Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение физико-химических свойств и биосинтеза ДНК вируса ядерного полиэдроза шелкопряда

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение физико-химических свойств и биосинтеза ДНК вируса ядерного полиэдроза шелкопряда"

Академия наук Украинской ССР Институт молекулярной биологии и генетики

На правах рукописи

МАРТЫНЕНКО Елена Ивановна

УДК 577.323:578.841.1

ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И БИОСИНТЕЗА ДНК ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА

03.00.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев 1988

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР.

Научные руководители: доктор биологических наук

кок и. п.,

кандидат биологических наук ЧЕРЕПЕНКО Е. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики АН

СССР.

Защита состоится «-£-> 198 ^ г. в

часов на заседании специализированного совета Д 016.11.01 при Институте молекулярной биологии и генетики АН УССР по адресу:

252627 Киев 143, ул. Заболотного, 150.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии и генетики АН УССР.

ГАУЗЕ Г. Г.,

кандидат биологических наук РЫНДИЧ А. В.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета

- ¡-¡I Актуальность проблемы. Энтомопатогенше вирусы, к числу кото-Üjjtíkj;относятся бакуловирусы, привлекли внимание как средство контроля численности насекомых. В последние года бакуловирусы вовлечены в круг объектов бготехнологии. Обнаружение факта сверхсинтеза одного из белков этих вирусов и генно-мпенервде манипуляции с их геномом позволили получить первые для этой группы вирусов экспрео-сируемые векторы большой синтетической мощности /Pennock et al., 1984; Smith et al., 1983; Kuroda et al., 1986/.В настоящее время наши представления о способе репродукция на молекулярном уровне . этих крупных кольцевых и, вероятно, одних из самых давних .репли-коков эукариотической клетки носят пока фрагментарный характер /Kelly, 1984; Doerfler, 198б/.Для раскрытия этого процесса важно знать область начала репликации ДЕК-геномов бакуловирусов, характер синтеза затравки и влияние метилирования вирусной ДНК на регуляцию репликации.

liais модель для изменяя репликатквного синтеза геномов этих вирусов особый интерес вызывает вирус ядерного полиздроза непарного шелкопряда /ШП Ш/.Это обусловлено резким отличием ГЦ-состава ДНК ВЯП от ДКК клеток Ш /ticCarthy et al., 1979/,что предоставляет возможность отделения новосинтезированных продуктов вирусной ДНК от клеточной с помощью физических методов.

Дель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилась разработка метода получения ДНК ВЯЛ Ш, а также системы синтеза ДНК in vitro, реагирующей.на добавление вирусной ДНК,выделение и характеристика новосянтезированного в такой системе продукта.

Для достижения основной цели необходимо.было решить следующие задачи. * ■.. . •

1. Охарактеризовать инфекционный материал природных популяций ЕШ Киевской области и разработать простой и эффективный метод .получения ДИК бакуловирусов. .

2. Изучить конформерностъ, размер, нуклеотидный состав /и содержание 5-метилцитозина/ ДНК изучаемого вируса.

3. Разработать условия физического■разделения ДНК вируса и клетки и оценить эффективность этого разделения.

4. С использованием компонентов ядер клеток инфицированных насекомых Р.diapar попытаться сконструировать бесклеточиую систему синтеза ДДК на основе матриц вирусного происхождения и лока-зать вирусную природу ношсинтезировацного продукта.

Научная новизна полученных результатов. Предложен эффективный и быстрый метод получения ДНК бакуловирусов. Впервые описаны физико-химические свойства и результаты рестрикционного анализа генома вируса ядерного полиэдроза природных популяций, непарного шелкопряда Киевской области - вредителя лесного хозяйства и садоводства.

Сконструирована бесклеточная система синтеза ДНК, реагирующая на добавление бакуловирусной ДНК. Система содержит клеточный хроматин из ядер инфицированных клеток КШ и ядерные солевые экстракты, полученные в присутствия диметилсульфоксида /ДМСО/.Разработанная система обеспечила получение низкополимерных ( 4S) ново-синтозированных молекул вирусной ДКК. Подобраны условия их выделения с помощью физических методов ц идентификации. Это открывает возмо;;шость дальнейшего исследования вопросов, связанных с проблемой молекулярных механизмов репликации ДШС-гекомов бакуловирусов.

