и треонинсинтетазы, изолированных из треонинового оперона Е. coli, под контролем про- и эукариотических'. регуляторов '

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени ' кандидата биологических наук

Ереван- 19S1

Работа выполнена в Институте молекулярной генетики АН СССР в отделе пекулярной эыбриогенетнки и клеточной дифференцировки.

Научный руководитель - лауреат Государственной премии СССР,

доктор биологических наук, профессор К.Г.Газарян.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Г.А.Ланосян,

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник А.Г.Нарсаданян

Ведущая организация - Институт экспериментальной

биологии АН Армении '

с? с;

Защита состоится " " ^cjiZ Sr 1991г. b^Z часов на заседании специализированного совета Д 005.15.01 при Институте боихиыии АН Армении ( '375044, Ере*ан-44, ул. П.Сь-вака, 5/1 ).

С диссертацией цожно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН Армении.

Автореферат разослан , г.

Ученый секретарь спецсовета доктор биологических наук,'

профессор А.Л.Сыиоиян

Гьеяение

Актуальность проблемы. Современная молекулярная биология и молекулярная генетшса достигла больших успехов в выяснении мена- ■ киэыов функционирования генетического аппарата и роди генов в обеспечении жизнедеятельности клеток и организмов. Изучены многие* процессы клеточной дифференцировки, индивидуального развития и их патологии. Но гораздо меньше, изучена роль генов в обеспечении устойчивого и сбалансированного обмена веществ. Метаболизм аминокислот - важнейшая часть этих процессов, так как аминокислоте являются не только компонентами белков, но выполняют много других, в частности, энергетических, регуляторных и др. функций. Белки есеа организмов - прокариот, эукэриот сотоят из одинакового небора аминокислот, которые синтезируются в результате сложных химических реакция. У прокариот в норме все аминокислоты синтезируются клеткой, и лишь мутации в каких-то генах делает их ауксотрофами. В ходе эволюции почему-то клетки алвотных стали естественными ауксотрофами по ряду ашно;тслот, получивших название незаменимых. Причина атого неясна. Почему часть ашно!Сислот у высших животных синтезируется, а синтез некоторых прекратился. Это явление имеет какое-то пока невыясненное биологическое значение, которое заинтересовало нас. Мы поставили перед собой задачу "исправить" этот "недостаток" животных . - заставить клетки животных приобрести способность к синтезу треонина - одной из важнейших незаменимых аминокислот. В опытах с животными ужа перенесены несколько сотен генов и большинство их функционировали в клетках животных. Это гоЕорит о принципиальной возможности решения такой проблемы.

Цель работы. Цель работы заключалась в выделении генов, атвегстгенных за синтео треонина в Е. соИ, подборе к ним регуляторных элеигнтоа, исследовании функционирования полученных конструкций и подготовке зтих генов для переноса в культуру клеток и в зиготы »тотних.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Для осуществления синтеза треонина в ¡спепсак животных нами были изолированы не только гены 1ИгВ и ШС, но и был впервые сконструировал слитный ген Ми ВС, обладающий одновременно гоиосеринкиназной и треонинсингазной .активностями. Нами впервые показана принципиапь-

нач с- ^'ложность осуществления синтеза треонина в клетках животных путем ^ведения в культуру клеток бактериальных генов. Этот резулът. свидетельствует о возможности слияния метаболических путей прокари* .и эукариот, которая помимо очевидного фундаментального значения, и| важное практическое значение, так как наши результаты позволяют ' . прямо начать эксперименты с целью получения трансгенных животных, способных синтезировать треонин.

Об'ьем и структура работы. Диссертация содержит введение, обзор литературы, изложение методов, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы, который-содержит 105 ссылок. Работа изложена на 82 страницах машинописного текста, иллюстрирова 9 рисунками и 4 таблицами.

Апробация работы. Материалы диссертации были,доложены на семинаре отдела молекулярной вмбрпогенетики и клеточной дифференци-рорки ИМГ .14 СССР 1.1 £>.90 г., международный рабочем совещании "Трансгеноз у животных; фундаментальные и прикладные.аспекты", (г. Раздан, 9-12 октября,- 1983 г. >.

МАТЕРШ® И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные и полученные нами, укаэань' в таблице 1 и в таблице'5?.

