Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных оперонов ячменя

Алейникова, Анастасия Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных оперонов ячменя
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных оперонов ячменя"

На правах рукописи

005045120

Алейникова Анастасия Юрьевна

Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных

оперонов ячменя

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 УАЙ

Москва-2012

005045120

Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва.

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Кузнецов Виктор Васильевич

Официальные оппоненты: Клячко Нелла Леопольдовна,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник,

Лаборатория физиологических и молекулярных механизмов адаптации Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растении

им. К.А. Тимирязева Российской академии наук. Москва, ведущий научный сотрудник,

Ламан Александр Георгиевич,

кандидат химических наук,

Филиал федерапьного государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Пущино, научный сотрудник,

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, Москва.

Защита состоится 19 июня 2012 г. в 11 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 002.210.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук по адресу: 127276, Москва, ул. Ботаническая, 35. Факс: (495) 977 8018, электронная почта: m-azarkovich@ippras.ru; ifr@ippras.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва.

Автореферат разослан « Цо » vXbfr-^ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета кандидат биологических наук

Азаркович Марина Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В 60 годы прошлого века было показано, что хлоропласта являются носителями генетической информации наряду с ядром и митохондриями (Ris, Plaut, 1962; Lyttleton 1962). В ходе эволюции цианобактериального предшественника в эукартиотческой клетке хозяина была утеряна большая часть его генов (Brennicke et al., 1993) и он превратился в полуавтономную клеточную органеллу-хлоропласт (Даниленко, Давыденко, 2003). В пользу наиболее признанной эндосимбиотической теории происхождения хлоропластов говорят данные о кодировании хлоропластным геномом РНК-полимеразы бактериального типа, осуществляющей транскрипцию генов пластома с бактериальных промоторов, а также большое сходство аппарата трансляция хлоропластов и бактерий. (Юрина, Одинцова, 1991). В процессе эволюции хлоропластные гены приобрели некоторые эукариотические черты, такие как наличие интронов и высокая стабильность мРНК (Mayfîeld et al., 1995). Кроме того, транскрипцию хлоропластных генов, наряду с полимеразой собственного кодирования, осуществляет РНК-полимераза, кодируемая ядром и транспортируемая в хлоропласт (Liere et al., 2011). Таким образом, контроль экспрессии хлоропластных генов включает в себя механизмы, характерные, как для прокариот, так и эукариот.

Большинство пластидных генов, по аналогии с генами прокариот, объединены в опероны и транскрибируются с единого промотора. В состав оперонов могут входить гены, кодирующие белки одного функционального комплекса, например, гро оперон, кодирующий три субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа -гроВ/гроС1/гроС2 (Юрина, Одинцова, 1991). Однако чаще всего опероны содержат гены, кодирующие функционально различные белки, которые должны накапливаться в хлоропластах в не равном количестве. Примером может служить оперон, кодирующий RPS2 белок и четыре субъединицы АТФ-синтазного комплекса -rps2/atpI/atpH/atpF/atpA. Субъединица III CF0 комплекса (atpH ген) должна накапливаться в 6-12 раз больше, чем остальные субъединицы. Согласованность экспрессии хлоропластных генов достигается, вероятно, за счет регуляции процесса транскрипции (Lerbs-Mache S., 2010).

Однако, несмотря на большой прогресс в последние годы в изучении

хлоропластной транскрипции, механизмы регуляции транскрипции индивидуальных

(

генов в составе хлоропластных оперонов у высших растений практически не изучены, хотя это исключительно важно для понимания регуляции биогенеза хлоропластов. Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в изучении интенсивности транскрипции генов пластидных оперонов, а также в изучении регуляции их транскрипции под действием различных факторов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

1. Выбрать для анализа гены, входящие в состав основных оперонов пластома ячменя, провести клонирование фрагментов этих генов, оптимизировать основные этапы run-on транскрипции.

2. Исследовать эффект возраста растений на регуляцию транскрипции отдельных генов в составе хлоропластных оперонов с целью выявления участков оперонов наиболее подверженных влиянию изучаемых факторов.

3. Провести детальное изучение интенсивности транскрипции этих участков на зеленых растениях в зависимости от возраста листа, действия АБК и МеЖа, от места локализации хлоропластов на листе, от продолжительности синтеза РНК in vitro, а также исследовать интенсивность транскрипции изучаемых генов на бесхлорофилльном мутанте ячменя albostrians.

4. Выявить возможные причины изменения интенсивности транскрипции генов в пластидных оперонах растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что гены основной транскрипционной единицы хлоропластных геномов высших растений - оперона -могут дифференциально регулироваться на уровне транскрипции. Изучена регуляция транскрипции 7 пластидных оперонов в зеленых растениях ячменя и в белых растениях мутанта ячменя albostrians разными факторами, как эндогенной, так и экзогенной природы. Впервые экспериментально показана терминация транскрипции хлоропластного оперона при помощи гена транспортной РНК, расположенного на комплементарной нити ДНК. Получены новые данные о процессинге хлоропластных оперонов. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов регуляции транскрипции в пластидах высших растений и могут быть использованы для разработки теоретических основ управления продуктивностью растений.

Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на 60 и 61 студенческих научных конференциях РГАУ - МСХА им. К.А. Тимирязева (Москва, 2007-2008), на XV, XVI и XIX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008, 2009, 2012), на Международной конференции «Фитогормоны: молекулярные механизмы действия» (Москва, 2009), на Межинститутском научном молодежном семинаре ИФР РАН «Актуальные проблемы физиологии, молекулярной биологии и биотехнологии растений» (Москва, 2010), на VII Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений-фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из которых 3 в журналах, рекомендованных ВАК. Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, списка сокращений и списка использованной литературы. Диссертационная работа изложена на 212 страницах, содержит 10 таблиц и 63 рисунка. Список цитируемой литературы составляет 253 наименования, из которых 241 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования. Объектом исследования служили первые настоящие листья растений ячменя (далее - первые листья) сорта Луч (Hordeum vulgare L.) разного возраста и 5-дневные белые и зеленые растения мутанта ячменя albostrians (Hordeum vulgare cv 'Haisa', Hess et al., 1993). Ячмень выращивали в почве в камерах фитотрона при 20-23°С, 16-ти часовом световом периоде (270 мкмоль квантов м~2с~'). Возраст растений определяли с момента прорастания семян.

Синтез проб ДНК. Фрагменты пластидной ДНК, используемые в качестве ДНК проб при ДНК-РНК гибридизации, подобраны с применением программы Vector NTI, используя последовательность хлоропластного генома ячменя (Hordeum vulgare L, NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_008590). Пробы выровнены по размеру и ГЦ-составу (табл. 1). Фрагменты ДНК очищены с помощью QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN) и нанесены на нейлоновую мембрану (Hybond-N, GE

Healthcare, США) с помощью прибора для дот-гибридизации (Slot-blot apparatus, BioRad, США).

Выделение хлорогъчастов и проведение run-on транскрипции. Выделяли хлоропласта и проводили run-on транскрипцию по методу, описанному в статье Зубо и Кузнецова (2008). Инкубацию листьев на воде, растворах абсцизовой кислоты (АБК, 7.6 X 10~5 М) или метилжасмоната (МеЖа, 10"4 М) вели в течение 24 часов при постоянном освещении (270 мкмоль квантов м~2с_1). Клеточные органеллы разделяли на ступенчатом градиенте перкола (40%, 70% - для зеленых и 10%, 20%, 70% - для белых растений). Гибридизацию 32Р-меченых РНК, полученных в ходе реакции транскрипции, с фрагментами ДНК, нанесенными на нейлоновую мембрану, проводили в течение ночи при температуре +58°С. В работе использовали фосфоимиджер (Molecular Imager FX, BioRad, США). Обработку данных run-on экспериментов проводили с помощью программ Quantity One и Excel. Эксперименты повторяли не менее 3 раз.

Синтез одноцепочечных проб РНК. Синтез одноцепочечных проб для экспериментов по изучению антисмысловой гибридизации, синтез меченых антисмысловых одноцепочечных РНК, а также меченых одноцепочечных зондов для защиты от РНКаз осуществлялся с помощью набора реактивов MAXIscript® In Vitro Transcription Kit (Applied Biosystems). Матрицей служили фрагменты, полученные ПЦР. Концентрацию ДНК измеряли на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). После синтеза меченые 32Р-РНК элюировали из геля.

Метод защиты от РНК-аз. Выделение РНК проводили из пластид ячменя, используя TRIzol (Invitrogen) реагент, следуя рекомендациям фирмы. Концентрацию РНК определяли на спектрофотометре Nanodrop 1000 (Thermo Scientific). Реакцию проводили с помощью набора реагентов MAXIscript® Kit (Applied Biosystems), следуя инструкции. Равные количества пластидной РНК и антисмыслового синтезированного фрагмента (32Р-УТФ) ко-прецепитировали спиртом. Осадок растворяли в гибридизационном буфере, денатурировали при 95°С и гибридизовали ночь при 42°С. На следующий день непрогибридизовавшуюся РНК гидролизовали смесью РНКаз, а неразрушенные нуклеиновые кислоты осаждали этанолом. Каждую пробу растворяли в буфере для нанесения (Gel Loading Buffer II), денатурировали при 95°С и наносили на полиакриламидный гель.

Все стандартные молекулярно-биологнческие методы (ПЦР, клонирование фрагментов ДНК, электрофорез ДНК и РНК в агарозном и ПААГ, перенос РНК на нейлоновую мембрану, мечение фрагментов ДНК и др.) выполнены, как описано в Маниатис и др. (1984). Быструю амплификацию 3'-концов кДНК (3'RACE) проводили, как описано в статье Zhelyazkova et al. (2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Дифференциальная транскрипция генов в онеронах. Для изучения транскрипции генов в оперонах хлоропластов ячменя, опираясь на данные по организации и экспрессии хлоропластного генома, были выбраны 30 генов, входящих в состав 7 оперонов, среди которых были как опероны с генами только функционально близких белков, так и опероны, гены которых кодируют белки, выполняющие совершенно различную функцию.

Поскольку в ходе развития растений происходит значительное изменение экспрессии пластидного генома (Emanuel et al., 2004), мы изучили, прежде всего, интенсивность транскрипции генов в хлоропластах 4 см фрагмента апикальной части первого листа ячменя 3-дневных проростков (молодой лист), 9-дневных растений (закончивший рост первый лист) и 18-дневных растений (старый первый лист). При столь различном состоянии фотосинтетического аппарата первого листа растений ячменя можно было ожидать изменения интенсивности транскрипции генов выбранных нами оперонов.

Результаты первого этапа работы показали, что гены, объединенные в опероны, могут транскрибироваться равномерно, как например у гроВ-гроС1-гроС2 оперона, гены которого кодируют субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа. Транскрипция генов оперонов может быть дифференциальной, даже для генов функционально однородных белков как у atpI-H-F-A оперона, кодирующих субъединицы АТФ-синтазы. Если же в одном опероне соседствуют гены, кодирующие компоненты различных функциональных групп, то «перепад» интенсивности транскрипции в опероне чаще приходится именно на такие участки. Для детального исследования транскрипции были выбраны 4 оперона: rps2-atpI-atpH-atpF-atpA, atpB-atpE-trnV-intr-ndhC-ndhK-ndhJ, psaA-psaB-rpsl4 и rrnl6-trnI-tmA-rrn23-rrn4,5-5S, где наблюдались «перепады» интенсивности транскрипции, и один оперон (гроВ-гроС1-гроС2), где транскрипция была равномерной.

В предварительных экспериментах установлено, что размер проб и содержание ГЦ пар влияет на интенсивность гибридизации с РНК, поэтому пробы для следующих опытов были выровнены по размеру и ГЦ составу (табл. 1).

Табл. 1. Некоторые характеристики проб, Для гроВ-гроС1-гроС2 оперона было

используемых для гибридизации.

Характеристики

Название оперона гибридизационных проб

Размер, п.н. Содержание ГЦ пар нуклеотидов, %

гроВ 200 38

atpB 100 34-38

rps2 100 28-38

psaA 200 43,0-43,5

rrnl6 200-202 49,5-55,0

подобрано по одной паре праймеров на каждый ген (рис. 1А). Полученные пробы ДНК были секвенированы, количественно выровнены, нанесены на нейлоновую мембрану и гибридизованы с 32-Р-РНК, которые были получены в ходе in vitro транскрипции в лизатах хлоропластов, выделенных из верхнего сегмента первого листа ячменя разного

возраста (см. материалы и методы). Как видно из результатов, приведенных на рис. 1, гроВ, гроС1, гроС2 гены имели довольно равномерную интенсивность транскрипции, которая практически не зависела от возраста растений.

Рис. 1. Влияние возраста растений на интенсивность транскрипции генов гроВ-гроС1-гроС2 оперона. А) Схема гроВ оперона. Гены изображены прямоугольниками. Серые прямоугольники - расположение проб в первой предварительной части экспериментов. Фиолетовыми прямоугольниками изображены 200-нуклеотидные пробы, используемые в гип-оп анализе. Б) Гистограммы интенсивности транскрипции при использовании проб гроВ-гроС1 -гроС2 генов у 3-, 9- и 16-дневных растений ячменя. Внизу гистограмм - названия проб, вверху - возраст растений.

А)

гроВ -- may, ■ 1 rpoCl rpoCZ ...........у,, ... v.-,-

Б)

200 -

100 -I

9 дней

150 100 -50 -т 0

16 дней

гроВ rpoCl гроС2

Равномерная транскрипция генов гроВ оперона была показана также в хлоропластах из апикальной и базальной частей листа из зеленых и белых растений

ячменя albostrians. Обработка апикальной части листа в течение 24 часов при постоянном освещении (270 мкмоль квантов м"2 с"1) растворами - АБК (7.6 х 10"5 М) или МеЖа (10~4 М) не изменяла характер транскрипции. Равномерный синтез РНК in vitro всех генов наблюдался также в ходе реакции транскрипции через 15, 30, 120 и 600 сек. Полученные данные говорят о высокой консервативности транскрипции генов гроВ оперона и, возможно, других оперонов, гены которых кодируют функционально близкие белки.

Более сложное строение имеет alpB оперон (atpB-atpE-trnV-intr-ndhC-ndhK-ndhJ), для которого были подобраны праймеры для девяти проб, выровненных по размеру и ГЦ - составу (табл. 1 и рис. 2А). Эти пробы охватывали зону «перепада» транскрипции: первая проба приходилась на atpE ген, вторая, третья и четвертая - на межгенный спейсер atpE-tmV генов, пятая и шестая - на интрон trnV гена, седьмая и восьмая - на межгенный спейсер tmV-ndhC генов, а девятая - на ndhC ген (рис.2А).

Из результатов, которые были получены на хлоропластах, выделенных из верхнего сегмента первого листа ячменя разного возраста (рис. 2Б), можно заключить, что интенсивность транскрипции с возрастом значительно снижалась, однако не было значимых различий в профиле транскрипции генов этого оперона. В отличие от гроВ оперона, профиль транскрипции генов atpB оперона имеет «перепады». Интенсивность транскрипции при использовании проб, которые приходятся на межгенный спейсер (atpB-2 и atpB-4), была ниже, чем транскрипция белок-кодирующей последовательности atpE гена (atpB-1), однако при применении alpB-З пробы интенсивность транскрипции имела более высокое значение. Для этого региона можно было ожидать увеличение интенсивности транскрипции за счет ее инициации перед trnV геном (Zhelyazkova et al., 2012), однако в этом случае изменение в профиле транскрипции могло бы происходить только начиная с четвертой пробы. Другая возможная причина может заключаться в инициации транскрипции trnM гена, который располагается между atpE и trnV генами, но на комплементарной нити ДНК (Kanno end Hirai, 1993). У зеленых растений транскрипция 1гпМ гена активно инициируется с двух промоторов и идет в противоположном направлении по отношению к транскрипции atpB оперона: промотор TlrnM-32 располагается в конце atpB-З пробы, TtrnM-582 - между пробами atpB-5 и atpB-6 (Zhelyazkova et al., 2012).