Практическая ценность .работы, В настоящее время за рубежом, а также ч в СССР ведутся разработки вирусных инсектицидов на основе ЬйП HL. В связи с этим возникла необходимость в идентификации и характеристике соответствующих ьирусных препаратов.В этих целях могут стать полезными представленные в диссертации данные,касающиеся морфологии полиэдров и вирионов изолята Ш1 природных популяций НШ Киевской области, а такте физико-химических свойств и рестрикционного ачализа генома изучаемого вируса.

Разработанный метод выделения ДНК позволяет быстро и просто получить большие количества /до 4 мг/ бакуловирусной ДИК, что до сих пор представляло ело:сную и громоздкую процедуру.

Апробация результатов. Материалы диссертации доложены на 1У Украинском биохимическом съезде /Киев,1982/; У1 съездъ Украинского микробиологического общества /Донецк, 1984/; У Всесоюзном биохимическом съезде /Клев ,1986/; конференции молодых ученых И'.ШиГ /Киев, 1983/; на совместном заседании отделов молекулярных механизмов биосинтеза белка, биохимической генетики и генетики человека Института молекулярной биологии и генетики АН УССР /Киев,1987/.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материала и методов, а также иялононие экспериментальных результатов и их обсуждения, выводов

и списка литературы /172 наименования/. Диссертация иллюстрирована 23 рисунками и 12 таблицами.

клтшшш и метода

Эксперименты выполняли на личинках старших возрастов природных популяций непарного шелкопряда /Р.dispar) Киевской области Украины. В работе использовали полиэдры /ПЭ/ вируса ядерного по-лиэдроза, выделенные из гусениц КШ, погибших от ядерного полиэд-роза в природных услов;1ЯХ.

Заражение насекомых вирусной суспензией осуществляли иктра-лтфально /Кок и др., 1900/. %-тимидин вводили гусеницам по гОмКи.

Полиэдры и вирусные частицы выделяли и очищали по методу Еер-гольда С модификациями McCarthy et al. /1979/.

ДНК ВЯЛ Ш получали: а/ из вкрионов /McCarthy et al., 1979; Кок и др.,1980/; б/ из полиэдров разработанным нами щелочь-поли-аминным методом, включающим растворение полиэдров в присутствии JíaOH, 6poi iCToro этидия /БЭ/ (200 мкг/мл) и I мМ спермидина /рН смеси 11,5/ с последующей фенольной обработкой полученного лиза-та /Черепенно, Мартыненко, 1985/.

Ядра выделяли из меток НШ по /Галкин и др.,1931/ в растворе следующего состава: 0,01 М трис-НС1; 0,25 М сахарозы, 6 tó.1 СаС12 и 0,5$ диэтиддитиокарбамина.' Целостность ядер контролировали с помощью световой микроскопии.

ДНК из клеток HI! получали с помощью хроматографии лизата ядер на оксиапатите в Na -фосфатном буфере /Черепенко и др.,1982/.

Использованные в экспериментах ДНК E.coü и Li.luteus выделяли фенольным методой. •..

Для электронно-микроскопического изучения формы полиэдров я вирусных частиц использовали негативное контрастирование /ианяков, 1979/. Электронную микроскопию препаратов ДНК ВЯП Ш проводили согласно /Kleinschmidt,1968/. ДНК оттеняли платиной на установке JEEc и исследовали ее на микроскопе JEíí -?л /Япония/.

Конформерное фракционирование препаратов вирусной ДМК' осуществляли с помощью центрифугирования их в градиенте плотности csci с БЭ. Для этого использовали стандартный пронормированный Jinno'imii и трехступенчатый /Babyicin et al., 1934/ градиент CsCl.

Плавучую плотность //>/ дкк ВЯП и клеток КН опроделяли согласно /Мандель и др.; 1970/. В качестве стандарта для вирусной Д!ТК использовали ДКК 13 тимуса теленка и селезокю: ккак.а для клоточи./" -

дкк ВЯП ни.