Для роста клеток использовали бульон Хоттинг^ра с добавками ампициллина. При отборе клонов, содержащих гибридные плазмиды, использовали агар.Мак-Конкй. Для изучения комплементации мутаций в И^гВ и ЬЬгС использовали ьгаризованную среду МЗ /Миллер Дж., 1976/, для выращивания биомассы клеток использовали жидкую среду М9 с соответствующими добавками-ампициллина и необходимых ьшнокис

При конструировании плаамид использовали рестриктазы ВатН1, ВеШ, ЕсоРЛ, НтсШ, НгпсШТ, РяИ, Р'/и!I, К£а1. 5ае'ЛНтП и лигаэу фага Т4, полученные из НПО "Ф?рмент" (Вильнюс). Для клонирования фрагментов ДНК применяли стандартны; методы, описанные Маниатисом и соавт. /Маниатис Т., и др:> 1084/. Клонировали с помощью векторов рТ219, Ш3тр8, рКГ>Т10 Г'РЬш шсга") и рЗК

Таблица I

Штаыыы ЕасЬег1сМ а оо11 и плнзннди

Штаым или плазыида

Генотип

Источник или лит,ссылка

С600 ьъгъюгз 1ви гее во фэей культуры ДОГ АН СССР

71527 «1гС 11уа527 ВКГШ*

В7 еирВ го1А «

71527-7 та537(рта7) и _

ТС1 К12 <1 /1еи-рго/ ¿арЕ получен от (ЯЪаоп 3?. (США)

thihstdq])5/P,tгв056 ргоА»

В+1ас1чч 1асг «1Ш.5

К1-1 ТСКрИ^З) получен от 0.А.Родионова (Институт ВКИИгенагика)

ЪЪ700 С600(рКН2) данная работа

1Л701 С600(рКИ5) __ п

12702 Т1527(рКМ5) Г)

Ь2?03 У1527(рКИ2) _ " _

12704 С600(рКМ7) — и -

12705 Т1527(рКИ7) _ »

12707 У152?(рККб) п

12708 СбОО(рКИб) - " -

12709 С600(рЮ19) п

рта? Атр ЪЬгАВС /б/

ртв^з Атр получена от 0,А.Родионова

рКМ2 Атр thгB данная работа . _ и _

рКМ5 Атр №гС л

рКИ5 Аир thгБG - " -

Ш17 Атр ШгВС — " —

рКИ9 Атр ^гВ

х Всесоюзная коллекции прошил енних микроорганизмов, Москва.

Таблица 2

Плазмиды с генами ЬЬг оперона

Плаамида Генотип Источник

рККЕ2 Ашр ШгВ пoj.yчeнa наш

рКМ35 Ашр Те1 ИтгВ ~ " -

рКМбО Атр ТеЬ 11тгВ - " -

рКМ62 Ашр ТеЬ 11тгС - " -

РКМ38 Ашр Те1 ЬЬгС - " -

рКМ55 Аир Те1 ШгВС • - " -

рКМЗ Агор Те1 thrB0 - " -

рШ-4К Кг)1 РЬапгас1а

рКБУЮ Атр Те1 РЬ&гта^аа

рМПО Ашр Те1 • получена нами

рМГЕро Атр Еро получена от Крамаровой

(НИИ Мед Биотехнологии. Ю СССР, Москва)

В табл. £ представлены плазмиды, где гены сЬгВ, ЬЬгС и ЬЫВС подставлены под контроль промоторов МГ и 5У40 (см. Результаты и , ' обсуждение).

("Stratagem") Дня элюции ЦИК из агароэнсго геля испольйоиали легкоплавкую агарозу фирмы "Bio-Rad", США. В качества источника геноо гснользовали плазмиду pYN7 /Дебабов В., и др., 1981/, причем известно, что ген thrA кодирует. нечувствительный к иигибированив треонином бифункциональный Формемт АК1-ГД1.

(Определение• нуклеотидной последовательное!и проводили по иьтсду Сенгера с соавторами /Sariger F., et al., 1977/. Использовали набор реактивов для секвенирования фирмы "Pharmacia P-L Bioctonicals Ire" (США-Швеция). Все процедуры проводили согласно разработкам атой же Фирмы.

Определение активности гомосеринкинаэы проводили по модифнциро валкой нами методике, описанной о литературе /Miyaj im R., and Shiio I., 1972; Theze J., et al., 1974; Burr В., 1970/.

При определении активности треонинсинтаэц основывались на методике списанной в работе Saint-Girons и Margarita /Sair.t-Gircnsl. , and M-j-gar ira D.. !Ги'5/. фосфогоыосерин, синтезированный химический путем, был получен от Зайцева Д.А. (ИКГ АН СССР).

Плазмидную ДИК выделяли по методу Blrnboirn Н. и Doly J. /Birnboim Н., ana Doly J., 1979/. Очистку ДИК проводили с помошью осаждения поли;лиленгликолем 6000.

