Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии и взаимодействий белка Stellate в семенниках Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии и взаимодействий белка Stellate в семенниках Drosophila melanogaster"

На правах рукописи

004685250

ЕГОРОВА Ксения Сергеевна

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ БЕЛКА STELLATE В СЕМЕННИКАХ DROSOPHILA MELANOGASTER

Специальность 03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 «ЮН 2010

Москва 2010 год

004605250

Работа выполнена в Лаборатории биохимической генетики животных Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН.

Научный руководитель: Научный консультант:

кандидат биологических наук Людмила Владимировна ОЛЕНИНА доктор биологических наук, академик РАН Владимир Алексеевич ГВОЗДЕВ

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михаил Борисович ЕВГЕНЬЕВ кандидат биологических наук Сергей Евгеньевич ДМИТРИЕВ

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится « УХ » илочч*_2010 г. в ^а часов на заседании

диссертационного совета Д 002.235.01 при Учреждении Российской академии наук Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН.

Автореферат разослан « УА » цч». 2010 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Регуляция семенник-специфичной генетической системы crystal-Stellate у Drosophila melanogaster является предметом активных исследований. Нарушение нормальной репрессии расположенных в Х-хромосоме тандемных кластеров семенник-специфичных генов Stellate сопровождается накоплением в сперматоцитах белковых кристаллов, дефектами конденсации и сегрегации мейотических хромосом, а также частичной либо полной стерильностью. Гены Stellate кодируют белок, гомологичный регуляторной р-субъединице протеинкиназы СК2 (СК2(3), однако у мух дикого типа не экспрессируются. Один из кластеров Stellate расположен в эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой - в гетерохроматине (участок h27 митотической прометафазной карты Х-хромосомы). Функция этих генов неясна, однако протеинкиназа СК2 играет важную роль в регуляции транскрипции и клеточного деления у D.melanogaster и других эукариот.

Репрессия кластеров генов Stellate осуществляется при участии локуса crystal, или Su(Ste) (Supressor of Stellate), расположенного в Y-хромосоме D.melanogaster (участок hi 1 митотической прометафазной карты Y-хромосомы). Повторы Su(Ste) обладают высокой степенью гомологии с генами Stellate. В норме экспрессия генов Stellate подавлена при помощи коротких РНК, обеспечиваемых антисмысловой транскрипцией локуса Su(Ste), по механизму piPHK-сайленсинга (Aravin et al., 2001; Vagin eî al., 2006). В отсутствие Y-хромосомы транскрипты Stellate накапливаются, и в сперматоцитах появляется кодируемый ими белок, образующий кристаллические звездчатые или иглоподобные структуры (Hardy et al., 1984; Bozzetti et al., 1995). Удаление небольшого участка Y-хромосомы, содержащего значительную часть повторов Su(Ste), также приводит к сверхэкспрессии генов Stellate (самцы cry'). И у самцов, лишенных Y-хромосомы, и у самцов cry' наблюдаются дефекты конденсации и сегрегации мейотического хроматина, что приводит к нарушению мейоза и, в конечном

итоге, к частичной или полной стерильности. Число копий гена Stellate варьирует у разных линий D.melanogaster от 15-50 копий (аллель Sie*) до 150400 копий (аллель Ste). В присутствии аллеля Ste+ белковые кристаллы, образующиеся в семенниках самцов cry1, имеют иглоподобную форму, мейотические дефекты незначительны, наблюдается неполная стерильность. В присутствии аллеля Ste в семенниках самцов cry' накапливаются звездчатые кристаллы, а сильные мейотические дефекты приводят к полной стерильности.

Причины возникновения и функциональный смысл существования системы Ste-Sa(Ste) до сих пор неясны. Повторы Stellate обнаружены только у D. melanogaster, у других видов Drosophila они отсутствуют. Считается, что эти повторы возникли в результате амплификации аутосомного гена CK2ßtes, кодирующего регуляторную ß-субъединицу протеинкиназы СК2 (Kalmykova et al., 1997). Механизм патогенеза, вызываемого сверхэкспрессией Stellate, до сих пор не выяснен. В ходе данной работы была обнаружена растворимая форма белка Stellate, присутствующая в ядрах сперматоцитов D.melanogaster, лишенных локуса crystal, и выявлены некоторые его партнеры, а также установлено, что эндогенный Stellate подвергается посттрансляционной модификации - триметилированию по остатку лизина. Эта посттрансляционная модификация специфически узнается антителами к гистону НЗ, триметилированному по остатку лизина К9 (НЗК9шеЗ), что свидетельствует о структурной мимикрии и возможности взаимодействия Stellate с хромодоменными белками. Полученные данные позволяют прояснить механизм патогенетического действия белка Stellate в семенниках D.melanogaster.

Цель и задачи работы

Целью работы являлась характеристика особенностей экспрессии и белок-белковых взаимодействий белка Stellate в семенниках D. melanogaster. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. изучение субклеточной локализации белка Stellate;

2. поиск возможных белковых партнеров Stellate in vivo\

3. исследование посттрансляционной модификации Stellate.

Научная новизна работы

Для исследования субклеточной локализации и поиска партнеров белка Stellate были получены высокоспецифичные антитела к Stellate. Впервые показано, что Stellate присутствует в растворимой форме в нуклеоплазме сперматоцитов. Установлено, что растворимый ядерный Stellate взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2 (СК2а) in vivo, a сверхэкспрессия генов Stellate в семенниках приводит к модуляциям фосфорилирования ядерных белков по остаткам серина. Показано, что при сверхэкспрессии кластеров генов Stellate выявляются белковые продукты как эухроматинового, так и гетерохроматинового кластеров Stellate.

В ходе работы установлено, что и растворимая, и кристаллическая формы эндогенного Stellate триметилированы по остатку лизина К92, причем эта постгрансляционная модификация структурно мимикрирует эпигенетическую модификацию гистона НЗ, триметилированного по остатку лизина К9 (НЗК9теЗ), с которой взаимодействует несущий хромодомен гетерохроматиновый белок НР1. Показано, что в метилировании белка Stellate принимает участие гистонметилтрансфераза dSETDBl. Это первый найденный случай триметилирования негистонового белка по остатку лизина у Drosophila.

Установлено, что Stellate обнаруживается в комплексе с гетерохроматиновым белком НР1, ответственным за формирование участков транскрипционно репрессированного гетерохроматина. Показано ассоциированное с фосфорилированием уменьшение электрофоретической подвижности НР1 в полиакриламидном геле на фоне сверхэкспресии генов Stellate, по сравнению с диким типом. Предложен механизм патогенетического действия Stellate в семенниках D.melanogaster.

Практическая значимость

Мутации, приводящие к нарушениям сперматогенеза, критически влияют на возможности воспроизводства и поддержания вида. Обнаружено

множество генетических локусов, повреждения которых приводят к стерильности, однако механизмы патогенетического влияния таких мутаций в большинстве своем неизвестны. Показано, что мутации по генам, участвующим в сайленсинге с помощью коротких piPHK, - aubergine, spindle-Е, armitage и др. (Aravin et al.s 2001; Vagin et al., 2006) - приводят к сверхэкспрессии генов Stellate и к соответствующим нарушениям сперматогенеза. Регуляция системы генов crystal-Stellate является объектом изучения многих исследователей, но причины патогенеза, вызываемого сверхэкспрессией Stellate, до сих пор неизвестны. Результаты данной работы позволили предложить модель патогенетического влияния сверхэкспрессии Stellate на состояние прицентромерного гетерохроматина, выражающегося в нарушениях когезии и сегрегации мейотических хромосом в сперматоцитах D.melanogaster. Согласно предложенной модели, растворимый триметилированный белок Stellate в ядрах сперматоцитов выполняет функцию регуляторной р -субъединицы протеинкиназы СК2, привлекая белок НР1 к гетеротетрамерному комплексу СК.2 и способствуя его гиперфосфорилированию. НР1 несет хромодомен, узнающий эпигенетическую модификацию НЗК9шеЗ, и в норме является мишенью фосфорилирования, осуществляемого СК2, которое важно для связывания части ядерного пула НР1 с гетерохроматиновыми локусами, в том числе с прицентромерным. Избыток гиперфосфорилированного НР1, в свою очередь, может вызывать гиперконденсацию прицентромерного гетерохроматина, что может служить причиной мейотических нарушений и некорректного сперматогенеза.

Обнаруженная в ходе данной работы посттрансляционная модификация Stellate - триметилирование по остатку лизина К92 -специфически узнается антителами к НЗК9теЗ и представляет собой один из немногих известных на данный момент случаев структурной мимикрии in vivo.

Апробация работы

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных симпозиумах и конференциях: на 16-м симпозиуме

FEBS/ESF, посвященном протеинкиназам, 'Dynamics of Cell Signal Systems' (Осло, Норвегия, 25-28 сентября 2008 г.); на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 23-27 июня 2009 г.); на протеомной школе-семинаре FEBS/EMBO 'Proteins and their Networks - from specific to global analysis' (о-в Спетсэ, Греция, 7-17 сентября 2009 г.); на Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября - 1 октября 2009 г.; 2-е место на конкурсе молодых ученых в рамках конференции).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных реферируемых журналах.

Материалы и методы

Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе: В настоящей работы были использованы терминальные ткани взрослых самцов D.melanogaster следующих линий:

Df(l)w, yw67c23(2); использована в качестве контрольной; в работе обозначена yw;

ywf/C(l)DX, yf/cry'Bs, Yy+; несет делецию локуса crystal в Y-хромосоме; в работе обозначена сгу'\

yw67c23/cry'Bs, Уу+/+;P{pC.aSpeR-6Ste-lacZ}\ несет делецию локуса crystal в Y-хромосоме, а также содержит вставку Р-элемента с 6 тандемными копиями гена Stellate во 2-й хромосоме; в работе обозначена///-172-2 cry;

w; 10.1-1 а™ / СуО GFP; +/+; хромосома 10.1-1аех несет делецию участка гена DmSetdbl, кодирующего 421-1261 а.о. гистонметилтрансферазы dSETDBl (Seum et al„ 2007); в работе обозначена dSETDBl+/-.

Обозначение crystal используется для обеих линий cry' и 111-112-2 cry.

Молекулярно-биологические методы:

Субклеточное фракционирование, Вестерн-блот-анализ,

иммунопреципитацию, пептидный фингерпринт и гетерологичную экспрессию в E.coli проводили согласно опубликованным стандартным протоколам.

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 102 страницах машинописного текста, содержит 28 рисунков и 7 таблиц. Список цитированной литературы состоит из 208 работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Ранее было показано, что делеция локуса crystal приводит к сверхэкспрессии генов Stellate в терминальных тканях самцов D.melarrogaster, которая проявляется в накоплении в цитоплазме сперматоцитов белковых кристаллов, а также в нарушениях мейотической конденсации и сегрегации хромосом и частичной либо полной стерильности (Hardy et al., 1984; Livak 1984; Bozzetti et al., 1995). Растворимая форма белка Stellate до сих пор обнаружена не была.

Получение антител к белку Stellate

Чтобы исследовать экспрессию Stellate в семенниках мух, несущих делецию локуса crystal, были получены высокоспецифичные антитела к белку Stellate. Для этого с помощью гетерологичной экспрессии ранее созданной в лаборатории конструкции, представляющей собой плазмиду pQE-ЗО, несущую процессированную последовательность эухроматинового гена Stellate (GenBank accession no. XI5899), в E.coli был экспрессирован рекомбинантный полноразмерный белок Stellate с 6His-T3roM на N-конце (6His-Stellate), который с помощью Ni-хелатной хроматографии очистили из лизата и использовали для иммунизации мышей. Полученные антисыворотки проверили иммуноферментным сорбционным анализом и Вестерн-блот-анализом.

Антитела, узнающие как рекомбинантный белок 6His-Stellate, так и эндогенный Stellate (расчетная молекулярная масса около 19,7 кДа, наблюдаемая подвижность в ДСН-ПААГ приблизительно соответствует 18 кДа) из семенников мух линий crystal, использовали в дальнейшей работе (рис. 1А). Сигнал Stellate отсутствовал в лизатах семенников дикого типа, тогда как специфичный сигнал в лизатах семенников мух линий crystal детектировался при 200-кратном разведении (рис 1Б).

150 —

75- Б

37 — 111-172-2 cry, сем. yw, сем.

мкг ЭС 3 0 6 С.З 0.15 ЗС

25 — ол...

20 - ян. е4 „ , ЛШШШшш............Stellate

* Stellate

15 —

50 — 37.

50 — 37 —

Рис. 1. (А) Вестерн-блот-анализ рекомбинантного 6His-Stellate и эндогенного Stellate в лизате семенников мух линии Ш-172-2 ау с использованием антисыворотки к белку Stellate. В лизатах контрольных семенников мух линии yw и голов мух линий yw и III-172-2 cry сигнала Stellate не выявлено. (Б) Последовательные разведения лизата семенников мух линии Ш-172-2 cry (от 30 до 0,15 мкг). Антитела к актину использованы для контроля загрузки.

Субклеточная локализация белка Stellate

Субклеточную локализацию белка Stellate исследовали при помощи иммуноокрашивания, совмещенного с конфокальной микроскопией, целых семенников мух линий crystal, лишенных локуса crystal. Было показано, что, помимо ранее известного накопления белка Stellate в кристаллической форме преимущественно в цитоплазме сперматоцитов (Bozzetti et al., 1995), Stellate также присутствует в растворимой форме в нуклеоплазме сперматоцитов

(середина фазы G2 мейотического цикла), в то время как в семенниках мух дикого типа сигнал не выявляется (рис. 2). Области иммунофлуоресцентного сигнала Stellate не были ассоциированы ни с ядерной ламиновой оболочкой, ни с окрашенными DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол) хромосомными территориями ядер интерфазных сперматоцитов.

Субклеточную и субъядерную локализацию белка Stellate также исследовали методами фракционирования и ультрацентрифугирования лизата в градиенте сахарозы. Низкоскоростное центрифугирование лизата семенников мух линии III-172-2 cry позволило получить ядерную фракцию, содержащую ядра и плотные цитоплазматические частицы (рис. ЗА). Отсутствие растворимого белка Stellate во фракции осветленной цитоплазмы свидетельствовало о том, что в цитоплазме Stellate может присутствовать только в кристаллической форме. Сравнение ядерных фракций лизатов, разделенных при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях (ДСН-ПААГ), выявило одну дополнительную полосу массой около 18 кДа в семенниках мух линии III-172-2 cry, идентифицированную как белок Stellate при помощи Вестерн-блот-анализа (рис. ЗБ).

Чтобы отделить кристаллы Stellate от большинства ядерных белков, ядерную фракцию семенников мух линии 111-172-2 cry обработали нуклеазой (бензоназой) для лучшей экстракции ядерных белков и провели последующее фракционирование нерастворимого материала при помощи зонального ультрацентрифугирования в 30-60% градиенте плотности сахарозы; полученные фракции исследовали путем электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализа (рис. 4). Было показано, что белок Stellate распределялся по двум зонам: первая располагалась в нижних слоях градиента и, по-видимому, представляла плотный кристаллический материал; вторая - в верхних слоях градиента, где были детектированы такие ядерные белки, как ламин и гистоны, что указывало на олигомерное состояние Stellate в этой зоне.

40 pm

<s , f

' je ' t О '^

, C,c£o Qjf

** - A

40 Iim -Jyf.«.

-----

"-с

о ^ - j о ЛО л V^'OQqO

г > DAPI

-Л*

о

Рис. 2. Внутриклеточное и внутриядерное распределение белка Stellate в семенниках. (А и Б) Конфокальные срезы иммунофлуоресцентно-окрашенных тотальных препаратов семенников мух линии III-172-2 cry (А) и контрольной линии yw (Б). Показаны только апикальные части семенников. (В) Иммунофлуоресцентное окрашивание ядер зрелых сперматоцитов мух линии III-172-2 cry. Голубой - DAPI, зеленый - Stellate, красный - ламин.

А Субклеточное фракционирование семенников Hl-172-2 cry

Гель, окрашенный Кумасси Вестерн-блот

Stellate

у-тубулин

кДа 250 100 75 50

„<£><? иг-'

I

ж

-

¿¿Г f \\V

Stellate актин

I CK2a ламин

Рис. 3. (А) Вестерн-блот-анализ субклеточного фракционирования лизата семенников мух линии III-172-2 cry. * - фракция ядер, содержащая также плотные цитоплазматические частицы. (Б) Электрофорез в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ ядерных фракций из семенников мух линий yw и III-172-2 cry. Основное отличие между контролем и опытом состоит в присутствии полосы Stellate (**).

Фракционирование в градиенте сахарозы 30% 60%

верх низ

13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

iM

Stellate актин ламин НЗКЭтеЗ

Рис. 4. Вестерн-блот-анализ фракционирования нерастворимой фракции семенников мух линии II1-172-2 cry в градиенте сахарозы после нуклеазной обработки. Stellate распределяется по двум зонам. Внизу: Stellate в обеих зонах подвергается триметилированию по остатку лизина и специфично узнается антителами к НЗК9теЗ (см. далее; верхние полосы соответствуют метилированному Stellate, нижние — триметилированному гистону НЗ).

Чтобы исследовать субъядерную локализацию Stellate, провели фракционирование лизата семенников по методу Мендеза и Штильмана (Mendez and Stillman, 2000) (рис, 5А). В результате лизат семенников мух линии III-172-2 cry был разделен на три фракции: (1) фракцию растворимых цитоплазматических белков (S2); (2) фракцию нуклеоплазмы, экстрагированной из ядер бессолевым буфером (S3); и (3) фракцию ядерного осадка, содержащую хроматин-ассоциированные белки, белки ядерного матрикса и другой нерастворимый материал (РЗ). Stellate сосредотачивался только во фракциях S3 и РЗ (рис. 5Б), в то время как каталитическая а-субъединица лротеинкиназы С К2 присутствовала во всех фракциях. Хроматиновый маркер ORC1 (origin recognition complex, субъединица i) был обнаружен только во фракции РЗ, обогащенной хроматиновыми белками. Растворимый ядерный Stellate составлял не более 10% от общего количества белка Stellate.

Лизат

I

ц/ф 1300 об/мин, 5', 4°С

S2 S3 РЗ

Р1

Stellate

Р1

(неосветл. цитоплазма) (тотальная ядерная фр.)

I 1

ц/ф 13200 об/мин, 15', 4"С экстракиия бессолевым буфеоом

/\ I

22 Р2 ц/ф 1700 об/мин. 5'. 4°С

(осветленная (осадок)

цитоплазма) рз

(нуклеоплаэма) (фр., обогащенная

хроматиновыми белками)

'*• -Шт

НР1

ORC1

Рис. 5. Растворимый ядерный белок Stellate является компонентом нуклеоплазмы. (А) Схема фракционирования по методу Мендеза и Штильмана. (Б) Вестерн-блот-анализ полученных фракций.

Таким образом, методами иммунофлуоресцентного окрашивания и фракционирования семенников мух линий стуя/а/ было показано, что

сверхэкспрессия генов Stellate приводит к появлению двух различных популяций белка Stellate, причем растворимый Stellate присутствует исключительно в нуклеоплазме. Полученные данные позволили предположить, что мейотические нарушения, связанные со сверхэкспрессией Stellate в сперматоцитах, могут быть вызваны взаимодействием растворимого ядерного Stellate с неизвестными белками-партнерами.

Поиск партнеров белка Stellate

Ранее было показано, что Stellate проявляет гомологию с регуляторной Р-субъединицей протеинкиназы СК2 (Livak, 1990; Bozzetti et al., 1995). Также было продемонстрировано, что рекомбинантный Stellate, взятый в 19-кратном избытке, умеренно улучшает каталитическую активность СК2а in vitro (Bozzetti et al., 1995). Однако до сих пор эндогенный Stellate обнаруживали в сперматоцитах только в кристаллической форме, и функциональность его взаимодействия с СК2а не была доказана.

Свидетельств того, что СК2а может откладываться в кристаллы, сформированные Stellate, в ходе данной работы найдено не было, поскольку во фракциях осадков, полученных при фракционировании семенников мух линий crystal и дикого типа yw, присутствовали одинаковые количества СК2а (рис. ЗБ). Иммунопреципитация белка Stellate из тотального лизата семенников мух линии 111-J 72-2 cry с использованием антител к Stellate выявила, что вместе со Stellate коиммунопреципитируется белок массой 37 кДа, который, как показал Вестерн-блот-анализ, является СК2а (рис. 6А). СК2а была обнаружена и в ядерной, и в цитоплазматической фракциях семенников, в то время как растворимый Stellate присутствовал исключительно в ядре (рис 5Б). Полученные данные свидетельствуют о том, что СК2а взаимодействует со Stellate именно в ядре. Накопление растворимого Stellate в ядре Может влиять на фосфорилирование специфических ядерных мишеней СК2, что подтверждается выявлением при помощи антител к фосфорилированному остатку серина во фракции тотальных ядер из семенников мух линий crystal

гиперфосфорилирования белка массой около 26 кДа, по сравнению с диким типом (рис. 6Б). Различий в фосфорилировании белков по остаткам серина между соответствующими цитоплазматическими фракциями обнаружено не было.

А

/

37 - «Ла» СК2а

20 - тт

ЯЯ! Stellate

кДа с/у' yw

150 - | • я

100 - j ¡V: . щшШ' ■

ЯШ

50 - ;

37 -

Г

25 -

фосфосерин

15 -

20 ~ t^fe Stellate

50 -

37 _ ш'"» актин

Рис. 6. (А) Каталитическая субъединица СК2а коиммунопреципитируется с белком Stellate. НМС - неиммунная мышиная сыворотка. (Б) Сверхэкспрессия генов Stellate в семенниках приводит к модуляциям фосфорилирования ядерных белков по остаткам серина (ядерная фракция); использованы антитела к фосфорилированному остатку серина (Zymed).

Stellate подвергается метилированию по остатку лизина Вестерн-блот-анализ показал, что эндогенный белок Stellate из семенников мух линий crystal, но не рекомбинантный 6His-Stellate, эффективно узнается антителами к триметилированному остатку лизина 9 гистона НЗ, НЗК9теЗ (рис. 7). Антитела к другим метилированным модификациям гистона НЗ - НЗК4ше2 и НЗК27шеЗ - не узнавали Stellate в Вестерн-блот-анализе (рис. 7).

и* ^

«fla ¿TÍ ^ ^ ^ 20-

<§ Stellate

кДа ^ «V ^

НЗКЭтеЗ

(верхн. полоса - Stellate,

нижн. полоса - гистон ИЗ) 20 —

1550-

Рис. 7. Эндогенный Stellate подвергается триметилированию in vivo. Вестерн-блот-анализ ядерных фракций из семенников мух линий crystal и yw. Антитела к актину использованы для контроля загрузки.

Иммуноокрашивание тотальных препаратов семенников мух линий crystal антителами к Stellate и НЗК9теЗ выявило высокую степень колокализации обоих сигналов в кристаллах Stellate (рис. 8). Яркие точечные сигналы НЗК9теЗ также присутствовали в ядрах сперматоцитов и, скорее всего, соответствовали триметилированному гистону НЗ.

Чтобы определить сайт метилирования белка Stellate при помощи масс-спектрометрии, провели многоступенчатую очистку нерастворимой фракции семенников, полученной при низкоскоростном центрифугировании и содержавшей ядра и большую часть кристаллов Stellate. Очистка включала последовательное удаление ядерной мембраны посредством инкубации ядерного осадка с 0,04% Triton-X 100 (Vann et al., 1997), экстракцию нуклеоплазмы бессолевым буфером (Mendez and Stillman, 2000) и последующую экстракцию хроматин-ассоциированных белков путем обработки нуклеазой (бензоназой) и экстракции высокосолевым буфером. Полученные в результате очистки нерастворимые фракции из семенников мух линий 111-172-2 cry и yw были разделены при помощи электрофореза в ДСН-ПААГ, гели были окрашены «Кумасси синим», и из дорожек с фракциями III-172-2 cry были вырезаны полосы массой около 18 кДа, соответствующие

Stellate по Вестерн-блот-анализу. Соответствующая область на дорожке с фракцией yw не содержала окрашенных полос. Трипсинолиз в геле, пептидный фингерпринт на MALDI-TOF-масс-спектрометре и последующий поиск в неизбыточных базах данных SW1SS-PROT и NCBI при помощи программного пакета Mascot (http://www.matrixscience.com') выявили продукты эухроматинового кластера Stellate, а также пептиды, общие для обоих кластеров, и пептиды, характерные для продуктов гетерохроматинового кластера Stellate. Поиск предсказанного сдвига масс на 14, 28 или 42 Да для триптических пептидов, содержащих, соответственно, моно-, ди- или триметилированные остатки лизина, выявил присутствие пептидов, соответствовавших последовательностям 92KYLRGDFGSCPNISCDR108 и 92KYMQGDFESCPNISCDR' 08 (эухроматиновый и гетерохроматиновый варианты Stellate, соответственно), с приростом массы на 42 Да, по сравнению с предсказанной (таблица 1).

Эти результаты, наряду с иммунохимическими данными, позволили предположить, что участок Stellate 89MHRKYL/M94 содержит триметилированный остаток лизина.

Таблица 1. Определение участка метилирования Stellate при помощи трипсинолиза и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. Наблюдаемая масса пептида из гетерохроматинового локуса указана с учетом допустимой при трипсинолизе в геле модификации - алкилирования остатков цистеина акриламидом.

Область Последовательность Кодирующий локус Преде каза иная масса, Да Наблюдае мая масса, Да Массовый сдвиг, Да

92-108 KYLRGDFGSCPNISCDR эухроматиновый 1930,89 1973,04 +42,15

92-108 KYMQGDFESCPNISCDR гетерохроматиновый 2134,90 2177,09 +42,19

Stellate

Г'

/ \ т / } \ у/1 ч

триметиллизин

* "V

т 2 Ч* ♦ и, совмещение ■Г -> 30um

. ' А: 1 / /

i • ^ / \ / J \ '

\ . \ \ , н - у// >ч|

Рис. 8. Эндогенный Stellate подвергается триметилированию in vivo. Колокализацня сигналов Stellate и НЗК9теЗ в иммунофлуоресцентно-окрашенных тотальных препаратах семенников мух линии cry1. Голубой - DAPI, зеленый - Stellate, красный - H3fC9me3, фиолетовый - ламин-В-рецептор.

Чтобы установить, подвергается ли метилированию растворимая ядерная фракция Stellate, провели анализ распределения сигналов от антител к H3K9ine3 на Вестерн-блоте во фракциях, полученных при фракционировании путем зонального ультрацентрифугирования в 30-60% градиенте плотности сахарозы (см. выше). Как и ожидалось, было обнаружено, что антитела к НЗК9шеЗ узнают Stellate как из кристаллической, так и из олигомерной областей градиента (рис. 4). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что и растворимый, и кристаллический Stellate подвергается триметилированию по остатку лизина in vivo. Более того, эта модификация представляет собой случай структурной мимикрии эпигенетической модификации НЗКЗтеЗ.

Выравнивание последовательностей Stellate и других регуляторных субъединиц СК2р, в том числе и предполагаемого предшественника Stellate CK2ptes (Kalmykova et al., 1997), выявило, что мотив для метилирования по остатку лизина возник и эволюционно закрепился только в генах Stellate (рис. 9). У мух, гетерозиготных по мутации в гене гистонметилтрансферазы dSETDBl, ответственной за ди- и триметилирование НЗК9, наблюдался эффект дозы гена, проявлявшийся в воспроизводимом снижении метилирования Stellate (рис. 10). Известно, что dSETDBl присутствует как в ядре, так и в цитоплазме (Yoon et al., 2008), что согласуется с полученными в работе данными по метилированию как ядерной, так и цитоплазматической популяций Stellate.

.............Р03182 I CSK2B_DP.OME.........QMIEKYQTGDFGHCPRVYCESQPMLPLGLS DIPGEAMVKTYCPKCI DVYT

.............spl P67870 I CSK2B_HUMAN......QMLEKYQQGDFGYCPRVYCENQPMLPIGLSDIPGEAMVKLYCPKCMDVYT

.............sp I 0968 63 I CSK2C_DF,OME......LMLDKYNKGEFGTCFRAFCHSQPVLPIGLSDNPGEDMVRIYCPKCNDVYI

.............splQ24 536| SSL_DROME........DMRLKYERGDFGSCPRVFCKRQKVLPVGLHDVWDKAQVKIYCPSCNNVYI

eu-Stellate--splQ7KV12ISTELl_DROME......AMHRKYLRGDFGSCFNI SCDRQNTLPVGLSAWGKSTVKIHCFRCKSNFH

eu ■ Stellate ■ • sp I Q7KV17 I STEL6_DROME......AMHRKYMRGDFGSCPMISCDRQNTLPVGLSAVWGKSTVKIHCPRCKSNFH

he t- Stellate ■ sp 1X97134 I STEL_DP.OME.......AMHRKYMQGDFESCPMISCDRQHTLPVGLSDWGKSTVKIYCPRCKKNFH

Рис. 9. Фрагмент выравнивания последовательностей Stellate и других регуляторных субъединиц СК2|5 в районе мотива метилирования Stellate. euStellate -продукт эухроматинового локуса Stellate, hetStellate - продукт эухроматинового локуса Stellate.

/ / /

анти-НЗК9теЗ

Stellate

□ Slellale-m OSIellata

Рис. 10. (А) Гистонметилтрансфераза dSETDBl принимает участие в метилировании Stellate. Антитела к H3K9me3 использованы для оценки метилирования Stellate в ядерной фракции (Р1, см. рис. 5), метилированный гистон НЗ не показан. Антитела к актину использованы для контроля загрузки. (Б) Денситометрический анализ распределения сигналов НЗК9теЗ (от триметилированного Stellate, Stellate-me3) и Stellate на Вестерн-блот-анализе (А) (нормировано на актин) (ImageQuant v. 5.2, Molecular Dynamics).

Разделение белков Stellate на фракции, кодируемые эухроматиновыми и гетерохроматиновыми повторами Stellate

Многоступенчатая очистка нерастворимой фракции семенников, содержащей большую часть кристаллов Stellate, для определения сайта метилирования белка при помощи масс-спектрометрии позволила электрофоретически разделить Stellate на две фракции, кодируемые эухроматиновыми и гетерохроматиновыми повторами. Несмотря на высокую гомологию нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, наличие триптических пептидов, характерных только для продуктов эухроматинового либо гетерохроматинового кластеров Stellate позволило при помощи масс-спектрометрического анализа определить, что верхняя полоса Stellate представляет собой продукты гетерохроматинового кластера, в то время как нижняя является продуктами эухроматинового кластера (таблица 2), причем

продукты обоих кластеров Stellate подвергаются триметилированию in vivo (таблица 1).

Таблица 2. Экспериментально выявленные пептиды, соответствующие продуктам эухроматинового и гетерохроматинового локусов Stellate. Жирным выделены пептиды, общие для обоих локусов.

Пептиды из продуктов эухроматинового локуса Stellate Пептиды т продуктов гетерохроматинового локуса Stellate

VVYGMIHAR VVYGMIHAR

KYVYGMIHAR KWYGMIHAR

Y1RAERGLIAMHR SDRGV1AMHR

GLIAMHR QNTLPVGLSDVWGK.

GLIAMHRKYMR QNTLPVG LSD VWGKSTVK.

KYMRGDFGSCPNISCDR iYCPRCK

YMRGDFGSCPNISCDR KNFHPK

QNTLPVGLSAVWGK

SNFHPK

Взаимодействие Stellate с НР1 и его последствия Эпигенетическая модификация НЗК9шеЗ узнается гетерохроматиновым белком НР1, содержащим хромодомен и ответственным за формирование участков транскрипционно репрессированного гетерохроматина (Lachner et al., 2001). Полученные в работе данные позволили предположить, что триметилированный Stellate также способен привлекать НР1 или другие хромодомен-содержащие белки. Анализ результатов химической сшивки in núcleo выявил ковалентно сшитый комплекс массой около 65 кДа, содержащий как Stellate, так и НР1, но отсутствующий в семенниках мух дикого типа (рис. 11, показан стрелкой).

i>

кДа £ £

250 -иг

150 - Шш

100- Я

75- Щ 50- Щ

37- к

2520-

ЭНТИ-НР1

$

§

кДа 250 1501007550-

2520-

cry-DSP Stellate

75КДЗ 50 (Да _____I „ .1_______

энти-Stelfate

cry-DSP НР1

75 кДа 50 кДа 1 . .. Т

Рис. 1 1. Stellate обнаруживается в комплексе с НР1 в семенниках мух линий crystal, но неуи'. Слева: Вестерн-блот-анализ DSP-сшивки in nucleo\ сту+DSP и jw+DSP -фракции из семенников мух линий ctystal и yw, соответственно, в которые был добавлен DSP; cry - контрольный препарат crystal (без DSP). Показаны фракции нуклеоллазмы, экстрагированные из химически сшитых ядер. Справа: денситометрический анализ распределения сигналов Stellate и НР1 во фракциях cat+DSP (ImageQuant v. 5.2, Molecular Dynamics). Комплекс, содержащий Stellate и HP1 и отсутствующий в пробе из семенников мух дикого типа, показан стрелками. DSP -дитиобиссукцинимидилпропионат (бифункциональный сшивающий агент).

НР1 в норме является мишенью множественного фосфорилирования, осуществляемого СК2, которое существенно для его связывания с гетерохроматиновыми локусами, в том числе с прицентромерным (Eissenberg et al„ 1994; Zhao and Eissenberg, 1999 и 2001; Shimada et al„ 2009). Фосфорилирование HP1 приводит к уменьшению его подвижности в условиях денатурирующего электрофореза в ДСН-ПААГ (Shimada et а!., 2009). Результаты проведенного в ходе работы субклеточного фракционирования свидетельствовали о том, что в ядрах сперматоцитов семенников мух линий crystal часть HP 1 локализуется в нуклеоплазме (рис. 5Б, фракция S3), в то время как другая часть присутствует в обогащенной хроматиновыми белками фракции РЗ, причем обладает меньшей подвижностью, по сравнению с S3 (рис.

5Б). При фракционировании семенников было обнаружено уменьшение подвижности HP 1 в геле в случае делеции crystal, по сравнению с диким типом (рис. 12). Более того, при обработке ядерной фракции семенников мух с делецией crystal щелочной фосфатазой из кишечника теленка наблюдалось увеличение подвижности НР1 в ДСН-ПААГ, по сравнению с необработанной фракцией, что свидетельствует о том, что снижение подвижности НР1 связано с его фосфорилировапием.

S2 S3 РЗ

кда yw cry yw cry yw cry 50-

37-

a*« * HP1

Рис. 12. Подвижность ассоциированного с хроматином HPI в ДСН-ПААГ падает на фоне делеции crystal. Вестерн-блот-анализ субъядерного фракционирования по Мендезу и Штильману. S2 - фракция цитоплазмы, S3 - фракции нуклеоплазмы, РЗ -фракции, обогащенные хроматиновыми белками.

Формирование гетерохроматина в прицентромерных районах необходимо для корректного образования кинетохора и последующей сегрегации хромосом при клеточном делении (Kellum and Alberts, 1995; Ekwall et al., 1996; Pidoux and Allshire, 2005). Как недостаточность, так и сверхэкспрессия НР1 приводят к нарушениям компактизации прицентромерного гетерохроматина и аномалиям центромерной когезии и сегрегации хромосом (Inoue et al, 2008).

Полученные в работе результаты позволили предложить модель патогенного влияния сверхэкспрессии Stellate в семенниках D.melanogaster, которое проявляется в дефектах конденсации и сегрегации мейотического хроматина и, в конечном итоге, в частичной или полной стерильности самцов. Согласно данной модели, Stellate выполняет в ядрах сперматоцитов функцию

дополнительной регуляторн@й -субъединицы СК2, при помощи триметиллизиновой метки эффективно привлекая НР1 к каталитической! -субъединице СК2 и способствуя его гиперфосфорилированию. Так, гистонметилтрансфераза G9a, moho- и диметилирующая НЗК9 in vivo, обладает способностью к автометилированию по остаткам лизина К114 и К185, причем G9aK185me3 по своему аминокислотному окружению схож с НЗК9гпеЗ и также взаимодействует с белком НР1 (Chin et al., 2007; Sampath et al., 2007; Rathert et al., 2008). Избыток фосфорилированного HP1, в свою очередь, может вызывать гиперконденсацию прицентромерного гетерохроматина, что может служить причиной мейотических нарушений и некорректного сперматогенеза у D.melanogaster при дерепрессии Stellate. Таким образом, проведенное исследование позволило приблизиться к пониманию молекулярно-биологических причин мейотических нарушений сперматогенеза D.melanogaster на фоне сверхэкспрессии белка Stellate, а также выявило новый случай молекулярной мимикрии.

выводы

1. Охарактеризована субклеточная локализация белка Stellate в сперматоцитах D.melanogaster при генетической дерепрессии кластеров генов Stellate; Stellate формирует кристаллы преимущественно в цитоплазме сперматоцитов, в то время как в нуклеоплазме сперматоцитов присутствует также в некристаллической растворимой форме.

2. При дерепрессии кластеров генов Stellate выявляются белковые продукты как эухроматинового, так и гетерохроматинового кластеров Stellate.

3. Эндогенный белок Stellate взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2.

4. Белок Stellate, как растворимый, так и кристаллический, несет посттрансляционную модификацию - триметилирование по остатку лизина К92; в метилировании Stellate принимает участие гистонлизинметилтрансфераза dSETDB 1.

5. Триметилированный по остатку лизина К92 белок Stellate специфически узнается антителами к модифицированному гистону НЗК9теЗ, демонстрируя структурную мимикрию соответствующего эпитопа гистона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи

1. Egorova K.S., Olenkina О.М., Kibanov M.V., Kalmykova A.I., Gvozdev V.A., and Olenina L.V. (2009) Genetically derepressed nucleoplasm^ Stellate protein in spermatocytes of D. melanogaster interacts with the catalytic subunit of protein kinase 2 and carries histone-like lysine-methylated mark. Journal of Molecular Biology, 389, 895-906.

2. Егорова K.C.. Оленкина O.M., Оленина JI.В. (2010) Метилирование негистоновых белков по остаткам лизина как способ регуляции их стабильности и функциональности. «Биохимия» (Москва), 75,613-628.

Тезисы

1. Ksenia Egorova, Ludmila Olenina, Oxana Olenkina, Vladimir Gvozdev. Studying of the expression and protein-protein interactions of Stellate protein in testes of Drosophila melanogaster. 49"1 Annual Drosophila Research Conference, San Diego, CA, USA, April 2-6,2008, abstract book, page 495C.

2. Ksenia S. Egorova. Ludmila V. Olenina, Oxana M. Olenkina, and Vladimir A. Gvozdev. The study of Stellate protein, its partners and role in signaling pathways in testes of Drosophila melanogaster. FEBS/ESF Workshop Novo Nordic Foundation Symposium, 16th Protein Kinase Meeting - 'Dynamics of Cell Signal Systems', Oslo, Norway, September 25-28,2008, abstract book, page 12.

3. Егорова K.C., Оленкина O.M., Кибанов M.B., Оленина Л.В, Гвоздев В.А. Генетически дерепрессированный нуклеоплазматический белок Stellate взаимодействует с каталитической субъединицей протеинканизы СК2 и подвергается метилированию по остатку лизина in vivo. IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), стр. 337 в сборнике тезисов.

4. Егорова К.С., Кибанов М.В., Оленкина О.М., Гвоздев В.А., Оленина Л.В. Выяснение механизма патогенетического действия белка Stellate в семенниках Drosophila melanogaster. Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Юрия Анатольевича Овчинникова (Москва, 28 сентября - 1 октября 2009 г.), стр. 69-72 в сборнике тезисов.

Заказ № 1б-а/05/10 Подписано в печать 05.05.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 mvw.cfr.ni; е-таИ:т/о@с/г.т

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Егорова, Ксения Сергеевна

Список сокращений.

1. Общая характеристика работы.

1.1 Актуальность проблемы.

1.2 Задачи исследования.

1.3 Научная новизна результатов исследования.

1.4 Практическая ценность.

1.5 Апробация работы.

2 Обзор литературы.

2.1 Экспрессия тандемных кластеров генов Stellate в семенниках Drosophila melanogaster.

2.1.1 Система crystal-Stellate.

2.1.2 Гены Stellate являются мишенью piPHK-сайленсинга.

2.1.3 Происхождение генетической системы crystal-Stellate.

2.1.4. Изучение особенностей белка Stellate.

2.2 Протеинкиназа СК2.

2.2.1 Роль СК2 в клетках различных организмов.

2.2.2 Структурно-функциональные характеристики СК2.

2.2.3 Мишени СК2.

2.2.4 CK2fi: внутривидовые особенности.

2.2.5 Мишени СК2 у D. melanogaster.

2.3 Метилирование негистоновых белков по остаткам лизина как способ регуляции их стабильности и функциональности.

2.3.1 Метилирование гистонов и концепция гистонового кода.

2.3.2 Метилирование транскрипционных факторов и других ядерных белков.

2.3.3 Метилирование белков трансляционного аппарата.

2.3.4 Белки, узнающие метилированные остатки лизинов («метиллизин-ридеры»).

2.3.5 Итоги и дальнейшие перспективы изучения метилированных белков.

3. Материалы и методы.

3.1 Линии Drosophila melanogaster, использованные в работе.

3.1.1 Схема скрещивания для получения мух с делецией локуса crystal, гетерозиготных по инсерции в ген гистонметилтрансферазы Su(Var)3-9.

3.2 Экспрессия и очистка рекомбинаптного белка Stellate.

3.3 Получение антител к белку Stellate.

3.4 Иммунофлуоресцентное окрашивание и конфокальная микроскопия.

3.5 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ.

3.5.1 Приготовление модифицированного полиакриламидного геля с измененной процентностью сшивки.

3.5.2 Окрашивание ПААГ «Кумасси».

3.5.3 Окрашивание ПААГ серебром.

3.6 Антитела.

3.7 Субклеточное фракционирование.

3.8 Фракционирование в градиенте сахарозы.

3.9 Субъядерное фракционирование.

3.10 Иммунопреципитация.

3.10.1 Ковалентная пришивка антител к протеин-С-сефарозе.

3.11 Аналитическая очистка белка Stellate и идентификация сайта метилирования.

3.12 Химическая сшивка белков in nucleo.

3.13 Фосфатазный анализ.

3.14 Иммуноферментный сорбционный анализ (ELISA).

4. Результаты.

4.1 Получение антител к белку Stellate.

4.2 Субклеточная локализация белка Stellate.

4.3 Поиск партнеров белка Stellate.

4.4 Stellate подвергается метилированию по остатку лизина.

4.5 Разделение белков Stellate на фракции, кодируемые эухроматиновыми и гетерохроматиновыми повторами Stellate.

5. Обсуяедение.

5.1 Субклеточная локализация белка Stellate.

5.2 Взаимодействие Stellate с СК2а.

5.3 Триметилирование Stellate.

5.4 Модель патогенеза при сверхэкспрессии Stellate.

6. Выводы.

7. Литература.

Благодарности

Список сокращений

АБТС — 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота)

ГЛМТ - гистонлизинметилтрансфераза

Да (кДа) - дальтон (кило дальтон)

ДМСО - диметилсульфоксид

ДСН - додецилсульфат натрия

ДСН-ПААГ — полиакриламидный гель, содержащий додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотреитол н. - нуклеотидов т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЭГТУ - этиленгликольтетрауксусная кислота (динатриевая соль)

ЭДТУ - этилендиаминтетрауксусная кислота (динатриевая соль)

DAPI - 4',6-диамидино-2-фенилиндол

DMP - диметилпимелимидат

DSP - дитиобиссукцинимидилпропионат

ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay (иммуноферментный сорбционный анализ)

НЗК4те2 - гистон НЗ, диметилированный по остатку лизина К4 НЗК9те2 - гистон НЗ, диметилированный по остатку лизина К9 НЗК9теЗ - гистон НЗ, триметилированный по остатку лизина К9 НЗК27шеЗ - гистон НЗ, триметилированный по остатку лизина К27 IPTG - изопропил-р-О-тиогалактозид piPHK - Piwi-ассоциированные короткие РНК PVDF - поливинилиденфторид Su(Ste) — Supressor ofStellate

1. Общая характеристика работы

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Егорова, Ксения Сергеевна

6. Выводы

1. Охарактеризована субклеточная локализация белка Stellate в сперматоцитах D. melanogaster при генетической дерепрессии кластеров генов Stellate; Stellate формирует кристаллы преимущественно в цитоплазме сперматоцитов, в то время как в нуклеоплазме сперматоцитов присутствует также в некристаллической растворимой форме.

2. При дерепрессии кластеров генов Stellate выявляются белковые продукты как эухроматинового, так и гетерохроматинового кластеров Stellate.

3. Эндогенный белок Stellate взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2.

4. Белок Stellate, как растворимый, так и кристаллический, несет посттрансляционную модификацию — триметилирование по остатку лизина К92; в метилировании Stellate принимает участие гистонлизинметилтрансфераза dSETDB 1.

5. Триметилированный по остатку лизина К92 белок Stellate специфически узнается антителами к модифицированному гистону НЗК9теЗ, демонстрируя структурную мимикрию соответствующего эпитопа гистона.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Егорова, Ксения Сергеевна, Москва

1. Ambler, R.P. and Rees, M.W. (1959). Epsilon-N-methyl-lysine in bacterial flagellar protein. Nature, 184, 56-57.

2. Aravin, A.A., Lagos-Quintana, M., Yalcin, A., Zavolan, M., Marks, D., Snyder, В., Gaasterland, Т., Meyer, J., and Tuschl, T. (2003) The small RNA profile during Drosophila melanogaster development. Dev. Cell, 5(2), 337-350.

3. Avila, J., Ulloa, L., González, J., Moreno, F., and Diaz-Nido, J. (1994). Phosphorylation of microtubule-associated proteins by protein kinase CK2 in neuritogenesis. Cell Mol. Biol. Res., 40(5-6), 573-579.

4. Balakireva, M.D., Shevelyov, Y.Y., Nurminsky, D.I. , Livak, K.J. and Gvozdev, V.A. (1992). Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster. Nucleic Acid Res., 20(14), 3731-3736.

5. Bibby, A.C. and Litchfield, D.W. (2005). The multiple personalities of the regulatory subunit of protein kinase CK2: CK2 dependent and CK2 independent roles reveal a secret identity for CK2beta. Int. J. Biol. Sci., 1(2), 67-79.

6. Bidwai, A.P., Zhao, W., and Glover, C.V. (1999). A gene located at 56F1-2 in Drosophila melanogaster encodes a novel metazoan beta-like subunit of casein kinase II. Mol. Cell Biol. Res. Commun., 1(1), 21-28.

7. Bjorling-Poulsen, M., Siehler, S., Wiesmuller, L., Meek, D., and Issinger, O.G. (2005). The 'regulatory' beta-subunit of protein kinase CK2 negatively influences p53-mediated allosteric effects on Chk2 activation. Oncogene, 24(40), 6194-6200.

8. Blau, J. (2003). A new role for an old kinase: CK2 and the circadian clock. Nat. Neurosci., 6(3), 208-210.

9. Blond, O., Jensen, H.H., Buchou, T., Cochet, C., Issinger, O.G., and Boldyreff, B. (2005). Knocking out the regulatory beta subunit of protein kinase CK2 in mice: gene dosage effects in ES cells and embtyos. Mol. Cell Biochem., 274(1-2), 31-37.

10. Boa, S., Coert, C., and Patterson, H.G. (2003). Sacharomyces cerevisiae Setlp is a methyltransferase specific for lysine 4 of histone H3 and is required for efficient gene expression. Yeast, 20, 827-835.

11. Bojanowski, K., Filhol, O., Cochet, C., Chambaz, E.M., and Larsen, A.K. (1993). DNA topoisomerase II and casein kinase II associate in a molecular complex that is catalytically active. J. Biol. Chem., 268(30), 22920-22926.

12. Bonet, C., Fernandez, I., Aran, X., Bernues, J., Giralt, E. and Azorin, F. (2005). The GAGA protein of Drosophila is phosphorylated by CK2. J. Mol. Biol., 351, 562-572.

13. Botuyan, M.V., Lee, J., Ward, I.M., Kim, J.E., Thompson, J.R., Chen, J., and Mer, G. (2006). Structural basis for the methylation site-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair. Cell, 127, 1361-1373.

14. Bouazoune, K. and Brehm, A. (2005). dMi-2 chromatin binding and remodeling activities are regulated by dCK2 phosphorylation. J. Biol. Chem., 280, 41912-41920.

15. Brady, J. and Kashanchi, F. (2005). Tat gets the "green" light on transcription initiation. Retrovirology, 2, 69.

16. Brennecke, J., Aravin, A.A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R., and Hannon, G.J. (2007). Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell, 128(6), 1089-1103.

17. Brooks, C.L. and Gu, W. (2006). p53 ubiquitination: Mdm2 and beyond. Mol. Cell, 21, 307315.

18. Brown, R.H. and Boulter, D. (1973). The amino acid sequence of cytochrome c from Nigella damascena L. (love-in-a-mist). Biochem. J., 133, 251-254.

19. Brown, R.H., Richardson, M., Scogin, R., and Boulter, D. (1973). The amino acid sequence of cytochrome c from Spinacea oleracea L. (spinach). Biochem. J., 131, 253-256.

20. Burnett, G. and Kennedy, E.P. (1954). The enzymatic phosphorylation of proteins. J. Biol. Chem., 211(2), 969-980.

21. Carroll, A.J., Heazlewood, J.L., Ito, J., and Millar, A.H. (2008). Analysis of the Arabidopsis cytosolic ribosome proteome provides detailed insights into its components and their post-translational modification. Mol. Cell. Proteorrdcs, 7, 347-369.

22. Cavallius, J., Zoll, W., Chakraburtty, K., and Merrick, W.C. (1993). Characterization of yeast EF-1 alpha: non-conservation of post-translational modifications. Biochim. Biophys. Acta, 1163, 75-80.

23. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., and Gatti, M. (1994). Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. J. Cell. ScL, 107,3521-3534.

24. Chakraborty, S., Sinha, K.K., Senyuk, V., and Nucifora, G. (2003). SUV39H1 interacts with AML1 and abrogates AJML1 transactivity. AML1 is methylated in vivo. Oncogene, 22, 52295237.

25. Cheeseman, I.M., Anderson, S., Jwa, M., Green, E.M., Kang, J., Yates, 3rd J.R., Chan, C.S., Drubin, D.G., and Barnes, G. (2002). Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipllp. Cell, 111, 163-172.

26. Chen, R., Fearnley, I.M., Palmer, D.N., and Walker, J.E. (2004). Lysine 43 is trimethylated in subunit c bovine mitochondrial ATP synthase and in storage bodies associated with Batten disease. J. Biol. Chem., 279, 21883-21887.

27. Chen, T. and Li, E. (2006). Establishment and maintenance of DNA methylation patterns in mammals. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 301, 179-201.

28. Chen, L.F., Mil, Y., and Greene, W.C. (2002). Acetylation of RelA at discrete sites regulates distinct nuclear functions of NF-kappaB. EMBOJ., 21, 6539-6548.

29. Chin, H.G., Esteve, P.O., Pradhan, M., Benner, J., Patnaik, D., Carey, M.F., and Pradhan, S. (2007). Automethylation of G9a and its implication in wider substrate specificity and HP1 binding. Nucleic Acids Res., 35, 7313-7323.

30. Chuikov, S., Kurash, J.K., Wilson, J.R., Xiao, B., Justin, N., Ivanov, G.S., McKinney, K., Tempst, P., Prives, C., Gamblin, S.J., Barlev, N.A., and Reinberg, D. (2004). Regulation of p53 activity through lysine methylation. Nature, 432, 353-360.

31. Chumakov, P.M. (2007). Versatile functions of p53 protein in multicellular organisms. Biochemistry (Mosc), 72, 1399-1421.

32. Cook, H.A., Koppetsch, B.S., Wu, J., and Theurkauf, W.E. (2004). The Drosophila SDE3 homolog armitage is required for oskar mRNA silencing and embiyonic axis specification. Cell, 116(6), 817-829.

33. Couture, J.F., Collazo, E., Hauk, G., and Trievel, R.C. (2006). Structural basis for the methylation site specificity of SET7/9. Nat. Struct. Mol. Biol., 13, 140-146.

34. DeLange, R.J., Glazer, A.N., and Smith, E.L. (1969). Identification and location of episilon-N-trimethyllysine in yeast cytochromes c. J. Biol. Chem., 244, 1385-1388.

35. DeLange, R.J., Glazer, A.N., and Smith, E.L. (1970). Presence and localization of an unusual amino acid, epsilon-N-trimethyllysine, in cytochrome c of wheat germ and Neurospora. J. Biol. Chem., 245,3325-3327.

36. DePamphilis, M.L. (2005). Cell cycle dependent regulation of the origin recognition complex. Cell Cycle, 4, 70-79.

37. Duran, A., Diaz-Meco, M.T., and Moscat, J. (2003). Essential role of ReLA Ser311 phosphorylation by zetaPKC in NF-kappaB transcriptional activation. EMBO J., 22, 39103918.

38. Eissenberg, J.C., Ge, Y.W., and Hartnett, T. (1994). Increased phosphorylation of HP1, a heterochromatin-associated protein of Drosophila, is correlated with heterochromatin assembly. J. Biol. Chem., 269(33), 21315-21321.

39. Escargueil, A.E., Plisov, S.Y., Filhol, O., Cochet, C., and Larsen, A.K. (2000). Mitotic phosphorylation of DNA topoisomerase II alpha by protein kinase CK2 creates the MPM-2 phosphoepitope on Ser-1469. J. Biol. Chem., 275(44), 34710-34718.

40. Farooqui, J., DiMaria, P., Kim, S., and Paik, W.K. (1981). Effect of methylation on the stability of cytochrome c of Saccharomyces cerevisiae in vivo. J. Biol. Chem., 256, 5041-5045.

41. Faust, M., Schuster, N., and Montenarh, M. (1999). Specific binding of protein kinase CK2 catalytic subunitto tubulin. FEBS Lett., 462(1-2), 51-56.

42. Filhol, O. and Cochet, C. (2009). Protein kinase CK2 in health and disease: cellular functions of protein kinase CK2: a dynamic affair. Cell Mol. Life Sci., 66(11-12), 1830-1839.

43. Fischle, W., Tseng, B.S., Dormann, H.L., Ueberheide, B.M., Garcia, B.A., Shabanowitz, J., Hunt, D.F., Funabiki, H., and Allis, C.D. (2005). Regulation of HPl-chromatin binding by histone H3 methylation and phosphorylation. Nature, 438, 1116-1122.

44. Fischle, W., Wang, Y., Jacobs, S.A., Kim, Y., Allis, C.D., and Khorasanizadeh, S. (2003). Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomband HP1 chromodomains. Genes Dev., 17, 1870-1881.

45. Fraser, A.G., Kamath, R.S., Zipperlen, P., Martinez-Campos, M., Sohrmann, M., and Ahringer, J. (2000). Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature, 408(6810), 325-330.

46. Ghavidel, A. and Schultz, M.C. (1997). Casein kinase II regulation of yeast TFIHB is mediated by the TATA-binding protein. Genes Dev. 11(21), 2780-2789.

47. Ghosh, S., May, M.J., and Kopp, E.B. (1998). NF-kappa B and Rel proteins: evolutionarily conserved mediators of immune responses. Annu. Rev. Immunol., 16,225-60.

48. Glover, C.V. (1998). On the physiological role of casein kinase II in Saccharomyces cerevisiae. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 59, 95-133.

49. Glover, C.V., Shelton, E.R., and Brutlag, D.L. (1983). Purification and characterization of a type II casein kinase from Drosophila melanogaster. J. Biol. Chem., 258(5), 3258-65.

50. Grankowski, N., Boldyreff, B., and Issinger, O.G. (1991). Isolation and characterization of recombinant human casein kinase II subunits alpha and beta from bacteria. Eur. J. Biochem., 198(1), 25-30.

51. Gregori, L., Marriott, D., West, C.M., and Chau, V. (1985). Specific recognition of calmodulin from Dictyostelium discoideum by the ATP, ubiquitin-dependent degradative pathway. J. Biol. Chem., 260, 5232-5235.

52. Gunawardane, L.S., Saito, K., Nishida, K.M., Miyoshi, K., Kawamura, Y., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007). A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science, 315(5818), 1567-1590.

53. Hanna, D.E., Rethinaswamy, A., and Glover, C.V. (1995). Casein kinase II is required for cell cycle progression during G1 and G2/M in Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem., 270(43), 25905-25914.

54. Hardy, R.W., Lindsley, D.L., Livak, K.J., Lewis, B., Siversten, A.V., Joslyn, G.L., Edwards, J., and Bonaccorsi, S. (1984). Cytogenetic analysis of a segment of the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics, 107, 591-610.

55. Hinton, R.H. and Mullock, B.M. (1997). 'Isolation of subcellular fractions' in Subcellular fractionation: A Practical Approach (Graham JM & Rickwood D, eds) pp.31-69. Oxford University Press, NY.

56. Ho, P.C., Gupta, P., Tsui, Y.C., Ha, S.G., Huq, M., and Wei, L.N. (2008). Modulation of lysine acetylation-stimulated repressive activity by Erk2-mediated phosphoiylation of RIP140 in adipocyte differentiation. Cell Signal, 20, 1911-1919.

57. Hu, E. and Rubin, C.S. (1990a). Casein kinase II from Caenorhabditis elegans. Properties and developmental regulation of the enzyme; cloning and sequence analyses of cDNA and the gene for the catalytic subunit. J. Biol. Chem., 265(9), 5072-5080.

58. Hu, E. and Rubin, C.S. (1990b). Expression of wild-type and mutated forms of the catalytic (alpha) subunit of Caenorhabditis elegans casein kinase II in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 265(33), 10609-10615.

59. Huang, J. and Berger, S.L. (2008). The emerging field of dynamic lysine methylation of nonhistone proteins. Cm/7*. Opin. Genet. Dev., 18, 152-158.

60. Huang, J., Perez-Burgos, L., Placek, B.J., Sengupta, R., Richter, M., Dorsey, J.A., Kubicek, S., Opravil, S., Jenuwein, T., and Berger, S.L. (2006). Repression of p53 activity by Smyd2-mediated methylation. Nature, 444, 629-632.

61. Huang, J., Sengupta, R., Espejo, A.B., Lee, M.G., Dorsey, J.A., Richter, M., Opravil, S., Shiekhattar, R., Bedford, M.T., Jenuwein, T., and Berger, S.L. (2007). p53 is regulated by the lysine demethylase LSD1. Nature, 449, 105-108.

62. Huq, M.D., Gupta, P., Tsai, N.P., White, R., Parker, M.G., and Wei, L.N. (2006). Suppression of receptor interacting protein 140 repressive activity by protein arginine methylation. EMBOJ., 25, 5094-5104.

63. Huq, M.D., Ha, S.G., Barcelona, H., and Wei, L.N. (2009). Lysine methylation of nuclear compressor receptor interacting protein 140. J. Proteome Res., 8, 1156-1167.

64. Huq, M.D., Ha, S.G., and Wei, L.N. (2008). Modulation of retinoic acid receptor alpha activity by lysine methylation in the DNA binding domain. J. Proteome Res., 7,4538-4545.

65. Jauch, E., Melzig, J., Brkulj, M., and Raabe, T. (2002). In vivo functional analysis of Drosophila protein kinase casein kinase 2 (CK2) beta-subunit. Gene, 298(1), 29-39.

66. Jauch, E., Wecklein, H., Stark, F., Jauch, M., and Raabe, T. (2006). The Drosophila melanogaster DmCK2beta transcription unit encodes for functionally non-redundant protein isoforms. Gene, 374, 142-152.

67. Jenuwein, T. and Allis, C.D. (2001). Translating the histone code. Science, 293, 1074-1080.

68. Kachirskaia, I., Shi, X., Yamaguchi, H., Tanoue, K., Wen, H., Wang, E.W., Appella, E., and Gozani, O. (2008). Role for 53BP1 Tudor domain recognition of p53 dimethylated at lysine 382 in DNA damage signaling. J. Biol. Chem., 283,34660-34666.

69. Kahali, B., Trott, R., Paroush, Z., Aliada, R., Bishop, C.P., and Bidwai, A.P. (2008). Drosophila CK2 phosphoiylates Haixy and regulates its activity in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun., 373, 637-642.

70. Kalmykova, A.I., Dobritsa, A.A., and Gvozdev, V.A. (1997). The Su(Ste) repeat in the Y chromosome and betaCK2tes gene encode predicted isoforms of regulatory beta-subunit of protein CK2 in Drosophila melanogaster. FEBSLett., 416(2), 164-166.

71. Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y., Dobritsa, A.A., and Gvozdev, V.A. (1997). Acquisition and amplification of a testis-expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94(12), 6297-3602.

72. Katz, M.L., Siakotos, A.N., Gao, Q., Freiha, В., and Chin, D.T. (1997). Late-infantile ceroid-lipofuscinosis: Lysine methylation of mitochondrial ATP synthase subunit с from lysosomal storage bodies. Biochim Biophys Acta, 1361,66-74.

73. Keller, D.M., Zeng, X., Wang, Y., Zhang, Q.H., Kapoor, M., Shu, H., Goodman, R., Lozano, G., Zhao, Y., and Lu, H. (2001). A DNA damage-induced p53 serine 392 kinase complex contains CK2, hSptl6, and SSRP1. Mol. Cell, 7(2), 283-292.

74. Kellum, R. and Alberts, B.M. (1995). Heterochromatin protein 1 is required for correct chromosome segregation in Drosophila embryos. J. Cell. Sci., 108, 1419-1431.

75. Kikkawa, U., Mann, S.K., Firtel, R.A., and Hunter, T. (1992). Molecular cloning of casein kinase II alpha subunit from Dictyostelium discoideum and its expression in the life cycle. Mol. Cell Biol., 12(12), 5711-5723.

76. Kim, J., Daniel, J., Espejo, A., Lake, A., Krishna, M., Xia, L., Zhang, Y., and Bedford, M.T. (2006)., МВТ and chromo domains gauge the degree of lysine methylation. EMBO Rep., 7, 397-403.

77. Kurash, J.K., Lei, H., Shen, Q., Marston, W.L., Granda, B.W., Fan, H., Wall, D., Li, E., and Gaudet, F. (2008). Methylation of p53 by Set7/9 mediates p53 acetylation and activity in vivo. Mol. Cell, 29,392-400.

78. Mangelsdorf, D.J., Thummel, C., Beato, M., Herrlich, P., Schutz, G., Umesono, K., Blumberg, B., Kastner, P., Mark, M., Chambon, P., and Evans R.M. (1995). The nuclear receptor superfamily: the second decade. Cell, 83, 835-839.

79. Martin, C. and Zhang, Y. (2005). The diverse function of histone lysine methylation. Nat Rev Mol Cell Biol., 6, 838-849.

80. Masatsugu, T. and Yamamoto, K. (2009). Multiple lysine methylation of PCAF by Set9 methyltransferase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 381, 22-26.

81. Mendez, J. and Stillman, B. (2000). Chromatin association of human origin recognition complex, cdc6, and minichromosome maintenance proteins during the cell cycle: assembly of prereplication complexes in late mitosis. Mol. Cell. Biol., 20, 8602-8612.

82. Metzger, E., Wissmann, M., Yin, N., Mueller, J.M., Schneider, R., Peters, A.H., Guenther, T., Buettner, R., and Schuele, R. (2005). LSD1 demethylates repressive histone marks to promote androgen-receptor-dependent transcription. Nature, 437, 436-439.

83. Morino, H., Kawamoto, T., Miyake, M., and Kakimoto, Y. (1987). Purification and properties of calmodulin-lysine N-methyltransferase from rat brain cytosol. J. Neurochem., 48, 1201-1208.

84. Murray, K. (1964). The occurrence of s-N-methyl lysine in histones Biochemistry, 3, 10-15.

85. Nagy, Z. and Tora, L. (2007). Distinct GCN5/PCAF-containing complexes function as co-activators and are involved in transcription factor and global histone acetylation. Oncogene, 26, 5341-5357.

86. Nakayama, J., Rice, J.C., Strahl, B.D., Allis, C.D., and Grewal, S.I. (2001). Role of histone H3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. Science, 292, 110113.

87. Nasmyth, K. (1996). Viewpoint: putting the cell cycle in order. Science 274(5293), 1643-5.

88. Nishida, K.M., Saito, K., Mori, T., Kawamura, Y., Nagami-Okada, T., Inagaki, S., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007) Gene silencing mechanisms mediated by Aubergine-piRNA complexes in Drosophila male gonads. UNA, 13, 1911-1922.

89. Noma, K., Allis, C.D., and Shiv, I.S. (2001). Grewal transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries. Science, 293, 1150-1155.

90. Palumbo, G., Bonaccorsi, S., Robbins, L., and Pimpinelli, S. (1994). Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster. Genetics, 138, 1181-1197.

91. Park, K.S., Frost, B., Tuck, M., Ho, L.L., Kim, S., and Paik, W.K. (1987). Enzymatic methylation of in vitro synthesized apocytochrome c enhances its transport into mitochondria. J. Biol. Chem.,262, 14702-14708.

92. Patnaik, D., Chin, H.G., Esteve, P.O., Benner, J., Jacobsen, S.E., and Pradhan, S. (2004). Substrate specificity and kinetic mechanism of mammalian G9a histone H3 methyltransferase. J. Biol. Chem., 279, 53248-53258.

93. Pepperkok, R., Lorenz, P., Ansorge, W., and Pyerin, W. (1994). Casein kinase II is required for transition of G0/G1, early Gl, and Gl/S phases of the cell cycle. J. Biol. Chem., 269(9), 6986-6991.

94. Pidoux, A.L. and Allshire, R.C. (2005). The role of heterochromatin in centromere function. Philos. Trans. R Soc. Lond. B. Biol. Sci., 360(1455), 569-579.

95. Pinna, L.A. (2002). Protein kinase CK2: a challenge to canons. J. Cell ScL, 115, 3873-3878.

96. Polevoda, B., Martzen, M.R., Das, B., Phizicky, E.M., and Sherman, F. (2000). Cytochrome c methyltransferase, Ctmlp, of yeast. J. Biol. Chem., 275, 20508-20513.

97. Polevoda, B. and Sherman, F. (2007). Methylation of proteins involved in translation. Molecular Microbiology, 65, 590-606.

98. Porras-Yakushi, T.R., Whitelegge, J.P., and Clarke, S. (2006). A novel SET domain methyltransferase in yeast: Rkm2-dependent trimethylation of ribosomal protein L12ab at the N terminus. J. Biol. Chem., 281, 35835-35845.

99. Porras-Yakushi, T.R., Whitelegge, J.P., and Clarke, S. (2007). Yeast ribosomal/cytochrome c SET domain methyltransferase subfamily: identification of Rpl23ab methylation sites and recognition motifs. J. Biol. Chem., 282, 12368-12376.

100. Rathert, P., Dhayalan, A., Murakami, M., Zhang, X., Tamas, R., Jurkowska, R., Komatsu, Y., Shinkai, Y., Cheng, X., and Jeltsch, A. (2008). Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nat. Chem. Biol., 4, 344-346.

101. Rice, J.C., Briggs, S.D., Ueberheide, B., Barber, C.M., Shabanowitz, J., Hunt, D.F., Shinkai, Y., and Allis, C.D. (2003). Histone methyltransferases direct different degrees of methylation to define distinct chromatin domains. Mol. Cell, 12, 1591-1598.

102. Roberts, D.M., Rowe, P.M., Siegel, F.L., Lukas, T.J., and Watterson, D.M. (1986). Trimethyllysine and protein function. Effect of methylation and mutagenesis of lysine 115 of calmodulin on NAD kinase activation. J. Biol. Chem., 261, 1491-1494.

103. Romero-Oliva, F. and Allende, J.E. (2001). Protein p21 (WAF1/CIP1) is phosphoiylated by protein kinase CK2 in vitro and interacts with the amino terminal end of the CK2 beta subunit. J. Cell Biochem., 81(3), 445-452.

104. Roussou, I. and Draetta, G. (1994). The Schizosaccharomyces pombe casein kinase II alpha and beta subunits: evolutionary conservation and positive role of the beta subunit. Mol. Cell Biol, 14(1), 576-586.

105. Sadaie, M., Shinmyozu, K., and Nakayama, J. (2008). A conserved SET domain methyltransferase, Setll, modifies ribosomal protein Rpll2 in fission yeast. J. Biol. Chem., 283,7185-7195.

106. Santos-Rosa, H., Schneider, R., Bannister, A.J., Sherriff, J., Berstein, B.E., Emre, N.C.T., Schreiben S.L., Mellor, J., and Kouzarides, T. (2002). Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3. Nature, 419,407-411.

107. Sasagawa, T., Ericsson, L.H., Walsh, K.A., Schreiber, W.E., Fischer, E.H., and Titani, K. (1982). Complete amino acid sequence of human brain calmodulin. Biochemistry, 21, 25652569.

108. Schotta G., Ebert A., Krauss V., Fischer A., Hoffmann J., Rea S., Jenuwein T., Dorn R., and Reuter G. (2002). Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatin gene silencing. EMBOJ., 21, 1121-1131.

109. Seum, C., Reo, E., Peng, H., Rauscher, F.J. 3rd, Spierer, P., and Bontron, S. (2007). Drosophila SETDB1 is required for chromosome 4 silencing. PLoS Genet., 3(5), e76.

110. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J.Y., and Mann, M. (2006). In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat. Protoc., 1, 2856-2860.

111. Shevelyov, Y.Y. (1992). Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed. Genetics, 132, 10331037.

112. Shi, X., Kachirskaia, I., Yamaguchi, H., West, L.E., Wen, H., Wang, E.W., Dutta, S., Appella, E., and Gozani, O. (2007). Modulation of p53 function by SET8-mediated methylation at lysine 382. Molecular Cell, 27, 636-646.

113. Shi, Y., Lan, F., Matson, C., Mulligan, P., Whetstine, J.R., Cole, P.A., Casero, RA., and Shi, Y. (2004). Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1. Cell, 119, 941-953.

114. Shimada, A., Dohke, K., Sadaie, M., Shinmyozu, K., Nakayama, J., Urano, T., and Murakami, Y. (2009). Phosphorylation of Swi6/HPl regulates transcriptional gene silencing at heterochromatin. Genes Dev., 23(1), 18-23.

115. Siomi, M.C. and Kuramochi-Miyagawa, S. (2009). RNA silencing in germlines — exquisite collaboration of Argonaute proteins with small RNAs for germline survival. Curr. Opin. Cell Biol., 21(3), 426-434.

116. St-Denis, N.A. and Litchfield, D.W. (2009). Protein kinase CK2 in health and disease: from birth to death: the role of protein kinase CK2 in the regulation of cell proliferation and survival. Cell Mol. Life Sci., 66(11-12), 1817-1829.

117. Strahl, B.D. and Allis, C.D. (2000). The language of covalent histone modifications. Nature, 403, 41-45.

118. Subramanian, K., Jia, D., Kapoor-Vazirani, P., Powell, D.R., Collins, R.E., Sharma, D., Peng, J., Cheng, X., and Vertino, P.M. (2008). Regulation of estrogen receptor alpha by the SET7 lysine methyltransferase. Mol. Cell, 30,336-347.

119. Takemori, N., Komori, N., Thompson, J.N.Jr., Yamamoto, M.T., and Matsumoto, H. (2007). Novel eye-specific calmodulin methylation characterized by protein mapping in Drosophila melanogaster. Proteomics, 7, 2651-2658.

120. Takemoto, A., Kimura, K., Yanagisawa, J., Yokoyama, S. and Hanaoka, F. (2006). Negative regulation of condensin I by CK2-mediated phosphoiylation. EMBOJ., 25, 5339-5348.

121. Taverna, S.D., Li, H., Ruthenburg, A.J., Allis, C.D., and Patel, D.J. (2007). How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers. Nat. Struct. Mol. Biol., 14, 1025-1040.

122. Theis-Febvre, N., Filhol, O., Froment, C., Cazales, M., Cochet, C., Monsarrat, B., Ducommun, B., and Baldin, V. (2003). Protein kinase CK2 regulates CDC25B phosphatase activity. Oncogene, 22(2), 22032.

123. Tulin, A.V., Kogan, G.L., Filipp, D., Balakireva, M.D., and Gvozdev, V.A. (1997). Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster. structure and molecular evolution. Genetics, 146(1), 253-262.

124. Usakin, L.A., Kogan, L.V., Kalmykova, A.I., and Gvozdev, V.A. (2005). An alien promoter capture as a primary step of the evolution of testes-expressed repeats in the Drosophila melanogaster genome. Mol. Biol. Evol., 22(7), 1555-1560.

125. Vagin, V.V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P.D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science, 313, 320-324.

126. Van Duyne, R„ Easley, R., Wu, W., Berro, R., Pedati, C., Klase, Z., Kehn-Hall, K., Flynn, E.K., Symer, D.E., and Kashanch,i F. (2008). Lysine methylation of HIV-1 Tat regulates transcriptional activity of the viral LTR. Retrovirology, 5, 40.

127. Van Hemert, F.J., Amons, R., Pluijms, W.J., Van Ormondt, H., and Moeller, W. (1984). The primary structure of elongation factor EF-1 alpha from the brine shrimp Artemia. EMBO J., 3, 1109-1113.

128. Van Noort, J.M., Kraal, B., Sinjorgo, K.M.C., Persoon, N.L.M., Johanns, E.S.D., and Bosch, L. (1986). Methylation in vivo of elongation factor EF-Tu at lysine-56 decreases the rate of tRNA-dependent GTP hydrolysis. Eur. J. Biochem., 160, 557-561.

129. Vanet, A., Plumbridge, J.A., Guerin, M.F., and Alix, J.H. (1994). Ribosomal protein methylation in Escherichia coliL the gene prmA, encoding the ribosomal protein Lll methyltransferase, is dispensable. Mol. Microbiol., 14, 947-958.

130. Vann, L.R., Wooding, F.B., Irvine, R.F., and Divecha, N. (1997). Metabolism and possible compartmentalization of inositol lipids in isolated rat-liver nuclei. Biochem. J., 327, 569-576.

131. Vazquez, J., Belmont, A.S., and Sedat, J.W. (2002). The dynamics of homologous chromosome pairing during male Drosophila meiosis. Curr. Biol., 12, 1473-1483.

132. Waggener, J.M. and DiMario, P.J. (2002). Two splice variants of Noppl40 in Drosophila melanogaster. Mol. Biol. Cell, 13, 362-381.

133. Walter, T.S., Meier, C., Assenberg,, R. Au, K.F., Ren, J., Verma, A., Nettleship, J.E., Owens, R.J., Stuart, D.I., and Grimes, J.M. (2006). Lysine methylation as a routine rescue strategy for protein crystallization. Structure, 14(11), 1617-1622.

134. Webb, K.J., Laganowsky, A., Whitelegge, J.P., and Clarke, S.G. (2008). Identification of two SET domain proteins required for methylation of lysine residues in yeast ribosomal protein Rpl42ab. Biol. Chem., 283,35561-35568.

135. Wessel, D. and Fluegge, U.I. (1984). A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and lipids. Anal. Biochem., 138, 141-143.

136. Wright, L.S., Berries, P.J., and Siegel, F.L. (1996). Calmodulin N-methyltransferase. Kinetics, mechanism, and inhibitors. J. Biol Chem., 271, 12737-12743.

137. Yang, X.D., Huang, B., Li, M., Lamb, A., Kelleher, N.L., and Chen, L.F. (2009). Negative regulation of NF-kappaB action by Set9-mediated lysine methylation of the RelA subunit. EMBOJ., 28, 1055-1066.

138. Yang, X.D., Tajkhorshid, E., and Chen, L.F. (2010). Functional interplay between acetylation and methylation of the RelA subunit of NF-kappaB. Mol. Cell Biol., 30(9), 21702180.

139. Yoon, J., Lee, K.S., Park, J.S., Yu, K., Paik, S.G., and Kang, Y.K. (2008).dSETDBl and SU(VAR)3-9 sequentially function during germline-stem cell differentiation in Drosophila melanogaster. PLoS One, 3(5), e2234.

140. Zelada, A., De Souza, F.S., Walz, K., Giasson, L., and Passeron, S. (2003). cDNA cloning, biochemical and phylogenetic characterization of beta- and beta'-subunits of Candida albicans protein kinase CK2. Yeast, 20(6), 471-478.

141. Zhao, T. and Eissenberg, J.C. (1999). Phosphorylation of heterochromatin protein 1 by casein kinase II is required for efficient heterochromatin binding in Drosophila. J. Biol. Chem., 274(21), 15095-15100.

142. Zhao, T., Heyduk, T., and Eissenberg, J.C. (2001). Phosphorylation site mutations in heterochromatin protein 1 (HP1) reduce or eliminate silencing activity. J. Biol. Chem., 276(12), 9512-9518.