Препаративное разделение ДНК ВЯП Ш1 и клетки Ш проводили в условиях трехступенчатого градиента CsCl (/=1,403 v/cur\ ß = =1,555 г/см3; />=1,710 г/см2 в течение 6 ч /Babykin et al.,1984/

Обработку вирусной ДНК рестриктазами и электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в агарозном геле осуществляли,как описано у Маниатиса я др. /1984/.

Размер генома ВЯП Н11 определяли с помощью кинетика реассоци-ации его фрагментов /Britten et al., 1974/, а также на основания гидролиза Д11К вируса рестриктазами - EcoRI и BamHI с последующим определением количества и размеров образующихся при этом фрагментов.

Фракционирование ДНК по скорости реассоциации последовательностей проводили путем полной денатурации и поэтапного отжига в . растворе с последующим разделением на оксиадатите /Прима и др., 1980/.

ГЦ-состав определяли химическими методами /Кирнос и др.,1981/.

Почек 5-мЦ осуществляли с помощью тонкослойной хроматографии /Васильев,1981/ и на жидкостном хроматографе високого давления /"Verlan", Швейцария/ /Исаева,1984/.

Перенос ДНК на нитроцеллкшозные фильтры, пик-трансляцию и гибридизацию ДПК-ДНК проводили по Southern /1975/, Rigby et al. /1977/ и Маниатису и др. /1984/.

Хроматин из ядер клеток НШ выделяли по Крутякову /1970/. В основу получения солевых экстрактов был положен метод, использованный Challberg et al./I979/.

ДНК-синтезяругащую активность бескяеточной системы синтеза ДНК оценивали по уровню включения %<Ш!Р в кислотонераствори-мую фракцию. Для этого экстрагированный фенолом из реакционной смеси меченый материал оса-дали трихлоруксусной кислотой и наносили на Gl'/с фильтры / "Whatman", Англия/.Радиоактивность просчитывали в толуо; jHOm сцинтилляторе на радиоспектрометре БЬ-ЗСУ'Ча-tertecimlque", Франция/.

Размер новосинтезированных фрагментов вирусной ДНК определяли седиментационным методом в условиях градиента плотности /5-20$/ щелочной сахарозы, содержащей I М HaCl и 0,3 М NaOH / Piglet et al •, 1974/. В качестве стандарта использовали обработанную EcoRI /ЦК шшзмида рвй322.

Статистическую обработку полученных результатов проводили стандартными статистическими методами /Рокицкий, 1967/ на основании 3 10 измерений.

' РЕЗУЛЬТАТЫ И.ОБСУЖДЕНИЕ

I Харрктдпиотика ПЗ, вирионов и препаратов ДНК, полученных разработанным щелочь-полиамянным методом

Полиэдры и вирионы, выделенные из полиэдрозных гусениц НШ, исследовали с помощью светозой и электронной микроскопии.Было показано, что морфология ПЭ, представленных многогранниками неправильной формы, и палочковидных вирионов, способных образовывать пучки, является типичной для ВЯЛ НШ.

В связи с громоздкостью традиционных методов и ^езким ухудшением качества материала при его хранении мы предприняли попытку разработать новый метод выделения ДНК бакуловирусов. Метод основан на применении сильных щелочей для растворения ПЭ в присутствии избытка бромистого этидия и минимальных количеств спермидина, являющегося стабилизатором суперскрученного состояния молекул ДНК и без которого натявнне ДНК бакуловирусов получить не удавалось.

Разработанный метод отличается простотой и быстротой - процедура получения ДНК, занимавшая ранее несколько дней, сократилась до I ч, обеспечивает выход до 4 мг ДНК на I г ПЗ и позволяет в отличие от стандартных методов выделять высокополимерные молекулы ДНК из длительно хранящихся ПЭ.

Препараты вирусной ДНК, полученные щелочь-полиашнннм методом, имели типичный для ДНК бакуловирусов конформерный состав,что указало на достаточную их интактность. Кроме того, они характеризовались незначительными примесями РНК, белка, углеводов /около 2%{ и высокой степенью освобождения от линейных молекул клеточной ДНК /99,7$ по результатам модельных экспериментов/.

2. Изучение физико-химических, свойств ДНК ВЯЛ НШ

Конформерная гетерогенность и размер вирусной ДНК. Анализ данных электронной микроскопии, центрифугирования в градиенте тот-ности cscx с БЭ и электрофореза в агарозном геле указал на конТур-мернуга гетерогенность препаратов ДНК ВЯП НШ, характеризующуюся линейными, кольцевыми и сцепленными кольцевыми молекулами,что типично для бакуловирусов /Кок и др. ,1980; McCarthy etral., 1979/.