КотршюФсрмашш клеток китайского хомячка (CÜO) ТК~ линий проводили чаш о лрииеняеши методом, когда клетки обрабатываются капьцийфосфатным преципитатои ДНК. ДИК бш!а заранее очищена центрифугированием в градиенте плотности СсС1.

Мэчекие белков проводили добавлением ['Ulmet в растущую культуру в концентрации 100 мкКи на 1 ил среди. Введение метки проводили ь течение 2-1 часов.

Гидролиз белков, дчя хроиатографическего анализа аминокислот на пластинках 13i 1шо 1 UV254 "Serva" (ФРГ), проводили с использованием протеьсы фирмы "Sigua" (США).

РЕЗУЛЬТАТА И ИХ ОБСУЭДЕНИЕ

Для решении поставленной перед наци авдечи, наии на первом этапе работы были сконструированы плазмиды, несушце гены треонино вого еперона Е. coli. Схема конструирования этих плазшд представ-

лена на рис. 1. Источником генов была плазмида рУМ7 /'До.бабоа В., и -.др., 1981/, которая содержала целиком треониновый ся^'-ртн, причем известно, что первый ген оперона, ЛНгА, .кодиоует нс-чувстпительный' ; к ииг'ибиро»заз1ил треонином' бифункциональный фермент аспартаткиназу I-гоыосерип: -ицрогенаэу I (АК1-ГДР.

' В процессе1 конструирования пл&зиид мы проверили стыки с точка*' лигирования фрагментов ДНК секвенированием. Второй по очередности' транскрипции ген треонинового оперона, ЬЬхВ, который кодирует фермент гомосеринкиназу СТО,- был проклонирова'н в составе вектора рТг19. Полученная плазмида содержит 80? п.н. 3' конца и1гА, полностью 11чгВ и 113 п.н. 5' конца третьего гена и

составе оперона, которой кодирует фермент треонинсингетазу (ТС). После секвенироеания участка ДНК & рКМ1 оказалось, что в 1Нг А имеется замена нуклеотида.. Обнару» энная мутация представляет собой точечную муаацию и находится в положении 1657 от стартового кодона Ш-А (см. рис. 2 и рис. 3). В этом положении .нуклеотид А оказался замененным на нуклеотид В, что в свою очередь•приводит к замене аминокислотного остатка эспарагина на остаток асларагшювои кислоты. Этот 4>акт представляется важным,. гак как может объяснить, почему ыутантная АК1-ГД1, - кодируемая рУМ7, нечувствительная к инги-бироЕанию треонином. По всей видимости, нами обнаружена мутация,

РНО НЕ УАЬ А5Н СУБ ТИН 5ЕН .

5' 3-

ССБ 6ТС- АТТ БТТ ААС ТСС АСТ ТСС А(1и

1645 [ О) АО . '1671

Рис. 2. Мутация в гене иг А.

которая ранее была описана в ряде работ /Коын Ж.. 1Ь67, СахгЛ-^гопз I., 1975, Гусятинер М., 1978./. Данная мутация била использована авторши для создания штаммов - продуцентов треонина.

Полученные в результате клонирования гышамиди с генами Ш'Г> и Ы-1ГС представлены в таблице 1. Все гены находятся под промотором

Рис. i • C'Aíhíu ¡íc!';:iруи^сь:-ам:1 ш;елияд с генаш tnr orf-рон'л ион 1 кздгрэлен За с промотора. Условия о'Зсчиачэши сгетриктоз i - ß-ЫИ; Ííg-Bglll; R-í'coRI; lill-ilintill; ¡IJl'l-HUvJllí; P-PsLl; Pv-PvuII; Ssr-Smal; Kp-Kpnl; Rs-feal; S-SalGl;

3p-5phl; X-^L

Лас оперона F. coli. Плазмиды рКМ2, pKf/i22 содержат 28 п.н. 3' кон ца thrA и thrD без 13 п.н. с 3' конца гена, только в рКМ22 thrB "имеет обратную ориентацию к lac промотору. рКМэ содержит полность thrC вместе с терминирующей областью оперона и фрагмент 3' конца thrB размером 13 п.н.. рКШ содержит 5? п.н. 3' конца thrA, цели-• том thrB и 113 п.н. 5' области thrC,

Для решения поставленной перед нами задачи - попытки окспрес сировать треониновые гены в система:; эукариот, мы решили слить ге ьы thrB и thrC. Это делалось для более успеиного решения задачи экспрессии наших генов, так как вероятность экспрессии одновремен | но'двух генов в клетках эукариот мала по сравнению со случаем, - когда в клетку вводится объединенный ген thrBC. С отой целью нами i были сконструированы плазмиды рКМЗ и рКМЛ Они содержат слитий 1 ген thrBC. в котором удалены нуклеотидные последовательности с 3' конца thrB и 5' конца thrC, вместе с терминирующим и инициирующем кодонами. После проверки рамки считывания оказалось, что в рКШ она нарушена для thrC. Для восстановления рамки считывания между, thrB и thrC был вставлен фрагмент ДНК из полилинкера вектора М13шр8 размером 28 п.н. и был получен pKf.fr\

После получения вышеперечисленных конструкций были проведены ; эксперименты по комплементацноннсму тестированию'с целью вняснаш ■ способности функционирования проклонировачных генов. Полученные 'плазмиды были перенесены в штаммы Е. coli С600 и VL.527. которые 'иутантны по генам thrb и tlirC. соответственно (см. табл.1).

Kalt видно из таблицы 3,- мутацию по thrB в штамме С600 комплементируют все плазмиды, содержащие thrB и lluBU. тогда как случае трансформации этого штамма плазмидой рКШ, содержащей thrC был получен отрицательный результат. На-таблицы видно так;ке. что комплементация имеет место с плазмидами рКШ и pIM7, которые содержат слитные гены thrBC, хотя в рКМЗ, в отличие от pKi.fr, нарушена рамка считывания для thrC. В случае с рКМо, скорее всего, происходит терминация трансляции, так как в результате сдвига образу ются нонсенс кодоны, первый из которых иозникает уже на расотсяни 10 п.н. от 5' конца thrC, но это не оказывает влияния на проявление ГК активности продуктом экспрессии UirB. Что каеаотсл рКМТ, т 'происходит нормальная трансляция и обраэоыавшийса (fc>noie проявляет

Таблица 3.

Комплемен,ay:.-, мутаций tluB и ttiiO в штаммах t. coli, содержали:; сконструированные гнтмиды с различными {•рннж'-нтаыи треонинового олерона

Плаомиды

Трансформируемы^ ¡KM,: pKHJ рКМ5 рКМ5 рКМГ рКМЕЯ

штаммы nj-.i-E) CthrB) :thrC) (thrBC) fthrF-O) (th».B<

C600 (ThiE ' f t + ч +

YL527 (ThrC ■ + +

ГК активность.

Как видно из чай ¿uf* таблицы 3. мутацию в VL527 комллементиру-ет рШ5, содерлсавдя целиком thrO и терминирующую область оперена, и рИМТ, содержимая слит tart ген tin ВО с ьосстановленной рамкой считывания thiC. Зтот факт свидетельствует о том, что образовавшийся а результате акспрессии слитого гена белок проявляет не только ГК, но и ТС актиЕность. Что ¡«асается плазмид рКШ, рИШ и рKÎ4Z2, которые содержат thrB, то они в этом итамие дали отрицательный результат при тестировании на комплементацию мутации, что соответствует омщаечому. Пол; чанный отрицательный результат после трансформации VL527 п^азмидой рКМб подтверждает предположение, что в результате сдвига рамки происходит терминация трансляции в начале thrC.

Продет.тйлаосн интересным тот факт, что мутацию в штамме С600 комплементируе? pKt.t'ï.', которая содержит thrB в обратной ориентации к 1ас промотору. Очевидно, что в данном случай считывание генной последовательности происходит не с 1ас промотора, а с какого-то .-. ■ *

- IQ. -

внутреннего промотора, -. скорее всего промотора, о котором сообщается в рас.' о Saint-Girons и Margarita /Saint-Girons I., and Margarita 1985/. Цитируемые авторы показали, что внутренний, промотор, названный ими thrBp, расположен в 3' конце thrA, где в 'участке.'ДНК, размером 61 п.н., показали наличие двух вероятных сайтов связывания для РНК-полимеразы. В pKMf'S мы оставили на 3' конце ttirA не 61 п.н., а 28 п.н., что говорит о том, что ути 28 п достаточны для инициации транскрипции thrB (см. рис. 4>. Очевидно также, что наличие ящика Прибнова и соответствующего сайта связывания с рибосомой достаточно для обеспечения экспрессии thrB по крайней мере на минимальном уровне.

PvU II

А С A G ü Т G С С G 6 Т G Т С 1 1Ü ■

TTTGCTGATCTGCTA

20 . 30-

' - RSal ■ ' '

С G I А О С С I С Т С А I ß G

40 .

