Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение ферментативного гидролизата хлореллы в качестве основы питательных сред

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение ферментативного гидролизата хлореллы в качестве основы питательных сред"

р Г 5 ОД - 3 МАР 1997

На правах рукописи

АХАПКИНА ИРИНА ГАВРИЛОВНА

ИЗУЧЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗАТА ХЛОРЕЛЛЫ В КАЧЕСТВЕ ОСНОВЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД.

(03.00.07. - микробиология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г\

¥

У

4 г'! МОСКВА -1997.

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Научный руководитель: - доктор биологических наук

Блинкова Л.П.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

Мельникова В.А. - кандидат биологических наук Кудинкина И.П.

Ведущая организация: - РГМУ им. Н.И. Пирогова.

Защита состоится 20 марта 1997г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 001.38.01 при НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 103064, г. Москва, Малый Казенный пер., 5а.

Автореферат разослан 1997г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н.

Кудрявцева Н.Г.

- 3 -ВВЕДЕНИЕ.

Современные фундаментальные исследования в таких областях, как медицина, микробиология, иммунология, цитология, вирусология, генная инженерия, ветеринария, экология, а также культивирование биологических объектов для расширение биотехнологических производств опираются на обеспечение высококачественными средами, причем особое внимание уделяется качественному составу и технологии приготовления питательных сред, их стандартности и стоимости. Как известно, качество сред, в первую очередь, определяется источником азота. Широко представленные в настоящее время питательные основы - гидролизаты сырья животного и растительного происхождения - не всегда биологически эффективны и экономически выгодны. Особую важность приобретают такие свойства питательных основ, как доступность, стандартность, пригодность для культивирования различных биологических объектов (прокариоты, эукариоты и др.), отсутствие негативных факторов (мутагенных, ингибиторных и т.д.).

Одним из перспективных источников такого сырья является биомасса микроводорослей, выращенных на безбелковой солевой среде.

v

Цель исследования. Изучение ферментативного гидролизата биомассы микроводорослей рода Chlorella (ФГХ) в качестве питательной основы сред культивирования различных биологических объектов.

Задачи исследования:

1. изучить качественные и количественные показатели роста различных таксономических групп микроорганизмов на жидких и плотных микробиологических средах, приготовленных на основе ФГХ (среды общего назначения, дифференциально-диагностические, накопительные );

2. изучить возможность применение ФГХ в средах для культивирования клеток эукариот;

3. разработать искусственный пищевой субстрат для микроарт-ропод на основе фрагментов и биомассы микроводорослей и ФГХ.

Научная новизна. В результате проведенных исследований доказана эффективность применения ФГХ в качестве питательной основы микробиологических сред, сред для культивирования клеток эукари-

от; отмечены стабильность основных культурально-морфологических и физиолого-биохимических свойств микроорганизмов, отсутствие выраженного цитотоксического действия ФГХ; сконструированы принципиально ноше искусственные питательные среды для микроартропод из фрагментов и биомассы микроводорослей и ФГХ.

Практическая значимость. На основании полученных данных предложена новая питательная основа сред различного назначения, являющаяся продуктом биотехнологического производства, стандартная по своим физико-химическим характеристикам, соответствующая принятым для питательных основ биологическим показателям, что, в свою очередь, позволит производить более стандартные питательные среды по сравнению со средами из сырья животного и растительного происхождения. В процессе работы предложены модифицированные рецептуры питательных срад различного назначения.

Отдельные этапы работы проведены совместно с сотрудниками лаборатории клеточных гибридом, лаборатории аллергодиагностики, лаборатории по разработке аллергенов института вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН. ,

Положение, выносимое на защиту:

I. Ферментативный гидролизат хлореллы - новая питательная основа сред для культивирования прокариот, эукариот, микроартропод.

Апробация диссертации. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции (Махачкала, 1994.) "Принципы и практика борьбы с холерой в республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тестсистем."

Диссертация апробирована 16.12.96г. на научной конференции отдела условно патогенных микроорганизмов НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, получено положительное решение на выдачу патента "Питательная среда для выращивания микроорганизмов".