Геном изучаемого вируса представлен двунитевыми крупны!."! кольцевыми молекулами ДНК длиной по данным рестрикционного анализа и кинетики реассоциации /рис. Г/ около 90 и ПО i£Ia соответственно.

(м-о"1, л-1)

Фрагменты

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10

11

12 13

• 14 15 Сумма

ДНК ВЯЛ НШ ,МДа +EcoRI +BanHI

11,7 10,5

9.5 8,9 7,9

7.6 6,9

6.3 5,2

4.8

3.4

2.5 2.1

1.9 13 90

13,7 13,0 11,7 9.5 8,7 7,9 7,7

6.3 4,2

3.4 1.9 1,2

89

Рис.1. А. Кинетические кривые реассоцяации ДНК ВЯЛ Й1Г/1/ и ДНК кише*лой палочки /2/. Б. а/ Распределение фрагментов ДНК вируса ядерного полиздроза /1,2/ непарного шелкопряда в сравнении с EcoRI -фрагментами ДНК фага /3/: I - EcoRI-фрагменты ДНК ВЯП НШ; 2 - BamHl -фрагменты ДНК ВЯЛ НШ; о/ Мрлекулярные массы фрагментов вирусного генома /ВДа/, полученные с помощью EcoRI и BamHI.

При сопоставлении этих значений с имеющимися литературными данными относительно изолята ШП 1Ш1 из Северной Америки - 88 и 106 № / McCarthy et al., 1979/ существенных расхождений не обнаружено.

Определение ГН-состава вирусной и клеточной ДНК. Для разработки конкретных условий физического разделения вирусной и клеточной ДНК Ш! установили их нуклеотидный состав с помощью химического метода /тайл.I/.Согласно полученным 'данным ДНК ВН11 Ш содержала 56+2 мол/2 Щ-пар, а ДНК клеток НШ - 38+2 мол%. Таким образом, разница в Ш-составе вирусной и меточной ДНК Ш по нашим оценкам достигала 18-19 мол$. Эта величина стала исходной при разработке условий их физического разделения.

Таблица I

Нуклеотидный состав ДНК клеток и вируса ядерного п^лиэдроза ЕШ, определенный с помощью хроматографии гидролизатов в тонком слое целлюлозы /п = 5/

Вид ДЕК ■ Основания, иол% Содержание

Г А Ц Т Щ-пар, мол#

Клеточная Вирусная 19,46 29,76 33,18 17,8 21,85 26,2 29,56 22,16 37,26 + 2 56,0 + 2

Определение содержания 5-мИ в ДНК ВЯП НШ. Экспериментальные данные относительно нуклеотидиого состава генома ШП НШ позволили рассчитать частоту встречаемости в этой ДНК потенциально метилируемых динуклеотидов ЦТ, составившую 0,09, что в 2-3 раза выше, чем в ДНК других зукариотическнх организмов и их вирусов. В результате проведенного исследования были получены следующие данные о содержании 5-мЦ в препаратах ДНК ШП ЕШ. Если при нанесении на стартовую линию тонкослойной пластины целлюлозы -I мкг 5-мД в качестве свидетеля после хроматографии обнаруживалось четкое пятно в соответствующей области пластины, то такое пятно не было обнаружено после хроматографии 1500 глкг изучаемого материала. Метилированный по 5-му положению цитозин. не был .обнаружен также и при хроматографии гвдролизата ДНК ШП НШ в- условиях ВЭЗХ. Как видно из рис.2,на хроматограмме гвдролизата ДНК изучаемого вируса в отличие отхро-матограммы ДНК ландыша как стандарта не обнаружен пик, соответствующий, 5-«Щ. '

На основании полученных данных можно заключить v что в ДНК В!Ш Ш 5-мЦ либо не содержится, либо его количество составляет менее 0,007$, что не удается выявить с помощью использованных хромат-)графических методов.