AA6TTAGÜAÜTÜ Г G А 50 sd * * *■

CA IG

thr В Рис. 4

На рисунке изображена нукяеотияна»! псследоичт» -лыкхл ь Фрагмл-64 П.Н. на 3' 1сонце thrA. Подчеркнуты две вероятные промоторные с ласти. Sd - сайт связывания с рибосомой.

Таблица. 4

ФЕРМЕНТАТИЕНАЯ АКТИВНОСТЬ ГК И ТС

Игами

Гени! ип Плазмида

Удельная акгивность

Гомосерин-киинза

'1'реноин-синтоэа

В7 Прототрэф нет 0.0

С600 • 1ЬгВ нет 0.0

С600 ШБ рккеангв) м.а

С600 и-,гВ рКМ5Щ-»гС) 0 0

С600 И1ГВ рШ'ШиВС) 7.0

даю КцБ рКШСШВС! 12.0

УЬ527 1ЬгС рКМ5и1тгС1 0.085

У1.527 l-.hr С рК№Ш1гВ1 0.00

УЬ527 1ЬгС рКШШи-ВС) 0.00

УЬ527 иигС рШГ(1ЬгВС) 0.064

рис.3. Авторадиограмма с

нуклеотидной последовательностью фрагмента ДНК,где обнаружена мутация.Стрелкой обозначено ыесто замесы нуклеотада (сы.рис.2)

"да

Ае.

С л т с

Следурщ^м зтапом aiiaiutaa функций поиучъинш. конструкций были експеримеьг. пЬ определению фермен'^&ттимй &чтие-пссти продуктов, экспрессия Haüiix генов.

Полученные результаты представлены в табл. 4. Из таблицы видно, что полученные результаты хорошо согласуются с выводами, сде-' ланными на основании экспериментов по генетической комплементации. Они показывают, что ГК активность отсутствует в самом шташе С600 и в, этом же штамме, трансформированном рКМ5, содержащей пен thrü. Уровень ГК активности у прототрофного штамма В? в 20 раз ниай, чем в случае, когда ыутантный штамм тршсформчроган Ш1.-13кидами, несущими thrB. Эта разница в уровнях «илиьност к,хорошо согласуется с тем, что коплйность плазмидных вектороь, куда ¡стройны наши гены,. обеспечивает амплификацию плазмид до :'4 копий ш. йактериальную хромосому. Сам факт, что в результате ^kci ipe-'сип рКМ2 мы сбнаружи-вали функционально активный фермент, свидетельствует о том, что последние 13 п.н. на 3' конце Ihr В но иг раю v роли а с-бр'йовании • активной формы белка.

■Из полученных результатов следует также, что thrB в pKML', с делецией 13 п.н. на 3' конце гена и,вставкой фрагмента на '.18 т.н. на 3' конце thrA, показывает уровень ГК активности, ксории сравним с активностью, этого фермента в случае трансформации ('600-плаз-мидаыи рКМб и pK,W. Это означает, что полученная нами конструкция со слитым геном thrBC образует продукт экспрессии, который проявляет 'функциональную активность на уроьье а^пшнос-ш фермента. продуцируемого изолированным thrB.

'. Для завершения тестирования функционировали.-! получениях конструкций в клетках Е. coli проводили опыты но определения! ГС активности. Надо сказать, что известны лишь единичные сообаичия, гм« авторы показывали наличие ферментативной активности ТС - фер-мента,. который превращает фосфогомоснрин п треонин, замыкай цепь 5-стадийной реакции, ведущей к-образованию треопина из асиартата г клетках Е. coli.

Полученные нами."результаты представлены в таблица 4. Видно, что рКМБ, которая содержит целиком t.hrC, и р!М\ содержащая слитный ген thrBC, показывают одинаковый уровень ТС ак/иьности. Псе • дедняя аотивность не обнарулина в случае'транс-формации V1.527 плаз-цидой рНМг, несущей ген thrB, что и ожидалось. Что касается отри-

цательного результата опытов с pKMû. то здесь, очевидно, происхо- . дит терминация трансляции thrC ввиду сдвига 'раыки считывания, о чей ш у азе говорили.

Иг ait. биохимическое определение ГК и ТС активности продуктов з!сспрессии наших конструкций показало, что изолированные гены тро- -онинсвого олерона под контролем lac промотора функционально активны, а в результате сконструированного нами слитого гена thrBO появляется белок, который обладает одновременно и ГК и ТС активнсс-тяни. Это дало нам возможность использовать комбинированный пен thrBC в дальнейших опыих по транс,?ормации культивируемых клеток глвотных и переносу утих ге:юв в зиготы для получения трансгенных «ивотных.

