Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция экспрессии оперона микроцина C

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Регуляция экспрессии оперона микроцина C"

На правах рукописи

Зухер Инна Сергеевна

Регуляция экспрессии оперона микроцина С

Специальность 03.01.03 — молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 МАР 2015

005561067

Москва 2015

005561067

Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН).

Научный руководитель:

Северинов Константин Викторович, доктор биологических наук, профессор. Официальные оппоненты:

Четверина Елена Владимировна, доктор биологических наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт белка Российской академии наук (ИБ РАН), ведущий научный сотрудник.

Каменский Петр Андреевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (МГУ), ведущий научный сотрудник.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН).

Защита диссертации состоится 21 апреля 2015 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул. Вавилова, д.34/5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук по адресу:

http://www.genebiology.ru/dissertation/dis-6/Zuher-dissertation.pdf Автореферат разослан « /2- » 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного ™пртя

кандидат фармацевтических наук

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Одна из важнейших проблем современного здравоохранения -появление бактерий, устойчивых к антибиотикам. Благодаря горизонтальному переносу генов детерминанты лекарственной устойчивости быстро распространяются в популяциях бактерий. Наиболее грозные внутрибольничные инфекции вызываются штаммами с множественной лекарственной устойчивостью. Применение коктейлей из антибиотиков, действующих сразу на несколько клеточных мишеней или связывающихся с разными сайтами одной и той же мишени, способно замедлить распространение лекарственной устойчивости. Однако даже такие стратегии использования антибиотиков могут лишь замедлить процесс развития устойчивости, но не способны его остановить. Таким образом, не вызывает сомнений, что медицина остро нуждается в новых антибактериальных веществах. К сожалению, в последние годы проходит все меньше времени между внедрением антибиотика в клиническую практику и появлением устойчивости к нему, а поиск новых антибиотиков происходит с недостаточной скоростью и эффективностью. Использование новых веществ, неродственных применяемым сейчас в медицине и действующих на новые клеточные мишени, могло бы значительно улучшить ситуацию.

Природные сообщества микроорганизмов вырабатывают огромное количество разнообразных веществ, используемых для внутри- и межвидовой конкуренции за ресурсы. Многие из этих веществ способны ингибировать рост бактерий, а следовательно, потенциально могут быть использованы как антибиотики. К таким веществам относятся синтезируемые на рибосомах бактериоцины. По некоторым оценкам, более 99% бактерий синтезируют хотя бы один бактериоцин, большинство из которых совершенно не изучены. Бактериоцины могут быть использованы в качестве

антибиотиков в медицинской и ветеринарной практике, однако до сих пор их практическое применение было ограничено. Учитывая повсеместное распространение устойчивости к традиционным антибиотикам, чрезвычайно важно получить детальные знания о способе действия, механизмах устойчивости и условиях повышения эффективности синтеза альтернативных, ранее не изученных антибактериальных веществ, в частности, бактериоцинов.

Микроцины представляют собой подкласс бактериоцинов с молекулярной массой до 10 кДа. Малый размер делает микроцины особенно перспективными для практического использования. Самый маленький из известных микроцинов, микроцин С Escherichia coli, ингибирует синтез белка и активен против энтеробактерий в микромолярных концентрациях. Для практического применения микроцина С крайне важно иметь возможность создания эффективных штаммов-продуцентов этого вещества. Для того, чтобы клетка могла эффективно синтезировать любой антибиотик, не подвергаясь его токсическому действию, экспрессия генов синтеза и устойчивости к антибиотику должна быть точно скоординирована: зрелый антибиотик не должен появляться в клетке раньше, чем белки устойчивости. Гены, кодирующие пептид-предшественник микроцина С и белки, катализирующие его созревание, находятся под управлением одного промотора. Можно ожидать, что существуют специальные механизмы, обеспечивающие необходимое соотношение пептидного субстрата и модифицирующих его ферментов. Выяснение молекулярных механизмов, обеспечивающих эффективный синтеза микроцина С, и являлось предметом данной работы.

Цели и задачи

Целью данной работы было выяснение регуляторных механизмов, обеспечивающих необходимые соотношения компонентов системы синтеза микроцина С и устойчивости к нему, а также характеристика их экспрессии

на разных стадиях роста культуры клеток-продуцентов Escherichia coli. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Определить механизм, обеспечивающий необходимое соотношение субстрата (пептида-предшественника МссА) и модифицирующего его фермента (аденилат-трансферазы МссВ) в клетках-продуцентах микроцина С.

2. Выяснить, действует ли подобный регуляторный механизм в гомологичных тсс Е. coli оперонах бактерий, эволюционно не близких Е. coli.

3. Исследовать влияние белков устойчивости к микроцину С на жизнеспособность клеток-продуцентов.

4. Охарактеризовать экспрессию генов тсс на разных стадиях роста культуры клеток-продуцентов.

5. Провести анализ транскриптов кластера генов тсс и определение их 5'-концов методом dRNAseq для исчерпывающего описания экспрессии генов тсс и картирования дополнительных промоторов, управляющих транскрипцией генов тсс.

Научная новизна

Показано, что оперон mccABCDE Е. coli транскрибируется с образованием моно- и полицистронного транскриптов. Короткий моноцистронный транскрипт содержит лишь открытую рамку считывания тссА, кодирующую пептид-предшественник микроцина С. Наличие этого транскрипта необходимо для эффективной продукции антибиотика. Установлено, что образование короткого моноцистронного транскрипта тссА регулируется уникальным механизмом трансляционной аттенюации, при котором терминация транскрипции происходит только при наличии сопряжения транскрипции и трансляции гена тссА. Определены последовательности в некодирующем участке РНК между генами тссА и тссВ, необходимые для осуществления такой аттенюации.

Продемонстрировано, что механизм трансляционной аттенюации консервативен для ряда оперонов, гомологичных тсс оперону Е. coli, найденных в геноме филогенетически далеких от Е. coli бактерий.

Продемонстрирована ведущая роль белка MccF Е. coli в защите клеток-продуцентов от внутриклеточного микроцина С на всех стадиях роста клеточной культуры. Изучена транскрипция генов тсс Е. coli на разных стадиях роста культуры клеток-продуцентов. Показано, что экспрессия гена mccF происходит конститутивно, то есть транскрипт mccF детектируется на всех стадиях роста клеточной культуры, тогда как оперон mccABCDE начинает экспрессироваться лишь при переходе от экспоненциальной стадии роста к стационарной. Проведен глобальный анализ транскриптов кластера генов тсс и определение их 5'-концов методом dRNAseq. Показано наличие ряда внутренних промоторов кластера генов тсс, предположительно вносящих вклад в обеспечение устойчивости клеток к микроцину С на ранних стадиях роста.