т Г

I

Рис. 2. Профиль ВЭКХ гид-ролизатов ДНК вируса ядерного полиэдроза /I/ и ДНК ландыша /2/

Время удерживания оснований

а/

б/

§

в

03 ЕГ о

4 и о я

Рис.3, а/ Характер распределения ДНК клетки и ВЯП НШ в градиенте плотности СбС1 /ультрацентрифугирование/, п=3; б/ Денситограмыа градиента проведенного центрифугирования ДИК, указанных в /а/

Относительное расстояние

Определение плавучей плотности ЛНК ВЯП НШ и клеток Щ.. Аналитическое центрифугирование в градиенте плотности СвС1 позволило определить плавучую плотность изучаемых ДНК. Она составила для ДНК ВЯП НШ 1,723 г/скР и для ДНК Ш 1,699 г/см3. При совместном ульт-рацеитрифугировании эти ДНК разделяются /рис.3/.Таким образом,данные по плавучим плотностям вирусной и клеточной ДГГК и измеренная наш разница в их нуклеотидном составе /18-19 мол$/ явились исходными при разработке условий препаративного разделения этих ДНК в градиенте плотности СеС1.

Разработка условий препаративного разделения вирусной и клеточной ДНК на основе различий в Щ-составе этих ДНК. Для препаративного разделения ДНК клетки и ВЯП НШ физическими методами провели серию модельных экспериментов. В результате удалось подобрать условия /рис.4/,обеспечиванцие отделение вирусной ДНК от клеточной при их центрифугировании в трехступенчатом градиенте СзС1 в течение 6 ч с 80%-иой эффективностью /по данным гибридизациошшх методов, в которых в качестве зонда использовали ДНК ВЯП НШ/.

Рис.4. Форма градиента плотности СйС1 и характер распределения молекул вирусной и клеточной ДШ НШ при центрифугировании в трехслойном градиенте СеС1 в угловом роторе при 40000 об/мин. А - пик оптического поглощения в области =1,723 г/см-э; Б - пик оптического поглощения в области р=1,6ЭЭг/ы£

3. Получение гибрядизацкошюго зовда клеточной ДД{, свободной от примеси ДНК латентного вируса ядерного по.. • :>дроза Ш1

Выделение новосинтезированных продуктов вирусной ДНК тесно связано с необходимостью контроля возможной примеси в них клеточной ДНК, присутствие которой можно выявить с помощью гибридизаци-оиных методов. Использование в этих опытах в качество зонда тотальных препаратов ядерной ДНК невозможно из-за латентного вирусоноси-тельства, известного для чешуекрылых /Кок и др. ,1980;Магатогоа<Л, 1986/.Поэтому для получения клеточного зовда, свободного от ДНК ВЯП НШ, был использован прием, учитывающий различие в скоростях их роассоциации.В связи с этим ш провели кинетическое фракциониро-

вание клеточного генома популяции ЕШ, содержащей небольшое количество латентного вируса, на составляющие кинетические классы с последующей проверкой блот-гибридизационными методами степени их очистки от вирусной ДНК. Для этого по результатам гибридизацион-ных опытов из двух исследованных популяций НШ Киевской области была отобрана Нирновская, содержащая по сравнению с Диматровской латентный вирус в значительно меньшем количестве.Затем изучили организацию нуклеотидных последовательностей клеточного генома/рис.5/.

Рис.5. Кривая реассоциации коротких фрагментов /400 п.о.±50/ тотальной ядерной ДНК ЕШ. По оси ординат - реассоциадия.%; по оси абсцисс -С0£ /м-с-'-.л-1/

На основании данных математического разложения экспериментальной кривой реассоциации этой ДНК выявили кинетические классы кук-леотидинх последовательностей, составляющих клеточный геном /табл. 2/,и рассчитали схему фракционирования этого генома на отдельные кинетические фракции,предусматривающую наименьшее их перекрывание. Однако использованная нами схема фракционирования /рис.6/ отличалась от расчетной сдвигом значений с^ фр частых повторов в сторону увеличения. Этот прием обеспечил включение в такую фракцию,кроме частых, также и примеси средних повторов клеточном генома, в то время как ДНК латентного вируса еще не успевала реассоцшровать. Даднке блот-гибридпзации с ДНК ШП Ш1 фракциошрованных по данной схеме клеточных последовательностей показали,что фракция /Спг у 0,14/,