Структура диссертации. Диссертация изложена на 154 страницах машинописного текста, включающего 39 таблиц, и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, трех

глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. включающего 248 источников.

" СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ФГХ. шрот микроводорослей, биомасса спи-рулины получены из АООТ "Вета" в виде порошка. По данным АОЗТ "Вета" ФГХ представляет собой смесь свободных аминокислот 60,62%), остаточного белка (4,12*), нуклеиновых кислот (0,01%), нуклеотидов (6,855t), углеводов (21,12*) и некоторого количества витаминов группы В.

Физико-химический контроль ФГХ проводился в соответствии с методиками, изложенными в "Сборнике инструкций", утвержденном приказом МЗ СССР N31 от 13.01.83г. и ФС 42-344-ВС-90 по следующим основным показателям: внешний вид, прозрачность и цветность I*-ного раствора, водородный показатель 1Ж-ного раствора, влажность, общий азот, аминный азот, хлориды, углеводы.

Тест-штаммы микроорганизмов для контроля качества питательных сред, рекомендованные ГИСК им. Л.А.Тарасовича, получены в ли-офилизированном состоянии из музея этого института. Условия хранения и восстановления микроорганизмов из этой и других коллекций из лиофильного состояния соблюдались в соответствии с рекомендациями, утвержденными МЗ РФ и ГУ карантийных инфекций. Штаммы микроорганизмов хранили в лиофилизированном состоянии при температуре (5+1)°С, а также на среде Романова или 0,ЗХ питательном агаре. Пересевы со среды хранения на питательный бульон, питательный агар и вновь на среду хранения проводили через каждые 3 месяца, но не более 4-х раз. Лиофилизированную культуру из ампул или со среды хранения пересевали в пробирки и чашки Петри с соответствующими питательными бульоном и агаром и инкубировали при температуре (37+1)°С (для Serratia шагоевоепв N1 - 22+2°С) в течение 18-20 часов. Все штаммы характеризовались типичными культурально-морфологичесними свойствами.

В качестве сред сравнения использовались: среда тиогликоле-вая (ТУ 42.14.161-79), среда Клиглера (ТУ 42.14.159-79), среда АГВ (ФС 42-201-ВС-88), среда ОТДМ (ФС 42-I92-BC-88), сухой питательный бульон (ФС 42-I88-BC-88), бульон Хоттингера - на основе оригинального перевара Хоттингера, среды Гисса (лабораторного при-

готовления), среда с аминокислотами (лабораторного приготовле ния). среда RPMI-1640 ("Sigma", США).

Среды сравнения готовились согласно общепринятым технологическим приемам (Биргер, 1967г., Лабинская, 1Э88г.). Готовые среда выдерживали при 37°С в течение двух суток для проверки стерильности.

Конструирование экспериментальных сред проводилось на основании известных рецептур (Герхардт, 1988г., Тартаковский, 1988г.), данных по питательным потребностям и физиолого-биохимическим свойствам биологических объектов, с использованием, в основном, реагентов отечественного производства. Свойства микробиологических питательных сред изучали в соответствии с "Методическими рекомендациями к контролю питательных сред по биологическим показателям" (M.I980).

Среды для выращивания широкого спектра микрооргашгемов оценивали по чувствительности, эффективности, стабильности основных свойств микроорганизмов.

Среды дифференциально-диагностические и для идентификации оценивали по дифференцирующим свойствам - ферментации углеводов, потреблению аминокислот, газообразованию.

Среду для определения антибиотикочувствительности изучали по чувствительности, характеру роста микроба и диаметру зон инги-биции роста индикаторного штамма.

Среду для определения токсинообразования дифтерийного микроба оценивали по чувствительности, скорости и характеру реакции преципитации.

Среду для контроля стерильности лекарственных препаратов оценивали по чувствительности и нейтрализующим свойствам в присутствии мертиолята (ФС 42-326-ВС-92).

Среды для выращивания клеток эукариот оценивали по активности пролиферации и жизнеспособности клеток мышиной миеломы линии P3-X63-Ag8.653 и гибридомы A-RlgG/F6A3. Клетки отмывали центрифугированием, ресуспендировали в среде 199. В лунку 24-луночного планшета (фирмы "Nuno") помещали I мл среды и вносили определенное количество клеток. Культуры клеток выращивали в автоматическом С02-инкубаторе (фирма "Labomed") при 37°С в насыщенной водными парами атмосфере с 65 углекислого газа. Подсчет живых и мертвых клеток осуществляли через каждые 24 часа в камере Горяева. За

процент пролиферации принимали отношение разности количества живых клеток на данный момент и исходного количества живых клеток к исходному количеству живьсх клеток, выраженное в процентах.

Среды для культивирования микроартропод оценивали визуальным анализом жизнедеятельности клещей Dermatofagoidae farinae и Туго-phagus putresoentlae. Культивирование клещей проводили в термостате при 25°С и 75* относительной влажности. Визуальный контроль популяции проводили под микроскопом. Контрольной средой для D. farinae служила домашняя пыль, для Т.putresoentlae в качестве контрольной среды использовали овсяную муку.

Статистическую обработку результатов проводили по формулам, рекомендованным И.П. Ашмариным, A.A. Воробьевым (1962г.).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ.

В результате предварительного исследования роста спектра культур на средах на основе ФГХ наиболее оптимальной оказалась рецептура среды с низким содержанием еминного азота. С целью выяснения соответствия ростовых свойств сред на основе ФГХ требованиям, предъявляемым к питательным основам, го данной рецептуре были приготовлены питательный бульон и питательный агар. Характеристики сред приведены в таблице N1.

Таблица N1.

Основные характеристики питательных сред.

Характеристика иреда на основе ФГХ Контр, среды

жидкая плотная жидкая плотная

аминныи азот в мг* 35 35 56 56

хлориды в % 0,72 0,72 0,41 0,41

рН 7,15 7,15 7,15 7,15

оптическая плотность 0,1 0,1

содержание агар-агара, % - 1,2** - 1.5

* - не измерялась

** - так как в процессе работы была отмечена удовлетворительная плотность агаризованных сред на основе ФГХ (агар-агар - г. Корсакове), то количество агар-агара было уменьшено до 1.2%.

- 8 - .

Согласно общепринятым рекомендациям было проведено исследование биологических показателей сред на основе ФГХ в сравнении с контрольными питательными агаром и бульоном. Данные, представленные в таблицах N2, показали, что по эффективности питательный бульон не основе ФГХ не уступал, а скорее превосходил контрольный бульон, при атом не изменялся характер роста испытанных культур. Так, Shigella flexneri 1а 8516, Salmonella typhi Н-901, Coryneba-oterium xerosis 1911 давали при росте диффузное помутнение среды, Streptooooous pyogenee Diok-1 характеризовался придонно-пристено-чным ростом. Через 24 часа роста отчетливо прочитывалась качественная реакция на образование сероводорода штаммом s.typhi Н-901,

Таблица N2.

Эффективность питательного бульона на основе ФГХ (I) в сравнении с контрольным бульоном (2).

Тест-штаммы кол-во микрооных тел в млрд/мл среды

через 4« часов

i

S.ílexneri 1®851б * 0,74+0,04 0.53+0,026

S.typhi Н-901 * I.41+0.038 0.77+0,037

С. xeroeis 1911 ** 1.25+0,032 1,30+0.042

* S.pyogenes Diok-1 1,00+0,032 нет роста

*-высев из разведения 10 с **-высев из разведения 10

также легко определялось образование индола культурой s.flexneri 1е 8516. Кроме того, изучаемая белковая основа обеспечивала высокую скорость роста микробов. Эффективный рост микробов наблюдался уже через 16 часов культивирования. (Интересно отметить, что часть питательного бульона на основе ФГХ была лиофилизирована и хранилась при комнатных условиях в течение 2,5 лет плотно укупоренная, после чего была восстановлена и испытана вторично. При этом не было обнаружено каких-либо изменений химического состава и биологических показателей.) Чувствительность питательного бульона на основе ФГХ была аналогична чувствительности контрольного питательного бульона, за исключением роста s. pyogenes Diok-1, ридимнд рост которого обнаруживался из разведения 10~®.

Данные эффективности -экспериментального и контрольного пита-

тельных агаров представлены в таблице N3. Эффективность экспериментального агара была адекватна эффективности контрольного по количеству выросших колоний, сохранению их морфологических особенностей. Культуры, для идентификации которых важную роль играет характер пигментации (Pseudomonas aeruginosa 27/99, Serratia mar-oeeoene N1), обладали более выраженной пигментацией на экспериментальной среде. Агаризованная среда на основе ФГХ обладала чувствительностью - 10 -10~7по отношению к испытанным культурам уже через 18-20 часов наблюдения.

Питательная основа не должна изменять биохимические свойства культур, в частности, отношение к углеводам и спиртам. В данном

Таблица N3.

Эффективность питательного агара на основе ФГХ в сравнении с контрольным питательным агаром через 20 часов.

(Посев из разведения )

Тест-штамм Среда на основе ФГХ Контрольная среда

кол-во колоний диаметр колоний кол-во колоний диаметр колоний

P.aerugi- nosa27/99 68+1,87 2,06+0,09 69,3+1,4 1,24+0.18

S.maroes-cens N1 70,7+7,7 1,88+0,1 84+8,72 2,19+0,06

S.typhi H-901 62,7+6,1 1,80+0,07 64,6+3,5 1.64+0.06

ö.aureus 6538P 41+2,4 1.75+0,05 39.7+2.2 1.16+0,02

ö.riexne-rl 1^516 52+5,2 1,71+0,08 47+5,51 1.76+0,03

S.sonne1 "S-fortn" 66+2,65 2.19+0,04 63.7+3,3 2,25+0,03

случае это особенно важно, т.к. ФГХ характеризуется высоким содержанием углеводов. Последнее обусловлено наличием фрагментов клеточной стенки микроводорослей, состоящей из целлюллозы, т.е. глю-козных полимеров (Саут, Уиттик. 1990г.), которые могут потребляться микроорганизмами только в случае наличия способности синтезировать целлюлазы, что присуще достаточно малому кругу микроорганизмов (Шлегель, 1967г.). Проведенный анализ ферментативной активности культур, выращенных на средах на основе ФГХ не показал какого-либо изменения их ферментативной активности в отношении сахвров. На следующем этапе ФГХ рассматривался как возможный источник свободного углевода. Для этого на основе ФГХ были пригото-

влены среда с 21 углеводом с конечным содержанием аминного азота

- 14 мг%. В качестве тест-штаммов использовали P.aeruginosa 27/99 и s.maroeeoene N1. Результаты культивирования показали равнозначность ответов P.aeruginosa 27/99 и S.maroesoens N1 на введение различных углеводов и спиртов в среды, приготовленные на основе как гвдролизата мяса, так и гидролизата микроводорослей. Особо следует отметить, что сама основа (среда без Сахаров) не являлась источником какого-либо углевода, ферментация которого приводила бы к образованию кислых продуктов. Далее на моделях жидкой и полужидкой (0,3% агар-агара) были испытаны экспериментальные среды на основе ФГХ с рН-индикатором - феноловым красным путем культивирования ряда энтеробактерий. Ферментация углеводов энтеробакте-риями была типичной для использованных штаммов. Среды с углеводами на основе ФГХ обладали высокой чувствительностью - 10~7-10~®. Таким образом, компоненты ФГХ не препятствовали быстрому и адекватному выявлению сахаролитического признака, а в случае полужидких вариантов - газообразования и подвижности.

Двухсахарный агар с железом или агар Клиглера был разработан для первичной дифференциации энтеробактерий путем одновременного выявления четырех биохимических свойств - ферментации глюкозы и лактозы, образования газа и сероводорода. На аналогичном агаре на основе ФГХ изученные штаммы характеризовались значительным ростом, типичной утилизацией лактозы и глюкозы, интенсивнее происходило газообразование, особенно культурами Morganella morganii 118, Proteus vulgaris, Enterobaoter cloacae, Klebsiella pneumoniae 1954, K.pneumoniae 1532. В тоже время только на третьи сутки очень слабо прочитывалась реакция на сероводород. Было сделано предположение, что соли железа вступают в реакцию комплексообра-зования с компонентами ФГХ, поэтому в конечной модифицированной рецептуре агара (ФГХ - 20-25 г/л, хлорид натрия - 5 г/л, лактоза

- 10 г/л, глюкоза - 1,5 г/л, сульфат железа двухвалентного - 0,15 г/л, тиосульфат натрия - 0,3 г/л, карбонат натрия - 0,8 г/л, феноловый красный - 0,05 г/л, агар-агар - 10-15 г/л) предусматривалось выпадение осадка, после стерилизации среды. Через 18-20 часов культивирования на данном агаре различных культур (Escherichia coli, E.oloacea, Citrobacter, HaXnia alvei, К.pneumonia, К. morganii, Providenoia aloalifaoiens, Proteus vulgaris. Salmonella typhimurium, S.maroesoens, S.aureus) легко определялись искомые

свойства бактерий - ферментация углеводов, образование газа и сероводорода, причем была отмечена большая интенсивность процессов газо- и сероводородообразования по сравнению с контрольной средой. Следовательно, ФГХ в составе сложных сред позволяет определять несколько биохимических признаков микроорганизмов одновременно, причем для некоторых процессов ФГХ показывает стимулирующий эффект. При этом, очевидно, что прямая замена пептона на ФГХ не всегда возможна.

Поскольку ФГХ представляет собой смесь, в основном, свободных аминокислот, то исследовалась возможность его применения в средах, в которых основная роль отводится ферментации свободной аминокислоты. С этой целью были приготовлены среды с лизином, аргинином и орнитином (IX аминокислоты) на основе ФГХ (42 мг* амин-ного азота) и бромтимоловым синим. Данные среды позволяли получать ответы по утилизации аминокислот в соответствии с биохимическими особенностями бактерий через 20-24 часа наблюдения. Контрольная среда (питательная основа без дополнительного внесения аминокислоты) либо выявляла ферментацию глюкозы (желтый цвет), либо оставалась по цвету практически без изменений. Следовательно, концентрации аминокислот, вносимых с ФГХ, настолько ниже доминирующей аминокислоты, что ими можно пренебречь и в дальнейшем использовать ФГХ в средах, где дифференциальным признаком служит утилизация аминокислот.

Важным свойством плотных сред является свободная диффузия в гель различных соединений. Поэтому на основе ФГХ были также приготовлены среды, аналогичные средам ОТДМ и АГВ. Среда на основе ФГХ обеспечивала интенсивное токсинообразование C.diphtheriae FW-8. Уже через 18 часов культивирования визуально легко определялась характерная дугообразная линия преципитации. На контрольной среде токсинообразование было к этому сроку слабо выраженным, и только через 40 часов ответ не вызывал сомнения. У нетоксиген-ного штамма с.xerosis 1911, как и ожидалось, отсутствовала линия преципитации, т.е. на экспериментальной среде, как и на контрольной не было выявлено неспецифичеких взаимодействий с антитоксической дифтерийной сывороткой. Как видно из данных таблицы N4 экспериментальная среда на основе ФГХ не препятствовала диффузии антибиотиков с дисков в гель, причем отмечалась меньшая вариабельность значений диаметров зон задержки роста Staphylooooous aur-

Таблица N4.

Чувствительность S.aureus 6538Р к антибиотикам.

Антибиотик диаметр зоны задержки роста S.aureus 6538Р В мм

эксперимент. контрольная

мономицин 23,33+0,33 23,33+1,62

ристомицин 12+0,06 12+0,05

тетрациклин 23,67+0,33 23+2.08

гентамицин 24,67+0,33 26.67+0,67

эритромицин 29+0,91 27+1,53

eus 6538Р по сравнению с контрольной средой. При этом сохранялась адекватная чувствительность к антибиотикам тест-штамма. Характер роста микроба соответствовал его фенотипическим особенностям (образование желтого пигмента), на фоне ровного "газона" культуры четко выделялись зоны кнгибиции роста микроба. Из приведенных данных видно, что ФГХ в составе агаризованных сред не препятствует диффузии в гель биологически активных веществ различного молеку-ляного строения и не изменяет степень их активности. Следует отметить, что ФГХ проявляет и стимулирующие свойств относительно образования биологически активных метаболитов (высокая скорость появления линии преципитации на среде ОТДМ).

На основе ФГХ была приготовлена накопительная среда, аналогичная тиогликолевой среде. Данные роста различных групп микроорганизмов поквзали адекватность ростовых свойств экспериментальной и контрольной сред. ФГХ в составе тиогликолевой среды не изменял характер роста микробов. Проведенная работа по конструированию наиболее оптимального варианта состава позволила приготовить среду в трех модификациях (среда IV - 30 г/л ФГХ, 5 г/л ЭКД; среда v - 25 г/л ФГХ, 5 г/л ЭКД; среда VI - 30 г/л ФГХ), которые оценивали по показателю чувствительности и нейтрализующим свойствам. Через 18 часов в разведении Ю-7 наблюдался рост Aloaligenes fa-eoalis 415 сверху, характерный для строгого аэроба, только на среде VI, отличавшейся отсутствием в составе экстракта кормовых дрожжей (ЭКД). Через 48 часов рост A. faeoalis 415 наблюдали на всех средах из разведения Ю-8. В отношении Cloetridium novyi 198 рост был выявлен в посевах из разведений и Ю-6 в придонной

части вначале в виде скоплений отдельных, колоний, затем помутнения нижней части среды. Следовательно, предложенные рецептуры сред обеспечивают комфортные условия для развития анаэробных и аэробных микроорганизмов, причем ФГХ выполняет также и функцию биологичеки активной добавки.

Аля изучения нейтрализующих свойств эксперименальных сред инокуляцию проводили суслазияли культуры А. ГаеоаНв 415 в разведениях Ю-6, Ю-7, Ю-8, смешанными с мертиолятом в концентрации 1:1000. Через 4 суток рост культуры в верхней части столбика среды обнаруживался в посевах из разведений 10_6и Ю-7 в трех пробирках из трех параллельных и из разведения Ю-8 в двух пробирках из трех паралллельных на средах IV и VI, на среде V - в одной из трех параллельных. Полученные данные показали эффективность применения ФГХ в составе накопительной среда для выявления как анаэробов, так и аэробов, причем ФГХ обеспечивает сохранение жизнеспособности микробов в присутствии ингибитора роста микроорганизмов - ртутного консерванта. —

Таким образом, проведенное исследование биологических свойств ФГХ в составе микробиологических сред показало, что данная белковая основа обладает питательными свойствами в низких концентрациях, одновременно являясь и биологически активным фактором, стимулирующим физиологичекую деятельность микробов, не оказывает выраженного влияния на основные биохимические и культура-льно-морфологичекие свойства микроорганизмов, в составе агаризо-ванных сред не препятствует диффузии в гель веществ различного молекулярного строения и не изменяет степень активности последних.

Необходимость все более масштабного культивирования клеток эукариот в настоящее время определяет создание новых модификаций таких широко применяемых сред, как КРМ1-1640, МБП и аналогичных, где питательными компонентами являются смеси высокоочищенных аминокислот. Было приготовлено пять вариантов сред, аналогичных КРМ1-1640, с различным содержанием ФГХ и биологически активных веществ. Ростообеспечивапцие свойства испытуемых сред исследовали путем культивирования адаптированных к среде КРМ1-1640 клеток мышиной миеломы линии РЭ-Хбз-1£в.б5Э при одновременной полной замене исходной среды КРМ1-1640 на экспериментальную. Контрольной

средой служила среда КРМ1-1640. На первые сутки наблюдалось небо льшое увеличение количества клеток, близкий процент табели клеток на всех средах. На третьи сутки на контрольной и I средах клетки достигали максимального процента пролиферации - 598 и 316 соответственно. при сохранении прежнего процента гибели клеток. На более голодной среде II клетки достигли максимальной степени пролиферации только на 4 сутки. При этом наблюдалось активное увеличение общего количества клеток - наибольшее относительно других экспериментальных сред, а также увеличение степени гибели клеток. Вероятно, ФГХ в низких концентрациях оказывал стимулирующий эффект на рост клеток, но не обеспечивал достаточное питание. В больших концентрациях ФГХ угнетал рост клеток (среда III), при этом не наблюдалось каких-либо морфологических изменений. Данные опытов по культивированию гибридомы А-М^/РбА^ при постепенной замене среды НРМ1-1640 на экспериментальные среды показали, что в этом случае нивелировалось негативное влияние не совсем удачных составов сред на основе ФГХ. Непродолжительная адаптация клеток к среде I в течение 4-5 суток привела к увеличению процента пролиферации гибридомных клеток до 907%, на среде ЙРМ1 -1640 пролиферация составляла 873$. Проведенное исследование поведения клеток эукариот, неадаптированных к ФГХ, на наиболее оптимальной среде I в течение 30 суток при рассеве через 4-5 суток показало их устойчивую жизнеспособность в новых условиях, сохранение закономерностей роста, отсутствие морфологических изменений, причем без введения в экспериментальные среды таких значительных факторов роста, как витамин РР, восстановленный глутатион и холинхлорид.

Таким образом, экспериментально были доказаны целесообразность и эффективность применения ФГХ в качестве готовой смеси аминокислот и ростовых факторов в средах для эукариот, причем' как в качестве самостоятельной питательной основы, так и стимулирующей добавки, при этом в случае продолжительного культивирования клеток на средах на основе ФГХ не было обнаружено видимое цигото-ксическое действие ФГХ.

Одной из проблем эффективного культивирования клешей, представляющих собой важные объекты медицинской акарологии, являются искусственные питательные субстраты. В работе, проведенной совместно с Бержец В.М. и Емельяновой О.Ю., были сконструированы пита-

тельные чреды для клещей о. Гаг1пав. Аналогичная работа, с использованием клещей X. ри-Ьгевоеп-Ыав, была проведена совместно с Желтиковой Т.М.. В качестве питательной основы был использован ФПС. Поскольку культивирование клещей проводится при высокой влажности атмосфер! (75%-НН), первоначально была проведена работа по выбору носитель-основы питательной среды. Наиболее эффективной носитель-основой оказался шрот микроводорослей. Биомассу циано-бактерий рода Зр1ги11па, ФПС и углевод использовали в дальнейшем в качестве питательной составляющей искусственных сред. В таблице N5 приведена качественная оценка искусственных сред для Т.ргЛгев-оепЗДае. Первоначально наблюдалась некоторая задержка развития Популяции клещей т.риггввоеггЫае увеличение длительности лаг-фазы, что, вероятно, обусловлено еще и необходимостью адаптационного периода при переходе на новый пищевой субстрат. Клещи П.Гаг1-пае на экспериментальных средах также проявили признаки адаптационного характера. В дальнейшем более удачная компоновка сред позволила добиться развития клещей Б.Гаг1пае алогичного развитию на контрольной среде (таблица N6).

Из приведены! данных ростообеспечивапцай способности экспе-

Таблица N5.

Оценка питательных субстратов для клещей Т.ргЛгевоепИав.

Среда N качество сред Среда N качество сред

I + + III -

II + + контрол. + + +

- единичные особи "+" - >10 экз./г среды "+ +" ->100 экз./г среды "+ + +" ->1000 экз./г среды

Таблица N6. Ростообеспечиващая способность искусственных сред для клещей о.*аг1пае.

Среда N численность клещей Среда N численность клещей

XVII 8671,67+42,48 XIX 2940,33+38,96

XVIII 4827,67+165,42 контрол. 9152,33+122,11

риментальных сред для клещей следует, что смесь ФГХ, фрагментов и биомассы микроводорослей представляет собой новую искусственную среду обитания пироглифидных и амбарных клещей и достаточно эффективна для их культивирования.

Таким образом, экспериментальное обоснование применения ФГХ в качестве питательной основы сред различного назначения, а именно культивирования и идентификации прокариот, культивирования эука-риот, культивирования микроартропод, расширяет ряд перспективных белковых питательных основ, стандартных по своим физико-химическим и биологическим показателям, т.к. сырьем, в данном случае, является биомасса определенного штамма микроводорослей рода Chlorella, получаемая биотехнологическим путем, и которая всегда может быть проверена на генетическую стабильность.

ВЫВОДЫ

I. Экспериментально обоснованы целесообразность и эффективность применения ферментативного гидролизата биомассы зеленых микроводорослей рода Chlorella в качестве питательной основы сред культивирования различных биологических объектов (прокариоты, эукариоты, мшфоартроподы).

2. ФГХ обладает высокой ростообеспечиващей способностью в низких концентрациях в составе микробиологических питательннх сред. Последние обладают необходимыми чувствительностью, эффективностью, дифференцирующей активностью, обеспечивают высокую скорость роста, стабильность основных культурально-морфологических и физиолого-биохимимических свойств.

3. ФГХ является готовой смесью аминокислот и ростовых факторов для приготовления сред для эукариот.Отмечено отсутствие цито-токсического действия ФГХ на эукариотические клетки.

4. Сконструированы искусственные питательные субстраты для микроартропод на основе фрагментов и биомассы микроводорослей и ФГХ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Питательная среда для выращивания микроорганизмов. /Альбицкая О.Н.. Ахапкина И.Г. Блинкова Л.П., Бутова Л.Г., Ершова З.И., Масленникова В.Г., Мещерякова А.Л. - Заявка N92-014702/13 (06II74) от 28.12.92., положительное.решение от 29.06.94.

2. Питательные среды на основе гидролизата биомассы хлореллы. -/Блинкова Л.П., Бутова Л.Г., Ершова З.И.. Ахапкина И.Г., Фомкина И.П., Щербатых Н.В. //Состояние и перспективы разработки препаратов для диагностики вирусных гепатитов и инфекций, управляемых специфическими средствами профилактики. - Мат. докл. Всеросс. науч. -практ. kohJi. Пермь, 1993. -0.30.

3 . Новая питательная основа для приготовления дифференциально-диагностических сред. /Ахапкина И.Г., Бутова Л.Г., Блинкова Л.П.. Щербатых Н.В.. Фомкина И.П. //Принципы и практика борьбы с холерой в республике Дагестан. Актуальные вопросы разработки микробиологических питательных сред и тестсистем. - Мат. докл. Всеросс. науч.-практ. конф. 31окт. 1994г. - Махачкала, 1994. - С.99.

4. Экологически чистые питательные среды. /Блинкова Л.П., Бутова Л.Г., Ахапкина И.Г., Фомкина И.П., Щербатых Н.В. //Там же, -

С.119.

5. Оценка качества питательных сред на основе биомассы микроводорослей по биологическим показателям. /Бутова Л.Г., Блинкова Л.П., Ахапкина И.Г., Фомкина И.П., Щербатых Н.В. //Там же, - С.121.

6. Использование дифференциально-диагностических сред на основе биомассы хлореллы в планшетных тест-системах. /Фомкина И.П.. Блинкова Л.П., Щербатых Н.В.. Ахапкина И.Г.. Бутова Л.Г. //Там же, - С.147.

7. Применение ферментативного гидролизата биомассы хлореллы в средах для выращивания клеток эукариот. /Блинкова Л.П., Ахапкина И.Г., Яковлева И.В., Свиридов В.В. //Х.микробиол., 1995. - Кб. - С.6.