Теоретическая и практическая значимость

В представленной работе впервые описан новый механизм трансляционной аттенюации, при котором для осуществления терминации транскрипциии необходимо ко-транскрипционное связывание рибосомы с новосинтезированным транскриптом. Также в работе впервые показаны вероятные детерминанты устойчивости клеток-продуцентов к микроцину С на ранних стадиях роста. Полученные в работе данные расширяют представления о механизмах обеспечения эффективного синтеза антибиотиков клетками-продуцентами и их устойчивости к собственным токсинам.

Методология н методы работы

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и биохимии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для продукции микроцина С клетками Е. coli необходимо наличие короткого моноцистронного транскрипта, содержащего лишь открытую рамку считывания тссА.

2. Образование моноцистронного транскрипта регулируется уникальным механизмом трансляционной аттенюации, при котором терминация транскрипции происходит только при ко-транскрипционном связывании рибосомы с насцентной мРНК тсс А.

3. Механизм трансляционной аттенюации используется в нескольких гомологичных тсс Е. coli оперонах, закодированных в геномах филогенетически удаленных от Е. coli бактерий.

4. Защита клеток-продуцентов от внутриклеточного микроцина С обусловлена в первую очередь белком MccF.

5. Ген mccF экспрессируется на всех стадиях роста культуры клеток-продуцентов микроцина С, тогда как экспрессия генов синтеза микроцина С начинается в позднеэкспоненциальной фазе роста.

6. Устойчивость клеток, несущих кластер генов тсс, к внешнему мик-роцину С может также обеспечиваться активностью ряда дополнительных внутренних промоторов оперона mccABCDE.

Степень достоверности и апробация результатов работы

Цели, поставленные в работе, достигнуты, результаты приведенных в

работе экспериментов грамотно интерпретированы и сделанные в работе выводы обоснованы, их достоверность не вызывает сомнений. Результаты работы были опубликованы в рецензируемых научных журналах и представлены на международных конференциях.

Публикации

Результаты работы были представлены на трех научных конференциях и опубликованы в двух статьях в международных рецензируемых научных

журналах (см. перечень в разделе «Работы, опубликованные по теме диссертации»).

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы,

материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, а также выводов, благодарностей и списка литературы. Работа изложена на 117 страницах машинописного текста, включая 30 рисунков и 3 таблицы. Список цитируемых литературных источников включает 146 наименований.

Содержание работы

Введение

Микроцин С (МсС), самый маленький из известных микроцинов, синтезируется клетками кишечной палочки Е. coli, несущими на плазмиде кластер генов mccA-F (Рис. 1А). Транскрипция генов mccABCDE осуществляется с промотора Ртсс, который зависит от регулятора сАМР-САР, активирующего экспрессию генов в отсутствие глюкозы в среде роста. Транскрипция гена mccF осуществляется с отдельного промотора. Зрелый МсС представляет собой гептапептид с присоединенным к С-концевому остатку аспарагиновой кислоты аденозинмонофосфата, модифицированного присоединением пропиламина к фосфатной группе. МсС проникает в чувствительные клетки через транспортер внутренней мембраны YejABEF, а затем расщепляется клеточными олигопептидазами с высвобождением процессированного МсС. Процессированный МсС представляет собой негидролизуемый аналог субстрата аспартил-аминоацил-тРНК-синтетазы. Связывание процессированного МсС с этим ферментом блокирует синтез белка в клетке.

г

и

тссс .;> mccD -тас ,><- mccF l-j

mc^>T(

TAA ATG

fncc^TGGCAAAATATAAATGTCCATTMATGCCACCCTGTACAGGGTGGCATACAAAATTTATCTGCGAGGTTATTT [Ш

потенциальный фактор-независимый терминатор

cc

МссВ . у . fMcl Arg-Tb Gly-Asn Ala ^ j : . f

fMet-Arg-Thr-Gly-Asn-Ala-Asn—-> гм«.а,,.тъ,-<и,-а*,.а|.-- i —=—* V -

V^Tv ^ ' ' ^

МссА-гептапептид Аденилированный гептапептид Зрелый МсС

Рис. 1. Кластер генов тсс Е. coli. А. Схема кластера генов тсс. Гены тсс обозначены серыми стрелками. Изогнутыми стрелками показаны промоторы перед опероном mccABCDE и геном устойчивости mccF. В рамке показана последовательность некодирующего участка между генами тссА и тссВ. Выделены стоп-кодон рамки считывания тссА и старт-кодон рамки считывания тссВ. Б. Путь биосинтеза МсС. Для каждой стадии указаны катализирующие ее ферменты.

1. Регуляция экспрессии генов синтеза МсС

Продукт экспрессии первого гена mccABCDE оперона, гептапептид МссА, приобретает биологическую активность после аденилировании белком МссВ. Так как пептид МссА представляет собой субстрат фермента МссВ, можно ожидать значительного превышения внутриклеточной концентрации пептида над концентрацией фермента. Однако, как видно из устройства оперона, синтез мРНК, кодирующей и МссА, и МссВ, управляется общим промотором Ртсс. Логично предположить наличие какого-либо специального механизма, обеспечивающего соотношение субстрата МссА и фермента МссВ, необходимое для эффективного синтеза МсС.

Между генами тссА и тссВ расположен инвертированный повтор, который при транскрипции мог бы образовывать фактор-независимый терминатор. В случае активности этого гипотетического терминатора при транскрипции с Ртсс промотора должны синтезироваться два транскрипта: более короткий моноцистронный продукт терминации в межгенном участке

и полноразмерный полицистронный транскрипт. Методом Нозерн-блот гибридизации с олигонуклеотидом, комплементарным тссА, мы показали, что в клетках, синтезирующих МсС, действительно синтезируется короткий транскрипт (Рис. 2А). В клетках, несущих гены тсс с удаленным фрагментом межгенного

& Б.

- 150 nt тссА

100 nt 1 2 тссВ

Ыа

60

а. 40

и и

1 20

тсс тссй51

Рис. 2. In vivo анализ транскриптов тсс оперона. А. Результаты Нозерн-блот гибридизации РНК из клеток, несущих плазмиду тсс, и контрольных клеток без плазмиды с меченым олигонуклеотидом, специфичным к тссА. Б. Слева: плазмидные транскрипты в препаратах РНК из клеток, несущих плазмиду тсс либо ее производную тсс/15/ с делецией инвертированного повтора в межгенном участке. Верхняя панель: Нозерн-блот детекция тссА. Средняя: реакция удлинения праймера. комплементарного началу тссВ. Нижняя: реакция удлинения праймера. комплементарного плазмидному гену Ыа. Справа: содержание МсС в супернатанте культуры клеток, несущих плазмиды тсс или тссА51. В. Схема моноцистронного транскрипта тссА. SD - последовательность Шайна-Дальгарно (SD).

участка, содержащего инвертированный повтор (тссЛ51), короткий транскрипт исчезает, в то время как содержание полицистронного транскрипта не изменяется (Рис. 2Б). Также в таких клетках значительно падает продукция МсС (Рис. 2Б).

Как показал метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE), 5'-конец тссА транскрипта расположен на 29 нт выше ATG кодона тссА, что совпадает с ранее опубликованными данными, а З'-конец расположен сразу за терминаторной шпилькой. Короткий транскрипт тссА может образовываться либо при терминации транскрипции, либо после расщепления длинного транскрипта в межгенном участке тссА-тссВ. Однако расщепление транскрипта в межгенном участке приводило бы к

появлению дополнительного 5'-конца, расположенного за геном тссА. Напротив, в случае появления короткого транскрипта вследствие терминации транскрипции, единственный детектируемый 5'-конец мРНК тсс оперона должен совпадать с точкой старта Ртсс промотора. Именно это и наблюдалось экспериментально.

Эксперименты по добавлению ингибитора инициации транскрипции рифампицина к растущей культуре клеток-продуцентов МсС продемонстрировали исключительно высокую стабильность моноцистронного тссА транскрипта (время полужизни более 20 мин), тогда как полицистронный транскрипт не отличался по стабильности от большинства клеточных транскриптов. Известно, что мРНК стабилизируется при связывании рибосом. Чтобы определить, связан ли транскрипт тссА с рибосомами, было проведено центрифугирование лизатов клеток-продуцентов МсС в градиенте сахарозы, позволяющее разделить фракции рибосом и свободной РНК. С образцами РНК, выделенной из этих фракций, проводили Нозерн-блот гибридизацию с олигонуклеотидом, комплементарным тссА (Рис. ЗА). Короткий транскрипт детектировался только в РНК из рибосомной фракции, что свидетельствует либо о наличии короткого транскрипта тссА исключительно в этой фракции, либо о быстрой деградации не связанного с рибосомами транскрипта.

Для инициации трансляции бактериальных мРНК необходимо наличие последовательности Шайна-Дальгарно, с которой связывается рибосома, и старт-кодона, с которого начинается трансляция. Клетки, несущие плазмиды тсс с мутациями в одном из этих элементов перед открытой рамкой считывания тссА, не синтезировали МсС. Концентрация полицистронного транскрипта в таких клетках практически не изменялась по сравнению с контрольными клетками с исходной плазмидой (Рис. ЗБ). Мутация в последовательности Шайна-Дальгарно (ББ) приводила к полному исчезновению транскрипта тссА, а при замене старт-кодона на стоп-кодон (АТО'->ТАА) транскрипт по- прежнему детектировался.

А.

Б.

тсс А

своб.РНК

тссВ * »

Ыа

1 2 3

номер фракции

Рис. 3. Короткий транскрипт тссА связан с рибосомами. А. Центрифугирование лизата клеток, содержащих плазмиду тсс. в градиенте сахарозы. На верхней панели представлены результаты детекции тссА в РНК образца до разделения, фракции 70S и фракции свободной РНК. На нижней панели представлен профиль центрифугирования и обозначены использованные для выделения РНК фракции. Б. Определение содержания плазмидных транскриптов в клетках, несущих плазмиды с нарушенной инициацией трансляции тссА. Обозначения как на Рис. 2. wt - РНК. выделенная из клеток, несущих плазмиду тсс без мутаций. АТО'->ТАА - несущих плазмиду тсс с заменой старт-кодона тссА на стоп-кодон. SD — плазмиду с мутацией в последовательности Шайна-Дальгарно гена тссА.

Отсутствие моноцистронного транскрипта при внесении мутации в последовательность Шайна-Дальгарно может наблюдаться либо если свободный от рибосомы транскрипт крайне нестабилен, либо если связывание рибосомы необходимо для появления короткого транскрипта. Чтобы проверить второе предположение, мы провели ряд дополнительных экспериментов in vitro.

В экспериментах по in vitro транскрипции РНК-полимеразой (РНКП) Е. coli ни на линейной, ни на суперскрученной ДНК матрице не удалось наблюдать терминацию транскрипции в межгенном районе тссА-тссВ. Промотор Ртсс является слабым, поэтому в дальнейших экспериментах была использована химерная матрица, где последовательность ДНК сильного промотора Т7 AI (-67/+30) была слита с начальной последовательностью оперона тсс (+1 + 154). Полученная химерная матрица не содержит тиминов в матричной цепи до положения +35, что дает возможность получать остановленные транскрипционные элонгационные комплексы, используя рибонуклеотидную затравку C'pA+lpU+2pC+3 для инициации транскрипции и ATP. GTP и '"Р-аСТР в качестве субстратов. При добавлении UTP или смеси

четырех рибонуклеотидов в реакционную смесь элонгация транскрипции может быть синхронно продолжена. При возобновлении движения остановленного комплекса синтезируется только полноразмерный транскрипт (Рис. 4А, дорожка 2). Если же элонгация остановленного комплекса проводилась в присутствии компонентов системы in vitro трансляции PURExpress, синтезировался более короткий транскрипт, 3'-конец которого совпадал с определенным in vivo З'-концом тсс А (Рис. 4А, дорожка 5). Этот короткий транскрипт не был связан с РНК-полимеразой и, следовательно, являлся продуктом терминации, Чтобы определить, какой именно из компонентов системы PURExpress необходим для терминации, мы использовали варианты PURExpress системы, не содержавшие либо рибосом - PURExpress ARibosomes, либо аминокислот и тРНК - PURExpress (Даа, AtRNA). Как видно из приведенных данных (Рис. 4А, дорожки 3 и 4), для терминации необходимо присутствие рибосом, но не аминокислот или тРНК.

В серии экспериментов по тоупринт-анализу (toeprint) было определено положение рибосомы на тссА РНК. Метод основан на способности связанной рибосомы останавливать движение обратной транскриптазы по цепи РНК. В присутствии PURExpress (Даа, AtRNA) наблюдается четкая полоса, соответствующая расстоянию 17/20 нт от начала открытой рамки считывания тссА, что соответствует расположению рибосомы на первом и втором кодонах тссА, соответственно (Рис. 4Б, дорожка 3; Рис. 4Д). Также наблюдались дополнительные точки остановки обратной транскриптазы вплоть до позиции +31 нт от старт-кодона тссА, соответствующие сканированию рибосомой вниз по РНК матрице. С полной системой in vitro трансляции (Рис. 4Б, дорожка 4) наблюдалось изменение набора продуктов обратной транскрипции: в дополнение к продуктам, соответствующим рибо-

„W

ЭК34— im

1 2 3 4 5

7J

//// -4° ff лГ

-VW-

ми

•|C

RG

'0 ■

■G 1 GG 1

'u ] ,

■A NA.«

'um '

1-

Г. ->таа|

матрица 5 и < й

PURExpress й(аа. tRNA) -

ПП-► т -

Зл

'с

+17/20-* f1

1 2 3 4 5 6

1 2 3 4 5 6

Рис. 4. Рибосомы стимулируют терминацию транскрипции в межгенном участке тссА-тссВ in vitro. А. Остановленные элонгационные комплексы РНКГ1 Е. coli формировали на ДНК-матрице, состоящей из Т7 AI промотора, слитого с фрагментом /исс(+1 + 154). Элонгацию возобновляли добавлением рибонуклеотидов или рибонуклеотидов с системой PURExpress. ПП - полноразмерный продукт. ПТ - продукт терминации. ЭК'34 - РНК остановленного элонгационного комплекса. Б. РНК тсс(+1 + 154) смешивали с компонентами системы PURExpress в условиях, идентичных условиям эксперимента А. и проводили реакцию обратной транскрипции с праймером. комплементарным З'-концу РНК. Продукты реакции разделяли в денатурирующем полиакриламидном геле рядом с продуктами реакции секвенирования ДНК /;гсс(+1 + 154). проведенной с тем же праймером. В. Условия эксперимента идентичны описанным в А, но остановленные элонгационные комплексы формировали на матрице, содержащей фрагмент тсс без мутаций (wt). с заменой в старт-кодоне тссА (ATG1 ->ТАА) либо с заменами в последовательности Шайна-Дапьгарно (SD). Г. РНК /лсс(+1 + 154) без мутаций (wt) или несущие мутации (ATG1 ->ТАА или SD) использовали для тоупринт-анализа в присутствии системы PURExpress Д(аа. tRNA). Д. Открытая рамка считывания тссА (выделена синим цветом) и начало межгенного участка. Кодоны обозначены вертикальными линиями. Цветными кружками обозначены положения Р-сайта рибосомы, которым соответствуют продукты тоупринт-анализа. обозначенные теми же цветами на панелях Б и Г. Черный кружок соответствует расположению Р-сайта рибосомы на рамке считывания +1.

соме, связанной с началом открытой рамки считывания тссА, появляются дополнительные продукты в положении +36 относительно старт-кодона, соответствующие рибосоме, находящейся на последнем кодирующем кодоне рамки считывания. Добавление антибиотика тиострептона, ингибирующего транслокацию, к реакциям с полной системой PURExpress приводило к накоплению продукта +17 нт, соответствующего рибосоме, находящейся на инициаторном кодоне, и исчезновению нижележащих полос (Рис. 4Б, дорожка 5).

Также была проведена серия экспериментов на матрицах, содержащих мутации в области инициации трансляции открытой рамки считывания тссА (Рис. 4В). Терминация транскрипции в присутствии полной системы PURExpress не зависит от мутации старт-кодона, но значительно падает на матрице с мутацией в последовательности Шайна-Дальгарно. Тоупринт-анализ положения рибосомы на мутантных РНК-матрицах в присутствии системы PURExpress (Даа, AtRNA) показал, что рибосома не связывается с РНК-матрицей, содержащей мутацию в последовательности Шайна-Дальгарно (Рис. 4Г).

Мутация старт-кодона (ATG'->TAA) приводит к уменьшению количества продукта обратной транскрипции в положении +17/+20 и появлению дополнительного продукта в положении +31, соответствующего рибосоме, связавшейся с AUG кодоном рамки считывания, сдвинутой на один нуклеотид вправо относительно тссА (рамка считывания +1) (Рис. 4Г, дорожка 4; Рис. 4Д). Таким образом, связывание рибосомы перед или внутри открытой рамки считывания тссА стимулирует формирование фактор-независимого терминатора транскрипции, срабатывание которого приводит к образованию короткого транскрипта тссА, необходимого для синтеза пептида-предшественника МсС. По всей видимости, часть транскрипта тссА, защищенная связанной рибосомой, может принимать участие во взаимодействиях, которые ингибируют формирование терминаторной шпильки. Проведенный нами анализ методами ферментативного пробинга не

выявил различий во вторичной структуре РНК отсс(+1+154) в связанной и не связанной с рибосомой форме. Тем не менее, нельзя исключить возможность структурных перестроек при ко-транскрипционном связывании рибосомы с насцентной РНК.

Таким образом, нами показано, что для эффективной продукции МсС клетками Е. coli, несущими тсс оперон, необходимо наличие отдельного моноцистронного транскрипта, содержащего открытую рамку считывания тссА. Этот транскрипт образуется в результате терминации транскрипции в участке между генами тссА и тсс В. Образование моноцистронного транскрипта контролируется механизмом трансляционной аттенюации: терминация транскрипции происходит только в случае сопряжения транскрипции и трансляции, в противном случае транскрипция идет без остановки на этом участке.

2. Трансляционная аттенюация в других тсс оперонах

wcc-подобные опероны встречаются у многих микроорганизмов, в том числе филогенетически не близких Е. coli. Большинство /исс-подобных оперонов организованы сходным образом и, подобно оперону Е. coli, содержат некодирующую область между предсказанными генами тссА и тссВ, в которой имеется инвертированный повтор. Проведенный в лаборатории Cynthia М. Sharma (Университет Вюрцбурга, Германия) глобальный анализ РНК, выделенной из клеток штамма Helicobacter pylori G27, выявил наличие моноцистронного транскрипта тссА wcc-подобного оперона этого организма. Чтобы проверить, образуется ли короткий транскрипт in vitro и необходимо ли для этого сопряжение транскрипции и трансляции, мы использовали в совмещенной системе транскрипции-трансляции матрицу с Т7 AI промотором (-67+30), слитым с последовательностью (+1+137) тсс оперона Н. pylori (Рис. 5А). При добавлении компонентов системы PURExpress ARibosome синтезировался только полноразмерный транскрипт, при добавлении в реакцию системы PURExpress, содержащей рибосомы,

наблюдалось появление дополнительного укороченного продукта транскрипции. Размер продукта соответствовал ожидаемому продукту терминации транскрипции на фактор-независимом терминаторе, образованном шпилькой в межгенном участке. Таким образом, образование моноцистронного транскрипта в тсс опероне Н. pylori также контролируется трансляционной аттенюацией. Появление моноцистронного транскрипта вероятно также и в других mcc-подобных оперонах.

PURExpress

Pwa P!u Hso Bwa

Рис. 5. Трансляционная аттенюация в mce-подобных оперонах. Остановленные комплексы РНКП Е. coli, содержащие радиоактивно меченую РНК, были сформированы на ДНК-матрицах, содержащих Т7 AI промотор (-67+30), слитый с фрагментами оперонов тсс, включающих участок от предположительного старта транскрипции до начала гена тссВ. А. Использовался фрагмент оперона Н. pylori. Элонгацию транскрипции возобновляли добавлением рибонуклеотидов в присутствии системы in vitro трансляции PURExpress. Б. Использовались тсс опероны организмов P. wasabiae (Pwa), P. luminescens (Plu), H. somnus (Hso) или В. washoensis (Bwa). Элонгацию транскрипции восстанавливали добавлением смеси рибонуклеотидов («-», нечетные дорожки) или смеси рибонуклеотидов и системы in vitro трансляции PURExpress («+», четные дорожки). ПП - полноразмерный продукт терминации, ПТ - продукт терминации. Серыми стрелками показаны дополнительные продукты транскрипционной реакции на матрице Bwa, жирной серой стрелкой показан предположительный продукт терминации.

Для проверки такой возможности были отобраны три оперона тсс из гаммапротеобактерий (Haemophilis somnus, Pectobacterium wasabiae, Photorhabdus luminescence) и один - из альфапротеобактерий (Bartonella washoensis) (Рис. 5Б). В случае тсс оперонов бактерий P. wasabiae и Р. luminescence наблюдалась значительная стимуляция терминации транскрипции при добавлении к остановленным элонгационным комплексам

рибонуклеотидов и компонентов полной системы PURExpress, тогда как при

добавлении только рибонуклеотидов синтезировался лишь полноразмерный продукт. В случае В. washoensis и Н. somnus стимуляции терминации транскрипции при сопряженной транскрипции-трансляции не наблюдалось.

Таким образом, результаты проверки нескольких тисс-подобных оперонов показывают, что механизм стимулируемой рибосомой терминации транскрипции, приводящей к образованию моноцистронной тссА мРНК, может быть широко распространен среди оперонов данного типа. Отсутствие сходства между последовательностями, на которых рибосома способна стимулировать терминацию транскрипции, пока не позволяет определить элементы последовательности и/или структуры, необходимые для трансляционной аттенюации. Возможно, сравнительные исследования большего числа тсс оперонов позволят выявить эти элементы в будущем.

3. Регуляция экспрессии и роль генов иммунности в синтезе МсС

В ранних работах по изучению микроцина С различали два варианта оперонов, кодирующих синтез МсС7, описанного группой Филипа Морено1, и МсС51, описанного группой Инессы Хмель2. Позже выяснилось, что МсС7 и МсС51 идентичны по структуре и механизму действия 3' 4 , однако генетическая система, использованная группой Хмель для продукции МсС51, после переноса из природного продуцента утеряла один из генов иммунности, mccF, и содержала только пять генов, mccABCDE. Кроме того, был отмечен ряд точечных полиморфизмов между оперонами МсС7 и МсС51, однако при проведенном нами повторном секвенировании они не подтвердились. Таким образом, оперон mccABCDE, кодирующий синтез МсС51, полностью совпадает с генами тсс, кодирующими МсС7, отличаясь

1 Novoa М.А., Diaz-Guerra L., San Millen J.L., Moreno F., Millan J.L. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin C7 production and immunity//J Bacteriol. -1986.-Vol. 168. - N 3. - P. 1384-1391.

2 Kurepina N.E., Basyuk E.I., Metlitskaya A.Z., Zaitsev D.A., Khmel I.A. Cloning and mapping of the genetic determinants for microcin CS1 production and immunity // Mol Gen Genet. - 1993. - Vol. 241. - N 5-6. - P. 700706.

3 Metlitskaya A.Z., Katrukha G.S., Shashkov A.S., Zaitsev D.A., Egorov T.A., Khmel I.A. Structure of microcin C51, a new antibiotic with a broad spectrum of activity // FEBS Lett. - 199S. - Vol. 357. - N 3. - P. 235-238.

4 Guijarro J.I., González-Pastor J.E., Baleux F., San Millan J.L., Castilla M. a, Rico M., Moreno F., Delepierre M. Chemical structure and translation inhibition studies of the antibiotic microcin C7. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - N 40. - P. 23520-23532.

лишь отсутствием mccF. Поскольку МсС эффективно продуцировался даже в усеченной системе МсС51, возник вопрос, действительно ли для продукции МсС необходимы все три белка иммунности, mccF, тссС и тссЕ.

3.1. Влияние инактивации белков иммунности на скорость роста клеток-продуцентов МсС

Белок MccF представляет собой пептидазу, способную расщеплять карбоксамидную связь между пептидной и нуклеотидной частями как процессированного, так и не процесированного МсС. Сверхпродукция белка MccF делает клетки устойчивыми к действию МсС, однако утеря гена иммунности mccF кластером тсс не нарушает продукцию антибиотика МсС51. В то же время внесение стоп-кодона в начало гена тссЕ в составе оперона mccABCDE на высококопийной плазмиде, не содержащей гена mccF, предотвращало продукцию МсС51, а в стационарной фазе роста даже в присутствии селективного антибиотика такая плазмида терялась из клеток. Вероятно, этот эффект связан с высокой токсичностью мутантной плазмиды. При трансформации мутантной плазмидой клеток штамма AABN, которые не способны процессировать МсС и потому полностью устойчивы к нему, не наблюдалось потери плазмиды и детектировался синтез МсС. Это наблюдение подтверждает связь потери плазмиды с высокой токсичностью для клеток Е. coli дикого типа экспрессии генов тсс при нарушении функции МссЕ и в отсутствие гена mccF.

Чтобы оценить влияние активности белка MccF на скорость роста клеток-продуцентов МсС, мы получили плазмиду mcc-F, содержащую инактивирующую белок MccF мутацию в гене mccF в составе полного кластера тсс. Чтобы избежать описанного выше эффекта потери клетками плазмиды, содержащей мутации в генах иммунности, в этом и последующих экспериментах использовались среднекопийные плазмиды, а селективный антибиотик ампициллин был заменен на более устойчивый аналог, карбенициллин. Были получены кривые роста клеток дикого типа, несущих

плазмиду тсс (с полным кластером генов тсс) либо плазмиду тсс-Е (содержащую мутацию в гене тссЕ) в среде с глюкозой или без нее (Рис. 6).

В присутствии глюкозы МсС не синтезируется, т.к. зависимый от сАМР-САР промотор Ртсс неактивен. Кривые роста обеих культур в присутствии глюкозы сходны. В отсутствие глюкозы рост культур с обоими вариантами кластера тсс замедляется и обе культуры достигают меньших оптических плотностей за время эксперимента, чем в присутствии глюкозы. Наблюдаемое ухудшение роста, вероятно, связано с затратами дополнительных ресурсов на синтез МсС, или же с токсичностью самого антибиотика для продуцентов. Клетки, несущие плазмиду тсс, растут в отсутствие глюкозы быстрее, чем клетки, несущие плазмиду тсс-Е. Таким образом, наличие функционального МссР положительно влияет на скорость роста клеток, синтезирующих МсС. Это может быть связано как с инактивацией ферментом МссР внутреннего (эндогенного) МсС, так и с повышением устойчивости к МсС, попадающему в клетку из культуральной среды (экзогенному МсС). Во всех четырех случаях добавление внешнего МсС через час после начала культивирования не приводило к подавлению роста. Таким образом, активности МссЕ и МссС достаточно для защиты клетки от экзогенного МсС.

За инактивацию МсС отвечает С-концевой ацетилтрансферазный домен бифункционального фермента МссЕ. Он ацетилирует процессированный МсС, делая его неспособным к связыванию с клеточной мишенью. Мы получили плазмиды, содержащие инактивирующие мутации одновременно в генах тссЕ и тссЕ (тсс-Е-Е) или только в тссЕ (тсс-Е). Клетки дикого типа, несущие эти плазмиды, продуцируют МсС. Клетки дикого типа, несущие плазмиду тсс-Е-Е, растут нормально при добавлении глюкозы, однако их рост почти останавливается в отсутствие глюкозы, при активации синтеза МсС (Рис. 7).

Время роста, ч

Рис. 6. Влияние MccF на скорость роста и устойчивость к МсС клеток Е. coli дикого типа, несущих плазмиду тсс. Кривая роста клеток, несущих плазмиду тсс без мутаций (показана красным цветом) либо mcc-F (показана синим цветом). Клетки выращивали на среде LB (сплошные линии), либо на среде LB с добавлением глюкозы (Glc. прерывистые линии).

Время роста, ч

Рис. 7. Влияние МссР и МссЕ на скорость роста и устойчивость к МсС клеток, несущих мутантные плазмиды тсс. Представлены кривые роста клеток дикого типа, несущих плазмиду тсс-Е-Е (показаны ярко-зеленым цветом) и клеток штамма Дуе]В. несущих плазмиды тсс-Е (обозначены красным цветом) или тсс-Е- Е (обозначены синим цветом). Клетки выращивали на среде ГВ (сплошная линия), либо на среде ЬВ с добавлением глюкозы (СЛс. прерывистая линия).

При экспрессии оперона тсс МсС сначала оказывается в цитоплазме, а затем экспортируется из клетки. Мы предположили, что МссР необходим для инактивации такого эндогенного МсС. Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели эксперимент с использованием клеток штамма \yejB, у которых отсутствует один из компонентов транспортера МсС, Уе]АВЕР. Клетки этого штамма, несущие плазмиду тсс-Е-Е, без добавления глюкозы росли очень медленно, в случае же добавления глюкозы (т.е. при блокировке синтеза МсС) рост ускорялся (Рис. 7). Клетки, несущие плазмиду тсс-Е (содержащие активный МссР) росли быстро как в отсутствие, так и в присутствии глюкозы (Рис. 7). Поскольку экзогенный МсС никак не влияет на рост культуры клеток штамма Дуе/Д остается предположить, что именно высокая концентрация эндогенного МсС приводила к замедлению роста культуры клеток Дуе]В в отсутствие МссР. Скорость роста клеток с активным МссИ и неактивным МссЕ изменяется при добавлении глюкозы значительно меньше, чем скорость роста клеток, несущих тсс кластер с обеими мутациями, что также подтверждает гипотезу о главенствующей роли МссР в инактивации эндогенного МсС.

3.2. Регуляция экспрессии тссР

Нами было исследовано внутриклеточное содержание транскриптов кластера генов тсс на разных стадиях роста (Рис. 8). Как видно, равновесная концентрация транскрипта тссР практически не изменяется во время эксперимента: наблюдается такая же динамика, как для транскрипта конститутивного гена Ыа. В то же время короткий и полноразмерный транскрипты оперона тссАВСЭЕ начинают детектироваться лишь в середине экспоненциальной фазы, непосредственно перед появлением МсС в среде.

Приведенные данные демонстрируют, что тссЕ начинает транскрибироваться раньше остальных генов кластера, и его транскрипция практически не зависит от фазы роста культуры. Таким образом, МссР

1 2 2.5 3 4 5 8

Шк

** **

• <т

41* • т т »

защищает клетки от МсС на всех стадиях роста, в том числе до начала активной продукции МсС клеточной культурой.

Кривая роста клеток, несущих кластер генов тсс Время роста, ч

i i

тссА тсс В

mccF

Ыа

МсС в среде

Рис. 8. In vivo анализ транскриптов тсс в клетках, находящихся на разных стадиях роста. Слева показана кривая роста клеток, несущих кластер генов тсс. Справа показаны результаты детекции транскриптов плазмидных генов в РНК, выделенной из образцов культуры клеток, собранных в указанных временных точках. На верхней панели показаны результаты Нозерн-блот гибридизации с зондом, специфичным к тссА. На нижних панелях - результаты реакций удлинения праймеров. комплементарных началам генов тссВ. mccF и Ыа. Ниже показаны результаты детекции МсС в супернатанте клеток на данной стадии роста: «-» - при нанесении супернатанта на газон чувствительных клеток не появлялись зоны ингибирования роста. «+» - появлялись.

4. Внутренние промоторы оперона тсс

4.1. Оперон тсс содержит внутренние промоторы

Как видно из устройства оперона тсс (Рис. 1), гены синтеза антибиотика транскрибируются раньше генов устойчивости к нему, что может приводить к отравлению клетки. Как мы показали выше, отчасти эту проблему решает конститутивная экспрессия mccF с отдельного промотора. Однако даже при делеции mccF синтез МсС не нарушается, и клетки, несущие такой кластер почти не теряют в скорости роста, что говорит о существовании каких-то дополнительных защитных механизмов. Мы получили кривые роста клеток дикого типа, несущих плазмиду mcc-F, к которым через час после начала роста был добавлен МсС в инактивирующих рост чувствительных клеток концентрациях. Добавление к клеткам, несущим плазмиду mcc-F, МсС на ранних стадиях роста никак не влияло на скорость роста клеточной культуры (Рис. 9А), несмотря на то, что основной промотор тсс неактивен до середины экспоненциального роста (Рис. 8). Тот же эффект

наблюдался и при выращивании культуры клеток с добавлением глюкозы, когда основной промотор тсс неактивен. Подобный результат заставляет предположить, что существуют внутренние промоторы оперона тсс, с которых экспрессируются гены устойчивости.

В следующем эксперименте мы внесли инактивирующие мутации в -10 последовательность промотора Pmcc (ТААААА—>TGCCCC), полностью нарушающие транскрипцию с промотора. Такая мутация была внесена в плазмиды тсс, mcc-F и mcc-E-F, описанные в разделе 3. В клетках, несущих такие плазмиды, отсутствовала продукция МсС. Клетки, несущие плазмиду с неактивным Ртсс промотором {тсс -Ршсс), оказались полностью устойчивы к МсС (Рис. 9Б), и действительно, в таких клетках не нарушена экспрессия mccF, обеспечивающего полную устойчивость к МсС.

Б.

Концентрация МсС 100 цМ 300 JIM

клетки без плазмиды

тсс- Рт„ mcc_-PmK-F тсс- Pmcc-E-F

Рис. 9. Не зависимая от MccF устойчивость клеток к МсС. А. Кривые роста клеток, несущих плазмиды pUC18 или mcc-F. Ь. Чувствительность к МсС клеток, несущих плазмиду тсс без мутаций или с мутациями в Ртсс и генах тссЕ и mccF. На газон тестируемых клеток наносили капли раствора МсС указанной концентрации. Чувствительность оценивали по размеру образовавшихся после подращивания газона зон ингибирования роста.

Клетки, несущие плазмиду тсс_-Pmcc-F, кодирующую неактивный MccF, не обладали полной устойчивостью, однако были менее чувствительны к МсС, чем клетки без плазмиды. Наконец, плазмида тсс_-Pmcc-E-FHe придавала клеткам дополнительной устойчивости к МсС по сравнению с клетками без плазмиды (Рис. 9Б). Таким образом, устойчивость к МсС клеток, несущих плазмиду mcc-F действительно должна обеспечиваться

- ü - mcc-F Glc + МсС -о- mcc-FGIc —*— pUC18 + МсС —%— pUCIS

наличием дополнительного промотора (или промоторов) перед генами устойчивости тссС и/или тссЕ.

4.2. Картирование внутренних промоторов кластера тсс in vivo

Чтобы определить положение внутренних промоторов, мы применили два подхода. Для поиска всех потенциальных промоторов кластера генов тсс использовалась плазмида pFD51, содержащая репортерный ген галактокиназы gal К без промотора. Плазмиды, содержащие тестовые фрагменты перед геном galK, трансформировали в клетки galK штамма и полученные трансформанты тестировали на наличие активности GalK, высевая на индикаторную среду МакКонки с 1% галактозой. В качестве тест-фрагментов мы использовали 10 фрагментов кластера тсс, длиной около 600 п.о. каждый и суммарно перекрывающих весь кластер. Все фрагменты были протестированы в двух ориентациях. Из клеток, в которых GalK был активен, выделяли РНК и картировали точки старта транскрипции методом удлинения праймера на РНК. Проведенный тест выявил четыре промотора в прямом и четыре промотора в обратном направлениях. Выявленные таким образом промоторы представляют собой участки, обладающие промоторной активностью in vivo в составе репортерных плазмид, однако не все из них могут быть активны в составе полного кластера тсс.

Чтобы выявить промоторы, активные при экспрессии кластера тсс in vivo, был проведен анализ РНК клеток-продуцентов МсС методом dRNAseq5. Этот метод позволяет одновременно выявить точки старта транскрипции и охарактеризовать транскриптом образца, сравнивая результаты полного секвенирования библиотек кДНК, построенных на РНК, обработанной («+ТЕХ») и не обработанной («-ТЕХ») терминальной экзонуклеазой. Образец «+ТЕХ» обогащен последовательностями начальных участков

s Dugar G., Herbig A., Forstner K.U., Heidrich N.. Reinhardt R., Nieselt K., Sharma C.M. High-resolution transcriptome maps reveal strain-specific regulatory features of multiple Campylobacter jejuni isolates. // PLoS Genet. - 2013. - Vol. 9. - N 5. - el003495.

новосинтезированных транскриптов, а образец «-ТЕХ» содержит все последовательности исходной тотальной РНК.

Для детекции внутренних промоторов тсс РНК выделяли из клеток, несущих плазмиду тсс, выращенных на богатой среде LB с добавлением или без добавления глюкозы (Рис. 10). При добавлении глюкозы зависимый от сАМР-САР промотор Ршсс тсс оперона неактивен, что позволяет детектировать слабые внутренние промоторы, плохо различимые на фоне активной транскрипции с основного промотора. Как видно, в присутствии глюкозы экспрессия генов mccABCD резко снижается, тогда как ген тссЕ продолжает экспрессироваться, что может объяснять наличие устойчивости к МсС клеток-продуцентов, растущих в присутствии глюкозы. Всего при анализе библиотеки «+ТЕХ» было найдено 7 промоторов в прямом и 6 — в обратном направлении. Большая часть найденных точек транскрипционного старта совпадала с точками старта, определенными в эксперименте с определением активности GalK. Совокупно на основании данных dRNAseq и скрининга по активности GalK были выбраны 13 потенциальных промоторов для дальнейшей проверки активности в опытах in vitro.

4.3. Проверка активности выявленных промоторов in vitro

Для проверки активности внутренних промоторов кластера тсс in vitro использовались соответствующие ПЦР фрагменты, а70-холофермент РНКП Е. coli и, в качестве праймера, динуклеотидмонофосфаты, соответствующие позициям -1+1 или +1+2 определенных in vivo точек старта. Стартовые точки полученных in vitro РНК картировали при помощи реакции удлинения праймера на этой РНК. Из протестированных 13 промоторов шесть проявили активность in vitro (три прямых: 4377, 7091, 7854 и три обратных: R5612, R6931, R9164) (Рис. 10). Также была подтверждена активность показанного ранее in vivo промотора PmcCF. Внутри оперона mccABCDE были обнаружены три активных сонаправленных с Ртсс промотора, Р2 (4377), РЗ (7091) и Р4 (7854), однако ни один из них не расположен непосредственно перед генами

иммунности. Промотор Р4 находится близко к З'-концу тссЕ и, следовательно, не может обеспечивать иммунность. Слабый промотор Р2 находится в начале гена тссС. С РНК, инициированной с этого промотора, могла бы синтезироваться укороченная форма МссС. Возможность функционирования укороченной формы МссС в качестве экспортной помпы для МсС не исключена, однако требует экспериментальной проверки.

Р2

4377

LB+J Il hJ -------L Ll

LB- J

______IJL^J

■ 1 il и .........Ш yHHUL.

г / г р

п,ссВ 1 тССС mccD1 ! JCC£

LB-

LB+

Glc-

Glc+

TT^^'Tf

PR5-. I 9243 9164

Рис. 10. Анализ транскриптов микроцинового оперона методом dRNAseq. LB и Glc соответствуют клеткам, выращенным на LB и LB с добавлением глюкозы, «+» - «+ТЕХ» библиотеке.«-»— « -ТЕХ» библиотеке. Масштаб шкалы покрытия (coverage) во всех представленных данных одинаковый. Стрелками обозначены старты транскрипции и их координаты относительно старта транскрипции РтСс- Зачеркнуты промоторы, не проявившие про-моторной активности в тесте in vitro. Выделены жирным промоторы, показавшие активность in vitro.

Данные dRNAseq также продемонстрировали наличие в выращенных в присутствии глюкозы клеток транскрипта тссЕ, инициированного с одного из двух промоторов, расположенных в начале тссЕ (6535 или 6361.

отмечены зеленым на Рис. 10) и укороченного транскрипта тссЕ, инициированного с РЗ. Промоторы 6361 и РЗ имеют близкую к консенсусу -10 последовательность, однако только РЗ был активен в транскрипции in vitro с <т70-холоферментом РНКП. Возможно, для активности промоторов 6535 и 6361 требуются дополнительные транскрипционные факторы либо альтернативный ст-фактор. С укороченного транскрипта тссЕ, инициированного с промоторов РЗ, 6535 или 6361, мог бы транслироваться укороченный вариант МссЕ, содержащий ацетилазный домен, которого достаточно для обеспечения иммунности к МсС.

Тот факт, что активность внутренних промоторов может обеспечивать устойчивость к МсС в отсутствие транскрипции с Ртсс, соотносится с ранее полученными данными лаборатории Морено. Согласно этим данным, клетки, несущие плазмиды, содержащие фрагменты от З'-конца гена тссВ до 3'-конца гена mccF или от З'-конца гена тссВ до середины тссЕ приобретали полную или частичную устойчивость к МсС. Весьма вероятно, что инициированные с расположенных в этих фрагментах внутренних промоторов транскрипты обеспечивали устойчивость клеток к МсС. В клетках, несущих все гены тсс такие транскрипты могли бы обеспечивать иммунность клеток к МсС на ранних стадиях роста в отсутствие активного MccF.

Выводы

1. Для продукции микроцина С клетками Е. coli необходимо наличие короткого моноцистронного транскрипта, содержащего лишь открытую рамку считывания тссА.

2. Образование моноцистронного транскрипта регулируется уникальным механизмом трансляционной аттенюации, при котором терминация транскрипции происходит только при ко-транскрипционном связывании рибосомы с насцентной мРНК тссА.

3. Механизм трансляционной аттенюации используется в нескольких гомологичных тсс Е. coli оперонах, закодированных в геномах филогенетически удаленных от Е. coli бактерий.

4. Защита клеток-продуцентов от внутриклеточного микроцина С обусловлена в первую очередь белком MccF.

5. Ген mccF экспрессируется на всех стадиях роста культуры клеток-продуцентов микроцина С, тогда как экспрессия генов синтеза микроцина С начинается в позднеэкспоненциальной фазе роста.

6. Устойчивость клеток, несущих кластер генов тсс, к внешнему микроцину С может также обеспечиваться активностью ряда дополнительных внутренних промоторов оперона mccABCDE.

Работы, опубликованные по теме диссертации

Публикации

1. Zukher I.. Novikova М., Tikhonov A., et al. Ribosome-controlled transcription termination is essential for the production of antibiotic microcin C. // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol. 42. - N 19. - P. 11891-11902.

2. Novikova M., Kazakov Т., Vondenhoff G.H., Semenova E., Rozenski J., Metlytskaya A., Zukher I.. Tikhonov A., Van Aerschot A., Severinov K. et al. MccE provides resistance to protein synthesis inhibitor microcin С by acetylating the processed form of the antibiotic. // J. Biol. Chem. - 2010. - Vol. 285. - N 17. -P. 12662-12669.

Тезисы конференций

1. Zukher I., Novikova M., Tikhonov A., Nesterchuk M.V., Osterman I.A., Djordjevic M., Sergiev P.V., Sharma C.M., Severinov K. Ribosome-controlled transcription termination is essential for production of antibiotic microcin С // Molecular Genetics of Bacteria and Phages Meeting. University of Wisconsin-Madison, Madison, WI, 2014.

2. Zukher I.. Novikova M., Nesterchuk M.V., Tikhonov A., Severinov K. Transcription regulation of the shortest bacterial gene // FASEB Mechanisms and Regulation of Prokaryotic Transcription Conference. Saxtons River, VT, 2013.

3. Zukher I.. Novikova M., Djordjevic M., Severinov K. K.S. Transcription regulation of microcin С production // Bacteria, Archaea and Phages Meeting. Cold Spring Harbor Laboratories, NY, 2012.

Заказ № 81-Р/02/2015 Подписано в печать 18.02.15 Тираж 80 экз. Усл. п.л. 1,4

ООО "Цифровичок", Москва, Большой Чудов пер., д.5 тел- (495)649-83-30 ^v" v www-cfr-ru e-mail: zakpark@cfr.ru