в.,%

О

100

Ю-2 Ю-1 I 10 Ю2 103 ю4 сл

Таблица 2

Кинетические параметры различных нуклеотидннх последовательностей,составляющих геном НШ

Последовательности Со**1/2 Параметры

Со*1/2 G -пар нуклео-тидов ui

ДИК E.coll 4,8 4,8 4,2-ТО6 I I

ДНК нш- 6,2-Ю8

Уникальная ДНК 1064 500 4,5-Ю8 0,47 I

Средние повторы 2,3 0,70 7,2-Ю5 0,30 700

Частые повторы 0,02 - 0,23 -

Обозначения: с0 * 1/2 ~ пеРи°Д полуреассоциации последовательностей в составе тотальной ДНК; Со&1/2- то же в составе фракции; % - доля генома,составляемая данным семейством последовательностей; - частота повторения последовательности в геноме - кинетическая сложность ДНК.

Рис.5. Схема фракционирования ДНК НШ по скорости реассоциацип.Указаны разделенных на оксиапатите однонитевых /стрелка/ и двунитевых

Йве стрелки/ молекул К. Ч-частые,С- средние повторы,У- уникальные последовательности ДНК

включающая частые и часть средних повторов клеточного генома,свободна от вирусных последовательностей, тогда как во фракцию сряд-неповторятцейся и уникальной ДНК уже включались реассоциированные молекулы ДНК латентного вируса /рис. 7/. Таким образом, клеточные последовательности, составляющие фракцию С^фр 0,14,свободные от вирусной ДНК, были использованы в качестве зонда чистой клеточной ДНК.

Более того,полученный результат блот—гибридизации вирусной ДНК с этой фракцией клеточного генома свидетельствовал о том, что быстрореассоциирущие последовательности клеточного генома, среди которых могут быть автономно реплицирующиеся последовательности, в вирусном геноме не содержатся.

Г Ь

п

Pec•7.;_Блот-гибридизация ДНК ВЯП Ш с 32р_Меченыш ДНК фракций клеточного генома,выделенных при соответствующих значениях CqtCgt =0,14; 2 - G0t =13;

12 3

4 Разработка внеклеточной системы синтеза ДНК ШП НШ и характеристика продуктов,синтезированных в этой системе

Получение клеточного хроматина и определение его активности в синтезе ДНК. Из ядер клеток контрольных и ВЯП-инфицированных /опыт/ гусениц НШ на 5-е сутки после заражения выделяли хроматин, изучали его состав и способность к эндогенному синтезу ДНК. В ре-, зультате было установлено, что оба препарата изолированного хроматина характеризовались одинаковым составом /ДНК : РНК : белок -1:0,2:2,4/ и сохраняли ДНК-синтеэирувдую активность в течение 30 мин. При этом включение изотопа было несколько выше в случае хроматина ядер клеток зараженных насекомых /рис.8/.Это и определило его использование в дальнейших опытах, в которых синтетическую активность полученного хроматина увеличивали за счет добавления ядерных солавьи экстрактов.

Влияние на уровни включения в ДНК солевых экстрак-

тов ядер клеток насекомых, зараженных ВЯЛ НШ. Использование солевого экстракта, полученного наш из ядер клеток инфицированных гусениц Ш в присутствия 0,3% ДМСО, почти'в два раза увеличило синтез ДЕК в бесклеточной системе /рис.9/.

Исследование природы В1 сличения [ЭДаттр в бесклеточной системе. Для выяснения природы синтезов, обеспечивающих включение изотопа в кислотонерастворимую фракцию, применили ингибиторы: кофеин, кокавлятатиП репарационный синтез, и актиномипин-о, инактивирущий репдцкативный синтез. Сравнение результатов изучения ДНК-синтези-

12 3

. рующей способности гомологичных бесклеточных систем / контроль и опыт/ в присутствии указанных ингибиторов позволило заключить,что ДНК-синтезирухщая активность контрольной системы в основном обусловлена внеплановым синтезом, в то время как в системе на основе хроматина и солебого экстракта из инфицированных гусениц НШ на фоне репарационного синтеза, возможно, имеет место и репликативный, что обусловлено присутствием в ней вирусных ДНК-матриц /рис.10/.

Влияние экзогенной вирусной ДНК на уровень включения PuJdTTP в бесклеточной системе..Матричную активность вирусной ДНК в системе in vitro испытывали в условиях значительной инактивации репарации - в присутствии 50 Ш кофеина. На основании собственных данных

<м

а го

я к S

I

го

Р< ю

ЕН

fH

'"tJ'

0J ,

А

Hh

Рис.10. Влияние кофеина и актиномицина-D на ДНК-синте-зирутащую способность систем in vitro ' на основе хроматина из инфицированных и контрольных ядер клеток НШ. Приводятся средние уровни включения радиоактивного предшественника синтеза ДНК в соответствующих гомологичных системах: к - опытной; I - не содержащей ингибиторы (п=Ю) j 2 - в присутствии кофеина

3 - в присутствии актиномицина-D (п=4);Б - контрольной: 4 - не содер.'хащей ингибиторы (11=4) 5 5 - содержащей кофеин (п=з); б - со-дераащей актиномицин -D (п=4)

12 5

5

и литературы был определен состав бесклеточной системы синтеза ДНК:

Клеточный хроматин . . . 0,2 мл , ' MgCl2.......10-мМ

Солевой экстракт . . Л«.®' CnW1! •'----*

Диткотрейтол......I iAi Кофеин......50 мМ

КС1..........50 мГЛ ЭДТА.......I мМ

4 OTP; сШ?Р; dCTPjdGTP ПО 0,5 мГ',1 Трио-ЙСХ, рН 7,5 . 50 мМ

. АТР.......... 2 мгЛ ПЭГ 20000 .....&%

[3HjdlTP, уд. акт. 2024 Ки/Ш.....15 мкКи

Согласно полученным данным /рис.11/, можно заключить,что бесклеточная система ла основе хроматина и солевых экстрактов,изолированных из ядер клеток НШ в разгар вирусной инфекции, реагировала на добавление вирусной ДНК.

Вндалекпе и характеристика продуктов синтеза ДНК in vitro. При центрифугировании в градиенте плотности SsCl продуктов, син- • тезированных в разработанной системе в присутствии экзогенной вирусной ДНК, в зоне градиента с /"=1,723 г/см3 обнаруживался пик радиоактивных молекул. Дальнейшее их изучение в денатурирующих условиях грпднеьта плотности щелочной сахарозы /5#-2($/ /рис.12/ показам, что изучаемая ДНК представлена низкополимерныии MS) : агкепта:.-,и практически одинакового размера, что, вероятно, может

1^5 •

си

'о м 60 ■

м 1 50 "

я

к 3 ¿Ю -

п

ш 30 -

20 -

' из' 10 '

260

0,1

Р: 5.11. Средние уровни ДНК-скнтеэя-ругащей активш.оти разработанной бесклеточной системы: I - в отсутствие экзогешшх ДНК: 2 - в присутствии I мкг ДНК ШП НИ! ^1=11)? о-в присутствии I мкг ДНК тимтоа теленка (п=7^> - в присутствии 2 мкг ДНК

7 9 II 13 1$ 17 19 21 23 25

Рис.12. Распределение в градиенте плотности щелочной сахарозы

меченых продуктов,синтезированных в 'есклето-чой системе: I - в присутствии 2 мкг экзогенной вирусной дНК; 2 - в присутствии 2 мкг тимусной ДЦК. Пунктиром указано положение в этом градиенте денатурированной линейной релерной ДНК плазмвды рВН322

иметь место при прерывистом синтезе вирусной ДНК. В случае тимусной ДНК в основном обнаруживались високополимерше меченые продукты синтеза.

Данные гибридизационного эксперимента, в котором в качестве зонда использовали ®2Р-ДНК фракции бнстрореассоциирующих последовательностей клеточного генома и 32Р-ДКК ВЯП НШ из шшгей зоны грн-

диента CsCI с бромистым этидием, доказали вирусное происхождение выделенных продуктов синтеза ДНК in vitro.

Таким образом, была разработана бесклеточная система синтеза ДНК, реагирующая на добавление вирусной ДНК и обеспечивающая синтез молекул ДНК небольшого размера. Такая система в принципе позволяет осуществить поиск областей ORI генома бакуловирусов с помощью рекомбииантных молекул,содержащих различные участки их генома.

ВЫВОДЫ

1. На основании данных морфологического изучения полиэдров и вири-онов, выделенных из гусенигг Ш природных популяций Киевской области, установлено, что исследованный материал типичен для вируса ядерного полиэдроза этого насекомого.

2. Предложен быстрый, простой и эффективный метод получения баку-ловирусной ДНК.

3. Исследование физико-химических свойств ДНК ВШ1 НШ показало,что эти молекулы характеризуются типичной для бакуловирусов гетеро-гешшстыо конформерного состояния, представленной линейными, кольцевым и сцепленными кольцевыми молекулами, и тлеют молекулярную массу приблизительно 100 ?<Ща /по данным кинетики реассо-циацди и рестршсционного анализа/. Содержание ГЦ-пар в геноме изучаемого вируса составило 56+2 мол$. Это на 18-19 мол$ превышает Щ-состав клеточной ДНК, что позволило разработать условия физического разделения этих ДНК с эффективностью 80$. Б пределах разрешения использованных методов /хроматография гидролиза-тов ДНК в топком слое целлтаозы и ВЭЕХ/ 5-мЦ в ДНК ВЯЛ Ш. характеризующейся высокой частотой встречаемости потенциально метилируемых дяпуклеотидов ЦТ /0,09/, не выявлены.

4. С помощью кинетического фракционирования ДНК клеток НШ, характеризующегося латентным носнтельством ВЯЛ, получена быстрореас-соцяирующая фракция клеточного генома, свободная от примеси вирусной ДНК. Это позволило показать, что в ДНК изучаемого вируса клеточные повторы, к которым относятся и автономно реплицирующиеся последовательности, отсутствуют.

5. На основе хроматина и солевых экстрактов, выделенных из ядер инфицированных клеток НИ, разработана бесклеточная система синтеза ДНК, реагирующая на добавление вирусной ДНК и обеспечивающая синтез нпзкополикерных молекул ДНК вирусного происхождения,что открывает перспективу изучения областей начала- репликации вярус-но'1 ÜIÍSv и ее регуляции.

Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:

1. Черепенко О. I., Мартииеико О. I., Кок I. П. Пор1вняльне доЫд-ження властивостей ДНК Bipycy i míthhh при ядерному пол!едроз1

Porthetria dispar L. // Укр. 6íoxím. з'1зд: Тез. доп. — Кшв, 1982. — Ч. 2. — С. 232—233.

2. Мартыненко Е. И., Черепенко Е. И., Кок И. П. Молекулярно-био-логическое исследование вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Porthetria dispar L. /'/ VI съезд Укр. микробиол. о-ва: Тез. докл.

— Донецк, 1984. — Ч. 2. — С. 207—208.

3. Черепенко Е. И., Мартыненко Е. И., Кок И. П. Физико-химическая характеристика ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда

Р. dispar L. // Укр. биохим. журн. — 1984. — Т.56, №6. — С. 614—619.

4. Черепенко Е. И., Мартыненко Е. И. Простой метод получения ДНК бакуловирусов // Молекуляр. биология. — 1985. — Т. 19, вып. 6. — С. 1519—1524.

5. Галкин А. П., Череигнко Е. И., Мартыненко Е. И. Синтез ДНК in vitro в системе хроматина насекомых, зараженных вирусом ядерного полиэдроза // V Всесоюз. биохим. съезд: Тез. стенд, сообщ. — М., 1986.

— Ч. 2. — С. 406—407.

6. Черепенко Е. И., Мартыненко Е. И., Бубенщикова С. Н., Галкин А. П. О метилировании ДНК клетки и ДНК вируса ядерного полиэдроза непарного шелкопряда Р. dispar// Молекуляр. генетика, микробиология и вирусология. — 1936. — № 8. — С. 40—43.

Подп. в печ. 25.10.88. БФ 23012. Формат 60X84/16. Бум. мн. ап. Офс. печ, Усл. печ. л. 1,05. Усл. кр.-отт. 1,05. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100 экз. За< каз 2072. Бесплатно.

Редакционно-издательский отдел с полиграфическим участком Института кибернетики имени В. М. Глушкова АН УССР 252207 Киев 207, проспект Академика Глушкова, 20