Следующим этапом нашей работы было конструирование плазмид с вышеописанными генами треонинового оперона для их переноса в клет-•ци йивотных. С этой целью ны осуществили клонирование наших генов в составе оукариотичмжого вектора pKSVIO ("Pharrracia"). В атом векторе находи-ся проштор ранних генов вируса SV40, соотзетствую-1ций стоп сигнал и сигнал полиаденилирования. Схема конструирования плазмид представлена на рисунке 5. Была получена серия плазмид ' (рКШ, рКШО, рКШ2), где гены thrB, thrBC находятся под контролем промотора SV40. Получены таю» плаамнди, где наши гены имеют обратную ориентацию к промотору.

Для получения конструкция с другим эукариотическии промотором, прснотором шталяотиониксзсго гена иыши (МГ), наш была заменена проиоторнйя часть pKSVIO, размером 1.5 т.п.н.. на промотор (В00 п.п.). В результате t-.u получили новый вектор, рИП0, где сохранены ijc-i ег.ементы pKSViO за исключением промоторной области. В результате была пслуч.-на еще одна серия плазмид (рКМ35, рКШ8, pKΣ5'i, опять с г-гриап'ныи, где гены обратно ориентированы к про- • мотору ? fi'.

После получения вьпиеназванных плазмид, уж> можно было переходить к экспериментам но переносу генов в клетки эукяриот.

В ТК'клеткл китьйасого хомячка (СНО) методом обработки клеток кальцийфсзфдтнцм преципитатси ЛИК были введены гены thrC, thrBC совиесшо с пеней тииидинкикааы СТК). В результате котранс-Формании посла отбора isichob на солектиыюй среде било получено около 50 клен 5а, из вторых н;ши били анализированы. Известно, что почти 100 % генов, введенных с определяющий селектирукш.;ий фак-

р 5 а к

и

ЩК/Ч' &

"Тс-Г

К. -'Л".0

Рис. 5. Схема конструирования с 1пг он- ¡го п пг.д

контролем промоторов ЬУ-¡и а М1. Ус^кдии" обозначении рестриктао - В-ВокШ; К,'-Ь.:111; 1. !л:о!.1, :И1-1т»Л1; Р-рь-11; Ру-РччШ; йя-БнгЛ;' КгИ 1:1- Еа-К.:п1; Я За! 31; : 5р-3рй1; Х )фа1:

тор геном, оказываются с трансформированные клетках /Глсбоа С. . 1989/. Наши эксперименты подтвердили эту закономерность. но для нас было неожиданным, что в 80 % обобранных наш клонах кьблызапся ожидаемый эффект. Еще более неожиданны« представляется, что положительный результат получен не только при трансформации клеток слитым геном ичгВС. но и с геном и»гС.

Результаты -.экспериментов показаны на двух рисунка (см. рис. 5 и рис. У). На рис. 6 изображена хроматограмма, полученная после гидролиза белков из кленов культура С[Ю после кетрансфсрмации 1ЬгВС. Е'идно, что во всех случаях, кроме соответствующего меченого тритием метионина, проявляется пятно, соответствующее треонину. Эти результаты говорят о том, что в анализировашых нами клонах происходит превращение гомосерина в треонин, после введения в клетки СНО гена г:КгВС, кодирующего белок. обладающий "К и ТС активностями. Делать какие-то количественные оценки этих результатов трудно, так как полученный нами результат соответствует, скорее всего, пороговым значениям, если учесть, что количество йа-лизируемсгс. белка ограничено возможностями хроматографии, гидролиз белков происходит не до конца и. наконец, образовавшийся треонин не еч-сь включается в белки. Только с учетом перечисленных факторов можно интерпретировать полученные результаты.

На рис. У первые 3 дорожки соответствуют клонам, полученным после перекоса в клетки плазмиды рКШ, где ИчгВС находится под контролем оУ40 промотора, а две последние дорожки на хроматограы-ме показывают результаты котрансформации с рКМб2, несущей Ш"С. Положительный результат с рКМ52 говорит о том, что в клетках СНО каким-то сгюсоиим мож^т быть происходит фосфорилирование гомосерина, который является субстратом для ГК. На рисунках не показан результат контрольного опыта, когда клетки инкубировались в присутствии Г3ИЗ метионина. после трансформации только ТК геном, и на хроматогрзмме получали только пятно с меченым метионином.

Следует сказать, что важным фактором, влияющим на количество образовнн-пигое,! треонина, является внутриклеточный пул гомосерина у животных. Исходя из теоретических посылок, можно думать, что количество непосредственного предшественника треонина, гомосерина. в кле;как невелико /Ппке^е^п .1., апс! МагИп 1986/, что связано с тем. что он не входит в состав пищевого белка и яв-

г .

г К

Г Щ":

-С Г .Г "ЛЙ' ' г-

1 г 3

4 5

Рис. 6. Радио/двюграо) хро«?.тограымы продукте!; гидролиза белков из трансформированных клеток С'НО ТК" .ышии. 1 - [Щ]|пе'1 + LJH3t.hr; 2'- 13НШ)|-; и - [*Ште1:; 4, Б, 6 - пробы гидролизатов белков из трансформированных плазмидой рШЗ (слитый ген Ни ВС) клеток.

Fue. 7. Радиоавтограф хроматограыны продукта; гпаролизи белков И' трансформированных клеток СИО ТК" линии. 1,2,3 - ирсйм гилроли^атои белков из т|>аисфйрыи|юыанны¥ плаамидой рККЗ (слишй г-ж tin ЕЮ) 1Ш"Гок 4,5 - npofiu гидролийатон белков из трпнсфоршфсьаннын плаамидой р1СШ2 (ген МцП) клеток.

ляется промежуточным продуктом.

Полученные нами результаты говорят о том, что перенос бак- -тсриального участка обмена (синтез теронина) не вызвало серьезных «.рушений в естественных процессах обмена в клетках животных с участием метионина и гомосерина.

Полученные результаты можно рассматривать как в какой-то смысле предварительные, так как очевидно, что полученные клоны требуют дальнейшего тщательного анализа. Пока совершенно не ясны механизмы, с помощью которых произошло предполагаемое слияние метаболических путей Е. coli и эукариотических клеток. Вылб бы интересно, например, провести функциональное тестирование полученных клонов с использованием синтетических средств для роста, из которых будет исключен треонин. Такие опыты нами уже проводятся.

Были также подготовлены конструкции с-геном thrBC для микроинъекции в зиготы мышеи, где гены тоеонинового оперона, подставленные под контроль МТ промотора.

Так как введенная в зиготы ДНК более эффективно внедряется в (клетки в линейной форме, чем в кольцевой, мы с помощью сайта Kpnl линеаризовали выше перечисленные плазмиды. В работе Brinster., /Brinster R., et al., 1982/ показано, что фрагмент ДНК размером 90 л.н. до старта Ш промотора. представляет собой тот минимальный Фрагмент, ксгорш обеспечивает нормальное функционирование МГ промотора. Так k-jk сайт Kpnl расположен на расстоянии 600 п.н. от точки начача транскрипции. этот сайт удобен для наших целей.

После микроинъокций tt ниготы мш'нй гена < ЬгВС. который находится в ллаамиде ph№5 под конгроН-.*м МГ промотора, родилось 30 мышей, которые в настоящее время анализируются. Предполагается исследовать экспрессию водимы:: гыюь в печени, трапсгенных мышей.

Итак,. в нашей работе впервые ставится задача вмешательства с помощью генной инженерии и переноса генов в биохимический механизм обмена аминокислот. До настоящего времени генно-инженерные манипуляции проводились с генами, которые в основном функционируют в дифференцирующихся клетках, т.е. с тка!^специфическими генами. Крюме них в клетках функционируют гены "домашнего хозяйства" (house keeping ¿ones), которые контролируют основные процессы обмена веществ. Эти процессы в ходе эволюции очень консервативны и мало изменяю!сл. Они во многом, практически

одинаковы и у прокариот и эукариот, т.к. необходимы любой клетке для существования. Эти процессы очень скоррелированы друг с . другом и любое их нарушение ведет к серьезным, часто летальным исходам. Возникает вопрос, можно ли изменять установившийся а ходе эволюции тип обмена веществ с помощью генной инженерии. На этот вопрос в литературе ответа пока нет. т.к. таких работ пока не проводилось.

консервативны и мало изменяются. Они во многом, практически одинаковы и у прокариот и эукариот, т.к. необходимы любой клетке для существования. Эти процессы очень скоррелировани друг с другом и любое их нарушение ведет к серьезным, часто летальным исходам. Возникает вопрос, можно ли изменять установившийся в ходе эволюции тип обмена веществ с помощью генной инженерии. На втот вопрос в литературе ответа пока нет, т.к. тйкйх работ пока не проводилось.

Мы избрали в качестве модели для решения такой эадачи синтез незаменимых аминокислот. Эта модель очень интересна, так как сейчас пока неясно, почему некоторые аминокислоты в ходе эволюции перестали синтезироваться в клетках животных, т.е. они стали ауксотрофиыи по этим аминокислотам. Либо их синтез вошел в противоречие с другими биохимическими процессами, либо энергетически было ьыгодно "отказаться" от их синтеза, либо, наконец, промежуточные продукты их синтеза понадобились для других, более важных, продуктов.

Огвит на поставленные вопросы можно получить только систематическим изучением наличия и уровня активности гомоееринки-назы и треонинсинтазы в ряду низших беспозвоночных и позвоночных животных.

Более кардинальным подходом для решения вопроса о причинах отсутствия синтеза незаменимых аминокислот у животных является генная инженерия. Однако, дело осложняется тем, что обычно в клетки Л1г,отных удается переносить одиночные гены, а в синтеза аиинокислот участвует много генов. В случае треонина ситуация благоприятная потому, что из 5 ферментативных регмщий в ¡глет ках животных присутствуют те, которые приводят к синтезу гоио-серина и Нехьа5 вот нить двух рейший. Из »¡их одна - реакция фосфорилпроьанид, вторая - превращения <{осфо! сносеринэ в треонин.

Гены STtfK двух ферментов присутствуют в треониновом опероне. Е, cal ■ , В своей работе мы на ставили перед собой цель решения всей эе дачи созданий клеток животных способных синтезировать треонин, . а только - первую часть этой большой проблемы. Но в нашей оабо- " те сделан принципиальный шаг вперед, который делает решаемой sсю проблему в целом. Этот шаг состоит в том, что мы получили Фук., .локально-активный слитчый ген thrBC, который можно переносить в геном животных. Этот ген активен ь бактериальных клетках И, судя по предварительным данным - в клетках млекопитающих, культивируемых in vitro. В последующей работе мы будем решать вторую часть проблемы - получение длительно перевиваемых транс- . формированных клеток и трансгенных животных, синтезирующих треонин. Решение бтой задачи требует много времени и специалистов, работающих с клетками культуры и с трансгенными животными. Решение такой задачи имеет с наш&й точ!си зрения большое научное и. прикладное значение.

Выводи

1. Изолированы гены треониноиого оперона Б. coli thrB и thrO. Показана экспрессия этих генов под контролем 1ас промотора в мутантных ¡тетках Е. coli.

2. Обнаружена мутация в гене thrA, которая приводит к замене аспарагина на ас-паратиповую кислоту в полипептидной цепи, что может быть причиной нечувствительности АК1-ГД1 к ингибиро-ванию треонином.

3. Путем слияния thrB и thrC, сконструирован нсвый (слитный) ген thrBC, где удалены нуклеотидные последовательности в 3' облас thrB и 5' области thrC. Методом генетической комплементации и биохимического анализа показано, что белок, кодируем^ слитным re ном thrBC, обладает как гомосеринкиназной, тач и треонинсинтазной активностями.

4. Сконструированы плаамиды. где UuD,thrC и thrBC подставлены под контроль аукариотичеоких промоторов: ранних геновЗУ40

и гена метаплотионп'на мыши.

5. Проведена котрансформациа культуры клеток хомячка CHÛ

, плазмидаыи, несущими гены -ipövHüHchöj'j знкрсш* и<>л »,->кг,?о}|£к.1 SV40, с ТК геном. Получены kt.ouu, tin;, сбч-зрутано метионина в треонин, как резул-лт/г ¡.чг-пг ес-сии бь« денннх гыап треонинового сперона С. coli.

Список работ, опубликовании но диссни&шм.

1. Манучарян К. Г., Генинг Л. В., fcrevcfta Т. В. К'мс;-ч|'Cu^iiin a изучение отдельных генов треюиин<\е..1. и :-г,ер;;на Е. col i. ■

III конференция молодых учена»; Иистпгу1-а с>«-ч:пэри»е!Г1:лЛ1..:лЧ bi.w • гИИ АН Арм.ССР. Тез. докл. Пиликан. IMiö. cip. 10.

2. Gazaryan К. G., Manuel a; ian K.G.. i'ioruiv I, V. il.i vsiw-t:» u, transfer threonine ger«s of E. сон to auiinal ceils 2C.th ¡i». ! of FEBS. Budapest., Hungary, Au^.i ГГ/-24 1950, p. :':Vr

3. Манучарян К.Г., Генинг tl. II, ¡>;;иикер Ы.tl, I г. Г Конструирование гена, кодпруми-л'с мчля^тиц, ccr.imt'>«<&.vi ]U>i ti и тативные активности гоыосершшиншн и Г i. /! пекулярная генетика, иикроЬигк i ил и пирсам нч i-> •},

с ¿2 1:>