Рис. 2. Влияние возраста растений и фитогормонов на интенсивность транскрипции генов atpB оперона. А) Схема atpB оперона. Гены изображены прямоугольниками. Серая штриховка внутри прямоугольника - расположение интрона. Фиолетовыми прямоугольниками изображены 100-нуклеотидные пробы, используемые в run-on эксперименте. Пробы подписаны цифрами 1-9. Б) и В) Гистограммы интенсивности транскрипции для проб alpE, trnV-intr, ndhC генов. Внизу гистограмм - подписи проб, вверху - возраст используемых растений - Б или вариант обработки - В, где Н20 -контроль, АБК и МеЖа.

А) Б)

s п.

X о

а а Р л н

¿w

20000 15000 10000 -5000 -0

\ 1 Ъ Ъ Ь Ь Л Ъ

АБК9 дней

/////////

чал ^ <ь л ъ °>

\ а ?> fc 'о fc Л % Ъ

<$> S> $ & S> S> S> S> S> <f» <fS & <*»

В ходе run-on транскрипции мы детектируем уровень транскрипции, который складывается как из смысловой, так и из антисмысловой транскрипции, предполагая, что антисмысловая транскрипция не вносит существенного вклада. В этом случае, использование двухцепочечных фрагментов ДНК в качестве зондов для гибридизации с меченой в ходе in vitro транскрипции РНК, привело, вероятно, к тому, что инициация транскрипции с Т/гиМ-32 промотора стала причиной резкого увеличения

интенсивности транскрипции при использовании одной из проб, расположенных в межгенном спейсере atpE-trnVгенов.

При инкубации листьев 9-дневного ячменя в течение 24 часов при постоянном освещении на растворах АБК (7.6 х 10"5 М) и МеЖа (10~4 М) интенсивность транскрипции генов atpB оперона снижалась (рис. 2Б), однако профиль интенсивности транскрипции генов оперона практически не менялся.

Рис. 3. Гистограммы значений интенсивности транскрипции генов atpB оперона в базальной и апикальной частях первого листа ячменя (вверху) и под влиянием разного времени синтеза РНК in vitro (внизу). Базальная часть - 2 см от основания листа, апикальная - 2 см от верхушки листа; 15, 30, 120, 600 секунд -время синтеза РНК. Расположение проб показано на рис. 2А.

А)

Базальная

10000

200 150 -100 50

15 сек

!?п

рок-

Апикальная

Сходные результаты получены при использовании в run-on экспериментах апикальной и базальной частей листа ячменя — (рис. ЗА). Из этих данных видно, что в базальной части листа интенсивность транскрипции генов этого оперона выше, чем в апикальной, однако профиль интенсивности транскрипции генов atpB оперона в разных частях листа практически не изменялся.

Рис. 4. А) Гистограммы значений интенсивности транскрипции генов ШрВ оперона у зеленых растений ячменя сорта «Луч» и белых растений мутанта ячменя а1Ьох/пап.ч. Подписи: «ЛУЧ» - листья зеленых 3- или 9-дневных растений ячменя сорта Луч; «Белый а1ЬозГпат» - листья полностью белых 5- дневных растений а1Ьо8(папз. Схема расположения проб на мембране см. рис. 2А. Б) Антисмысловая транскрипция изучаемого участка ШрВ оперона. Вверху-схема а/рВ оперона и расположения на нем одноцепочечных гибридизационных проб РНК. Гены изображены прямоугольниками. Серые прямоугольники - гибридизационные пробы ДНК, используемые в пт-оп эксперименте. Голубыми стрелками показаны одноцепочечные пробы РНК комплементарные антисмысловым транскриптам, синими - РНК пробы комплементарные смысловым транскриптам. Внизу - гистограммы значений интенсивности транскрипции для одноцепочечных проб РНК: голубые гистограммы показывают антисмысловую транскрипцию, синие - смысловую, серые - суммарную.

А)_

8000 6000 -4000 2000 0

9-дневный «Луч»

\ Л> А - > <о <Ь Л » / / / / / / / / /

500 400 300 200 100 0

Белый а1Ьо$Ггшю 1*1

У / У / / / / /

¿9 ^ & ^

Б)

х с.

•А и X Я

а.

оСрЕ^ (• - ч 1 1 : 1 { {гпУ* 1 ■ ' - I 1' ■ 1

В1

12 3 4

!3 В4

¡гпМ

3-дневный «Луч»

50 +

^о 4-

и,а

М1 М2 МЗ М4

9-дневный «Луч»

50 4-40 4-

В1 В2 ВЗ ВЛ

1.11.1

12 3 4

■Ш

12 3 4

М1 М2 МЗ М4

Белый а1Ьоы1г1ап$

й|||

М1 М2 МЗ М4

В1 В2 ВЗ В4

В отличие от зеленых растений, в пластидах белых листьев мутанта ячменя albostrians профиль транскрипции изучаемого участка atpB оперона изменялся, а интенсивность транскрипции генов была ниже практически на порядок. Нужно отметить, что у белых растений, где транскрипцию ведет исключительно РНК-полимераза ядерного кодирования, происходит инициация транскрипции перед atpB геном (TalpB-593; Swiatecha-Hadenbruch et al., 2007; Zhclyazkova et al., 2012), а также перед другими генами этого оперона, с промоторов не характерных для зеленых растений (Т/тК-111; ТиойС-249; Tw//jC-639; TndhC-329).

Единственным в этом опероне общим для белых и зеленых растений является промотор перед ndhC геном ('TndhC-336). Однако интенсивность транскрипции с этих промоторов, как показали Zhelyazkova с соавторами (2012) и как можно заключить из наших данных, гораздо ниже, чем с промоторов тех же генов в зеленых растениях и, вероятно, несмотря на наличие NEP-зависимых промоторов (например, перед ndhC геном), PEP - основной фермент, транскрибирующий этот оперон в зеленых растениях разных возрастов. Однако, как видно из наших данных, NEP транскрибирует этот оперон не только слабее, но и качественно иначе (рис. 4А). Профиль интенсивности транскрипции изучаемого участка atpB стал более равномерным, увеличение интенсивности транскрипции при использовании atpB-3 пробы на межгенный спейсер, характерное для зеленых растений, «сгладилось» (рис. 4А), что согласуется с отсутствием инициации транскрипции trnM гена у белых растений в этом регионе.

На основании эксперимента (рис. ЗБ) по изучению времени синтеза РНК на интенсивность транскрипции генов atpB оперона можно заключить, что типичный профиль интенсивности транскрипции его генов наблюдался уже после 15 секунд синтеза. Таким образом, сокращение времени синтеза не повлияло на профиль транскрипции atpE-tmVintr-ndhC генов.

Такая же серия экспериментов была проведена для rps2 и psaA оперонов.

При изучении интенсивности транскрипции rps2-atpI-atpH-atpF-citpA оперона между atpI-H-F-A генами наблюдался «перепад» интенсивности транскрипции, который приходится на начало atpF гена. Возраст растений и время синтеза меченой РНК в реакции транскрипции in vitro не оказывали значимого влияния на профиль

транскрипции а1р!-Н-Р-А генов, однако под действием экзогенных гормонов, а также у белых растений мутанта ЫЬозичат различия «сглаживались».

Другим очень важным опероном является ггп оперон, который включает гены всех рибосомных РНК - 165, 238, 4,5Э и 5Б. Кроме того, он содержит гены трех тРНК - ггп16/1ШАПе/1ШАА1а1ггп2Утг4,58/ггп58ПгпЛг° (рис. 5А). У разных систематических групп наземных растений нуклеотидные последовательности генов рРНК чрезвычайно консервативны, что делает его особенно интересным для изучения.

При изучении интенсивности транскрипции генов ггп оперона было показано, что скорость транскрипции генов различается для растений разного возраста (данные не приведены, поскольку профиль транскрипции генов сходен). На рис. 5Б представлены результаты для 9-дневных растений. Важно отметить, что интенсивность транскрипции ггп!6 гена, определенная с помощью трех независимых гибридизационных проб к разным участкам гена, дала близкие результаты, что говорит о корректности применяемого метода анализа. Несмотря на то, что для этого оперона должен синтезироваться единый первичный транскрипт, у 9- и 16- дневных растении наблюдается высокая интенсивность транскрипции для ггп 16 гена, за которым идет 2-3 кратное падение интенсивности транскрипции для последующих изученных нами генов данного оперона, и этот «перепад» приходится на межгенныи спейсер ггп16/1ИНЛПе генов.

Для того чтобы понять возможную причину изменения скорости транскрипции генов внутри ггп оперона, была изучена интенсивность транскрипции генов этого оперона у мутантных растений ячменя а1Ъо$1г'1ап$, что позволяет судить о влиянии на транскрипцию генов пластидпых оперонов отсутствие пластидпой мультисубъединичной РНК-полимеразы.

Как показывают результаты рис. 5Б, отсутствие РНК-полимеразы бактериального типа оказало существенное влияние на скорость транскрипции генов ггп оперона. Наблюдаемое падение скорости транскрипции после ггп 16 гена у 9-и 16-дневных зеленых растений, еще более сильно было выражено для 5-дневных расгешш ¿¡¡Ык/гитз. Нужно отмстить, что в белых растениях мутанта, как предполагают на основе дифференциального секвенпрования РНК (2Ье1уа7коуа с1 а1., 2012), транскрипция этого оперона инициируется с промотора, расположенного перед гт!6 геном (Тггп16ЛЪ), однако инициация транскрипции с этого промотора более,

чем в три раза ниже, чем с РЕР-зависимого промотора в зеленых растениях (Тггп16-116).

Рис. 5. Интенсивность транскрипции генов гт16 оперона у зеленых растений ячменя сорта «Луч», зеленых и белых растений мутанта ячменя а1Ьох1папх и антисмысловая транскрипция участка этого оперона. Подписи как на рис. 4. А) Схема ггп16 оперона. Обозначения как на рис. 2. Голубыми стрелками показаны одноцепочечные РНК пробы комплементарные смысловым транскриптам (16 м- и 16-I аз), черными - РНК пробы комплементарные антисмысловым транскриптам (/6 х и 16-1я). Б) Гистограммы значений транскрипции генов гт16 оперона у зеленых растений ячменя сорта «Луч», зеленых и белых растений мутанта а1Ьо,Игшт. В) Радиоавтограф результатов одного из серии экспериментов и Г) Гистограммы значений интенсивности транскрипции при использовании одноцепочечных проб РНК. Внизу гистограмм и радиоавтографов - подписи проб, вверху - вариант пластидной РНК используемой для гибридизации. А)

ГГП16

trnl*

trnA'

Б)

16-.Я 16-mid 16-end 16-1 1st 1-mid I-end

В)

A-mid A-end

к"

к S В к о. w

i К

30000 25000 -20000 -15000 10000 5000 -

9-дн «Луч»

3 дн «Луч»

16 s 16 as М16-1 s 16-1 as

45000 ■ щ

30000 ■ i

15000 0 ■ -II

15000 12000 9000 600G 3000

Зеленый albostrians

ПППШ

9 дн «Луч»

60000 40000 20000

^ АЛ///

16 s 16 as М16-1 s 16-1 as

--1-r-i-1

25000 20000 15000 -10000 -5000

Белый albostrians

5 дн albostrians

16 s 16 as M 16-1 s 16-1 as

Так как транскрипция in vitro этого не показывает, то можно предположить, что кроме инициации, на результаты, полученные в ходе реакции run-on транскрипции, оказывает влияние стабильность ггп16 транскрипта. Предполагается, что в отличие от trn генов, гены рРНК стабилизируются за счет взаимодействия с белками в ходе

формирования рибосом (Hess et al., 1993). Для мутанта albostrians, пластиды которого не имеют рибосом (Siemenroth et al., 1981; Hess et al., 1992), было показано отсутствие накопления rrnlö транскрипта (Hess et al., 1992). Однако в работе Siemenroth с соавторами (1981) было показано накопление рРНК, и предполагалось на основании этого, что причиной белого фенотипа мутанта растений albostrians было отсутствие рибосомных белков и нарушение процессинга. У белых растений ячменя наблюдается довольно высокая интенсивность транскрипции rrnlö гена (Hess et al., 1993).

Мы предполагаем, что стабильность ггп16 транскрипта обеспечивается не только за счет взаимодействия с рибосомными белками, но, возможно также, за счет вторичной структуры, которую образует последовательность ггп16 гена, как было показано для кукурузы и табака (Zwieb et al., 1981; Strittmatter et al., 1985).

Увеличение в белых растениях «перепада», который наблюдается после rrnlö гена, можно объяснить отсутствием в его кодирующей области инициации транскрипции с промотора нижерасположенного trnl гена (Т7гл/-608) (Zhelyazkova et al., 2012). Такое предположение, однако, не дает ответа на вопрос, почему транскрипция после rrnlö гена терминируется, а транскрипция с Ttrnl-608 промотора продолжается.

Таким образом, несмотря на стабильную структуру этого оперона, в профиле его интенсивности транскрипции наблюдались «перепады»: интенсивность транскрипции при применении проб на кодирующую область rrnlö гена была выше, чем у ниже расположенных проб, что было показано для листьев ячменя разного возраста, для разных частей листа и для разного времени синтеза РНК в реакции run-on транскрипции. Причем, этот перепад усиливался в отсутствие полимеразы хлоропластного кодирования, некоторых ядерных рибосомных белков и, возможно, из-за нарушения процессинга у белого мутанта albostrians.

Изучение роли антисмысловой транскрипции. Чтобы выяснить влияние антисмысловой транскрипции на интенсивность транскрипции в межгенном спейсере atpE-trnVгенов, которое детектируется двухцепочечными пробами ДНК в ходе run-on транскрипции, при помощи РНК-полимеразы фага Т7 были синтезированы и фракционированы в условиях денатурирующего электрофореза новые одноцепочечные пробы. После электрофореза пробы были перенесены на нейлоновую мембрану и гибридизованы с продуктами run-on реакций, проведенными

в лизатс хлоропластов листьев 3- н 9-дневных зеленых растений н в лизате пластид белых растений alboslriaiis (рис. 4Б). На основании полученных данных можно заключить, что увеличение интенсивности транскрипции у зеленых растений для третьей пробы (atpB-З), складывалось из смысловой (одноцепочечная проба ВЗ) и из антисмысловой (одноцепочечная проба А/3) транскрипции, причем, вклад антисмысловой транскрипцш! был более значительным. Этот результат согласуется с инициацией транскрипции на комплементарной нити tniM гена, с промотора, который располагается на участке комплементарном третье пробе. Однако, профиль интенсивности транскрипции этого участка, полученный с помощью одноцепочечных проб у зеленых растений разного возраста, не был равномерным.

Таким образом, анализируя полученные данные, можно заключить, что те участки, где в зеленых растениях активно идет антисмысловая транскрипция, имеют более низкую смысловую транскрипцию. Это позволяет предположить, что антисмысловая транскрипция может регулировать транскрипцию смысловых транскриптов. Такое предположе1ше уже высказывалось ранее (Nishimura et al., 2004; Hegemaii et al., 2005; Hotto et al., 2010; Georg et al, 2010; Zghidi-Abouzid et al., 2011), однако до настоящего времени показать участие тРНК, локализованной на антисмысловой нити, в такой регуляции экспериментально не удалось.

У пластид из белых листьев мутанта albostrians, где инициация tmM транскрипции, как предполагается (Zhelyazkova et al., 2012), приходится на другой участок - комплементарный ndhC гену (TirnXf-1754), как смысловая, так и антисмысловая транскрипция имеют низкие показатели транскрипции, однако интенсивность транскрипции используемых проб достаточно равномерна. Это согласуется, как с дашшми гап-оп экспериментов, так и с отсутствием на комплементарной нити изучаемого участка сайтов инициации транскрипции.

Для гпг16 оперона на основашш дифференциального секвешфовапия РНК было также предположено существование антисмысловой транскрипции за счет инициации транскрипции расположенного на комплементарной нити rpsl2 гена в зеленых растениях - с T/ps/2-4898, что соответствует началу интрона trnA гена, в белых растениях - с Trpsl2-2002, что соответствует межгешюй области tmV-nnl6 генов в 12 н.п. от старта инициации транскрипции mil6 гена (Ттг1б-\3). Чтобы оцепить, какой вклад антисмысловая транскрипция вносит в изменение профиля транскрипции rrnl 6

оперона, были синтезированы новые одноцепочечные РНК пробы, которые в точности соответствовали положению двухцепочечных проб (рис. 5А). Пробы после электрофоретического разделения были перенесены на нейлоновую мембрану и гибридизованы, как и ранее, с продуктами гип-оп реакций (рис. 5В, Г.).

На основании приведенных данных можно заключить, что антисмысловая транскрипция не вносит существенного вклада в интенсивность транскрипции проб, которые приходились на конец ггп16 гена и межгенный спейсер ггп 16-1т1. Кроме того, результаты экспериментов с одноцепочечными пробами РНК согласуются с данными, которые были получены с помощью двухцепочечных проб ДНК: у растений а1ЪовМат интенсивность транскрипции пробы на ген ггп! б было значительно выше, чем у пробы на межгенный спейсер. У зеленых растений также наблюдалось падение интенсивности транскрипции, но только у 9-дневных растений. У трехдневных зеленых растений не было «перепада» между смысловыми транскриптами по результатам гибридизации с одноцепочечными пробами, в то время как при гибридизации с ДНК пробами наблюдалось небольшое падение интенсивности транскрипции между концом ггп гена и межгенной областью.

Применение метода «защиты от РНКаз» для выяснения роли антисмыеловой транскрипции и изучения процесса созревания транскриптов генов хлоропластных оперонов. Для изучения влияния антисмысловой транскрипции ¡гпМ гена на транскрипцию ШрЕ гена, расположенного на комплементарной нити ДНК, были синтезированы см (аШ^епБе - антисмысловые) меченые зонды, комлементарные 3'-концу ШрЕ гена (как показано на рис. 6А) и гибридизованы с пластидной РНК 3- и 9-дневных зеленых растений и 5-дневных белых растений а/6о5/пал5. После гибридизации некомплементарные участки были подвержены нуклеазной деградации, а комплементарные нанесены на денатурирующий электрофорез, радиоавтограф которого приведен на рис. 6Б. Результаты показывают, что первая и вторая пробы, которые были комплементарны концу кодирующей области афЕ гена, по нашим предположениям, должны были содержать фрагменты 204 и 100 н.п., соответственно. Эти фрагменты соответствовали бы зрелому 3' концу транскрипта ШрЕ гена. Ни в зеленых, ни в белых растениях не было фрагментов такого размера, однако для второй пробы был обнаружен фрагмент размеров около 210 н.п., который соответствовал 3'-концу кодирующей области 1гпМ

гена, расположенного на комплементарной нити. У белых растений, как полных защит (т.е. когда вся меченая проба РНК была защищена в ходе гибридизации хлоропластными транскриптами и не была разрушена при нуклеазной обработке), которые были, вероятно, результатом гибридизации с оперонным транскриптом, так и более коротких форм было гораздо меньше, что согласуется с меньшей интенсивностью транскрипции, которая была обнаружена в ходе run-on экспериментов. Кроме того, первая проба содержала более короткую (на 15-20 н.п.) форму, которая, вероятно, соответствовала 3' нетранслируемой области ¡7Г/лЕ-мРНК. Эта форма была характерна только для мутанта albostrians, который, как уже говорилось, имеет дефекты процессинга, и, как отмечалось ранее (Hess et al., 1993), может накапливать промежуточные продукты процессинга в довольно большом количестве.

Для того чтобы выяснить, с чем связано падение интенсивности транскрипции после ггп16 гена, которое было показано как с помощью двухцепочечных проб ДНК, так и с помощью одноцепочечных проб РНК, был использован также метод защиты от рибонуклеаз.

На основании полученного радиоавтографа и схемы предполагаемого созревания транскриптов изучаемого участка оперона можно заключить, что в белых растениях ячменя нет зрелых ггп16 транскриптов, так как первая, вторая и третья меченые 32Р-РНК (на рис. 7 обозначены 1, 2, 3) не дают никаких дополнительных полос, кроме полной защиты.

Четвертая антисмысловая РНК, комплементарная смысловому транскрипту, который приходится на начало trnl гена и захватывает восемь нуклеотидов от его интрона, имеет у белых растений кроме полной защиты еще и дополнительные полосы, которые соответствуют началу trnl гена (194 н.п.) и первому экзону вместе с интроном (49 н.п.). Как было показано ранее (Vogel et al., 1999), интрон trnl гена не подвергается сплайсингу в белых растениях мутанта ячменя albostrians, однако нарушен именно этап вырезания интрона, в то время как транскрипт trnl гена вырезается из преРНК (Vogel and Hess., 2001). Если сравнивать интенсивность гибридизации, то можно заметить, что эти фрагменты представлены в белых пластидах в разном количестве, что, вероятно, связано с нарушением стабильности не сплайсированной тРНК.

Рис. 6. Изучение транскрипции участка а1рВ оперона с помощью метода защита от РНК-аз. А) Схема ШрВ оиерона и расположения меченых одноцепочечных гибридизационных РНК проб. Обозначения как на рис. 2. Темно-фиолетовым показан участок, где 3- и 4- пробы пересекаются на 16 н.п. Черными стрелками показаны одноцепочечные РНК пробы комплементарные смысловым транскриптам, ниже показан размер проб. Цифры рядом со стрелками обозначают пробы, где 1 - а!рВ-рго!-1, 2 - а1рВ~ рго1-2, 3 - а(рВ-рго1-3. Тонкие вертикальные штрихи показывают места, где ожидается наличие зрелых концов РНК, толстые линии- где были обнаружены концы. Вертикальная стрелка указывает на вероятное место терминации транскрипции. Обращаем внимание, что /гпМ ген изображен для удобства объяснения и не может детектироваться данными пробами. Б) Радиоавтограф фракционирования устойчивых к РНК-азе фрагментов с применением вертикального электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, как и в части А) рис., обозначены цифрами, над дорожками - вариант пластидной РНК используемой для гибридизации. М - маркер 100-500 н.п.

А) ;....................................Б) азРНК 1 2 3

ипУ*

гиз 4 ~ггпМ

: пёЬС

ея'кн-

1 -

1 2 <! ипм

247

204 Ж \

265 $

100 . 16? г :

! Т/ги.М-32

= 200-210 1:~.50-§5 5

.......1......... >257..................

31-41! 1 1

=120 .! =137

¿г г? о?

- 100

Рис. 7. Изучение транскрипции участка ггп1б оперона с помощью метода защита от РНК-аз. А) Схема ггп 16 оперона и расположения меченых одноцепочечных гибридизационных проб РНК. Обозначения как на рис. 2. Черными стрелками показаны одноцепочечные РНК пробы комплементарные смысловым транскриптам, ниже показан размер проб. Цифры рядом со стрелками - обозначают пробы, где 1 - ггп16-епс!-1, 2 - ггп1б-епс/-2, 3 - ггп16-епс1-3, 4 - ггп!6-епс1-4. Тонкие вертикальные штрихи показывают места, где ожидается наличие зрелых концов РНК. Б) Радиоавтограф фракционирования устойчивых к РНК-азе фрагментов с применением вертикального электрофореза в полиакриламидном геле. Пробы, как и в части А рис., обозначены цифрами, над дорожками - вариант пластидной РНК используемой для гибридизации. М - маркер 100-500 н.п. А) ...........................Б) авРНК 12 3 4

16.« 16-тШ

16-ет! 16-1■ /-5С ¡-(1ш1 ¡-ет!

ЕЕЭ

А-ппс! А-еп(1

Таги/-608

197

194

235

Таким образом, на уровне накопления РНК, показано присутствие mil 6 пре-РНК, которая, однако, не подвергается экзонуклеазной деградации в направлении 3 '5' и не имеет у белых растений зрелых форм, что позволяет говорить о нарушении этапа созревания на уровне деградации 3 '-конца синтезируемой пре-РНК.

У 3- и 9- дневных зеленых растений сорта «Луч» картина накопления транскриптов была другой. Первая и вторая пробы, которые защищают конец mil6 гена, кроме ожидаемых полос в 197 и 111 н.п., соответственно, которые представляет собой продукт защиты зрелого 3' конца ггп16 транскрипта, имели еще и дополнительные полосы, которые были примерно на 50 н.п. короче основных. Третий меченый антисмысловой фрагмент РНК давал только полную защиту, также как и в белых растениях, что согласуется с отсутствием каких-либо концов РНК в этом регионе. Четвертая меченая РНК, которая комплементарна началу trnl гена и захватывает восемь нуклеотидов его интрона, защищала процессированные (235, 194, 41 н.п.) и полные преРНК (243 н.п.). В отличие от белых растений, появлялось два новых фрагмента, которые представляют собой полную защиту, но уже без интрона trnl гена (235 н.п.), а также фрагмент trnl гена без интрона (41 н.п.). По интенсивности гибридизации можно заключить, что у 3-дневных растений больше молекул преРНК (полосы 235 и 194 н.п.), в то время как у 9-дневных растений больше зрелых транскриптов (полоса размером 41 н.п.).

Кроме этого, на уровне накопления РНК у 3- и 9-дневных растений наметилось постепенное снижение количества транскриптов, соответствующих первой, второй и третьей пробам, в то время как накопление транскриптов, комплементарных четвертой пробе для 3-дневных растений было больше, чем у первой пробы (на конец гт1б гена), а для 9-дневных растений немного возрастало по сравнению с интенсивностью гибридизации третьей пробы, что в целом согласуется с данными полученными в ходе run-on транскрипции с одноцепочечными и двуцепочечными зондами. Не было обнаружено «перепада» накопления транскриптов после ггп16 гена у белых растений, как это было установлено на уровне интенсивности транскрипции.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Долгое время считалось, что регуляция экспрессии индивидуальных генов в хлоропластах осуществляется точно также как в прокариотических

предшественниках, однако со временем стали накапливаться факты, которые не укладывались в такое представление. Вероятно, в процессе ко-эволюции в пластидах растений были сформированы механизмы регуляции экспрессии не свойственные для оперонной системы прокариот - регуляции транскрипции индивидуальных генов в составе пластидных оперонов.

Основным результатом диссертационной работы является установление факта дифференциальной регуляции транскрипции индивидуальных генов в составе оперонов под действием разных факторов.

Такой вывод сделан на основании изучения интенсивности транскрипции генов пластидных оперонов листьев растений разного возраста, базальной и апикальной частей листа, отличающихся различным состоянием хлоропластов, на основании изучения влияния на лист фитогормонов - АБК и МеЖа, а также листьев бесхлорофилльного мутанта ячменя albostrians. Построены временные кривые синтеза 32Р-РНК в условиях in vitro. В работе изучена интенсивность транскрипции генов, входящих в состав 7 оперонов у 4-, 9- и 18-дневных растений ячменя, и было показано, что гены в составе оперонов могут дифференциально транскрибироваться. Проведен детальный анализ интенсивности транскрипции генов 5 оперонов, на основании которого опероны можно условно разделить на две группы (табл. 2).

Табл. 2. Изменение профиля транскрипции генов изучаемых оперонов под действием экзогенных и эндогенных факторов._

Названия оперонов Изменение профиля интенсивности транскрипции

Возраст растений Апикальная и базальная части листа Обработка АБК Время синтеза РНК in vitro albostrians мутант

гроВ - - - - -

psaA - - + +/- -

rps2 - - + - +

atpB - - - - +

irn!6 + - - - +

К первой группе можно отнести гроВ оперон, все гены которого кодируют субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа, и имеют довольно равномерную интенсивность транскрипции, которая практически не зависит от всех вышеперечисленных факторов. Вторая группа оперонов более разнообразна, как по составу генов, так и по их регуляции. В нее вошли опероны, профиль интенсивности

транскрипции генов которых менялся под действием какого-то одного фактора (например, в листьях бесхлорофилльного мутанта ячменя, atpB оперон), или же под действием нескольких факторов (например, в листьях albostrians мутанта и под действием - АБК или изменение с возрастом в зеленых растениях (rps2 и /та/6 опероны, соответственно).

В литературе есть данные о регуляции транскрипции индивидуальных генов оперонов за счет внутренних промоторов, как например, свет-регулируемого промотора psbD гена (psbK оперон) (Hoffer and Christopher, 1997). Для нескольких оперонов митохондрий дрожжей показана возможность дифференциальной регуляции генов на уровне транскрипции (Krause and Dieckmann, 2004). На основании дифференциального секвенирования РНК (Zhelyazkova et al., 2012) было показано наличие большого количества как РЕР-, так и NEP-зависимых промоторов внутри хлоропластных оперонов, которые ранее не были идентифицированы. Многие из них, вероятно, принимают участие в регуляции транскрипции, однако по нашим данным интенсивность транскрипции генов в составе оперонов может не только увеличиваться, но и уменьшаться.

Другой важный результат нашей работы заключается в установлении факта терминации транскрипции atpB оперона на участке 3 '-нетранслируемой области atpE гена, комплементарном кодирующей и промоторной областям trnM гена. В литературе обсуждается такая возможность. В хлоропластном геноме тРНК часто располагаются одиночно на комплементарной нити ДНК и транскрибируется в противоположном направлении относительно оперонных транскриптов, например, trnW ген относительно petLG оперона, trnS-GGA относительно tmT-rps4-ycf3 генов, trnS-GCU - psbK оперона, trnH-trnl-rpl23-rpsl 1-rpoA, trnN -rrnl6 оперона.

Кроме того, показано, что в белых растениях идет транскрипция и накопление пре-рРНК ггп16 гена даже в отсутствие рибосом. Однако не происходит созревание этого транскрипта.

Таким образом, детальный анализ интенсивности транскрипции генов в оперонах показывает, что опероны, которые состоят из генов, кодирующих

функционально различные белки или РНК, требуют дополнительной внутри оперонной регуляции транскрипции. Такая регуляция может заключаться, как в увеличении интенсивности транскрипции одного из генов за счет наличия собственного внутри оперонного промотора, так и в уменьшении транскрипции за счет ее терминации. Вероятно, не меньший вклад в регуляцию транскрипции хлоропластных генов в составе оперонов вносит стабилизация их транскриптов. Полученные данные важны для понимания фундаментальных основ регуляции экспрессии пластома. Дальнейшие исследования должны быть направлены на точную локализацию и экспериментальное доказательство наличия внутри пластидных оперонов и регуляторных элементов, участвующих, как в активации, так и в подавлении транскрипции индивидуальных генов, а так же на изучение белковых факторов, отвечающих за регуляцию этих цис-элеменов.

ВЫВОДЫ

1. На основании анализа транскрипции 30 генов, входящих в состав 7 пластидных оперонов, установлена дифференциальная регуляция их транскрипции. Показано, что гены гроВ оперона, кодирующие субъединицы одного белкового комплекса, транскрибируются равномерно, в то время как гены ггп16, гр.$2, ряаА и а1рВ оперонов, кодирующие функционально не связанные белки или РНК, транскрибируются неравномерно.

2. Возраст растений в большинстве случаев не оказывает существенного влияния на профиль интенсивности транскрипции генов изучаемых оперонов.

3. АБК и МеЖа ингибировали интенсивность транскрипции большинства генов исследованных хлоропластных оперонов. Причем, АБК оказывала дифференциальное влияние на активность РНК-полимераз пластидного и ядерного кодирования, а МеЖа подавлял интенсивность транскрипции генов всех изученных оперонов и не влиял на профиль их интенсивности транскрипции.

4. Получены новые факты участия антисмысловой транскрипции в регуляции транскрипции генов, локализованных на смысловой нити ДНК. Показана точная локализация терминации транскрипции а!рЕ гена ШрВ оперона.

5. Совокупность наших результатов подтверждает гипотезу о том, что пластидные опероны, состоящие из генов, кодирующих функционально различные белки или

РНК, требуют дополнительной внутриоперонной регуляции транскрипции, которая может осуществляться с участием внутриоиеронных промоторов, последовательностей ДНК, ослабляющих транскрипцию, а так же с вовлечением специфичных РНК-связывающих белков, обладающих высокой РНК-азной активностью.

Список работ по материалам диссертации

1. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2007) Дифференциальная транскрипция генов хлоропластных оперонов ячменя. Тезисы VI Съезда Общества физиологии растений, Сыктывкар, с. 173-175

2. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2008) Дифференциальная регуляция уровня транскрипции отдельных генов оперонов растений ячменя разного возраста. Тезисы докладов международной научной конференции "Физико-химические основы структурно-функциональной организации растений, Екатеринбург, с. 43-44.

3. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2008). Особенности регуляции транскрипции генов в хлоропластных оперонах. Тезисы докладов «Ломоносов -2008», Москва, с. 1.

4. Зубо Я.О., Лысенко Е.А., Алейникова А.Ю., Кузнецов В.В., Пшибытко Н.Л. (2008) Изменение транскрипционной активности генов пластома ячменя в условиях теплового шока. Физиология растений, 55, с. 323-331.

5. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О. (2009) Особенности транскрипции генов в составе оперонов в хлоропластах растений ячменя разных сортов. Тезисы докладов «Ломоносов - 2009», Москва, с. 181-182.

6. Фрадкина A.A., Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2009) Детальное изучение интенсивности транскрипции ггп16 и psaA оперонов в хлоропластах ячменя. Тезисы докладов 62 студенческой научной конференции РГАУ — МСХА им. К.А. Тимирязева, Москва, с. 69-71.

7. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. (2009) Изменение уровня транскрипции генов в оперонах хлоропластов растений ячменя. Тезисы докладов «Физико-химические механизмы адаптации растений к антропогенному загрязнению в условиях крайнего севера», Апатиты, с. 24-26.

8. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2011) Экспрессия генов, входящих в состав оперонов пластома ячменя. VII съезд Общества физиологов растений России "Физиология растений — фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий", Нижний Новгород, с. 36-37.

9. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2011) Интенсивность транскрипции генов atpB оперона хлоропластов листьев ячменя в зависимости от действия разных факторов. Вестник Томского государственного университета. Биология, 3 (15), с. 139-142.

10. Алейникова А.Ю., Кузнецов В.В., Зубо Я.О. (2012) Неравномерная транскрипция генов в оперонах пластома ячменя. Вестник Российского университета дружбы народов. Серия-агрономия и животноводство. 1,с. 12-19.

11. Алейникова А.Ю., Зубо Я.О., Кузнецов В.В. Профиль интенсивности транскрипции хлоропластных оперонов в растениях ячменя при воздействии различных факторов. Тезисы докладов «Ломоносов — 2012», Москва, с. 183-184.

Подписано в печать 11 мая 2012 г. Объем 1,0 п.л. Тираж 110 экз. Заказ № 289 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Алейникова, Анастасия Юрьевна

1. Введение.

2. Литературный обзор.

2.1. Пластидный геном.

2.2. Организация хлоропластных генов.

2.3. Перенос хлоропластных генов в ядро и его последствия.

2.4. Транскрипция пластидных генов.

2.4.1. РНК-полимеразы пластид.

2.4.2. Промоторы хлоропластных генов.

2.4.3. Транскрипционные факторы.

2.4.3.1. Сигма-факторы.

2.4.4. Экзогенные и эндогенные факторы, влияющие на транскрипцию пластид.

2.5. Пост-транскрипционный этап экспрессии хлоропластных генов.

2.5.1. РНК-процессинг: эндонуклеазы.

2.5.2. РНК-процессинг: экзорибонуклеазы.

2.5.3. Межцистронный процессинг транскриптов пластидных оперонов.

2.5.4. Стабильность РНК.

2.5.4.1. РРЯ белки.

2.5.5. Полиаденилирование.

2.5.6. Созревание 5 конца.

2.5.7. Сплайсинг интронов.

2.5.8. Эдитинг РНК.

3. Материалы и методы исследования.

3.1. Объект исследований.

3.2. Клонирование фрагментов ДНК.

3.2.1. Подбор праймеров к клонируемому гену.

3.2.2. Полимеразная цепная реакция.

3.2.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.

3.2.4. Элюция фрагментов ДНК из геля.

3.2.5. Цитирование.

3.2.6. Трансформация клеток Е соИ.

3.2.6.1. Приготовление компетентных клеток.

3.2.6.2. Трансформация бактериальных клеток плазмидной ДНК.

3.2.7. Выращивание бактерий на агаризованной ЬВ среде.

3.2.8. Поиск бактериальных колоний, несущих рекомбинантные плазмиды.

3.2.9. Рестрикция фрагментов ПЦР и плазмидной ДНК.

3.3. Выделение ДНК.

3.3.1. Выделение хлоропластной ДНК в растворе высокой ионной силы.

3.3.2. Выделение плазмидной ДНК.

3.3.2.1. Микровыделение плазмидной ДНК.

3.3.2.2. Макровыделение плазмидной ДНК.

3.4. Выделение пластид из листьев ячменя.

3.4.1. Подсчет количества хлоропластов.

3.4.2. Обработка листьев фитогормонами.

3.5. Метод run on транскрипции.

3.5.1. Очистка ПЦР фрагментов.

3.5.2. Нанесение фрагментов ДНК на нейлоновую мембрану.

3.5.3. Транскрипция in vitro. Выделение синтезированной меченой РНК.

3.5.4. ДНК-РНК гибридизация.

3.5.5. Экспозиция нейлоновой мембраны с радиочувствительным экраном и анализ результатов.

3.6. Антисмысловая транскрипция.

3.6.1. Транскрипция in vitro.

3.6.2. Электрофорез РНК в агарозном геле.

3.6.3. Перенос РНК на нейлоновую мембрану.

3.7. Метод защиты от РНК-аз.

3.7.1. Выделение пластидной РНК.

3.7.2. Копреципитация и расщепление не гибридизованной РНК.

3.7.3. Денатурирующий электрофорез РНК в полиакриламидном геле.

3.8. Быстрая амплификация 3'-концов кДНК (3 RACE).

4. Результаты и обсуждение.

4.1. Изучение интенсивности транскрипции пластидных оперонов

4.2. Детальное изучение изменения интенсивности транскрипции пластидных оперонов.

4.2.1. Влияние размера проб на интенсивность ДНК-РНК гибридизации.

4.2.2. Влияние процента ГЦ пар нуклеотидов гибридизационных проб на интенсивность ДНК-РНК гибридизации.

4.3. Выяснение роли антисмысловой транскрипции в регуляции транскрипции пластидных генов.

4.4. Анализ транскриптов atpB и rrnlô оперонов с применением метода Т4 лигирования.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных оперонов ячменя"

В 60 годы прошлого века было показано, что хлоропласты являются носителями генетической информации наряду с ядром и митохондриями (Ris, Plaut, 1962; Lyttleton 1962), однако, возможно в процессе ко-эволюции цианобактериального предшественника в эукариотческой клетке хозяина, хлоропласт потерял автономность (Даниленко, Давыденко, 2003). В подцержку наиболее признанной эндосимбиотической теории происхождения хлоропластов говорят данные о том, что хлоропластный геном кодирует полимеразу бактериального типа, которая инициирует транскрипцию генов пластома с а70 промоторов бактериального типа, а трансляция ее продуктов осуществляется на 70S рибосомах (Юрина, Одинцова, 1991). Кроме того предполагают, что в процессе ко-эволюции большая часть генов предшественника современных хлоропластов была или потеряна или перенесена в ядро (Brennicke et al., 1993). Многие белки, кодируемые этими генами, приобрели транспептид, благодаря которому они перенаправляются обратно в хлоропласт. В процессе ко-эволюции хлоропластные гены приобрели некоторые эукариотические черты, например наличие нитронов и высокую стабильность мРНК (Mayfield et al., 1995). Кроме того, транскрипцию хлоропластных генов, наряду с полимеразой собственного кодирования, осуществляет полимераза кодируемая ядром и транспортируемая в хлоропласт (Liere et al., 2011). Таким образом, контроль экспрессии хлоропластных генов включает в себя процессы, которые напоминают как прокариотическую, так и эукариотическую системы.

Большинство генов, кодируемых хлоропластным геномом, организованы по аналогии с прокариотическими генами в опероны и транскрибируются согласованно с единого промотора(-ов) как полицистронная единица, в том числе и гены, которые кодируют белки, входящие в какой-либо один функциональный комплекс или связанные функционально, что характерно для прокариот. К таким оперонам относится гро оперон, кодирующий три субьединицы (ß, ß' и ß") РНК-полимеразы бактериального типа - гроВ/гроС1/гроС2. Сюда же можно отнести ггп оперон, который включает гены всех необходимых для хлоропластных рибосом РНК - 16S, 23S, 4,5S и 5S. Однако он содержит так же гены трех тРНК -ггп¡6/tRNAПе/tRNAА 1а/гrn23/ггп4,SS/rmSS/tr^ (Юрина, Одинцова, 1991).

Однако чаще разные субъединицы мультибелковых комплексов кодируются генами нескольких оперонов (Юрина, Одинцова, 1998). Транскрипция таких оперонов происходит согласованно, что позволяет получить правильное стехиометрическое соотношение продуктов - белков или РНК. Согласованность экспрессии хлоропластных генов достигается за счет регуляции процесса транскрипции (Lerbs-Mache, 2011). Интенсивность синтеза РНК с того или иного оперонного промотора(ов) определяется силой этого промотора. Активность промотора зависит от его нуклеотидной последовательности, а так же, возможно, от топологии хлоропластной ДНК (Lerbs-Mache, 2011; Liere et al., 2011). В регуляцию транскрипции, как уже отмечалось, вносит вклад участие в этом процесс двух хлоропластных РНК-полимераз - хлоропластного и ядерного кодирования. На точность и активность транскрипции генов влияют белковые транс-факторы (включая а-факторы и другие белковые регуляторы транскрипции), а также важное значение имеет их модификация, например, фосфорилирование (Pfalz et al., 2006; Schweer et al., 2010).

Чаще всего опероны содержат гены, кодирующие функционально различные белки, которые должны накапливаться в хлоропластах в неодинаковом количестве. Примером может служить оперон, кодирующий RPS2 белок и четыре субъедишщы АТФ-синтазного комплекса - rps2/atpI/atpH/atpF/atpA. Субъединица III CF0 комплекса (кодируется atpH геном) должна накапливаться в 6-12 раз больше, чем остальные субъединицы. Наличие внутреннего промотора перед atpH геном делает возможным дополнительное накопление РНК этого гена. Интересно, что транскрипция всего оперона и atpH гена, зависит от разных а-факторов (SIG3 узнает промотор перед atpH геном, SIG2, а также возможно и другие а- факторы, определяют транскрипцию всего оперона; Zghidi et al., 2007).

Однако, несмотря на большой прогресс в последнее время в изучении хлоропластной транскрипции, механизмы регуляции транскрипции отдельных генов в составе хлоропластных оперонов у высших растений совершенно не изучены, хотя это исключительно важно для понимания регуляции биогенеза хлоропластов.

Цель и задачи исследования. Цель диссертационной работы состояла в изучении интенсивности транскрипции генов пластидных оперонов, а также в изучении регуляции их транскрипции под действием различных факторов. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

4. Выявить возможные причины изменения интенсивности транскрипции генов в пластидных оперонах растений.

Научная новизна и практическая ценность работы. Показано, что гены основной транскрипционной единицы хлоропластных геномов высших растений -оперона - могут дифференциально регулироваться на уровне транскрипции. Изучена регуляция транскрипции 7 пластидных оперонов в зеленых растениях ячменя и в белых растениях мутанта ячменя albostrians разными факторами, как эндогенной, так и экзогенной природы. Впервые экспериментально показана терминация транскрипции хлоропластного оперона при помощи гена транспортной РНК, расположенного на комплементарной нити ДНК. Получены новые данные о процессинге хлоропластных оперонов. Полученные результаты вносят существенный вклад в понимание механизмов регуляции транскрипции в пластидах высших растений и могут быть использованы для разработки теоретических основ управления продуктивностью растений.

2. Литературный обзор 2.1. Пластидный геном

В клетках растений основная часть генетической информации локализуется в ядре, однако сравнительно небольшая часть генов находятся в хлоропластах (пластом) и митохондриях (хондром). Пластом представляет собой совокупность генов и регуляторных элементов, расположенных на пластидной ДНК. Это самая большая и сложноорганизованная внеядерная часть эукариотического генома. Молекулы ДНК органелл относительно просты, невелики по размеру и, за исключением геномов некоторых водорослей и простейших, замкнуты в кольцо, о чем впервые сообщили Мэнинг с соавторами в 1971 году, исследуя хлоропластную ДНК (хлДНК) Euglena gracilis (Даниленко, Давыденко, 2003). Размер молекул хлДНК для каждого вида растений оказался величиной постоянной.

С появлением новых, более совершенных методов исследования в пластидах стали обнаруживать линейные молекулы ДНК (Lilly et al., 2001), которые представляют собой совокупность полноразмерных пластидных ДНК с ответвляющимися структурами, которые, вероятно, представляют собой интермедиа™, образующиеся в процессе репликации (Bendich, 2004). Есть данные, что в Chlamydomonas присутствуют как линейные молекулы хлДНК, так и димеры с кольцевой структурой (Maul et al., 2002).

Все хлоропласты содержат, по крайней мере, несколько копий хлДНК, которые организованы в нуклеоиды. Хотя способ упаковки хлДНК пока недостаточно исследован, геном по своей структуре, вероятно, большее сходен не с хроматином эукариот, а с бактериальным геномом, поскольку, как и бактерии, он не имеет гистонов.

Практически у всех высших растений организация хлоропластных геномов очень сходна. Геном хлоропласта представляет собой кольцевую двуцепочечную молекулу ДНК. У большинства наземных растений пластидный геном имеет размер 120-160 т.п.н. (Green, 2011). Наибольшее различие в размере пластидных геномов обусловлено количеством генов, входящих в инвертированный повтор (и поэтому гены в таких повторах являются дуплицированными), в то время как количество идентифицированных белок кодирующих генов и генов тРНК (обычно растения имеют 27-31 генов тРНК) очень сходно (Chumley et al. 2006; Gao et al., 2009).

Табл.1. Гены пластидного генома. Гены, выделенные жирным шрифтом, практически всегда отсутствуют в редуцированных геномах (динофлагеляты, не фотосинтезирующие пластиды) (Green, 2011 с изменениями).

Функция Гены Комментарии

РНК:

Рибосомные rns, rnl, rrn5 4.58 рРНК есть только в

Транспортные irпА fuge), trnC(gca), trnDfguc), trnE(uuc), trnF(gaa), trnG(gcc), trnG(ucc), trnH(gug),trnI(cau), trnl(gau), trnK(uuu), trnL(caa), trnL(uaa), trnM(cau), trnN(guu), trnP(ugg),trnQ(uug), trnR(acg), trnRfccg), trnRfucu), trnS(gcu), trnS(uga), trnT(ugu), trnV(uac), растениях

Другие trnW(cca), trnY(gua) rnpB (рибонуклеаза P), ffs RNA (SRP), ssra(tmRNA)

Транскрипция cbbX, rbcR, rpoA, rpoB, rpoCl, тШК в зеленых rpoC2, matK растениях, сЪЪХ и rbcR в красных водорослях

Трансляция tufA

Рибосомные белки

Малая субъединица rps2, rps3, rps4, rps5, rps6, rps7, все пластиды в красных rps8, rps9, rpslO, rpsll, rpsl2, водорослях rpsIS, rpsl4, rpsló, rps!7, rpsl8, rpsl9, rps20

Большая субъединица rpll, rpl2, rpl3, rpl4, rpl5, rpló, rplll, rpll2, rpll3, rpll4, rpll6, rpll8, rpll9, rpl20, rpl21, rpl22, rpl23, rpl24, rpl27, rpl29, rpl31, rpl32, rpl33, rpl34, rpl35, rpl36 все пластиды в красных водорослях и некоторых зеленых водорослях и растениях продолжение табл. 1

Фотосинтез

АТФ-синтаза atpA, atpB, atpD, atpE, atpF, Все пластиды в красных atpG, atpH, atpl водорослях

Фотосистема I psaA, psaB, psaC, psaD, psaE, рта/3, Е, Г нет в растениях psaF, psal, psaJ, psaL, psaM

Фотосистема П psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbl, psbJ, psbK, psbL, psbN, psbT, psbV, psbX, psbY, psbZ, psb28

Цитохромный petA, petB, petD, petF, petG, в ядре у растений и комплекс petLfycp), petM (yc/31), многих водорослей petN(ycf6)

КАБН дегидрогеназа Только в растениях за ndhA, ndhB, ndhC, ndhD, ndhE, исключением некоторых ndhF, ndhG, ndhH, ndhl, ndhJ, ndhK гимноспермных

Метаболизм accD, acpP, chlB, chll, chlL, ассБ только в растениях, chlN, rbcL, rbcS, thiG, thiS, cysA гЪсЬ и гЪсБ имеют различное происхождение в красных и зеленых водорослях

Протеазы: созревание и clpC, clpP, dnaB, dnaK, протеолиз белков ftsH(ycf25), groEL

Сборка мембран ccsl, ccsA, secA, secG, secY, только красные водоросли sufB, sufC, tatC

В настоящее время определена полная нуклеотидная последовательность пластома многих высших растений - http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/leuks.cgi. Среди однодольных это - рис - Oryza sativa (japónica cultivar ~ group) и Oriza Nivaray, кукуруза (Zea mays), пшеница (Triticum auestivum), ячмень (Hordeum vulgare) и многие другие (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject?Db=genome&Cmd =ShowDetailView&TermToSearch=20081). Полученные данные говорят о том, что гены хлоропластов многих высших растений практически идентичны (Албертс Б. и др., 1994; Green, 2011).

Несмотря на общий набор одних и тех же генов в пластомах растений, отличительной чертой для разных линий эволюции является отбор сохраненных генов, присутствие или отсутствие интронов и повторов, эдитинга транскриптов и физическая организация самих геномов, включая реорганизацию и наличие/отсутствие межгенных спейсеров.

Особенностью хлоропластной ДНК является наличие довольно протяженных инвертированных повторов- Же (т.е. имеющих противоположную ориентацию), которые обычно включают гены рибосомной РНК. Инвертированные повторы разделяют кольцевую молекулу ДНК на большую и малую уникальные области.

В хлоропластном геноме выделяют две группы генов:

- к первой группе относятся все гены, связанные с функционированием генетического аппарата пластид: гены транспортных и рибосомных РНК, гены субъединиц РНК-полимеразы и гены, кодирующие белки пластидных рибосом (рис !)•

- ко второй группе принадлежат гены, кодирующие большую субъединицу РБФК, белки фотосистем I (ФС1) и II (ФСП), цитохромного Ь/Т комплекса, АТФ-синтазы (рис 1) (8и^игаД992).

В хлоропластах также найдены гены, сходные по нуклеотидной последовательности генам ЫАОН-дегидрогеназы митохондрий. (Даниленко, Давыденко, 2003).

Гены рибосомных РНК

Пластидные 708 рибосомы состоят из двух субъединиц с константами седиментации соответственно 508 и 308. В состав большой субъединицы входят три типа молекул рРНК, кодируемых хлоропластным геномом: 238, 58 и 4.58, а в состав малой субъединицы входит 168 рРНК. Гены рибосомных РНК в пластидах чаще всего локализованы в инвертированных повторах и, таким образом, представлены двумя копиями.

Гены белков пластидных рибосом

Хлоропластные рибосомы наземных растений состоят из 58 - 62 белков: в среднем 25 белков входят в состав малой и 35 белков - в состав большой субъединицы (Даниленко, Давыденко, 2003). Причем, было установлено, что

13 примерно треть из них кодируются пластомом, остальные - ядерным геномом (Sugiura, 1992). Показано значительное отличие генов рибосомных белков пластидного и ядерного кодирования. Гены рибосомных белков частично собраны в опероны.

Рис. 1. Схематическое изображение пластома ячменя. LSC, SSC-болылая и малая уникальные области, IRA и IRB - левый и правый инвертированные повторы. Цветом показано принадлежность к одной из групп, которые указаны внизу рисунка (по Zhelyazkova et al., 2012). photosystem l phoiosydom II cytochrome Ы comple*

ATP synthase

NADU dehydrogenase

Rub'sCO large svtvmt

RNA polymerase ttoomal p»ctere ISSU) boson»« ptoteme fLSU) clpP. ma)K oïl», :jenes. hypothefcsl crtoroplasl reading frames rfcff franster HNAr. nbosomal RNAs Ф ось рФЕСЦ- --peto»

MiAUUG- — pbfc* im1*! *"K(ÎUJ -

•a'« SB

Гены транспортных РНК

В хлоропластном геноме присутствуют обычно от 27 до 35 генов тРНК (Sugiura, 1992; Green, 2011). Причем хлоропластные тРНК весьма консервативны по своей структуре. При сравнении нуклеотидных последовательностей этих генов у риса, табака и маршанции выявлена высокая гомология (Даниленко, Давыденко, 2003).

Гены РНК-полимеразы бактериального типа

РНК-полимераза E.coli кодируется тремя генами (гроА, гроВ, гроС), контролирующими соответственно a-, ß- и ß'-субъединицы в соотношение 2:1:1, т.е. синтезируемый фермент имеет структуру c^ßß'. Структура хлоропластной РНК-полимеразы оказалась сходной, за исключением того, что N- и С-части ß'-субъединицы кодируются в хлоропластах двумя различными генами (rpoCl и гроС2) и обозначаются соответственно ß' и ß". В настоящее время известно, что 4 хлоропластных гена кодируют субъединицы хлоропластной РНК-полимеразы бактериального типа: гроА, гроВ, rpoCl и rpoC2 (Sugiura, 1992).

Гены субъединиц рибулозобифосфаткарбоксилазы

Из множества ферментов цикла Кальвина лишь РБФК частично кодируется хлоропластным геномом.

Основной белок стромы хлоропластов - РБФК состоит из восьми идентичных больших субъединиц с молекулярной массой 53-55 кД и восьми идентичных малых субъединиц с молекулярной массой 12-14 кД. У высших растений малая субъединица РБФК кодируется ядерным геномом, а большая - хлоропластным.

Гены компонентов тилакоидных мембран хлоропластов

Тилакоидные мембраны хлоропластов включают в себя четыре функционально различные комплекса: ФС1 и ФСП, цитохромный b/f комплекс и АТФ-синтазу. Пять белковых компонентов ФС1 кодируются хлоропластным геномом. Это гены psaA, psaB, psaC, psal и psaj (табл. 2). Два первых гена (psaA, psaB), кодирующие субъединицы А и В реакционного центра ФС1, у высших растений входят в один оперон. Ген psaC кодирует кофактор-связывающую субъединицу размером 9 кД (Sugiura, 1992; Del Campo et al., 2002).

Хлоропластный геном содержит гены, по крайней мере, 14 компонентов ФСИ (табл. 2).

Табл. 2. Белок-кодирующие пластидные гены (Hagemami, Hagemann, 1994; Allen et al., 2011).

Ген Продукт пена Число аминокислот (у Nicotmna)

Гены рибосомалшых белков 30S субъединица rps 2 CS 2 236 rps J CS 3 218 rps 4 CS 4 201 rps 7 CS 7 155 rps 8 CS 8 134 rps 11 CS II 138 rps 12' CS 12 123 rps 14 CS 14 100 rps 15 CS 15 15 rps J б1 CS 16 86 rps ¡8 CS 18 101 rps 19 CS 19 92

SOS субъединица rpl 2' CL 7 274 rpl 14 CL 14 123 rpl 16' CL 16 134 rpl 20 CL 20 128 rpl 21 CL 21 116 (Marchantía) rpl 22 CL 22 155 rpl 23 CL 23 93 rpl 32 CL 32 55 rpl 33 CL 33 66 rpl 36 CL 36 37

Гены РНК-полимериэы и матургиы rpo А «-субъедкнмца 337 гро В Р-субъедннкца 1070 rpo СУ ¡3'-субъединица 687 rpo С2 (3"-субъед1шица 1392 mat К Интронная матураза (Epijagus)

Гены NA DH-дегидрогеназы ndh А' Субъединица I 364 ndh В' Субъединица 2 387 ndhC Субъедишша 3 120 ndh D Субъеднница4 509 ndh E Субъедииниа 4L 101 ndh F Субъединица 5 710 ndh G Субъединица 6 176 продолжение табл

Ген Продукт гена Число аминокислот у Nkotiana} ndhl "psbG" 284 полипептид 27 кД ndhH ORF 393; субъедннигт 49 кД 393 fn- В ORF 167; 167

18 кД Fe-S-бслок ORF 158 158

Гены поляпегггидов етромы rhcL Большая субъединииа рубиско 477

Inf А Инициируюиш фактор 1 96 т/А Фактор элонгашш EF-Tu

Chlamу domonas) clpP АТФ-зависнмая гтротеаза

Гены фотосистемы 1 psa А P70Ö апопротеия 1а 750 psa В Р700 апопротеик Ib 734 psa С 9 кД Fe-S-бсяок 81 psa J 1-пол1тептил psa J J-иодипептид

Гены фотосистемы II psh л Полшшггшд реакционного центра D, 353 psh В 47 кД хлорофилл апопротеин 508 psh С 43 кД хлорофилл апопротеин 473 psb D Полнпелтид реакционного центра Д 453 psh E а-субъединиш антохрома bsvt 83 psh F /3-субъедмшша цитохрома bS50 39 psb С G -белок 284 psb H Фосфопротеин ЮкД 73 psh! 1-пол1ШС1тщ 4,8 кД 52 psb К К-поллпегпид 3.9 кД psb L L-полипептид ФСИ psbM М-лолипептнд ФСП psb N N-полипсптид ФСП

Гены комплекса цитохром b/f 320 pet A цитохром/ 215 pet В' цитохром 160 pel £> Объедишша IV pei С Субьеднница V: ORF 37

H' АТФаза atp A а-субъедишша 507 atp В ß-субъ единица 498 aipE е-су&ьсдинида 133 arpF' Субъедишша1 184 atp И Субъслинииа III 81 atpI Субъедишша IV 247 Гены с нитронами.

Например, ген psbA кодирует белок D1 молекулярной массой 32 кД, который входит в реакционный центр ФСП, а гены psbB и psbC кодируют, соответственно, белки массой 47 и 43 кД, входящие в состав ФСП (Sugiura,1992). Белок Dl (psbA) вместе с белком D2 (psbD) и цитохром Ь559 (две его субъединицы кодируются, соответственно, генами psbE и psbF) составляют реакционный центр ФСП. Из семи компонентов, входящих в цитохромный b/f комплекс, пять кодируются хлоропластной ДНК (табл. 2). Продуктом гена petA является цитохром f, petB -цитохром Ьб. Гены petB и petD у высших растений входят в состав единого оперона с генами ФСП - psbB и psbH. АТФ-синтазу составляют два комплекса: CFi и CF0. Первый состоит из пяти, второй - из четырех субъединиц. Хлоропластный геном кодирует три субъединицы - а, ß и е - CFj комплекса и три субъединицы - I, III и

IV - CF0 комплекса (табл. 2).

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Алейникова, Анастасия Юрьевна

6. Выводы

1. На основании анализа транскрипции 30 генов, входящих в состав 7 пластидных оперонов, установлена дифференциальная регуляции их транскрипции. Показано, что гены гроВ оперона, кодирующие субъединицы одного белкового комплекса, транскрибируются равномерно, в то время как гены ггп16, гр$2, рзаА и аХрВ оперонов, кодирующие функционально не связанные белки или РНК, транскрибируются неравномерно.

5. Совокупность наших результатов подтверждает гипотезу о том, что пластидные опероны, состоящие из генов, кодирующих функционально различные белки или РНК, требуют дополнительной внутриоперонной регуляции транскрипции, которая может осуществляться с участием внутриоперонных промоторов, последовательностей ДНК, ослабляющих транскрипцию, а так же с вовлечением специфичных РНК-связывающих белков, обладающих высокой РНКазной активностью.

5. Заключение

Регуляции экспрессии генов является одной из наиболее широко исследуемых проблем в молекулярной биологии. Именно экспрессия генов, в конечном счете, определяет количество синтезированных в клетке тРНК, рРНК и белков. Долгое время считалось, что регуляция экспрессии индивидуальных генов в хлоропластах осуществляется точно также как в прокариотических предшественниках, однако со временем стали накапливаться факты, которые не укладывались в такое представление. Вероятно, в процессе ко-эволюции как в пластоме, так и в ядре клетки-хозяина, произошли изменения, которые привели к формированию регуляции экспрессии не свойственной для оперонной системы прокариот - регуляции транскрипции индивидуальных генов в составе пластидных оперонов.

В данной диссертации изучался именно этот этап экспрессии хлоропластных оперонов. Основным результатом является установление факта дифференциальной регуляции транскрипции индивидуальных генов в составе оперонов под действием разных факторов.

Такой вывод сделан на основании изучения интенсивности транскрипции генов пластидных оперонов листьев растений разного возраста, базальной и апикальной частей листа, отличающихся различным состоянием хлоропластов, на основании изучения влияния на лист фитогормонов - АБК и МеЖа, а также листьев бесхлорофилльного мутанта ячменя albostrians. Построены временные кривые синтеза 32Р-РНК в условиях in vitro. В работе изучена интенсивность транскрипции генов, входящих в состав 7 оперонов у 4-, 9- и 18-дневных растений ячменя, и было показано, что гены в составе оперонов могут дифференциально транскрибироваться. На основании предварительных результатов для детального анализа были выбраны пять участков оперонов, которые включают зоны «перепадов» интенсивности транскрипции генов.

На основании детального изучения интенсивности транскрипции выбранных участков опероны можно условно разделить на две группы (табл.10). В первую группу можно отнести гроВ оперон, все гены которого кодируют субъединицы РНК-полимеразы бактериального типа, и имеют довольно равномерную интенсивность транскрипции, которая практически не зависит от всех вышеперечисленных факторов, что говорит о высокой консервативности транскрипции этого оперона. Вторая группа оперонов более разнообразна, как по составу генов, так и по их регуляции. В нее вошли опероны, чей профиль интенсивности транскрипции генов менялся под действием какого-то одного фактора (например, в листьях бесхлорофилльного мутанта ячменя, ШрВ оперон), или же под действием нескольких факторов (например, в листьях а1Ьоз№ат мутанта и под действием - АБК или изменение с возрастом в зеленых растениях (гря2 и ггп1б опероны, соответственно).

Табл. 10. Изменение профиля транскрипции генов изучаемых оперонов под действием экзогенных и эндогенных факторов.

Название оперона Изменение профиля интенсивности транскрипции

Возраст растений Апикальная и базальная части листа Обработка АБК Время синтеза РНК in vitro albostrians мутант гроВ — — — — — psaA — — + +/- — rps2 — — + — + atpB — — — + rrnl6 + — — +

Другой важный результат нашей работы заключается в установлении факта терминации транскрипции atpB оперона на участке 3'-нетранслируемой области atpE гена, комплементарном кодирующей и промоторной областям trnM гена. В литературе обсуждается такая возможность. В хлоропластном геноме тРНК часто располагаются одиночно на комплементарной нити ДНК и транскрибируются в противоположном направлении относительно оперонных транскриптов, например, trnW ген относительно petLG оперона, trnS-GGA относительно trnT-rps4-ycß генов, trnS-GCU -psbK оперона, trnH- trnl-rpl23-rpsl 1-rpoA, trnN-rrnlö оперона.

Относительно недавно было высказано предположение, согласно которому инициация транскрипции генов, расположенных на комплементарной нити, может регулировать смысловую транскрипцию генов (Zhelyazkova et al., 2012). Было показано, что инициация транскрипции генов, в особенности тРНК, начинается на значительном расстоянии от их кодирующей область (1000-10000 н.п.), в зоне, где на комплементарной нити располагаются функциональные гены, например: транскрипция trnC-GCA в зеленых растениях ячменя инициируется с промотора (TtrnC-12426), расположенного в начале кодирующей области atpl гена.

Кроме того, показано, что в белых растениях идет транскрипция и накопление пре-рРНК rrnlö гена даже в отсутствие рибосом. Однако не происходит созревание этого транскрипта.

Из литературных данных известно, что 16S рРНК стабилизируется за счет связывания с хлоропластными рибосомными белками. На основании этого предполагают, что в отсутствии рибосом не происходит накопление этих транскриптов. Однако мы показали, что у белого мутанта ячменя albostrians, этот ген активно транскрибируется и его пре-РНК накапливается до столь же высокого уровня, как и у зеленых растений, несмотря на то, что созревание пре-РНК этого гена, у бесхлорофилльного мутанта не происходит (Vogel and Hess, 2001).

Таким образом, детальный анализ интенсивности транскрипции генов в оперонах показывает, что опероны, которые состоят из генов, кодирующих функционально различные белки или РНК, требуют дополнительной внутри оперонной регуляции транскрипции. Такая регуляция может заключаться, как в увеличении интенсивности транскрипции одного из генов за счет наличия собственного внутри оперонного промотора, так и в уменьшении транскрипции за счет ее терминации. Вероятно, не меньший вклад в регуляцию транскрипции хлоропластных генов в составе оперонов вносит стабилизация их транскриптов. Полученные данные важны для понимания фундаментальных основ регуляции экспрессии пластома. Дальнейшие исследования должны быть направлены на точную локализацию и экспериментальное доказательство наличия внутри пластидных оперонов и регуляторных элементов, участвующих, как в активации, так и в подавлении транскрипции индивидуальных генов, а так же на изучение белковых факторов, отвечающих за регуляцию этих цис-элеменов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алейникова, Анастасия Юрьевна, Москва

1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж. (1994)

2. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. Т. 1. М.: Мир, 517 с.

3. Антонов А.С. (2006) Геносистематика растений. М.:ИКЦ Академкнига, 293 с.

4. Даниленко Н.Г, Давыденко О.Г. (2003) Миры геномов органелл. Мн.:1. Технология, 494 с.

5. Зубо Я.О. (2006) Гормональная регуляция транскрипции хлоропластных геновячменя. Дисс. кадн. биол. наук, Москва, 137 с.

6. Зубо Я.О., Кузнецов В.В. (2008) Применение метода run-on транскрипции дляизучения регуляции экспрессии пластидного генома. Физиология растений, 55, 114-122.

7. Лысенко Е.А., Кузнецов В.В. (2005) РНК-полимеразы пластид. Молекулярнаябиология, 39, 762-775.

8. Кузнецов В.В. (1995) Гормональная регуляция биогенеза хлоропластов. Дисс.докт. биол. наук, Москва, 311с.

9. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии.

10. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. М.: Мир, 1984, 480 с.

11. Селиверстов А.В., Лысенко Е.А., Любецкий В.А. (2009) Быстрая эволюцияпромоторов пластомных генов ndhF у цветковых растений. Физиология растений, 56(6), 926-934.

12. Юрина Н.П., Одинцова М.С. (1991) Экспрессия генома хлоропластов и ее регуляция. Генетика, 27, 1125-1134.

13. Юрина Н.П., Одинцова М.С. (1998) Сравнительная характеристика структурной организации генома хлоропластов и митохондрий растений. Генетика, 34, 5-22.

14. Ямбуренко М.В. (2008) Роль фитогормонов и света в регуляции транскрипции хлоропластных генов в ячмене. Дисс. кадн. биол. наук, Москва, 160 с.

15. Allen J.F. (2003) The function of genomes in bioenergetic organelles. Philos Trans R Soc bond В Biol Sci., 358(1429): 19-38.

16. Allen J.F., de Paula W.B., Puthiyaveetil S., Nield J. (2011) A structural phylogenetic map for chloroplast photosynthesis. Trends Plant Sci., 16(12), 645-55.

17. Allison L.A., Simon L.D., Maliga P. (1996) Deletion of rpoB reveals a second distinct transcription system in plastids of higher plants. EMBO J., 15(11), 2802-9.

18. Anthonisen I.L., Kasai S., Kato K., Salvador M.L., Klein U. (2002) Structural and functional characterization of a transcription-enhancing sequence element in the rbcL gene of the Chlamydomonas chloroplast genome. Curr Genet., 41(5), 349-56.

19. Baeza L., Bertrand A., Mache R., Lerbs-Mache S. (1991) Characterization of a protein binding sequence in the promoter region of the 16S rRNA gene of the spinach chloroplast genome. Nucleic Acids Res., 19(13), 3577-81.

20. Baginsky S., Tiller K., Pfannschmidt T., Link G. (1999) PTK, the chloroplast RNA polymerase-associated protein kinase from mustard (<Sinapis alba), mediates redox control of plastid in vitro transcription. Plant Mol Biol., 39(5), 1013-23.

21. Barbrook A.C., Howe C.J., Purton S. (2006) Why are plastid genomes retained in non-photosynthetic organisms? Trends Plant Sci., 11(2), 101-8.

22. Barkan A. (1993) Nuclear mutants of maize with defects in chloroplast polysome assembly have altered chloroplast RNA metabolism. Plant Cell, 5, 389-402.

23. Barne K.A., Bown J.A., Busby S.J., Minchin S.D. (1997) Region 2.5 of the

24. Escherichia coli RNA polymerase sigma70 subunit is responsible for the recognition of the extended-10 motif at promoters. EMBO J., 16(13), 4034-40.

25. Bartel D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 281-297.

26. Beardslee T.A., Roy-Chowdhury S., Jaiswal P., Buhot L., Lerbs-Mache S., Stern D.B., Allison L.A. (2002) A nucleus-encoded maize protein with sigma factor activity accumulates in mitochondria and chloroplasts. Plant J., 31(2), 199-209.

27. Beick S., Schmitz-Linneweber C., Williams-Carrier R., Jensen B., Barkan A. (2008) The pentatricopeptide repeat protein PPR5 stabilizes a specific tRNA precursor in maize chloroplasts. Mol Cell Biol., 28(17):5337-5347.

28. Bendich A.J. (2004) Circular chloroplast chromosomes: the grand illusion. Plant Cell, 16(7): 1661-6.

29. Birnboim H.C., Doly J. (1979) A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res., 7(6): 1513-23.

30. Bligny M., Courtois F., Thaminy S., Chang C.C., Lagrange T., Baruah-Wolff J., Stern D., Lerbs-Mache S. (2000) Regulation of plastid rDNA transcription by interaction of CDF2 with two different RNA polymerases. EMBOJ., 19(8), 1851-60.

31. Bohne A.V., Ruf S., Borner T., Bock R. (2007) Faithful transcription initiation from a mitochondrial promoter in transgenic plastids. Nucleic Acids Res., 35(21), 7256-66.

32. Boilenbach T.J., Schuster G., Stern D.B. (2004) Cooperation of endo- and exoribonucleases in chloroplast mRNA turnover. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol., 78, 305-37.

33. Boilenbach T., Schuster G., Portnoy V. and Stern D.B. (2007) Polyadenylation, processing and degradation of chloroplast RNA. Topics in Current Genetics, 19:175211.

34. Bonen L., Vogel J. (2001) The ins and outs of group II introns. Trends Genet., 17(6), 322-31.

35. Boudreau E., Nickelsen J., Lemaire S., Ossenbühl F., Rochaix J-D. (2000) The Nac2 gene of Chlamydomonas reinhardtii encodes a chloroplast TPR protein involved in psbD mRNA stability, processing and/or translation. EMBOJ., 19:3366-3376.

36. Boyer S.K. and Mullet J.E. (1986) Characterization of P. sativum chloroplast psbA transcripts produced in vivo, in vitro and in E. coli. Plant Molecular Biology, 6(4), 229243.

37. Brennicke A., Grohmann L., Hiesel R., Knoop V. and Schuster W. (1993). The mitochondrial genome on its way to the nucleus: Different stages of gene transfer in higher plants. FEBSLett, 325, 140-145.

38. Britton R.A., Wen T., Schaefer L., Pellegrini O., Uicker W.C., Mathy N., Tobin C., Daou R., Szyk J., Condon C. (2007) Maturation of the 5' end of Bacillus subtilis 16S rRNA by the essential ribonuclease YkqC/RNase Jl. Mol Microbiol., 63(1): 127-38.

39. Cahoon A.B., Harris F.M., Stern D.B. (2004) Analysis of developing maize plastids reveals two mRNA stability classes correlating with RNA polymerase type. EMBO Rep., 5(8), 801-6.

40. Canino G., Bocian E., Barbezier N., Echeverría M., Forner J., Binder S., Marchfelder A. (2009) Arabidopsis encodes four tRNase Z enzymes. Plant Physiol., 150, 1494-1502.

41. Casano L.M., Martin M. and Sabater B. (2001). Hydrogen peroxide mediates the induction of chloroplastic Ndh complex under photooxidative stress in barley. Plant Physiol., 125: 1450-1458.

42. Chen L.J., Orozco E.M. Jr. (1988) Recognition of prokaryotic transcription terminators by spinach chloroplast RNA polymerase. Nucleic Acids Res., 16(17), 841131.

43. Chory J. (2010) Light signal transduction: an infinite spectrum of possibilities. Plant J., 61(6), 982-91.

44. Christopher DA, Kim M, Mullet JE. (1992) A novel light-regulated promoter is conserved in cereal and dicot chloroplasts. Plant Cell., 4(7), 785-98.

45. Chun L., Kawakami A., Christopher D.A. (2001) Phytochrome A mediates blue light and UV-A-dependent chloroplast gene transcription in green leaves. Plant Physiol., 125(4), 1957-66.

46. Del Campo E.M. (2009) Post-transcriptional control of chloroplast gene expression. Gene Regul Syst Bio., 3:31-47.

47. Del Campo E.M., Sabater B., Martin M. (2002) Post-transcriptional control of chloroplast gene expression. Accumulation of stable psaC mRNA is due to downstream RNA cleavages in the ndhD gene. J Biol Chem., 277(39), 36457-36464.

48. Dinkins R.D., Bandaranayake H., Baeza L., Griffiths A.J.F. and Green B.R. (1997) hep, a nuclear photosynthetic electron transport mutant of Arabidopsis thaliana with a pleiotropic effect on chloroplast gene expression. Plant Physiol, 113, 1023-1031.

49. Drager R.G., Girard-Bascou J., Choquet Y., Kindle K.L., Stern D.B. (1998) In vivo evidence for 5-3' exoribonuclease degradation of an unstable chloroplast mRNA. Plant J., 13(l):85-96.

50. Drapier D., Girard-Bascou J. and Wollman F.-A. (1992) Evidence for nuclear control of the expression of the atpA and atpB chloroplast genes in Chlamydomonas. Plant Cell, 4, 283-295.

51. Eisermann A., Tiller K., Link G. (1990) In vitro transcription and DNA binding characteristics of chloroplast and etioplast extracts from mustard (Sinapis alba) indicate differential usage of the psbA promoter. EMBOJ., 9(12), 3981-7.

52. Ellis R.J., Hartley M.R. (1971) The sites of synthesis of chloroplast proteins. Biochem J., 124(2), 11-12.

53. Emanuel C., Weihe A., Graner A., Hess W.R., Börner T. (2004) Chloroplast development affects expression of phage-type RNA polymerases in barley leaves. Plant J., 38(3), 460-72.

54. Emanuel C., von Groll U., Müller M., Börner T., Weihe A. (2006) Developmental tissue-specific expression of the RpoT gene family of Arabidopsis encoding mitochondrial and plastid RNA polymerases. Planta, 223(5), 998-1009.

55. Fargo D.C., Boynton J.E., Gillham N.W. (2001) Chloroplast ribosomal protein S7 of Chlamydomonas binds to chloroplast mRNA leader sequences and may be involved in translation initiation. Plant Cell, 13:207-218.

56. Favory J.J., Kobayshi M., Tanaka K., Peltier G., Kreis M., Valay J.G., Lerbs-Mache S. (2005) Specific function of a plastid sigma factor for ndhF gene transcription. Nucleic Acids Res., 33(18), 5991-9.

57. Fisk D.G., Walker M.B., Barkan A. (1999) Molecular cloning of the maize gene crpl reveals similarity between regulators of mitochondrial and chloroplast gene expression. EMBOJ., 18(9):2621-2630.

58. Gao L., Yi X., Yang Y.X., Su Y.J., Wang T. (2009) Complete chloroplast genome sequence of a tree fern Alsophila spinulosa: insights into evolutionary changes in fern chloroplast genomes. BMC Evol Biol., 9, 130.

59. Georg J., Honsel A., Voss B., Rennenberg H. and Hess W.R. (2010). A long antisense RNA in plant chloroplasts. New Phytol. 186:615-622.

60. Georg J., Voss B., Scholz I., Mitschke J., Wilde A. and Hess W.R. (2009) Evidence for a major role of antisense RNAs in cyanobacterial gene regulation. Mol. Syst. Biol. 5: 305.

61. Gothandam K.M., Kim E.S., Cho H.J., Chung Y.Y. (2005) OsPPRl, a pentatricopeptide repeat protein of rice is essential for the chloroplast biogenesis. Plant Mol Biol., 58(3):421-433.

62. Green B.R. (2011) Chloroplast genomes of photosynthetic eukaryotes. Plant J., 66(l):34-44.

63. Gruissem W., Elsner-Menzel C., Latshaw S., Narita J.O., Schaffer M.A., Zurawski

64. G. (1986) A subpopulation of spinach chloroplast tRNA genes does not require upstream promoter elements for transcription. Nucleic Acids Res., 14(19), 7541-56.

65. Gumpel N.J., Ralley L., Girard-Bascou J., Wollman F.A., Nugent J.H., Purton S. (1995) Nuclear mutants of Chlamydomonas reinhardtii defective in the biogenesis of the cytochrome b6f complex. Plant Mol Biol., 29(5):921-32.

66. Hagemann R., Hagemann M. (1994) Extranuclear inheritance: Plastid Genetics. Progress in Botany, 55: 260-275.

67. Hajdukiewicz P.T., Allison L.A., Maliga P. (1997) The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the plastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids. EMBO J., 16(13), 4041-8.

68. Hakimi M.A., Privat L, Valay J.G., Lerbs-Mache S. (2000) Evolutionary conservation of C-terminal domains of primary sigma(70)-type transcription factors between plants and bacteria. J Biol Chem., 275(13), 9215-21.

69. Han C.-D., Patrie W., Polacco M. and Coe E.H. (1993). Aberrations in plastid transcripts and deficiency of plastid DNA in striped and albino mutants in maize. Planta, 191, 552-563.

70. Hashimoto M., Endo T., Peltier G., Tasaka M., Shikanai T. (2003) A nucleus-encoded factor, CRR2, is essential for the expression of chloroplast ndhB in Arabidopsis. Plant J., 36(4):541-549.

71. Hattori M., Miyake H., Sugita M. (2007) A pentatricopeptide repeat protein is required for RNA processing of clpP pre-mRNA in moss chloroplasts. J Biol Chem., 282(14), 10773-10782.

72. Haugen P., Simon D.M., Bhattacharya D. (2005) The natural history of group I introns. Trends Genet., 21(2): 111-9.

73. Hayashi K., Shiina T., Ishii N., Iwai K., Ishizaki Y., Morikawa K., Toyoshima Y. (2003) A role of the -35 element in the initiation of transcription at psbA promoter in tobacco plastids. Plant Cell Physiol, 44(3), 334-41.

74. Hayes M.L., Reed M.L., Hegeman C.E., Hanson M.R. (2006) Sequence elements critical for efficient RNA editing of a tobacco chloroplast transcript in vivo and in vitro. Nucleic Acids Res., 34(13):3742-54.

75. Hayes R., Kudla J., Schuster G., Gabay L., Maliga P., Gruissem W. (1996) Chloroplast mRNA 3'-end processing by a high molecular weight protein complex is regulated by nuclear encoded RNA binding proteins. EMBO J., 15(5): 1132-41.

76. Hegeman C.E., Halter C.P., Owens T.G. and Hanson M.R. (2005) Expression of complementary RNA from chloroplast transgenes affects editing efficiency of transgene and endogenous chloroplast transcripts. Nucleic Acids Res. 33, 1454-1464.

77. Herrmann R.G., Possingham J.V. (1980) Plastid DNA-the plastome. Results Probl Cell Differ., 10,45-96.

78. Hess W.R., Blank-Huber M., Fieder B., Borner T., Rudiger W. (1992) Chlorophyll synthetase and chloroplast tRNAglu are present in heat-bleached, ribosome-deficient plastids. J. Plant Physiol., 139, 427-430.

79. Hess W.R., Hoch B., Zeltz P., Hubschmann T., Kossel H., Borner T. (1994) Inefficient rpl2 splicing in barley mutants with ribosome-deficient plastids. Plant Cell, 6(10), 1455-65.

80. Hess W.R., Börner T. (1999) Organellar RNA polymerases of higher plants. Int Rev Cytol., 190, 1-59.

81. Hirose T, Sugiura M. (2001) Involvement of a site-specific trans-acting factor and a common RNA-binding protein in the editing of chloroplast mRNAs: development of a chloroplast in vitro RNA editing system. EM BO J., 20(5), 1144-52.

82. Hoffer P.H., Christopher D.A. (1997) Structure and blue-light-responsive transcription of a chloroplast psbD promoter from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol., 115(1), 213-22.

83. Homann A., Link G. (2003) DNA-binding and transcription characteristics of three cloned sigma factors from mustard (Sinapis alba L.) suggest overlapping and distinct roles in plastid gene expression. Eur JBiochem., 270(6), 1288-300.

84. Hotto A.M., Huston Z.E. and Stern D.B. (2010) Overexpression of a natural chloroplast-encoded antisense RNA in tobacco destabilizes 5S rRNA and retards plant growth. BMC Plant Biol., 10, 213.

85. Hübschmann T, Börner T. (1998) Characterisation of transcript initiation sites in ribosome-deficient barley plastids. Plant Mol Biol., 36(3), 493-6.

86. Hübschmann T., Hess W.R., Börner T. (1996) Impaired splicing of the rpsl2 transcript in ribosome-deficient plastids. Plant Mol Biol., 30(1), 109-23.

87. Inada H., Seki M., Morikawa H., Nishimura M., Iba K. (1997) Existence of three regulatory regions each containing a highly conserved motif in the promoter of plastid-encoded RNA polymerase gene (rpoB). Plant J., 11(4), 883-90.

88. Jahn D. (1992) Expression of the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast tRNA(Glu) gene in a homologous in vitro transcription system is independent of upstream promoter elements. Arch Biochem Biophys., 298(2), 505-13.

89. Kanno A., Hirai A. (1993) A transcription map of the chloroplast genome from rice (Oryza sativa). Curr Genet. 23(2), 166-74.

90. Kapoor S., Sugiura M. (1999) Identification of two essential sequence elements in the nonconsensus type II PatpB-290 plastid promoter by using plastid transcription extracts from cultured tobacco BY-2 cells. Plant Cell, 11(9), 1799-810.

91. Kapoor S., Wakasugi T., Deno H., Sugiura M. (1994) An atpE-specific promoter within the coding region of the atpB gene in tobacco chloroplast DNA. Curr Genet., 26(3), 263-8.

92. Karcher D., Bock R. (2002) The amino acid sequence of a plastid protein is developmentally regulated by RNA editing. J Biol Chem277(7), 5570-4.

93. Kasai K., Kanno T., Endo Y., Wakasa K., Tozawa Y. (2004) Guanosine tetra-and pentaphosphate synthase activity in chloroplasts of a higher plant: association with 70S ribosomes and inhibition by tetracycline. Nucleic Acids Res., 32(19), 5732-41.

94. Kestermann M., Neukirchen S., Kloppstech K., Link G. (1998) Sequence and expression characteristics of a nuclear-encoded chloroplast sigma factor from mustard (Sinapis alba). Nucleic Acids Res., 26(11), 2747-53.

95. Kim M., Mullet J.E. (1995) Identification of a sequence-specific DNA binding factor required for transcription of the barley chloroplast blue light-responsive psbD-psbC promoter. Plant Cell, 7(9), 1445-57.

96. Kim M., Christopher D.A., Mullet J.E. (1993) Direct evidence for selective modulation of psb A, rpoA, rbcL and 16S RNA stability during barley chloroplast development. Plant Mol Biol., 22(3):447-63.

97. Kim T.K., Zhao Y., Ge H., Bernstein R., Roeder R.G. (1995) TATA-binding protein residues implicated in a functional interplay between negative cofactor NC2 (Drl) and general factors TFIIA and TFIIB. J Biol Chem., 270(18), 10976-81.

98. Klein R.R., Mullet J.E. (1990) Light-induced transcription of chloroplast genes. psb A transcription is differentially enhanced in illuminated barley. J Biol Chem., 265(4), 1895-902.

99. Kleine T., Maier U.G., Leister D. (2009) DNA transfer from organelles to the nucleus: the idiosyncratic genetics of endosymbiosis. Annu Rev Plant Biol., 60:115-38.

100. Kotera E., Tasaka M., Shikanai T. (2005) A pentatricopeptide repeat protein is essential for RNA editing in chloroplasts. Nature, 433(7023):326-330.

101. Krause K., Berg S., Krupinska K. (2003) Plastid transcription in the holoparasitic plant genus Cuscuta: parallel loss of the rrnl6 PEP-promoter and of the rpoA and rpoB genes coding for the plastid-encoded RNA polymerase. Planta, 216(5), 815-23.

102. Krause K., Dieckmann C.L. (2004) Analysis of transcription asymmetries along the tRNAE-COB operon: evidence for transcription attenuation and rapid RNA degradation between coding sequences. Nucleic Acids Res., 32(21), 6276-83.

103. Krinke L., Wulff D.L. (1990) RNase Ill-dependent hydrolysis of lambda cII-0 gene mRNA mediated by lambda OOP antisense RNA. Genes Dev., 4(12A), 2223-33.

104. Kudla J., Igloi G.L., Metzlaff M., Hagemann R., Kossel H. (1992) RNA editing in tobacco chloroplasts leads to the formation of a translatable psbL mRNA by a C to U substitution within the initiation codon. EMBO J., 11(3), 1099-103.

105. Kulaeva O.N., Burhanova E.A., Karavaiko N.N., Selivankina S.Y., Porfirova S.A., Maslova G.G., Zemlyachenko Y.V., Borner T. (2002) Chloroplasts affect the leaf response to cytokinin. J Plant Physiol., 159: 1308-1316

106. Lahiri S.D., Allison L.A. (2000) Complementary expression of two plastid-localized sigma-like factors in maize. Plant Physiol., 123(3), 883-94.

107. Lahmy S., Barneche F., Derancourt J., Filipowicz W., Delseny M. and Echeverria M. (2000) A chloroplastic RNA-binding protein is a new member of the PPR family. FEBSLett., 480(2-3), 255-260.

108. Lam E., Hanley-Bowdoin L., Chua N.H. (1988) Characterization of a chloroplast sequence-specific DNA binding factor. J Biol Chem., 263(17), 8288-93.

109. Lerbs-Mache S. (2000) Regulation of rDNA transcription in plastids of higher plants. Biochimie, 82(6-7), 525-35.

110. Lerbs-Mache S. (2011) Function of plastid sigma factors in higher plants: regulation of gene expression or just preservation of constitutive transcription? Plant Mol. Biol., 76(3-5), 235-49.

111. Levy H., Kindle K.L. and Stern D.B. (1997) A nuclear mutation that affects the 3processing of several mRNAs in Chlamydomonas chloroplasts. Plant Cell, 9, 825836.

112. Liere K., Link G. (1994) Structure and expression characteristics of the chloroplast DNA region containing the split gene for tRNA(Gly) (UCC) from mustard {Sinapis albaL.). Curr Genet., 26(5-6), 557-63.

113. Liere K., Maliga P. (1999) In vitro characterization of the tobacco rpoB promoter reveals a core sequence motif conserved between phage-type plastid and plant mitochondrial promoters. EMBOJ., 18(1), 249-57.

114. Liere K, Weihe A, Börner T. (2011) The transcription machineries of plant mitochondria and chloroplasts: Composition, function, and regulation. J Plant Physiol., 168(12), 1345-60.

115. Liere K. and Börner T. (2007) Transcription and transcriptional regulation in plastids. In Cell and Molecular Biology of Plastids, R. Bock, ed (Berlin/Heidelberg: Springer), 121-174.

116. Liere K., Börner T. (2006) Transcription of plastid genes. In: K. D. Grasser (ed.) Regulation of Transcription in Plants. Blackwell Publishing Ltd., Oxford, pp. 184-224.

117. Liere K., Link G. (1995) RNA-binding activity of the matK protein encoded by the chloroplast trnK intron from mustard (Sinapis alba L.). Nucleic Acids Res., 23(6), 917-21.

118. Lilly J.W., Havey M.J., Jackson S.A., Jiang J. (2001) Cytogenomic analyses reveal the structural plasticity of the chloroplast genome in higher plants. Plant Cell, 13(2), 245-54.

119. Lisitsky I., Schuster G. (1995) Phosphorylation of a chloroplast RNA-binding protein changes its affinity to RNA. Nucleic Acids Res., 23, 2506-2511.

120. Loschelder H., Schweer J., Link B., Link G. (2006) Dual temporal role of plastid sigma factor 6 in Arabidopsis development. Plant Physiol., 142(2), 642-50.

121. Lung B., Zemann A., Madej M.J., Schuelke M., Techritz S., Ruf S., Bock R., and Hiittenhofer A. (2006) Identification of small noncoding RNAs from mitochondria and chloroplasts. Nucleic Acids Res. 34, 3842-3852.

122. Lysenko E.A. (2007) Plant sigma factors and their role in plastid transcription. Plant Cell Rep., 26, 845-859.

123. Lysenko E.A. (2010) Plastid Transcription: Bacterial core with Eukaryotic extension// In: Ashwani Kumar (ed), Plant genetic transformation and molecular markers. Pointer Publishers, Jaipur, 66-86.

124. Lyttleton J.W. (1962) Isolation of ribosomes from spinach chloroplasts. Exp. Cell Res.,26, 312-7.

125. Maier R.M., Neckermann K., Igloi G.L., Kössel H. (1995) Complete sequence of the maize chloroplast genome: gene content, hotspots of divergence and fine tuning of genetic information by transcript editing. J Mol Biol., 251(5), 614-28.

126. Martin W. (2003) Gene transfer from organelles to the nucleus: frequent and in big chunks. Proc Natl Acad Sci. USA., 100(15), 8612-4.

127. Maul J.E., Lilly J.W., Cui L., dePamphilis C.W., Miller W., Harris E.H., Stern D.B. (2002) The Chlamydomonas reinhardtii plastid chromosome: islands of genes in a sea of repeats. Plant Cell, 14(11), 2659-79.

128. Mayfield S.P., Yohn C.B., Cohen A., Danon A. (1995) Regulation of chloroplast gene expression. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 46, 147-166.

129. Meierhoff K., Felder S., Nakamura T., Bechtold N., Schuster G. (2003) HCF152, an Arabidopsis RNA binding pentatricopeptide repeat protein involved in the processing of chloroplast psbB-psbT-psbH-petB-petD RNAs. Plant Cell, 15(6), 148095.

130. Meurer J., Berger A. and Westhoff P. (1996) A nuclear mutant of Arabidopsis with impaired stability on distinct transcripts of the plastid psbB , psbD/C, ndhH and ndhC operons. Plant Cell, 8, 1193-1207.

131. Michel F., Ellington A.D., Couture S., Szostak J.W. (1990) Phylogenetic and genetic evidence for base-triples in the catalytic domain of group I introns. Nature, 347(6293), 578-80.

132. Miyagi T., Kapoor S., Sugita M., Sugiura M. (1998) Transcript analysis of the tobacco plastid operon rps2/atpI/H/F/A reveals the existence of a non-consensus type II (NCII) promoter upstream of the atpl coding sequence. Mol Gen Genet., 257(3), 299307.

133. Monde R.A., Schuster G., Stern D.B. (2000) Processing and degradation of chloroplast mRNA. Biochimie., 82(6-7), 573-82.

134. Monod C., Goldschmidt-Clermont M., Rochaix J.D. (1992) Accumulation of chloroplast psbB RNA requires a nuclear factor in Chlamydomonas reinhardtii. Mol Gen Genet., 231(3), 449-59.

135. Morikawa K., Shiina T., Murakami S., Toyoshima Y. (2002) Novel nuclear-encoded proteins interacting with a plastid sigma factor, Sigl, in Arabidopsis thaliana. FEBSLett., 514(2-3), 300-4.

136. Mullet J.E., Klein R.R. (1987) Transcription and RNA stability are important determinants of higher plant chloroplast RNA levels. EMBO J., 6(6), 1571-9.

137. Mullet J.E., Klein P.G., Klein R.R. (1990) Chlorophyll regulates accumulation of the plastid-encoded chlorophyll apoproteins CP43 and D1 by increasing apoprotein stability. Proc Natl Acad Sci USA., 87(11), 4038-42.

138. Murakami K.S., Masuda S., Campbell E.A., Muzzin O., Darst S.A. (2002) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science, 296(5571), 1285-90.

139. Murakami S., Kuehnle K., Stern D.B. (2005) A spontaneous tRNA suppressor of a mutation in the Chlamydomonas reinhardtii nuclear MCD1 gene required for stability of the chloroplastpetD mRNA. Nucleic Acids Res., 33(10), 3372-80.

140. Nakahira Y., Baba K., Yoneda A., Shiina T., Toyoshima Y. (1998) Circadian-regulated transcription of the psbD light-responsive promoter in wheat chloroplasts. Plant Physiol., 118(3), 1079-88.

141. Nakamura T., Meierhoff K., Westhoff P., Schuster G. (2003) RNA-binding properties of HCF152, an Arabidopsis PPR protein involved in the processing of chloroplast RNA. Eur J Biochem., 270(20), 4070-4081.

142. Nakamura T., Ohta M., Sugiura M., Sugita M. (2001) Chloroplast ribonucleoproteins function as a stabilizing factor of ribosome-free mRNAs in the stroma. J Biol Chem., 276, 147-152.

143. Nickelsen J., Link G. (1993) The 54 kDa RNA binding protein from mustard chloroplasts mediates endonucleolytic transcript 3-end formation in vitro. Plant J., 3, 537-544.

144. Nickelsen J., Link G. (1990) Nucleotide sequence of the mustard chloroplast genes trnH and rpsl9. Nucleic Acids Res., 18(4), 1051.

145. Nickelsen J., Link G. (1991) RNA-protein interactions at transcript 3' ends and evidence for trnK-psbA co-transcription in mustard chloroplasts. Mol Gen Genet., 228(1-2), 89-96.

146. Nickelsen J. (2003) Chloroplast RNA-binding proteins. Curr. Genet., 43(6), 392399.

147. Nickelsen N. (1998) Chloroplast RNA stability. In J-D Rochaix, M Goldschmidt-Clermont, S Merchant, eds, Molecular Biology of Chlamydomonas: Chloroplasts and Mitochondria, Vol 7., Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, 151163.

148. Nishimura Y., Kikis E.A., Zimmer S.L., Komine Y. and Stern D.B. (2004) Antisense transcript and RNA processing alterations suppress instability of polyadenylated mRNA in Chlamydomonas chloroplasts. Plant Cell, 16, 2849-2869.

149. Okuda K., Myouga F., Motohashi R., Shinozaki K., Shikanai T. (2007) Conserved domain structure of pentatricopeptide repeat proteins involved in chloroplast RNA editing. Proc Natl Acad Sci USA., 322, 572-574.

150. Okuda K., Nakamura T., Sugita M., Shimizu T., Shikanai T. (2006) A pentatricopeptide repeat protein is a site recognition factor in chloroplast RNA editing. J Biol Chem., 281(49), 37661-37667.

151. Oliver R. and Poulsen C. (1984) Structure of a heavily transcribed region of barley chloroplast DNA. Transfer RNA genes for serine (UGA), glycine (GCC, UCC), formyl-methionine and threonine {GG\S).Carlsberg Res. Commun. 49, 647-673.

152. Opdyke J.A., Kang J.G., Storz G. (2004) GadY, a small-RNA regulator of acid response genes in Escherichia coli. J. Bacteriol., 186(20), 6698-705.

153. Ostersetzer O., Cooke A.M., Watkins K.P., Barkan A. (2005) CRS1, a chloroplast group II intron splicing factor, promotes intron folding through specific interactions with two intron domains. Plant Cell., 17(1), 241-55.

154. Pfalz J., Liere K., Kandlbinder A., Dietz K.-J. and Oelmüller R. (2006) pTAC2, -6 and -12 are components of the transcriptionally active plastid chromosome that are required for plastid gene expression. The Plant Cell, 18, 176-197.

155. Pfannschmidt T., Link G. (1994) Separation of two classes of plastid DNA-dependent RNA polymerases that are differentially expressed in mustard (Sinapis alba L.) seedlings. Plant Mol Biol., 25(1), 69-81.

156. Pfannschmidt T., Link G. (1997) The A and B forms of plastid DNA-dependent RNA polymerase from mustard (Sinapis alba L.) transcribe the same genes in a different developmental context. Mol Gen Genet., 257(1), 35-44.

157. Pfannschmidt T. (2003) Chloroplast redox signals: how photosynthesis controls its own genes. Trends Plant Sei., 8(1), 33-41.

158. Pfannschmidt T. (2010) Plastidial retrograde signalling-a true "plastid factor" or just metabolite signatures? Trends Plant Sei., 15(8), 427-35.

159. Phinney B.S., Thelen J.J. (2005) Proteomic characterization of a triton-insoluble fraction from chloroplasts defines a novel group of proteins associated with macromolecular structures. JProteome Res., 4(2), 497-506.

160. Prikryl J., Rojas M., Schuster G., Barkan A. (2011) Mechanism of RNA stabilization and translational activation by a pentatricopeptide repeat protein. Proc Natl Acad Sei USA, 108(1), 415-20.

161. Privat I., Hakimi M.A., Buhot L., Favory J.J., Mache-Lerbs S. (2003) Characterization of Arabidopsis plastid sigma-like transcription factors SIG1, SIG2 and SIG3. Plant Mol Biol., 51(3), 385-99.

162. Quesada-Vargas T., Ruiz O.N., Daniell H. (2005) Characterization of heterologous multigene operons in transgenic chloroplasts: transcription, processing, and translation. Plant Physiol., 138(3), 1746-62.

163. Reinbothe C., Parthier B., Reinbothe S. (1997) Temporal pattern of jasmonate-induced alterations in gene expression of barley leaves. Planta, 201(3), 281-7.

164. Rio D.C., Ares M.Jr., Hannon G.J., Nilsen T.W. (2010) Polyacrylamide gel electrophoresis of RNA. Cold Spring Harb Protoc., 2010(6):pdb.prot5444.

165. Ris H, Plaut W. (1962) Ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplast of Chlamydomonas. J. Cell Biol. 13, 383-91.

166. Ruwe H., Schmitz-Linneweber C. (2011) Short non-coding RNA fragments accumulating in chloroplasts: footprints of RNA binding proteins? Nucleic Acids Res. Dec 1. E-pub ahead of print.

167. Salvador M.L., Klein U., Bogorad L. (1993) Light-regulated and endogenous fluctuations of chloroplast transcript levels in Chlamydomonas. Regulation by transcription and RNA degradation. Plant J., 3(2), 213-9.

168. Satoh J., Baba K., Nakahira Y., Tsunoyama Y., Shiina T., Toyoshima Y. (1999) Developmental stage-specific multi-subunit plastid RNA polymerases (PEP) in wheat. Plant J., 18(4), 407-15.

169. Schmitz-Linneweber C., Williams-Carrier R.E., Williams-Voelker P.M., Kroeger T.S., Vichas A., Barkan A. (2006) A pentatricopeptide repeat protein facilitates the trans-splicing of the maize chloroplast rpsl2 pre-mRNA. Plant Cell, 18(10), 2650-2663.

170. Schön A., Krupp G., Gough S., Berry-Lowe S., Kannangara C.G., Söll D.1986) The RNA required in the first step of chlorophyll biosynthesis is a chloroplast glutamate tRNA. Nature, 322(6076), 281-4.

171. Schweer J., Türkeri H., Link B., Link G. (2010) AtSIG6, a plastid sigma factor from Arabidopsis, reveals functional impact of cpCK2 phosphorylation. Plant J., 62(2), 192-202.

172. Sekine K., Hase T., Sato N. (2002) Reversible DNA compaction by sulfite reductase regulates transcriptional activity of chloroplast nucleoids. J Biol Chem., 277(27), 24399-404.

173. Serino G., Maliga P. (1998) RNA polymerase subunits encoded by the plastid rpo genes are not shared with the nucleus-encoded plastid enzyme. Plant Physiol., 117(4), 1165-70.

174. Sexton T.B., Christopher D.A., Mullet J.E. (1990) Light-induced switch in barley psbD-psbC promoter utilization: a novel mechanism regulating chloroplast gene expression. EMBOJ., 9(13), 4485-94.

175. Sharwood R.E., Halpert M., Luro S., Schuster G. and Stern D.B. (2011) Chloroplast RNase J compensates for inefficient transcription termination by removal of antisense RNA. RNA, 17, 2165-2176.

176. Shiina T., Allison L., Maliga P. (1998) rbcL Transcript levels in tobacco plastids are independent of light: reduced dark transcription rate is compensated by increased mRNA stability. Plant Cell, 10(10), 1713-22.

177. Shiina T., Tsunoyama Y., Nakahira Y., Khan M.S. (2005) Plastid RNA polymerases, promoters, and transcription regulators in higher plants. Int Rev Cytol., 244, 1-68.

178. Siemenroth A., Wollgiehn R., Neumann D., and Börner T. (1981). Synthesis of ribosomal RNA in ribosome-deficient plastids of the mutant "albostrians" of Hordeum vulgare L. Planta, 153, 547-555.

179. Silhavy D., Maliga P. (1998) Plastid promoter utilization in a rice embryogenic cell culture. Curr Genet., 34(1), 67-70.

180. Small I.D., Peeters N. (2000) The PPR motif a TPR-related motif prevalent in plant organellar proteins. Trends Biochem Sei., 25(2), 46-7.

181. Sriraman P., Silhavy D., Maliga P. (1998) The phage-type PclpP-53 plastid promoter comprises sequences downstream of the transcription initiation site. Nucleic Acids Res., 26(21), 4874-4879.

182. Srivastava A.K., Schlessinger D. (1989) Escherichia coli 16S rRNA 3'-end formation requires a distal transfer RNA sequence at a proper distance. EMBO J.,8(10), 3159-66.

183. Stern D.B., Kindle K.L. (1993) 3'end maturation of the Chlamydomonas reinhardtii chloroplast atpB mRNA is a two-step process. Mol Cell Biol., 13(4), 227785.

184. Stoppel R., Meurer J. (2012) The cutting crew ribonucleases are key players in the control of plastid gene expression. J. Exp. Bot., 63(4), 1663-73.

185. Strittmatter G., Gozdzicka-Jozefiak A., Kössel H. (1985) Identification of an rRNA operon promoter from Zea mays chloroplasts which excludes the proximal tRNAVal(GAC) from the primary transcript. EMBO J., 4(3), 599-604.

186. Sugiura M. (1992) The chloroplast genome. Plant Mol Biol., 19(1): 149-68.

187. Suzuki J.Y., Maliga P. (2000) Engineering of the rpl23 gene cluster to replace the plastid RNA polymerase alpha subunit with the Escherichia coli homologue. Curr Genet., 38(4), 218-25.

188. Swiatecka-Hagenbruch M., Liere K., Börner T. (2007) High diversity of plastidial promoters in Arabidopsis thaliana. Mol. Genet. Genomics, 277(6), 725-34.

189. Takahashi H., Watanabe A., Tanaka A., Hashida S.N., Kawai-Yamada M., Sonoike K., Uchimiya H. (2006) Chloroplast NAD kinase is essential for energy transduction through the xanthophyll cycle in photosynthesis. Plant Cell Physiol., 47(12), 1678-82.

190. Tiller K., Link G. (1993) Sigma-like transcription factors from mustard (Sinapis alba L.) etioplast are similar in size to, but functionally distinct from, their chloroplast counterparts. Plant Mol Biol, 21(3), 503-13.

191. Tozawa Y., Tanaka K-, Takahashi H., Wakasa K. (1998) Nuclear encoding of a plastid sigma factor in rice and its tissue- and light-dependent expression. Nucleic Acids Res., 26(2), 415-9.

192. Vaistij F., Boudreau E., Lemaire S.D., Goldschmidt-Clermont M., Rochaix

193. J.D. (2000) Characterization of Mbbl, a nucleus-encoded tetratricopeptide-like repeat protein required for expression of the chloroplast psbB/psbT/psbH gene cluster in Chlamydomonas reinhardtii. Proc Natl Acad Sci USA., 97, 14813-14818.

194. Vera A., Hirose T., Sugiura M. (1996) A ribosomal protein gene (rpl32) from tobacco chloroplast DNA is transcribed from alternative promoters: similarities in promoter region organization in plastid housekeeping genes. Mol Gen Genet., 251(5), 518-25.

195. Vera A, Sugiura M. (1994) A novel RNA gene in the tobacco plastid genome: its possible role in the maturation of 16S rRNA. EMBO J., 13(9), 2211-7.

196. Vogel A., Schilling O., Spath B., Marchfelder A. (2005) The tRNase Z family of proteins: physiological functions, substrate specificity and structural properties. Biol Chem., 386(12), 1253-64.

197. Vogel J., Borner T., Hess W.R. (1999) Comparative analysis of splicing of the complete set of chloroplast group II introns in three higher plant mutants. Nucleic Acids Res., 27, 3866-3873.

198. Vogel J, Hubschmann T, Borner T, Hess WR. (1997) Splicing and intron-internal RNA editing of trnK-matK transcripts in barley plastids: support for MatK as an essential splice factor. J Mol Biol., 270(2): 179-87.

199. Vogel J., Hess W.R. (2001) Complete 5' and 3' end maturation of group II intron-containing tRNA precursors. RNA, 7(2), 285-92.

200. Wagner E.G., Altuvia S. and Romby P. (2002) Antisense RNAs in bacteria and their genetic elements. Adv. Genet., 46, 361-398.

201. Walter M., Kilian J., Kudla J. (2002) PNPase activity determines the efficiency of mRNA 3'-end processing, the degradation of tRNA and the extent of polyadenylation in chloroplasts. EMBO J., 21(24), 6905-14.

202. Weihe A., Borner T. (1999) Transcription and the architecture of promoters in chloroplasts. Trends Plant Sci., 4(5), 169-170.

203. Westhoff P., Herrmann R.G. (1988) Complex RNA maturation in chloroplasts. The psbB operon from spinach. Eur JBiochem., 171(3), 551-64.

204. Williams P.M., Barkan A. (2003) A chloroplast-localized PPR protein required for plastid ribosome accumulation. Plant J., 36(5), 675-86.

205. Xie G., Allison L.A. (2002) Sequences upstream of the YRTA core region are essential for transcription of the tobacco atpB NEP promoter in chloroplasts in vivo. Curr Genet., 41(3), 176-82.

206. Yamamoto Y.Y., Puente P., Deng X.W. (2000) An Arabidopsis cotyledon-specific albino locus: a possible role in 16S rRNA maturation. Plant Cell Physiol., 41, 68-76.

207. Yamazaki H., Tasaka M., Shikanai T. (2004) PPR motifs of the nucleus-encoded factor, PGR3, function in the selective and distinct steps of chloroplast gene expression in Arabidopsis. Plant J., 38(1), 152-163.

208. Yang J., Stern D.B. (1997) The spinach chloroplast endoribonuclease CSP41 cleaves the 3'-untranslated region of petD mRNA primarily within its terminal stem-loop structure. J Biol Chem., 272(19), 12874-80.

209. Yao J., Roy-Chowdhury S., Allison L.A. (2003) AtSig5 is an essential nucleus-encoded Arabidopsis sigma-like factor. Plant Physiol., 132(2), 739-747.

210. Yu Q.B., Jiang Y., Chong K., Yang Z.N. (2009) AtECB2, a pentatricopeptide repeat protein, is required for chloroplast transcript accD RNA editing and early chloroplast biogenesis in Arabidopsis thaliana. Plant J., 59(6), 1011-23.

211. Yukawa M., Kuroda H., Sugiura M. (2007) A new in vitro translation system for non-radioactive assay from tobacco chloroplasts: effect of pre-mRNA processing on translation in vitro. Plant J., 49(2), 367-76.

212. Zerges W., Rochaix J.D. (1994) The 5' leader of a chloroplast mRNA mediates the translational requirements for two nucleus-encoded functions in Chlamydomonas reinhardtii. Mol Cell Biol., 14(8), 5268-77.

213. Zghidi W., Merendino L., Cottet A., Mache R. and Lerbs-Mache S. (2007) Nucleus-encoded plastid sigma factor SIG3 transcribes specifically the psbN gene in plastids. Nucleic Acids Res., 35(2), 455-464.

214. Zghidi-Abouzid O., Merendino L., Buhr F., Malik Ghulam M. and Lerbs-Mache S. (2011) Characterization of plastid psbT sense and antisense RNAs. Nucleic Acids Res., 39, 5379-5387.

215. Zhelyazkova P., Sharma C.M., Förstner K.U., Liere K., Vogel J., Börner T. (2012) The primary transcriptome of barley chloroplasts: numerous noncoding RNAs and the dominating role of the plastid-encoded RNA polymerase. Plant Cell., 24(1), 123-36.

216. Zubo Y.O., Yamburenko M.V., Kusnetsov V.V., Börner T. (2011) Methyl jasmonate, gibberellic acid, and auxin affect transcription and transcript accumulation of chloroplast genes in barley. J Plant Physiol., 168(12), 1335-44.

217. Zwieb C., Glotz C., Brimacombe R. (1981) Secondary structure comparisons between small subunit ribosomal RNA molecules from six different species. Nucleic Acids Res. 9(15), 3621-40.

218. Также хотелось бы выразить особую благодарность д.б.н., профессору Ольге Николаевне Кулаевой за поддержку и ценные рекомендации в ходе работы.

219. Искренне благодарю старших коллег Евгения Анатольевича Лысенко, Елену Станиславовну Пожидаеву и Артема Владимировича Демиденко за помощь в освоении необходимых лабораторных методов, участие в обсуждении полученных результатов и ценные замечания.

220. Хочу также поблагодарить за совместную работу Фрадкину Анну.

221. Считаю своим долгом поблагодарить за помощь в подготовке и оформлении диссертации секретаря диссертационного совета к.б.н. Марину Ивановну Азаркович и зам.дир., зав.лаб., д.б.н. Игоря Евгеньевича Мошкова.

222. Искренне благодарю оппонентов и рецензентов данной рабе

Информация о работе

Алейникова, Анастасия Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.05

Диссертация

Неравномерность транскрипции генов в составе хлоропластных оперонов ячменя - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы