Изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и их инфицированности РНК-содержащими вирусами с помощью молекулярно-генетических методов

Калашников, Александр Евгеньевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и их инфицированности РНК-содержащими вирусами с помощью молекулярно-генетических методов
ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и их инфицированности РНК-содержащими вирусами с помощью молекулярно-генетических методов"

На правах рукописи КАЛАШНИКОВ Александр Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПОПУЛЯЦИЙ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA И ИХ ИНФИЦИРОВАННОСТИ РНК-СОДЕРЖАЩИМИ ВИРУСАМИ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Специальность: 03.02.07 - генетика

28 НОЯ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Дубровицы - 2013

005541287

Работа выполнена в группе популяционной иммуногенетики Отдела генетики популяций и природопользования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И.Вавилова Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

Удина Ирина Геннадьевна

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник-

доктор биологических наук, профессор Букаров Нурмагомед Гаджикулиевнч

Федеральное государственное унитарное предприятие «Московское», начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Бурмистрова Лилия Александровна

Государственное научное учреждение научно-исследовательский институт пчеловодства Россельхозакадемии, заведующая Отделом технологии переработки и стандартизации продуктов пчеловодства, заместитель директора

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО Российский государственный аграрный

университет МСХА имени К.А. Тимирязева

Защита состоится «<$6» декабря 2013 г. в 10 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии, тел./факс (4967) 65-11-01, www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан <Л)» ноября 2013 г. и размещен на сайте Министерства образования и науки Российской Федерации.

Ученый секретарь совета Д 006.013.03 г И.В.Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. На территории России наиболее распространены карпатская, серая горная кавказская, среднерусская порода медоносной пчелы Apis mellifera и породный тип "Приокский", выведенный в результате скрещивания пчел среднерусской и серой горной кавказской породы. Среднерусская порода относится к подвиду темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. (Авдеев H.B. и др., 2008, Николенко А.Г., Поскряков A.B., 2002), характеризуется уникальным комплексом черт, включая зимостойкость и устойчивость к инфекциям, и служит исходным материалом при создании промышленных пород.

В отдельных регионах произошла гибридизация темной лесной пчелы А. т. mellifera L с южными породами, относящимися к подвидам А. т. carnica, А. т. liguistica и А. т. caucasica (Никоноров Ю.М. и др., 1998, Бородачев A.B., Са-вушкина JI.H., 2007, Салтыкова Е.С. и др., 2007). Ингрогрессия южных пород пчел в популяции среднерусской пчелы приводит к ухудшению производственных качеств и меньшей устойчивости к суровым природным условиям гибридных популяций пчел, а также к снижению иммунитета, что способствует распространению инфекционных заболеваний (Booth В., 2011) и к сокращению генетического разнообразия популяций пчел (Tencheva D. et al, 2004).

Для сохранения аборигенных пород пчел необходимо дополнительно к морфометрическому методу (Алпатов В.В., 1948, Бородачев A.B. и др., 2002) использовать современные методы анализа генетических ресурсов: анализ мтДНК (Николенко А.Г., Поскряков A.B., 2002, Schneider S.S. et al, 2005, Ильясов P.A. и др., 2007) и микросателлитных локусов (Estoup A. et al, 2002, Непей-вода С.Н. и др., 2011, Зиновьева H.A. и др., 2011). В соответствии с Федеральным законом о племенном животноводстве и рекомендациями Комиссии по биологии пчелы и конгресса «APIMONDIA» (http://abeekeepersblog.blogspot.com) (2009г.) для изучения и сохранения аборигенных популяций животных и пчел следует применять микросателлитный анализ. В последнее время стали накапливаться данные о дифференциации отечественных популяций пчел с применением ДНК-маркеров (Зиновьева H.A. и др. 2013, Ильясов P.A. и др., 2008, Кривцов Н.И. и др., 2010), однако эти данные носят фрагментарный и неполный характер.

Для предотвращения сокращения численности популяций пчел вследствие распространения вирусных заболеваний необходима профилактика заражения клещом Varroa destructor, который служит переносчиком вирусов, и контроль за вирусными инфекциями при помощи ДНК-диагностики. В зарубежных популяциях пчел при помощи ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) выявлен высокий уровень инфицированности РНК-содержащими вирусами: в одной семье могут быть одновременно выявлены до пяти-шести разных вирусов (Miranda J.R. et al, 2010). Для отечественных пород пчел данные об их инфици-рованности вирусами весьма малочисленны (Батуев Ю.М. и др., 2010).

Использование ДНК-маркероь является эффективным инструментом не только для диагностики вирусных инфекций, но и для определения принадлежности к конкретной породе. Применение молекулярных методов при разведе-

нии пчел и пчелиных маток и получении пчелопакетов промышленных пород является актуальным для сохранения их генетического разнообразия.

Цель и задачи исследований. Целью работы является изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и выявление инфицированносги пчел РНК-содержащими вирусами при помощи моле-кулярно-генетических методов.

Для достижения цели определены следующие задачи исследования:

1. характеристика дифференциации отечественных популяций пчел с помощью морфометрического анализа;

2. характеристика генетической дифференциации отечественных пород пчел при помощи анализа вариабельности митохондриального генома;

3. характеристика генетической дифференциации пород, популяций и семей пчел при помощи микросателлитных маркеров ядерного генома;

5. анализ уровня инфицированносги пчелиных семей РНК-содержащими вирусами методом ОТ-ПЦР;

6. структурный и филогенетический анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей обнаруженных РНК-содержащих вирусов пчел (DWV SBV и BQCV).

Научная новизна

1. Впервые изучены отечественные популяции пчел одновременно по морфометрическим параметрам (по кубитальному индексу, с использованием цифровых технологий измерения) и по совокупности молекулярно-генетических маркеров. Охарактеризованы чистопородные популяции среднерусской, карпатской и серой горной кавказской пород. В некоторых популяциях среднерусской породы выявлено смешение с южными породами пчел.

2. У пчел среднерусской породы и в выборках пчел из смешанных популяций впервые обнаружено явление гегероплазмии с присутствием одновременно нескольких вариантов митотипов. Установлена дифференциация отечественных популяций пчел по межгенному локусу мтДНК с рестрикцией по сайту Dra I.

3. Впервые проведен комплексный анализ отечественных популяций пчел анализ по четырем микросателлитным локусам А24, А28, и А14 и А88 (по ло-кусам А28 и А14 данные уникальны). Для карпатской породы охарактеризована дифференциация пчел по микросателлитным локусам на уровне отдельных семей.

4. Методом ОТ-ПЦР в условиях разведения отечественных пчел на пасеках выявлено инфицирование РНК-содержащими вирусами DWV, SBV, BQCV, KBV, CBPV и ABPV не только пчел, но и клещей (DWV, ABPV). Впервые показана множественная инфекция отечественных пчел несколькими вирусами. Нуклеотидные последовательности фрагментов вирусов DWV, SBV и BQCV, выделенных из отечественных пчел, получены, проанализированы и зарегистрированы в Genbank (GQ422786, JX993278, КС138854, КС138852, КС020673, КС020674, КС138853).

Практическая значимость работы

1. На основании полученных результатов с применением молекулярно-генетических маркеров возможно определение чистопородных популяций пчел и смешанных популяций пчел среднерусской породы с южными породами. Полученные результаты и использованные в работе методы анализа могут быть использованы при создании паспорта пород в качестве исходных данных для селекционных центров и генетического мониторинга процессов селекции.

2. Методы молекулярной диагностики являются эффективным инструментом для ежегодной выбраковки семей пчел, инфицированных вирусами, в рамках ветеринарных мероприятий с целью предотвращения дальнейшего распространения вирусных заболеваний и гибели популяций пчел.

3. Проведение анализа вариабельности длины межгенного локуса COI-COII мтДНК и микросателлитных локусов наряду с ДНК-диагностикой вирусных заболеваний пчел можно рекомендовать в качестве обязательных тестов при подготовке коммерческих пчелопакетов и маток на племенных предприятиях, а также при изучении отечественных популяций пчел с целью их сохранения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетическая дифференциация отечественных пород и популяций пчел по микросателлитным локусам А24, А28, А88 и А14, длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и вариантам сайта рестрикции Dra I межгенного локуса COI-COII мтДНК.

2.. Различие чистопородных и смешанных популяций по длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и кубитальному индексу.

3. Внутри- и межсемейная дифференциация пчел карпатской породы по микросателлитных локусам А24, А28, А88 и А14.

4. Гетероплазмия пчел с присутствием одновременно нескольких вариантов митотипов по длине межгенного локуса COI-COII мтДНК.

5. Наличие инфицированности отечественных популяций пчел РНК-содержащими вирусами DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV, наиболее частое распространение вируса DWV и SBV. Инфицированность пчелиных семей несколькими вирусами одновременно.

6. Наличие инфицирования клещей Varroa destructor РНК-содержащими вирусами пчел.

7. Степень идентичности нуклеотидных последовательностей РНК-содержащих вирусов пчел DWV, SBV и BQCV на территории России с ранее изученными нуклеотидными последовательностями этих вирусов, представленными в Genbank. Филогенетическое своеобразие нуклеотидной последовательности вируса деформации крыла.

Апробация работы. Результаты диссертации представлены на II профильных конференциях: «Актуальные проблемы инфекционной патологии и ветеринарной медицины» (Покров, 2009); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции

«65 лет академии пчеловодства» (Рыбное, Рязанской области, 2010); Международной конференции «Пчеловодство XXI век» (Москва, 2010); II Международном форуме "Медовый пир", Международной научно-практической конференции «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии» (Ярославль, 2010); 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011); Международной конференции «Проблемы популяционной и общей генетики» посвященная памятной дате 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова» (Москва, 2011); III Международном форуме пчеловодов «Медовый пир», Международной конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО» (Ярославль, 2012); Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012); XXXXIII International Apicultural Congress «APIMONDIA» (Киев, Украина, 2013); 50 Naukowa konferenja pczelarska (Pulawy, Poland, 2013).

Публикация результатов исследований. По результатам исследований опубликовано 22 научные работы: 8 статей в рецензируемых журналах (5 журналов (Вопросы вирусологии, Вестник РАСХН, Сельскохозяйственная биология, Пчеловодство, Вестник Башкирского государственного аграрного университета) включены в список ВАК Минобрнауки РФ для защиты диссертаций), 7 статей в научных сборниках и материалах конференций, 7 тезисов докладов.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 211 страницах, содержит 45 таблиц, 44 рисунка, 1 схему, 23 страницы приложений с иллюстрациями, 22 формулы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, практических предложений, выводов и списка литературы, который включает 278 источников, в том числе 193 иностранных источника.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена в группе популяционной иммуногенетики Отдела генетики популяций и природопользования Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, поддержана грантом РФФИ 08-04- 13740-офи_ц «Разработка ДНК-технологий для паспортизации пород и породных линий медоносной пчелы Apis mellifera на территории России» (2008-2009 г.) и Госконтрактами Минобрнауки «Молекулярно-генетический анализ биоразнообразия растений, животных и человека» 14.740.12.0826 (2011-1.4-501-001) (2011 г.) и «Экспериментальный, биоинформационный и геногеографический анализ геномного разнообразия человека и животных» № 8088 (2012 г.). Изучение генетической дифференциации отечественных популяций пчел с помощью молекулярных методов и выявление инфицированности пчел вирусами в России проводилось согласно схеме исследований, указанной на рис. 1.

Для изучения ДНК-маркеров (мтДНК и микросателлитов) и морфометри-ческого анализа использовали рабочих пчел из следующих популяций карпатской породы (А. т. carpatica): Адыгея (1М_К, N=117), Московская область (2МО_К, общее количество образцов N=10), Закарпатье (Украина) (3U_K, N=52); 2) среднерусской породы (А. т. mellifera): Владимирская область (4T_S,

N=22), Мамадышский район (Татарстан) (5Т_8, N=82), г. Арск (Татарстан), (22Т_8, N=7), Башкирия (23ВА_8, N=3), Марий-Эл (24МА_8, N=1), Кемеровская область (25КЕ_8, N=2), Вологодская область (26У_8, N=1), Кировская область (27К1_8, N=1), Алтай (28АЬТ_8, N=1), Мордовия (29М1Ю_8, N=2) Пермский край (11Р_8, N=63), Красноярский край (12КЛ 8, N==28), Республика Коми (13КО_8, N=45), Удмуртия - Красный Яр (14Ш_8, N=26), Б. Уча(15Ш_8, N=25), д. Моторки (16Ш_8, N=29), Завьяловский район. (17Ш_8, N=9), г. Воткинск (18Ш_8, N=7), Орловская область (ЗООЫ_8, N=1); Полесье (Белоруссия) (6В_8, N=74); серая горная кавказская (А. т. саисаз к а йс/гЬ.): Северная Осетия-Алания, (7К_8С, N=5), Краснодарский край (8К_8С, N=37); карника (А. т. сагтса Ро11т): Абхазия (9К_КА, N=14); породный тип «Приокский» Рязанская область, (10Я_0, N=29); африканская пчела {А. т. акапзопп (19АР_А, N=10) (рис. 2).

[ Изучение отечественных популяций пчел

I 4

Морфометрический Анализ генетической ДНК-диагностика

анализ структуры популяций пчел вирусных заболеваний

1 ; 1 1 1 1

Определение Анализ ва- Анализ Выделе- Секвени- Сравни-

кубитального риабельно- вариа- ние рование тельный

индекса, сти длины бельно- РНК, и анализ анализ

сравнение по- межгенного сти мик- прове- нуклео- уровня

лученных ве- локуса С01- росател- дение тидных инфици-

личин куби- СОП литных ОТ- фрагмен- рованно-

тального ин- мтДНК, локусов ПЦР, тов виру- сти пчел

декса со стан- анализ по- скри- сов ме- различ-

дартом поро- лиморфизма нинг по- тодом ных по-

ды, сопостав- межгенного пуляций молеку- род и

ление резуль- локуса С01- пчел и лярной геогра-

татов морфо- СОН клещей филоге- фическо-

метрии с дан- мтДНК ме- на при- нии го ме-

ными по моле- тодом ПЦР- сутствие стопо-

кулярным ПДРФ вирус- ложения

маркерам ной инфекции

Определение генетической дифференциации отечественных популяций пчел _и уровня инфицированности РНК-содержащими вирусами_

Рисунок 1. Схема исследований

Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен в следующих выборках среднерусской породы: Удмуртия - Завьяловский район - (УИ, общее количество пчел N=27), д. Люк (ЛЮ, N=9), д. Постол (ПО, N=6), д. Ке-

нервай (ЯК, N=18) и п. Позимь Якшур-Бодьинского района - (УБ, N=33), Се-лычкинское лесничество (ЛЕС, N=15), Юкаменский район (ВИ, N=15), Кизнер-ский район (КИ, N=6) и Вавожский район (ГУ, N=9); Тульская область (М, N=21); карники: Абхазия (АБ, N=15), Домодедовский район (Московская область) (Д, N=12); карпатской породы: Ставропольский край (CK, N=45), Майкопский район (Адыгея), (MAB, N=42), Истринский район (Московская область), (БА, N=9). Анализ распространения РНК-содержащих вирусов проведен в образцах клеща Varroa destructor в Удмуртии: д. Кенервай Якшур-Бодьинского района, (ЯК-К с личинки, N=10) и (ЯК-KP с рамки улья, N=10), д. Постол Завьяловского района (ПО-К с личинки, N=10) (рис. 2).

Рисунок 2. Схема локальных популяций для отбора образцов для генетического анализа (1) и для анализа вирусов пчел методом ДНК-диагностики (2).

Закрашены регионы отбора проб на территории России

Собранные образцы пчел изучены с помощью морфометрического метода (определения кубитального индекса (КИ)) для оценки принадлежности к породе при сравнении со стандартом породы (Авдеев Н.В., 2008, Бородачев А.В. и др., 2002). Анализ митохондриального генома пчел проведен с помощью изучения вариабельности длин участка межгенного локуса COI-COI1 мтДНК (Croizer R.H., Croizer Y.C., 1993) и полиморфизма участка межгенного локуса COI-COII мтДНК методом ПЦР-ПДРФ с рестриктазой Dra I (Insuan S. el al, 2007). Анализ четырех микросателлитов проведен по модифицированному методу (Estoup A. el al, 1995). РНК-содержащие вирусы пчел определены по модифицированному методу (Berenyi О. et al, 1996, Miranda J.R. et al, 2010 и Chen Y.P. et al, 2006). Анализ нуклеотидных последовательностей проведен по протоколам (Tamura К. et al, 2007 и 2011) и методом молекулярной филогении (Nei М. et al, 1983, Saitou N. et al, 1987).

Статистическая обработка результатов проведена при помощи компьютерных программ: GDA версии 1.1 (Zaykin D., et al, 1995, Weir D.S. et al, 1996), "GenAlExó" (Peakall R., Smouse P.E., 2012), визуализация филогенетических деревьев осуществлена при помощи "TreeView 1.6.6" и "GeneTree 1.1.1". Анализ нуклеотидных последовательностей вирусов, полученных с помощью секвени-

(1)

(2)

рования, проведен при помощи программ: "Mega 5," "Unipro UGENE 1.9.4", "SeqEdit" и "Chromas".

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Морфометрический анализ пчел

Средние значения КИ, интервалы и частоты КИ в каждой выборке приведены на рис. 3. По данным морфометрического анализа средние значения КИ популяций пчел среднерусской и карпатской пород оказались ниже соответствующего стандарта породы примерно на 10%, а для популяций пчел серой горной породы - выше на 7% относительно стандарта породы (Бородачев A.B. и др, 2002).

популяции ПЧ1:Л

'ОКИ Омик в макс BD Os От ПСУ

Рисунок 3. Распределение значений КИ в изученных выборках пчел

Полученные результаты по данному критерию предполагают смешение или метизацию пчел среднерусской породы с южными породами пчел (в Республике Коми и Красноярском крае примерно на 10%). При помощи анализа величин КИ выявлены характерные для пород пчел оценки (для карпатской породы в диапазоне <0,4, а для среднерусской >0,55). Изученные выборки достоверно отличались между собой (Г-тест) по значениям КИ (Р=0,05).

3.2. Анализ полиморфизма длин межгенного локуса С01-С0И мтДНК

При анализе вариабельности длин межгенного локуса С01-С0Н мтДНК выявлены варианты митотипов, характерные для темной лесной пчелы (среднерусская порода, рС?<3, 546 п.н.) и южных подвидов медоносной пчелы (породы карпатская, серая горная кавказская, карника р(}, 350 п.н.); для отдельных выборок пчел отмечена гетероплазмия (табл. 1). При любительском разведении пчел отмечена метизация среднерусских пчел с южными породами, так как пчеловоды зачастую предпочитают разведение более миролюбивой карпатской

породы. В табл. 1 указаны результаты анализа длины межгенного локуса ССИ-СОП мтДНК в семьях пчел.

Таблица 1

Распределение митотипов в изученных выборках пчел

Номер и размер (количество семей), выборки Митотипы в п.н. Гетероплазмия 546/796 раа/рзха Гетероплазмия 546/1134 Р<2(>/Р5хд Гетероплазмия 350/1134 Р(>/Р5х1}

350 РО 546 РСЮ 938 Р4хО

1М К (N=54) 1

2МО К (N=3) 1

Зи К (N=40) 0,975 0,025

4Т в (N=22) 0,273 0,591 0,136

5Т Б (N=17) 0,038 0,808 0,077 0,038 0,038

6В в (N=21) 1

7К Бв (N=4) 0,750 0,250

8К 80 (N=34) 1

9К КА (N=6) 1

10К в (N=29) 0,931 0,074

11Р 8 (N=47) 0,044 0,933 0,022

12КВ. 8 (N=12) 0,428 0,428 0,143

13КО 8 (N=39) 0.205 0,744 0,051

14Ш Э (N=26) 0,154 0,846

15Ш Э (N=25) 0,960 0.040

16Ш в (N=29) 1

171Ш в (N=9) 1

18Ш) в (N=5) 0,600 0,400

19АР А (N=9) 0,889 0,111

1 22Т 8 (N=5) 0 1

1 23ВА Э (N=3) 0,667 0,333

В выборке 24МА_Я выявлен митотип Р<3 южного подвида. Еще несколько выборок пчел были представлены небольшим количеством пчел и для них выявлены митотипы, соответствующие среднерусской породе, а также гетеро-плазмия: в 25КЕ_Б - Р<3<3 и Р(2<3/Р5х<3, в 29МКВ 8 - РСК> и РСЮ/РЗхд, в - Р<5Р/Р5х(3 в 30(Ж_8 - РС"С>/Р5хС>. В выборке пчел 28АЬТ_Б обнаружена гетероплазмия РС>С>/РЗх<3, а в 27К1_Б установлен только один митотип РрО-Все выборки чистопородных популяций пчел из племенных предприятий отличались наличием одного митотипа, характерного для данной породы, в то время как в смешанных популяциях выявлено несколько митотипов. У гибридного по происхождению породного типа "Приокский" в соответствии с ожиданием выявлено два митотипа, которые представлены один - у южных пород, другой - у среднерусской породы пчел (ЮКв). По результатам нашего анализа пчелы, принадлежащие племенным предприятиям, не подверглись метизации. У пчел Полесья обнаружен только южный митотип. Таким образом, они не могут быть отнесены к темной лесной пчеле. На основе анализа вариабельности длины межгенного локуса С.01-С0Н мтДНК можно говорить о незначительном

смешении пчел карпатской породы на территории Закарпатья (в среднем 2,5%) и о более заметном смешении серой горной кавказской породы в Северной Осетии (25,0%) со среднерусской породой, а также о незначительном смешении пчел среднерусской породы в Татарстане (3,8%) и Пермском крае (4,4%) и более выраженном смешении во Владимирской области (27,3%), Красноярском крае (42,8%), Республике Коми (20,5%), Удмуртии (15,4-60,0%) с южными породами.

Таким образом, популяции пчел племенных предприятий являются чистопородными, при любительском разведении выявлены смешанные популяции. Следует заметить, что данный вид анализа позволяет улавливать смешение (гибридизацию) пород только по материнской линии.

3.3. Анализ полиморфизма межгенного локуса СОЬСОП мтДНК методом ПЦР-ПДРФ с рестриктазой Ига I

Анализ полиморфизма межгенного локуса СОГ-СОП мтДНК методом ПЦР-ПДРФ с рестриктазой Ога I позволил выявить от 1 до 4 сайтов узнавания Ога I в амплифицированном фрагменте мтДНК (рис. 4).

1024 п.И.

300 п.н.

250 п.н. 200 п.н. 150 п.н.

К1(АМАС01)

( В ( с(о ( Е

200 п.н.

50 п.н. 50 п н- 50 п.н.

150 п.н.

,К2(АМАСО!)

500 п.н.

Рисунок 4. Схема рестрикции амплифицированного фрагмента межгеннош локуса С01-С011 мтДНК пчел по сайту Ога I

Длины фрагментов определены на основе данных электрофоретического анализа. При изучении популяций пчел обнаружено 14 различных митотипов. Установлены различия по частоте митотипов для отдельных популяций (рис. 5). Анализ полиморфизма межгенного локуса СОЬСОП предоставляет более детальные данные о генетическом разнообразии мтДНК пчел, как на внутрипо-родном, так и на межпородном уровне, по сравнению анализом вариабельности длин межгенного локуса, который эффективен только для выявления митотипов северных и южных пород.

Рисунок 5. Частоты митотипов по сайту Dra I межгенного локуса COI-COII мтДНК в изученных популяциях пчел

Анализ ПЦР-ПДРФ позволил выявить внутрипородные различия для популяций карпатской породы (1М_К, 3U_K), серой горной кавказской (7K_SG, 8KSG), среднерусской породы (татарской, владимирской, тульской, пермской, коми-пермяцкой, удмуртской популяций) (4T_S, 5_T_S, 22T_S, HP S, 14-18UD_S). Установлено отличие полесской популяции 6BS от популяций среднерусской породы и ее уникальное генетическое своеобразие.

3.4. Анализ ядерного генома пчел по микросателлитным локусам 3.4.1. Дифференциация пород пчел по микросателлитным маркерам

Результаты исследования полиморфизма михросателлитных локусов показали, что породы пчел отличались между собой по аллельному профилю. Показатели генетической изменчивости пород и популяций по четырем микросателлитным локусам представлены на рис. 6 и 7. Для микросателлитного локуса А24 обнаружено 4 аллеля, для А28 - 7, для А88 - 5 и для А14 - 13 аллелей. Для пород пчел определено среднее значение количества наблюдаемых аллелей на локус /</<,=3,438=0,294 и количества информативных аллелей на локус N«=2,285±0,131. Определены также индекс информативности (индекс Шеннона) /=0,892±0,057, величины наблюдаемой Яо=0,324±0,052 и ожидаемой Не=0,517±0,029 гетерозиготности (средние значения указаны на рис. 7). Выявлен дефицит гетерозигот, что подтверждается величиной индекса фиксации, коэффициент инбридинга у индивидуумов по отношению ко всей выборке в целом составляет F(Fls}=0,380±0,091. Доля полиморфных локусов более 75%. Значение PhiPT=0,209 (Р=0,01). При анализе генетического разнообразия по

AMO VA выявлено, что степень генетического разнообразия внутри пород пчел составляла 79% (¿#=143), а между породами 21% (df=7). Для изученных выборок отмечены отклонения от равновесия Харди-Вайнберга. Коэффициент инбридинга F¡, в субпопуляциях (группах) по отношению ко всей популяции в целом составил 41%.

iNa

i Ne i 77771 No. Приватные аллели — Не

Рисунок 6. Средние показатели генетической изменчивости для изученных четырех микросателлитных локусов в породах пчел. По оси ординат - средние значения приведенного показателя, или средние значения гетерозиготности. По оси абсцисс указаны породы: К-карпатская, КА-карники, SG- серая горная кавказская и S-среднерусская породы, G-гибридный «Приокский» породный тип, AF-африканская, ВЕ-Полесская популяции пчел

Вероятность идентичности различных пород при анализе по четырем ло-кусам А24, А28, А88 и А14 не превышала 0,05. При анализе генетических расстояний исследуемые породы пчел сформировали на генетическом «древе» несколько кластеров (рис. 7). Для сохранения популяций пчел необходимо изучение дифференциации популяций и семей пчел по совокупности микросателлитных локусов.

tí

Рисунок 7. Дендрограмма

филогенетических взаимо__К А „

_отношении пород пчел, по-

Ар строенная на основе генети-

Iэ ческих расстояний для мик-

___росателлитов по алгоритму

ВЕ ближайшего соседа (N1)

3.4.2. Дифференциация отечественных популяций пчел по микросателлитным локусам

При анализе выборок популяций пчел, составленных по породному и географическому признаку, выявлен полиморфизм микросателлитных локусов: А24, А28, А88 и А14. Средние показатели генетической изменчивости: Na=*2,929±0,148, А^=2,138±0,104, /=0,790±0,051, #о=0,323±0,040, //е=0,465±0,028. Таким образом, выявлен дефицит гетерозигот при значении Hfis)>0313±0,071 (рис. 8). Выявлены отклонения от равновесия Харди-Вайнберга. Показано, что микросателлитные локусы А88 в популяции 9К_КА, 5T_S и 7K_SG и А14 в популяции 7K_SG мономорфны. Согласно расчету по AMOVA, степень разнообразия генотипов внутри популяций составляла 69% (#=137), между популяциями 31% (#=13). Значение PhiPT=0,308 (Р=0,010).

Рисунок 8. Средние показатели генетической изменчивости микросателлитных локусов в популяциях пчел. По оси ординат указаны средние значения приведенного показателя, либо средние значения гетерозиготности. По оси абсцисс указаны обозначения популяций

Выявлено наличие частных (уникальных для популяции) аллелей в популяциях пчел карпатской породы (1М_К), закарпатских пчел (Зи_К), владимирской популяции (4Т_Б), африканских пчел (19АР_А), полесских пчел (6В_8), пчел из Республики Коми (13КО_Э), красноярской популяции (121Ж_8). Всего обнаружено 10 частных аллелей. Значения средних показателей генетической изменчивости свидетельствуют о различиях между популяциями (рис. 8). Сравнение семей попарно показало, что все семьи пчел отличались друг от друга, образуя на диаграммах отдельные кластеры. В ряде локусов отмечено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга. При проведении филогенетического анализа на основе генетических расстояний по М. Нею исследуемые популяции пчел сформировали на генетическом «древе» несколько кластеров, которые в целом соответствовали породной принадлежности и географическому местоположению.

3.4.3. Дифференциация семей пчел по микросателлитным маркерам

Метод анализа микросателлитов позволяет проводить идентификацию породы в целом, определять породную принадлежность и происхождение конкретной особи пчел, а также определять структуру популяций и их генетическую изменчивость. Для микросателлитного локуса А24 обнаружено 4 аллеля, А28 - 11 аллелей, А88 - 6 аллелей, А14 - 5 аллелей. Средние параметры генетической изменчивости: Na от 2,725±0,179 до 4,500±0,996, Ne от 1,690±0,150 до 2,338±0,360, #0=0,447, #е=0.414 (средние значения указаны на рис. 9). Результаты сравнения семей, полученные при помощи метода анализа разнообразия AMOVA, показали, что все изученные семьи отличались друг от друга. Согласно AMOVA разнообразие между семьями составляло 28% (df= 9), внутри семей

Рисунок 9. Средние показатели генетической изменчивости семей пчел (Ктел=10) 1М_К карпатской породы (Р=0,05, КСЕМСЙ=10)

При определении параметров внутрипородного разнообразия карпатской породы (на уровне семей) установлено, что количество аллелей в семьях пчел 1М К карпатской породы для разных локусов различно: для локуса А24 количество аллелей варьировало в диапазоне 1,5-3,0, для А28 -1,0-15,5, для А88 -3,0-12,1, для А14 - 1,0-12,6. Диапазон изменчивости количества выявленных аллелей в разных семьях подтверждает участие нескольких трутней в оплодотворении пчелиной матки.

3.5. Анализ распространения РНК-содержащих вирусов пчел на территории России Образцы пчел анализировали на наличие РНК-содержащих вирусов: деформации крыла (DWV), вируса острого паралича (ABPV), вируса хронического паралича (CBPV), кашмирского вируса (KBV), вируса мешотчатого расплода (SBV) и вируса черных маточников (BQCV) (Berenyi О. et al, 2006). Проведен

анализ образцов пчел среднерусской породы из Удмуртии, Московской и Тульской областей, карпатской породы из Адыгеи и Ставропольского края, Московской области. В Удмуртии проведен анализ на присутствие вирусов в клещах Varroa. Амплифицированные фрагменты в ОТ-ПЦР имели длину соответствующую расчетной и литературным данным (Berenyi О. et al, 2006, Chen Y.P. el al, 2006): 370 п.н. для ABPV, 435 п.н. для DWV, 702 п.н. для DWV2, 472 п.н. для BQCV, 395 п.н. для KBV, 315 п.н. для CBPV и 487 п.н. для SBV. В условиях разведения пчел на пасеках с высокой степенью заклещеванности выявлено инфицирование хотя бы одним из исследуемых вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV, CBPV в 25% случаев. На одной из исследуемых пасек (КИ) не выявлено РНК-содержащих вирусов пчел. Наиболее часто обнаружены DWV (50%) и SBV (48%), BQCV (13%), KBV (9,6%), CBPV (12%) и ABPV (16%) выявлены реже (рис. 10).

В образцах клещей обнаружены вирусы DWV и ABPV. Выявлена множественная (комбинированная) инфекция пчел двумя (частота в среднем 33,9%) и более двух (21,2%) вирусами (вплоть до шести одновременно), что представляет угрозу гибели пчелиной семьи.

Рисунок 10. Частоты вирусов в инфицированных образцах пчел и клещей

Из множественных инфекций наиболее часто встречается комбинация вирусов П\УУ-АВРУ-СВРУ-ЗВУ-В<ЗСУ (8,3%), а также О^'У-АРВУ-КВУ и АРВУ-СВРУ-БВУ (до 14,2%, каждая). В некоторых случаях вирусная инфекция обнаружена у пчел без внешних признаков заболевания, что свидетельствует о том, что отсутствие клинических признаков заболевания не исключает их инфицирования. Вспышки болезни могут возникнуть при любых неблагоприятных для пчелиной семьи условиях, которые приведут к снижению иммунитета.

3.5.1. Анализ нуклеотидной последовательности вирусов пчел !>\\'\ ,

вВУ и В(}СУ

С помощью ОТ-ПЦР амплифицированы фрагменты вирусного генома. Шесть нуклеотидных последовательностей трех РНК-содержащих вирусов, выделенных из отечественных пчел, проанализированы и зарегистрированы в СепЬапк: Б\¥У (0(^422786, .1X993278, КС138854, КС! 38852, БВУ (КС020673, КС020674) и ВОСУ (КС138853). Нуклеотидные последовательности проанализированы в системе В1шп. Полученные вирусные последовательности имеют

высокую степень гомологии (не менее 85%) с другими нуклеотидными последовательностями для вирусов из Genbank, а также с соответствующими транслированными аминокислотными последовательностями - не менее 97%. Области изученных нуклеотидных последовательностей вирусов DWV, SBV и BQCV, представляют собой фрагменты структурной единицы капсида вируса (белок VP3), предполагаемого структурного полипептида и С-домена геликазу, соответственно.

Проведено сравнение полученных нами нуклеотидных последовательностей вирусов с имеющимися в Genbank нуклеотидными последовательностями по алгоритму CLUSTAL (Higgins D., et al, 1994) (также и для соответствующих аминокислотных последовательностей). При анализе всего спектра имеющихся в Genbank нуклеотидных последовательностей, соответствующих области изученных фрагментов DWV, SBV и BQCV, обнаружено 48, 44 и 90 нуклеотидных замен соответственно. Для DWV и BQCV выявлены нуклеотидные замены, которые приводят к изменению аминокислотного состава полипептида, в том числе, изменяют гидрофобность участков молекулы и заряд аминокислотных остатков. Для SBV значимых нуклеотидных замен не выявлено.

Методом молекулярной филогении построены филогенетические деревья для изученных нуклеотидных последовательностей вирусов. Для DWV во всех наблюдаемых ветвях филогенетического дерева наблюдается объединение вирусных последовательностей в кластеры практически независимо от их географического происхождения, тем не менее, обнаруженные в России нуклеотидные последовательности DWV образуют единый кластер. Нуклеотидные последовательности SBV из России сформировали единый кластер с последовательностями вирусов из Франции и Австрии, сюда же входят последовательности вирусов из Германии и США. Для BQCV наибольшую степень гомологии нук-леотидная последовательность из России имела с вирусом из Венгрии. Это позволяет предположить, что вирусы SBV и BQCV в России имеют сходное происхождение с европейскими вирусами.

ВЫВОДЫ

1. Одновременный анализ вариабельности длины межгенного локуса COI-COII мтДНК и морфометрических параметров (кубитальный индекс) позволяет выявить чистопородные популяции пчел карпатской, серой горной кавказской и среднерусской породы, а также гибридные популяции. По данным анализа вариабельности длины межгенного локуса COI-COII мтДНК степень гибридизации отдельных популяций пчел (исходно среднерусской породы) с южными породами составляет от 2,5 до 60%. Выборки пчел из племенных хозяйств являются чистопородными.

2. В изученных отечественных популяциях пчел выявлены 14 митоти-пов межгенного локуса COI - COII мтДНК по сайту рестрикции Dra I. Популяции среднерусских пчел имеют внутрипородные различия по спектру выявленных митотипов. Полесская популяция по результатам этого анализа не относится к среднерусской породе пчел, а характеризуется генетическим своеобразием.

3. Основные породы и популяции пчел различаются по частотам ал-лельных вариантов микросателлитных локусов А24, А28, А88 и А14. Средние значения числа наблюдаемых и информативных аллелей на локус составляют 3,438 и 2,285, соответственно. Для изученных выборок пчел установлено отклонение от равновесия Харди-Вайнберга и отмечен дефицит гетерозигот со средними значениями F(Fis) 0,380, Я0=0,324 и Яе=0,517. Анализ генетического разнообразия AMOVA подтвердил большее разнообразие внутри пород (79%), по сравнению с разнообразием между породами (21%). На основе спектра изученных микросателлитных локусов пчелы среднерусской породы четко дифференцируются от других пород. Отмечена удаленность закарпатской и карпатской популяций пчел друг от друга.

4. При помощи анализа по четырем микросателлитным локусам А24, А28, А88 и А14 установлена дифференциация семей на примере карпатской породы. Аллели изученных локусов являются высокоинформативными для оценки внутрипородной дифференциации. Среднее количество аллелей в отдельных семьях различно для разных локусов и достигает 15,5.

5. Впервые при помощи ОТ-ПЦР в выборках популяций пчел среднерусской породы (на территории Удмуртии, Ставропольского края, Московской, Тульской области), карпатской породы (Адыгея и Московская область) и кар-ники (Абхазия) выявлено присутствие РНК-содержащих вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV. Наиболее часто обнаружены DWV (средняя частота в семьях пчел 50%) и SBV (48%), с меньшей частотой отмечены вирусы ABPV (16%), BQCV (13%), CBPV (12%) и KBV (9,6%).

6. Установлена инфекция пчел одновременно двумя вирусами (в среднем от 33,9%) и более двух (от 21,2%). Методом ОТ-ПЦР выявлено присутствие РНК-содержащих вирусов (DWV, ABPV) в клещах Varroa destructor, что подтверждает возможность переноса ими вирусов пчел.

7. При сопоставлении полученных нуклеотидных последовательностей РНК-содержащих вирусов пчел DWV (GQ422786, JX993278, КС138854, КС138852), SBV (КС020673, КС020674) и BQCV (КС138853), выделенных из отечественных популяций пчел, с ранее зарегистрированными в Genbank, установлена высокая степень их идентичности не менее 85%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуем анализ вариабельности длины межгенного локуса COI-COII митохондриальной ДНК для быстрого и эффективного определения принадлежности медоносных пчел к южным породам и среднерусской породе или их гибридизации.

Для создания паспорта пород, контроля чистопородного разведения и процесса селекции промышленных пород пчел рекомендуем использовать анализ микросателлитных локусов А24, А28, А88 и А14 и Dra I-вариантов межгенного локуса COI-COII митохондриальной ДНК.

Для предотвращения распространения вирусных заболеваний рекомендуем проводить ДНК-диагностику РНК-содержащих вирусов DWV, SBV, BQCV, KBV, APBV и CBPV методом ОТ-ПЦР.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации В ведущих рецензируемых журналах, определенных ВАК

1. Удина, И.Г. Обнаружение вируса деформации крыла у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в Московской области методом ОТ-ПЦР / И.Г. Удина, С.С. Кунижева, А.Е. Гришечкин, А.Е. Калашников, B.C. Учаева, Н.И. Кривцов, В.И. Злобин // Вопросы вирусологии,-2010,- №5.- С.37-40.

2. Удина, И.Г. Идентификация вируса деформации крыла (DWV) у медоносной пчелы / И.Г. Удина, А.Е. Гришечкин, А.Е. Калашников, В.И. Злобин, Н.И. Кривцов // Вестник РАСХН.-2010.- №1.- С. 69-71.

3. Колбина, Л.М. О вирусной инфекции пчел в республике Удмуртия / Л.М. Колбина, H.A. Санникова, СЛ. Воробьева, С.Н. Непейвода, Е.В. Паньков, И.В. Масленников, И.Г. Удина, А.Е. Калашников // Пчеловодство.- 2012.-№8,- С. 35.

4. Калашников, А.Е. Генетическая дифференциация медоносной пчелы Apis mellifera L. республики Удмуртия / А.Е. Калашников, И.В. Масленников, Л.М. Колбина, И.Г. Удина // Вестник Башкирского аграрного университета,- 2013,- №1,- С.67-71.

5. Калашников, А.Е. Генетическая дифференциация популяций медоносных пчел (Apis mellifera L.) и распространение РНК-содержащих вирусов на фоне эпизоотии клеща Varroa destructor на территории Удмуртии / А.Е. Калашников, И.В. Масленников, Л.М. Колбина, И.Г. Удина // Сельскохозяйственная биология,-2013.- №4,- С.88-92.

В рецензируемых журналах, не входящих в список определенных ВАК

6. Калашников, А.Е. Дифференциация отечественных пород пчел по микросателлитным локусам / А.Е. Калашников, Н.И. Кривцов, A.B. Борода-чев, С.А. Малькова, И.Г Удина.// Наука Кубани,-2011.- №4,- С.10-15.

7. Калашников, А.Е. Распространение РНК-содержаших вирусов у медоносной пчелы Apis mellifera L. на территории России / А.Е. Калашников, И.Г. Удина// VetPharma. Pharm animals.- 2012.- N 1.- Р.72-76.

8. Калашников, А.Е. Генетическая дифференциация и распространение РНК-содержащих вирусов популяций медоносной пчелы Apis mellifera L. На территории Удмуртии / А.Е. Калашников, И.В. Масленников, Л.М. Колбина, И.Г. Удина // VetPharma. Pharm animals.- 2013.- №1,- С.88-92.

В сборниках научных трудов

9. Гришечкин, А.Е. Обнаружение вируса деформации крыла (DWV) у медоносной пчелы Apis mellifera L. на пасеках в московской области методом RT-PCR / А.Е. Гришечкин, С.С. Кунижева, B.C. Учаева, Н.И. Кривцов, В.И. Злобин, И.Г. Удина, А.Е. Калашников // Актуапьные проблемы инфекционной патологии и ветеринарной медицины, Покров, изд-во ГНУ ВНИИВВиМ Рос-сельхозакадемии,- 2009.- С. 118-121.

10. Калашников, А.Е. Выявление инфицированное™ медоносной пчелы Apis mellifera РНК-содержащими вирусами в Майкопском районе республики Адыгея и Московской области / А.Е. Калашников, А.Е. Гришечкин, С.А.

Малькова, Н.И. Кривцов, И.Г. Удина // Сборник статей основные направления развития пчеловодства на современном этапе. Материалы научно-практической конференции, посвященные 65-летию академии пчеловодства, Рыбное, Рязанской области, изд-во Рязанский государственный агротехнологи-ческий университет им. П.А. Костычева.- 2010.- С.26-29.

11. Удина, И.Г. Инфицированность медоносной пчелы Apis mellifera РНК-содержащими вирусами в Центральной России, республиках Абхазия и Адыгея / И.Г. Удина, А.Е. Калашников, С.А. Малькова, A.B. Бородачев, Н.И. Кривцов // Международная научно-практическая конференция «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии», изд-во «Узорочье», Ярославль,-2Ш.- С.128-131.

12. Удина, И.Г. Возможности паспортизации отечественных пород пчел при помощи анализа микросателлитных локусов (SSR) / И.Г. Удина, А.Е. Калашников, Н.И. Кривцов // Международная научно-практическая конференция «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии», изд-во «Узорочье», Ярославль,-2010.- С. 49-53.

13. Калашников, А.Е. Генетическая дифференциация медоносной пчелы Apis mellifera L. республики Удмуртия / А.Е. Калашников, И.В. Масленников, JI.M. Колбина, И.Г. Удина // Сборник статей всероссийской молодежной конференции конференции «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки», Уфа, изд-во Башкирский государственный аграрный университет.- 2012.- С. 160-166.

14. Калашников, А.Е. Распространение РНК-содержащих вирусов у медоносной пчелы Apis mellifera L. на территории России / А.Е. Калашников, И.Г. Удина// III Международный форум пчеловодов «Медовый пир». Международной конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО», Ярославль, изд-во «Узорочье»,- 2012,- С. 49-51.

15. Калашников, А.Е. Дифференциация отечественных пород пчел по микросателлитным локусам / А.Е. Калашников, Н.И. Кривцов, A.B. Бородачев, С.А. Малькова, И.Г. Удина // III Международный форум пчеловодов «Медовый пир». Международной конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО», изд-во «Узорочье», Ярославль.- 2012.- С.104-107.

Тезисы на научно-практических конференциях

16. Калашников, А.Е. Выявление инфицированности медоносной пчелы Apis mellifera РНК-содержащими вирусами в Московской области и республике Адыгея / А.Е. Калашников, А.Е. Гришечкин, С.А. Малькова, Н.И. Кривцов, И.Г. Удина // XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва,- 2010.- С. 24.

17. Калашников, А.Е. Паспортизация отечественных пчел при помощи анализа микросателлитных локусов (STR) / А.Е. Калашников, A.B. Бородачев, Н.И. Кривцов, И.Г. Удина // 15 -ая международная Путинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века», Пущина,- 2011.-С.231-232.

18. Калашников, А.Е. Выявление вирусного заражения медоносной пчелы Apis mellifera РНК-содержащими вирусами / А.Е. Калашников, СА. Малькова, Н.И. Кривцов, И.Г. Удина // 15-ая международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века, Пущино.- 2011.-С.17-18.

19. Калашников, А.Е. Исследование популяций отечественных пород пчел при помощи анализа вариабельности STR-локусов / А.Е. Калашников // Международная конференция «Проблемы популяционной и общей генетики» посвященная памятной дате 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова, Москва.- 2011,- С.200.

20. Калашников, А.Е. Изучение популяций медоносной пчелы Apis mellifera L. на территории Удмуртии с помощью молекулярно-генетических и морфометрических методов / А.Е. Калашников, И.В. Масленников // Конференция «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии»,- Уфа, 2012,- С. 38-39.

21. Maslennikov, I.V. Distribution of RNA-containing viruses of bees in the Udmurt Republic / I.V. Maslennikov, L.M. Kolbina, A.E. Kalashnikov, I.G. Udina // Apimondia. Kiev, Ukraine. - 2013.- P.211.

22. Kalashnikov, A.E. Genetic diversity of honey bees Apis mellifera L. populations and spread of RNA-containing virus on the territory of Udmurtia / A.E. Kalashnikov, I.V. Maslennikov, L.M. Kolbina, I.G. Udina. // 50 Naukowa konferenja pczelarska. Pulawy, Poland.- 2013,- P.35-36.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (4967)65-13-18 (4967)65-15-97

Сдано в набор 14.11.2013. Подписано в печать 18.11.2013. _Заказ № 40. Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калашников, Александр Евгеньевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ ОБЩЕЙ ГЕНЕТИКИ ИМЕНИ Н.И. ВАВИЛОВА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи 04201453596 / л

КАЛАШНИКОВ Александр Евгеньевич

ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ОТЕЧЕСТВЕННЫХ ПОПУЛЯЦИИ МЕДОНОСНОЙ ПЧЕЛЫ APIS MELLIFERA И ИХ ИНФИЦИРОВАННОСТИ РНК-СОДЕ РЖАЩИМИ ВИРУСАМИ С ПОМОЩЬЮ МОЛЕКУЛЯ РНО-ГЕН ЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

специальность: 03.02.07-Генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент

И.Г. Удина

Москва — 2013 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ..........................................................................................................................................................2

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ...........................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ.................................................................................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................................................10

1.1 Популяции пчел в России и СНГ................................................................................................................10

1.2. Смешение подвидов медоносных пчел...................................................................................................13

1.3. морфометрический анализ популяций пчел..........................................................................................1 7

1.4. Исследование популяций пчел при помощи анализа митохондриального и ядерного геномов

пчел........................................................................................................................................................................22

1.5 РНК-содержащие вирусы пчел...................................................................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................................................71

2.1. Материалы.....................................................................................................................................................71

2.2. Методы исследований................................................................................................................................80

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ....................................................................................................93

3.1. морфометрический анализ пчел...............................................................................................................93

3.2. Анализ породной принадлежности пчел при помощи полиморфизма мтДНК..............................102

3.3. Анализ ядерного генома пчел при помощи микросателлитных маркеров....................................111

3.3.1. Дифференциация пород пчел по микросателлитным маркерам....................................................111

3.3.2. Дифференциация популяций пчел по микросателлитным маркерам..............................................123

3.3.3. Дифференциация семей пчел по микросателлитным маркерам......................................................135

3.3.4. Различие в дифференциации популяций по микросателлитным маркерам с учетом особенностей структуры пчелиной семьи.......................................................................................................................150

3.4. Анализ распространения РНК-содержащих вирусов пчел................................................................158

3.4.1. Анализ нуклеотидпой последовательности вируса деформации крыла (DWV) пчел.....................164

3.4.2. Анализ нуклеотидпой последовательности вируса мешотчатогорасплода (SBV) пчел .............172

3.4.3. Анализ нуклеотидпой последовательности вируса черных маточников (BQCV) пчел..................177

ВЫВОДЫ................................................................................................................................................................182

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................................................185

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................................................................................................212

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

дцРНК, двухцепочечная РНК КИ- кубитальный индекс мтДНК- митохондриальная ДНК МС- микросателлиты

оцРНК- одноцепочечная рибонуклеиновая кислота

ОТ-ПЦР (RT-PCR)- двухстадийная реакция обратной транскрипции с последующим ПЦР полученной кДНК ПЦР- полимеразная цепная реакция

ПЦР-ПДРФ мтДНК - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов РИД- реакция иммунодиффузии

ABPV- acute bee paralysis virus, вирус острого паралича пчел

BQCV- black queen cell virus, вирус черных маточников пчел

CBPV- chronic bee paralysis virus, вирус хронического паралича пчел

CCD- collapse colony disorder, коллапс колоний

DWV- deforming wing virus, вирус деформации крыла

IAPV- Israel acute paralysis virus, Израильский вирус острого паралича

IFV- infectious flacherie virus, инфекционный вирус шелковичного червя

IIV-6, invertebrate iridescent virus type 6, радужный вирус беспозв. 6 типа

KBV- Kasmir bee virus, Кашмирский вирус пчел

KV, Kakugo vims, вирус Какуго

ORF, open reading frames, открытая рамка считывания (транскрипции) RNAz- RNA interference, интерференция РНК

SNP- single nucleotide polymorphism, полиморфизм однонуклеотидных замен.

SBV- sacbrood bee virus, вирус мешотчатого расплода пчел SPV- (slow paralysis virus), вирус медленного паралича UTR- untranslated region, нетранслируемая область Varroa destructor virus (VDV-1), вирус Varroa destructor 1 типа

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. На территории России наиболее распространены карпатская, серая горная кавказская, среднерусская порода медоносной пчелы Apis mellifera и породный тип "Приокский", выведенный в результате скрещивания пчел среднерусской и серой горной кавказской породы. Среднерусская порода относится к подвиду темной лесной пчелы Apis mellifera mellifera L. [1, 53], характеризуется уникальным комплексом черт, включая зимостойкость и устойчивость к инфекциям и служит исходным материалом при создании промышленных пород.

В отдельных регионах произошла гибридизация темной лесной пчелы А. т. mellifera L с южными породами, относящимися к подвидам А. т. carnica, А. т. liguistica и А. т. caucasica [8, 54, 68]. Интрогрессия южных пород пчел в популяции среднерусской пчелы приводит к ухудшению производственных качеств и меньшей устойчивости к суровым природным условиям гибридных популяций пчел, а также к снижению иммунитета, что способствует распространению инфекционных заболеваний [106] и к сокращению генетического разнообразия популяций пчел [260].

Для сохранения аборигенных пород пчел необходимо дополнительно к морфометрическому методу [2, 7] использовать современные методы анализа генетических ресурсов: анализ мтДНК [28,53, 242] и микросателлитных локу-сов [21, 52, 141]. В соответствии с Федеральным законом о племенном животноводстве и рекомендациями Комиссии по биологии пчелы и конгресса "APIMONDIA" nittp.7/abeekeepersblo^.blogspot.com) (2009г.) для изучения и сохранения аборигенных популяций животных и пчел следует применять микро-сателлитный анализ. В последнее время стали накапливаться данные о дифференциации отечественных популяций пчел с применением ДНК-маркеров [22, 37], однако эти данные все еще носят фрагментарный и неполный характер.

вирусных инфекций при помощи ДНК-диагностики. В зарубежных популяциях пчел при помощи ОТ-ПЦР (ПЦР с обратной транскриптазой) выявлен высокий уровень инфицированности РНК-содержащими вирусами: в одной семье могут быть одновременно выявлены до пяти-шести разных вирусов [196]. Для отечественных пород пчел данные об их инфицированности вирусами весьма малочисленны [5].

Использование ДНК-маркеров является эффективным инструментом не только для диагностики вирусных инфекций, но и определения принадлежности к определенной породе. Применение молекулярных методов при разведении пчел и пчелиных маток и получении пчелопакетов промышленных пород является актуальным для сохранения их генетического разнообразия.

Цель и задачи исследований. Целью работы является изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и выявление инфицированности пчел РНК-содержащими вирусами при помощи моле-кулярно-генетических методов.

Для достижения цели определены следующие задачи исследования:

1. характеристика дифференциации отечественных популяций пчел с помощью морфометрического анализа;

5. анализ уровня инфицированности пчелиных семей РНК-содержащими вирусами методом ОТ-ПЦР;

6. структурный и филогенетический анализ фрагментов нуклеотидных последовательностей обнаруженных РНК-содержащих вирусов пчел (DWV, SBV и BQCV).

Научная новизна.

1. Впервые изучены отечественные популяции пчел одновременно по морфометрическим параметрам (по кубитальному индексу, с использова-

нием цифровых технологий измерения) и по совокупности молекулярно-генетических маркеров. Охарактеризованы чистопородные популяции среднерусской, карпатской и серой горной кавказской пород. В некоторых популяциях среднерусской породы выявлено смешение с южными породами пчел;

2. У пчел среднерусской породы и в выборках пчел из смешанных популяций впервые обнаружено явление гетероплазмии с присутствием одновременно нескольких вариантов митотипов. Установлена дифференциация отечественных популяций пчел по межгенному локусу мтДНК с анализом сайта рестрикции Dra. I;

3. Впервые проведен комплексный анализ отечественных популяций пчел анализ по четырем микросателлитным локусам А24, А28, и А14 и А88 (по локусам А28 и А14 данные уникальны). Для карпатской породы охарактеризована дифференциация пчел по микросателлитным локусам на уровне отдельных семей;

ходных данных для селекционных центров и генетического мониторинга процессов селекции.

3. Проведение анализа вариабельности длины межгенного локуса COI-СОИ мтДНК и микросателлитных локусов наряду с ДНК-диагностикой вирусных заболеваний пчел можно рекомендовать в качестве обязательных тестов при подготовке коммерческих пчелопакетов и маток на племенных предприятиях, а также при изучении отечественных популяций пчел с целью их сохранения.

Положения, выносимые на защиту:

1. Генетическая дифференциация отечественных пород и популяций пчел по микросателлитным локусам А24, А28, А88 и А14, длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и вариантам сайта рестрикции Dra. I межгенного локуса COI-COII мтДНК.

2. Различие чистопородных и смешанных популяций по длине межгенного локуса COI-COII мтДНК и кубитальному индексу.

3. Внутри- и межсемейная дифференциация пчел карпатской породы по микросателлитных локусам А24, А28, А88 и А14.

6. Наличие инфицирования клещей Varroa destructor РНК-содержащими вирусами пчел.

Апробация работы. Результаты диссертации представлены на 11 профильных конференциях: «Актуальные проблемы инфекционной патологии и ветеринарной медицины» (Покров, 2009); XXII Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (Москва, 2010); Международной научно-практической конференции «65 лет академии пчеловодства» (Рыбное, Рязанской области, 2010); Международной конференции «Пчеловодство XXI век» (Москва, 2010); II Международном форуме "Медовый пир", Международной научно-практической конференции «Современное пчеловодство. Проблемы, опыт, новые технологии» (Ярославль, 2010); 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века» (Пущино, 2011); Международной конференции «Проблемы популяционной и общей генетики» посвященная памятной дате 75-летию со дня рождения академика Ю.П. Алтухова» (Москва, 2011); III Международном форуме пчеловодов «Медовый пир», Международной конференции «Пчеловодство России на пути вступления в ВТО» (Ярославль, 2012); Конференции молодых ученых «Актуальные проблемы генетики и молекулярной биологии в рамках фестиваля науки» (Уфа, 2012); XXXXIII International Apicultural Congress "Apimondia» (Kiev, Ukraine, 2013); 50 Naukowa konferenja pczelarska (Pulawy, Poland, 2013).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 218 страницах, содержит 45 таблиц, 44 рисунка, 1 схему, 23 страницы приложений с иллюстрациями, 22 формулы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований и их обсуждения, практических предложений, выводов и списка литературы, который включает 278 источников, в том числе 193 иностранных источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Популяции пчел в России и СНГ

Пчелы в качестве насекомых-опылителей возникли в начале-середине мелового периода синхронно с покрытосеменными (цветковыми) растениями. Понимание диверсификации пчел и их совместной эволюционной истории с покрытосемянными растениями требовало тщательного изучения филогении пчел и покрытосемянных растений [106]. Реконструкции филогении пчел на уровне семейств и подсемейств с помощью анализа белок-кодирующих генов таких, как фактор элонгации 1, РНК-полимераза 2, LW родопсин, ядерных рибосомных генов 28S и 18S, позволяет четко определить филогенетические взаимоотношения видов пчел. В процессе эволюции пчел описаны взаимоотношения «хозяин-растение - реципиент-пчела», а специфичность пчелы относительно "хозяина-растения" является родовой чертой пчел [135]. На территории Башкортостана превалируют энтомофильные растения, и пчелы опыляют до 90% от общего количества сельскохозяйственных растений. Для опыления сельскохозяйственных растений традиционно используют перевозку пчел, что служит необходимым условием интенсификации сельского хозяйства, перевозки пчел организуют в соответствии с разработанным планом [75], из расчета использования не менее двух пчелиных семей на один гектар опыляемой культуры [83].

Анализ генетического разнообразия популяций пчел с помощью SNP-маркеров позволяет предположить, что медоносная пчела Apis mellifera возникла на Африканском континенте и оттуда распространилась в Европу (и далее на восток) вероятно двумя волнами, различными по времени и составу. В результате спектры подвидов пчел в Восточной и Западной Европе географически относительно близки, но удалены с генетической точки зрения. Третья волна распространения пчел носила антропогенный характер и привела к вытеснению раннее интродуцированных европейских подвидов пчел африканскими пчелами Apis mellifera scutellata, что привело к гибридизации и вы-

теснению европейских подвидов, в связи с чем возникает вопрос о характеристике истинно аборигенных пчел на той или иной территории [273].

1.1.1. Аборигенные подвиды пчел в России

Среднерусский подвид пчел Apis mellifera mellifera L.

В России аборигенной пчелой являлается подвид темной лесной пчелы А. т. mellifera L - среднерусская пчела). Активное перемещение семей пчел началось с момента изобретения для них колод и ульев. Обмен семьями пчел между странами и континентами был широко распространен с 19 в. Общепринятой теорией является то, что темная лесная пчела произошла от тёмной североафриканской (телльской) (А. т. intermissa) и тёмной пиренейской пчелы. Среднерусские пчелы расселились естественным путем до Урала и Западной Сибири, заняв территорию южной части Урала и Западной Сибири впл�

Информация о работе

Калашников, Александр Евгеньевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.02.07

Диссертация

Изучение дифференциации отечественных популяций медоносной пчелы Apis mellifera и их инфицированности РНК-содержащими вирусами с помощью молекулярно-генетических методов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы