Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение биосинтеза эйкозаноидов при облучении и ожоге и его влияние на радиочувствительность

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение биосинтеза эйкозаноидов при облучении и ожоге и его влияние на радиочувствительность"

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ АКАДЕМИИ НАУК АРМЕНИИ

на правах рукописи

ДЖИНАНЯН КАЕЕН ОГАНЕСОВИЧ

ИЗУЧЕНИЕ БИОСИНТЕЗА ЭЙКОЗАНОИДОВ ПРИ ОБЛУЧЕНИИ И ОШГЕ И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ

специальность 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1991

Работа выполнена в НИИ медицинской радиологии Ю Армении (директор - д. и. н., проф. Оганесян Н М.)

Научные руководители - доктор химических наук

А. Г. ПАНОСЯН

кандидат биологических наук Г. X. ГРИГОРЯН

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

профессор МИ. АГАДЖАНОВ

кандидат биологических наук

доцент

Ц. Ы. АВАКЯН

Ведущая организация - Ереванский Государственный университет.

Защита состоится "¿к" Я/^ аЯ- .1992 г. в часов на

васедаяии специализированного совета Д 005.15.01 при Институте биохимии АН Армении (375044, Ереван-44,- ул П. Севака, 5/1)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института биохимии АН Армении.

Автореферат разослан " "_1991 г.

Ученый секретарь

специализированного совета

<

доктор биологических наук,

профессор с с с & <--<■ Цл-, А. А. СИШНЯН

Актуальность проблемы. Существующие методы профилактики и патогенетической терапии лучевой болезнии базируются на современном уровне знаний механизмов развития радиационного поражения и теорий Действия радиозащитных средств. Концепция о биохимическом фоне радиорезистентности организма во многом отражает практически все из них, однако полна "белых пятен", в частности о роли эйкозаноидов в развитии радиационного поражения.

Некоторые эйкозаноиды являются высокоактивными посредниками межклеточных и внутриклеточных коммуникаций и вовлечены' в работу, по существу, всех регуляторных систем организма на всех уровнях: центральной нервной, нейроэндокринной, иммунной систем, систем посредников внутриклеточного ответа (ц-АМФ, ц-ГМФ," инозитолтрифосфат, дигли-цериды, калмодулин, протеинкиназа С), системы генетической информации (синтез ДНК, деление и диферекциация клеток). Биологически активные эйкозаноиды являются продукта).« ферментативного перекисного окисления арахидоновой кислоты: вместе с тем, считает общепринятым, что перекисное окисление липидов играет важную роль как в развитии повреждающих факторов радиации , так и радиозащитной реакции организма Четких представлений, .однако, о биохимических механизмах окисления конкретных субстратов и об их непосредственной роли з развитии лучевой болезни не имелось. Естественно было предполагать, что "эйкозаноиды могут быть вовлечены как в реакции зарождения и развития радиационного поражения, так и в защитные реакции организма на облучение.

Настоящая работа посвящена именно этому вопросу и является часты) плановых иследований НИИМР Ш Армении по теме "Изучение биосинтеза эйкозаноидов в эксперименте для обоснования новых методов профилактики и патогенетической терапии комбинированных радиациои-но-термических поражениях (КРТП)" N0 гос. регистрации 0186000388 выполняемой в рамках Всесозной научной проблемы N0 10 ("Отгонка 1").

Цель и задачи исследования. Для выяснения роли эйкозаноидов з регуляции радиочувствительности клеток, тканей, органов и всего организма в целом, что и является основной целью настоящего иследова-ния необходимо знать:

-как изменяется биосинтез эйкозаноидов при облучении,

-как изменяется радиочувствительность при действии блокаторов их

биосинтеза,

-как влияют различные эйкозаноиды на радиочувствительность клеток и организма при их действи извне. •В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи;:.

1. Исследовать активность ферментов биосинтеза эйкозаноидов при облучении и КРГП, для этого изучить:

- биосинтез эйкозаноидов в полиморфоядерных лейкоцитов (ШЯЛ) кроликов при рентгеновком облучении,

- биосинтез эйкозаноидов в ШЯЛ крыс при КРТП,

- биосинтез эйкозаноидов при^облучении изолированных ШЯЛ человека, влияние цистеамина.

2. Определить уровень лейкотриеиов (ЛТ) С^ , В^, простациклина и тромбоксана к^ крови кроликов и крыс при рентгеновском облучении, термическом ожоге и КРГП

3. Исследовать влияние ингибиторов биосинтеза эйкозаноидов на радиочувствительность крыс при облучении.

. 4. Изучить влияние диеты с различным содержанием ненасыщенных жирных кислот на выживаемость крыс и жирнокислотный состав печени, крови и селезенки при облучении.

Научная новизна. Исследованна роль эйкоааноидов при облучении и КРТП, Эйкозаноиды являются посредниками отклика организма на дейст- . вие ионизирующего излучения и оксидативный стрес при КРТП На ранних стадиях после воздействия происходит активация биосинтеза эйкозаноидов, что является защитной, адаптивной реакцией организма, поскольку ингибиторы биосинтеза эйкозаноидов уменьшают радиорезистентность животных к облучении, а сами лейкотриены и некоторые простатландины оказывают сильный радиозащитный эффект.

Новый подход в изыскании радиозащитных средств заключается в использовании аналогов простагландинов и лейкотринов в качестве радиопротекторов, а также ингибиторов биосинтеза эйкозаноидов для лечения лучевой болезни и КРТП, поскольку эйкозаноиды являются медиаторами воспаления.

Показанно, что радиозащитное действие растительных масел связанно с повышенным содержанием и утилизацией полиеновых жирных кислот -

- Б -

субстатов липоксигеназ и биосинтеза эйкозаноидов.

Практическая ценность. На основании полученных данных предложи новый подход к целенаправленному поиску новых радиопротекторов у. средстЕ для лечении лучевой болезни, основанный на использовании аналогов эйкозаноидов и веществ влияющих на их биосинтез.

Практическая ценность работы также состоит рекомендациях диеты с растительным маслом для повышения радиочувствительности организма.

Апробация работы. Основные результаты диссертации представлены на Всесоюзном симпозиуме по биохими липидов, Алма-Ата 1987, Всесоюзной конференции "Синтез и исследование простатландинов" Шнек, 1989, Всесоюзной конференции по КРТП, Ереван 1989.

Публикации. Результаты исследования по теме диссертации представлены в 5 статьях и 2 тезисах докладов на конференциях.

Обьем работы. Диссертация изложена на 95 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор литературы, результаты собственных наблюдений, обсуждение результатов, заключение, выводы, указателя литературы, включающего 172 источника, в том числе 29 отечественных и 143 иностранных. Работа иллюстрированна 8 рисунками, 22 схемами и содержит ЗЗтаблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Условия облучения и нанесение ожога. Кроликов массой 2,3-3 кг подвергали однократному общему рентгеновскому облучению в дозе 6, 2 Гр (аппарат Рум-17).

В опытах использовали группы крыс массой 180-200 г. КРТП моделировали последовательным действием рентгеновского излучения в дозе 5,25 Гр (условия те же) и нанесения наповерхность тела (15%) огога III Б степени. На выстриженную поверхность спинки крыс в интервале 10-15 мин после облучения наносили термический ойог при помощи нагретой медной пластинки (200 С ).

Образцы суспензии ПМЯЛ подвергли действию ß -лучей в течении 5 мин с помощью аппарата Луч-I: доза-600 Р(120 Р/мин), источик Со, фо-

кусное расстояние - 40 см. Через 30 сек после облученния к инкубационной смеси прибавляли этанольный раствор арахидоновой кислоты (АК).

Инкубация арахидоновой кислоты с ПМЯЛ и предварительная очистка метаболитов. Выделение ШЯЛ из переферической крови человека или подопытных животных производили по методике Бойум (Boyum, 1976). Образцы суспензии ПМЯЛ в фосфатном буфере инкубировали пять минут с меченной по углероду или тритию арахидоновой кислотой, метаболиты очивщи тьердофазной экстракцией алкилированным силикагелем "Sep-Рак, С-18" модифицированным методом Пауэла (Pawel, 1982) и анализировали с помощью обрашенно-фаэовой ВЭЖХ В ряде опытов клетки инкубировали с цистеамином, глутатионом или дополнительно стимулировали ионофором А-23187.

КЗ,'¡Я (ЛКВ, Швеция) метаболитов АК в ПШ проводили на колонках с гидрофобным силикагелем Lichrosorb RP-18 и Núcleos! 1 С-18. Детекция - при 280 ;ш И 235 нм, а также с помощью диодного детектора (Varían) в диапазоне ¡00-337 нм с одновременной регистрацией УФ спектров.

Вещества идентифицировали путем сравнения с истинными стандартами на основании данных ВЭЖХ и У^спегаров.

При хроматографии собирали фракции по I мл: от каждой фракции отбирали пробы пс 100 мил и измеряли в них радиоактивность с помощью У-сцшшшяциошюго счатчшш SL 4221 Rosho Bioelectro- ni true.

Опродэлаииа ЛТО^и. ЖВ^в. сыворотке.крови при облучении, термическом ожоге и КРГП крыс проводили с помощью наборов для радиоимушгаго Ш1ализа " Система анализа t З0-ЛТВ4" и "Специальная система анализа [ 3 Ш-ЛТС^ -моноклональное антитело" (Amarsham) по прилагаемы.'.) к ним методикам. В работе испояьвовали &-оцинтшшцио1ший счетчик Mirk 111(Tracor) и сцмнтшшциоиную жидкость Брея [Bray Q. Y. ETC., 19603, Предварительную очистку образцов сыворотки крови проводили твердофазной экстракцией лейкотриенов с помощью насадок Sep-Pal-; с-18 (Vaters) о алкшшродошшм силикагелем по методу Паузла.

Опр9Долени§ вшбодных жирных кислот, условия ГКХ. Выделение суммарных липидов крови, печени и селезенки, а также получение суммарных жирных кислот а виде метиловых эфиров проводили по общепринятым

методикам, описанным в монографии Кейтса С Куйте U- и др., t!375].

Газовую хроматографию метиловых эфиров хириых кисло? проводи-т на приборах Chrom-4M и JKM-ßO, снабхвнннх ялтетю'ионизаитниин дз тектором. В работе использовали колонки с В% ГОРА иа ЗСромосорО'Э W. Для идентиФшсащш жирных кислот иеяользойшш кстшшш стандарты (Sigma).

^пользование._ики<биторов биосинтеза зйквзякаидев яа щздточуйет-витзльность крыс .при дОлу^ения и КРШ В опытах использовали 750 белых беспородных крыс массой 100-200 г, во БО крив в каждой группе. Фенил гидразон ванилина (ФГЮ вводили яивотиым трортыт, однократно за 30 мин до облучения в 0,GS-hom растяорэ карбоксю^тилцёллшоэн в дозах 1/2, 1/8 и 1/80 от СД : 80, 20 it 2 иг па крыеу eeoftmcTse»-но. Токсичность ФГВ определяли яа б<злт баепородпт иштс массой 18-20 г. Животным контрольных групп - порахлшгш и не подвергнул« облучению, вводили такой т cGi/зи ( Iií/í) раетпорктеля, Условия облучения и КРТП описаны выше.

Аналогичном способом изучали влияние диглюкезида кукурбигацииа R дKP. мпд - 2000 мг/кг (на «шах), исследуемая доза - 1мг/да, водный раствор, пероральное введеши.

Влияние индометацина (Sigma) изучали в дозах 25, 12.5 и 5 мг на крысу, внутрибршиино, за Z ч до облучения.

Условия диеты крыс. В опытах использовали 500 беспородных белых крыс, которых содержали в течение 30 дней до облучения ( однократно, доза - 600 Р, ) на диете с различным по природе "жировым компонентом": а - свинным жиром, б - бараньим жиром, .в - подсолнечным маслом и г - рыбьим жиром. Всего - 10 групп крыс, по 50 в каждой, три серии опытов - результаты приведены в таблице 1 где указаны результаты применения стандартного - А (30% калорий от жиров) и высокожирового - В (50Z калорий от жиров) рационов.

За выживаемостью животных следили в. течение 30 днй после облучения, В одном из опытов, от каждой группы животных отобрали по 5 крыс до облучения и из третий день после него, для изучения акирнокислот-ного состава крови печени и селезенки.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЗДЕНИЕ

Активность ферментов биосинтеза эйкозаноидов при облучении и KPTIL

Ш изучали способность изолированных гранулоцитов к синтезу эй-когакоидоБ в разлитые сроки после облучения кроликов и КРТП крыс (влияние In vivo), а также влияние if-облучения на изолированные гра-нудоциты человека (in vitro).

i з

Рис. 1.

обозначение А и В исполь-зованны для построения кривых выживших кроликов, С,0 и Е- для кроликов с детальным исходом на 9-12 дни после облучения.

Биосинтез эйкозаноидов в ШЯЛ кроликов при рентгеновском облучении. ПМЯЛ кроликов, подвергнутых действию ионизирующей радиации, инкубировали с С I-I4 с]- арахидоновой кислотой в отсутствии факторов стимулирующих лейкоциты, метаболиты анализировали с помошыо ВЭЖХ. Как видно из рис. I, в 1-е сутки, сразу после облучения резко усиливается активность ферментов окисляющих арахидоновую кислоту: в инкубационной среде увеличивается количество метаболитов липоксигенааного окисления б-гидрокси-бЕ,8Z,11Z,142-эйкозатетраеноЕой кислоты (б-НЕТЕ),

12 - гидрокси - 5Z,8Z,10Е,14Z - зйкозатетраеновой кислоты (12-HETE), 15-r!iAP0Kcn-5Z,8Z, 11Z, 13Е-эйкозатетраеновой кислоты (1Б-НЕТЕ), а таже продукта цикдооксигеназного пути метаболизма арзхидоносой кислоты 12-гидрокси-52,8Z, 10Е-гентадекатриеиовой кислоты (ШГГ), Образований лейкотриепов при этом не? наблюдалось. lia 3-й сутки активность этих ферментов падает, а на 7-е етугл, в период наивысшей смертности - подавлена полностью. Б период ремиссии у вьжшшк аашогшк набло-дается тенденция к восстановлению активности фериэнтов ¡саслдца зра-

ХИДОНОБОЙ КИСЛОТЫ.

Биосинтез эйтзаноидов в Ш.'ЛЛ кркс при KPTIL

ПМЯЛ крыс, подвэргвугьж КРТП» иикуб1фовали в ириоугсгояш ¡юпофора cá%-23IS? с СI-* С1 аргшадоповой кислотой; кс-таЗолигы аягишшцюваш с поетцью ВЭЖ5С Как видаю из'рис. 2, в персий дань, сразу .тл после КРТП наблюдается активация образования ЛГД|, 20-011-ЛГВ4И Е- Н2ТЕ, п более поздние cpoioi их биосинтез значительно оохгблои.

го. о'

Рис. 2. Биосинтез 5-1ШТЕ, ЛТВ^и 20-0Н-ЛГВ4в ШЯЛ крыс при ÍÍPTIX Л - 20-0Н-ЛТВ

в - лтв

С - 5-НЕТЕ " п

* о

пмоль/10 1слеток , . с

11.0

10.0

Наблюдаемые нами изменения Сиосшгтеза зйкозановдоз при облучешя; и КРТП находятся в соответствии с.имэкцимиея в литературе данными о факторах, влияющих на активность липоксигеназ и биосинтез зйкозакок-дов . Увеличение образования продуктов дипоксигенаэного окисления в ранние сроки поражения, по всей вероятности, объясняется образованием гидроперекисей липидов, неизбежно возникающих в бедьаих количествах при неферментативном окислении липидов продукта.1® радиелиаа воды. Гидроперекиси липидов -простагландин (ПГ) в^г НРЕТЕ являются активаторами липоксигеназ и циклоокеигеназы, схема 1.

Подавление биосинтеза зйкозаноидов в более поздние сроки мотет

5ьггь вызвано двумя причинами: способностью липоксигенаэ и циклоокси-геназы к самодезактивации при действии образующихся гидроперекисей (точнее - продуктов их ра;- южения). Гидроперекиси липидов (НРЕТЕ И ПЩ>) в высоких концентрациях инактивируют циклооксигеназу, липокси-геназу, IITHg -синтетазу и проксидный компонент ПГН2 -синтетазы [Aharony D. etc., 1987, Marnett L. J. etc., 1985, Moneada S. etc., 1976]. Известно также, что гидроксильный радикал ОН'инактивирует ЛТВ ^ , то есть затухает генерация (^лейкоцитами и их функции подавлены

Биосинтез зйкозаноидов при У-облучеат изолированных ПШЛ человека, влияние цистеамина.

Является ли активация биосинтеза эйкоааноидов гранулоцитами непосредственной реакцией на ионизирующее иалучение и как быстро проявляется это воздействие? Для ответа на эти вопросы, а также на вопрос как влияет аминотиольные радиопротекторы на биосинтез эйкоааноидов, ш исследовали метаболизм арахидоновой кислоты в присутствии изолированны}: ПШЛ человека предварительно подвергнутых действию я-дучей к условиях № vitro. Суспензию'ПШЛ переферической крови здоровых доноров подвергали ¿-облучению в течение 5 шк (120 Р/шн) и через 30 сек после облучения добавляли арахидоновую кислоту. В ряде опытов клетки после облучения стимулировали ионофором кальция и предварительно обрабатывай! ашнотшльнш радиопротектором - цистеа-мжюм. Кал авдио иг рксунка 3, предварительное облучение клеток приводит к резкой активации биосинтеза эйкоааноидов: б-НЕТЕ, 15-НЕТЕ,

- и -

ЛТВ4, 20-011-ЛТВ^,ЛТС4> что.по всей вероятности, вызывается по?, ем уровня гидроперекисей липидов в результате неферментат, окисления при действии продуктов радиолиза воды.

JN VIM

15->Е7Е

Рис. 3 Изменение активности ферментов биосинтеза эйкозаноидов при облучении ПШЛ человека.

in vitro, нг/Ю клеток. »- серии опытов со стимулированием клеток ионо-фором Са*2

12 1Е7Е

из

ПС

Эти результаты подтверждают предположение о том, что ферменты биосинтеза эйкозаноидов являются своего рода "силами быстрого реагирования" в ответ на оксидативный стресс. Они активируется в клетках по меньшей мере в течение 30 сек после облучения.

Влияние цистеамина на метаболизм арахидонозой кислоты зависит от условий опыта. Цистеамин не влияет иа активность липоксигеназы соевых бобов, окислявшей арахидоновую кислоту до Ш-НРЕТЕ,но понижет уровень 12-НЕТЕ и ННГ при инкубации арахидоновой кислоты с ШЯЯ человека (рис. 4). Такой эффект можно объяснить следующим образом. Как указывалось выше, низкие концентрации гидроперекисей лирных кислот активируют липоксигенаэы и циклооксигеназу; действуя как антгокси-дант, цистеамин восстанавливает гидроперекиси до оксиккслот, понижая тем самым активность липоксигеназ и циклооксигенааы.

Если лейкоциты, обработанные цистеамином, стимулировать ионофо-

ром кальция, то наоборот, наблюдается активация липоксигенаа и повышение биосинтеза 12-НЕТЕ» 5-НЕТЕ, ЛТ^, бЕ-ДГВ^к 125-бЕ-ЛТВ4(рис. 4) по сравнении с опытами без добавок цистеамина.

HtCi

l 1 е

6-Е-1ЛЗ 12-СЕ-ПВ

3-1ЕТЕ

Рис. 4 Влияние цистеамииа на биосинтетическув актив-кость ПМЯЛ человека при облучении in vitro, hp/10 клеток.

А - Л + цист+j+AK + ионф В - Л+£)Г+ АК + ионф

А

Ш

CJKT6

При облучении клеток в присутствии цистеш.ша и последующе» добавлении арахидоновой кислоты, наоборот, ушньазетса образование 12-НЕТЕ, Б-НЕГЕ, ЛТВ^, бЕ-ЛТВ^, 123-6Е-ЯГЕ^, но увеличивается биосинтез радиопротекторного ЛТС (рис. 4), Это селективное увеличение биосинтеза ЛТС^можио объяснить тем, что цистеамин вызывает высвобождение эндогенного глутатиона tLiyesey J. С. etc., 19853, который выключается в биосинтез ЛГС^ под влиянием глутатион-5-трансферазц [ Murphy R. С. etc., 1979].

Тагам обрааом, действие амионотиольных радиопротекторов опосредованно их воздействием на биосинтез эйкозаноидов.

Уровень ЛТС4 , ЛГВ 4, в крови кроликов и крыс при рентгеновском облучении, термическом ояоге и КРТП.

В литературе совершенно отсутствуют сведения о липоксигеназных

метаболитах арахидоновой кислоты в тканях и биологических жидкостях при КРТП. МЫ исследовали уровень ЛГВд! ЛТС^в сыворотке крови крыс при рентгеновском облучении, термическом ожоге и КРТП, рис.5.

2 24 -13 ? 14

О 2 24 43 7 14

Рис. 5 уровень лейкотриенов В^ и с4

3 С!ЮОрОТ!-е крови крыс при рентгеновском облучении терстископ ожоге и комби-Кфог.анном раднацшнпо-гзрююэспом порг'-.'-анш!, г;г/ш.

Л ■■ -Т;' В, В - Л?с.

О г 24 43 7 14

Череп 2 часа поело облучения. уровень ЛТС^в сьгооротге крови падает, затем попытается, достигая максимума через 43 часов. Б случае

ЛТВ . наблюдается понижение, однако в дальнейшем, его содержание л

непрерывно возрастает и превышает норму. При термическом ожоге, содержание .'ГГСдВ сыворотке крови крыс падает почти вдвое через 4 часа после оглга, через 43 часов - небольшой подьем, затем ~ резко снижение, Статистически достоверного изменения уровня ЛТВ^при термическом огаэге не наблюдается. Наиболее резкие изменения имеются при КРТП. В этом случае график зависимости содержания ЛТС^и ЛТВ^в сыворотке крови крыс от времени после радиационио-термического воздействия имеет синусоидальную форму с максимумом через 48 часов и минимумами на 4

о

час и 7 день после воздействия (рис.бв).

Сопоставление этих результатов с данными о биосинтезе эйкоэанои-дов при облучении и термическом ожоге приводит, на первый взгляд, к

парадоксу: биосинтетическая активность лейкоцитов увеличивается (по крайней мере в отношении 5-НЕТЕ и 12-НЕТЕ), а уровень Л Г В 4и ЛТС^ в сыворотке крови уменьшается, хотя они образуется по одному и тому же биосинтетическому пути,что и 5-НЕТЕ. Обяснить такой "парадокс" возможно, если учесть два обстоятельства Пэрвое заключается в том, что гидрокси радикал ОН', образующийся в результате радиолига воды или генерации суяероксиданиона инактивируэт лейкотриены Вд и С^

tHenderson W. R. etc. , 19831. Второе это то, что 5-НЕТЕ и 12-НЕТЕ является ингибиторами липокеигеназы и биосинтеза ЛТЕ^и JFTC^C Chang J. eto., 1985], в результате чего, за определенный промежуток времени после воздействия, в крови их накопится меньше, чем будет образовываться в норме ( следует учесть такие и то, что ЛТВ^и ЛТС^ постоянно катаболизируюггея в крови и их уровень в крови зависит от метаболизма во всех органах и тканях). Снижение уровня ЛТС^ка седьмой день после облучения, по всей вероятности, в наибольшей мере является следствием лейкопении, тогда как повышение на 48 час, возможно, адаптивной реакцей активации биосинтеза зйкозаноидов.

Радиочувствительность крыс при действии факторов, вдкяюздне на образование зйкозаноидов.

Влияние ингибиторов биосинтеза зйкозаноидов на

радиочувствительность крыс при облучении и KPTIL

Являются ли изменения в биосинтезе зйкозаноидов при действшг радиации одним из проявлений вторичных метаболических нарушений вследствие радиацинного поражения, или эйкозаноиды сами играют какую то роль в регуляции природной радиочувствительности? Если - да, то какую - радиосенсибилизируюшую или радиозащитную?

Один из способов найти ответ на этот вопрос - это изучить радиорезистентность животных при применении ингибиторов биосинтеза зйкозаноидов. С этой целью мы использовали: ингибитор липоксигеназ - фе-нилгидразон ванилина (ФГВ) СШносян А. Г. и др., 1987], ингибитор циклооксигенааы - индометацкн I Lands W. Е. М. etc., 19831, и ингибитор высвобождения из фосфолипидов свободной арахидоновой кислоты - диг-ликозид кукурбитацина R (ДКР), СШносян А. Г. и др., 1985, Паносян А. Г. и др., 19793. (схема 2).

схема 2.

мсмдищы

ШЯШ.8«

ФЛ - фосфолипазы ЦО - циклооксигеназы Л) - липокскгеяазы шисоиммв

ДКР также- увеличивает секрецию кортикостерокдов СПаносяи А. Г. и др., 19873, которые,как известно, подавляют высвобождение арахидоно-вой кислоты tHi rata F. etc., 19803.

До облучения животным вводили тот или иной ингибитор. На рис. 6 приведены результаты испытаний,указывающие на то, что смертность во всех трех случаях увеличивается, а средняя продолжительность жизни павших животных - уменьшается по сравнению с контрольной групой животных, которым не вводили тестируемые соединения. Ее© более выражен этот эффект при КРТП при действи ФГВ (рис. 6а). Эффект носит дозоза-висимый характер (рис. бб и в).

ш is го - я

Рис. 6а - Влияние ФГВ на выживаемость ,срыс при облучении.

бв - Влияние ДКР (1 мг/кг) на выживаемость крыс при облучении. А -контроль. , В -1/80 СД/6 , С -1/8 СД/(5, О -1/2 СД/6

Тагам образом, уменьшение количества субстрата и подавление активности липоксигеназ приводит к увеличен!» радиочувствительности животных и ускоряет их гибель при облучении к КРГП, т. е. активацию липоксигеназ можно расматривать ¡ж защитную реакцию организма, подавление которой приводит к более быстрой гибели животных.

Влияние диеты с различным содержанкой нэиасыщршшх жирных кислот на выживаемость крыс и кирнокислотный состав печени, крови и селезенки при облучении.

Известно, что-, лимитирующей стадией яппокскгеназного окисления является стадия стереоселективного элиминирования аллильного атома водорода пента-1,3-диеновой группировки в молекулах подииенасычшшх жирных кислот [Panisslan A. G. etc., 1982, Schewe Т. etc., 1986].

Образовавшийся стабильный радикал служит своего рода ловушкой активных форм кислорода, образующихся при радиолпзе воды, что приводит в конечном итоге к уменьшению их количеств в клетке и предотвращает деструкцию ферментов и других макромолекул, т. е. .тарные- кислоты, как бы, отводят на себя действие ионизирующей радиации и том самым проявляют свое анткоккслителыюе действие при облучении, которое не может бьгть отпасено только к токоферолу, присутствующему в жирах в виде примесей СБурлакова Е. Б. и др. , 1975]. Описанные ниже опыты по изучению влияния диеты,различающейся по составу жирных кислот, на радиочувствительность крыс, подтверждают это предположение.

Кроме того, поскольку активация биосинтеза эйкозаноидов в немалой степени зависит от наличия и доступности свободной арахедоиовой кислоты, опять таки следует предполагать, что диета с повышенным содержанием ненасыщенных жирных кислот может оказать благоприятное влияние на радиорезистентность организма.

Ш изучали влияние диеты с различным содержанием ненасыщенных жирных кислот на.радиорезистентность крыс путем определения выживаемости и средней продолжительности жизни павших животных при действии ионизирующего излучения. Кроме того, с целью проверки вышеиалажешю-го предположения, мы исследовали изменения относительного содержания моноеновых кислот, а также субстратов липоксигеназ и циклооксигеназ - полиеновых жирных кислот крови, печени и селезенки крыс при облучении.

Как видно из таблицы 1 выживаемость крыс увеличивается при диете с ненасыщенными жирными кислотами: подсолнечным маслом или рыбьим жиром. Использование бараньего или свиного жира повышает смертность при облучении.

На рис. 7 показано относительное содержание арахидоновой (20:4), линолевой (18:2) и олеиновой кислот в сумме жирнокислотной фракции, полученной в результате метанолиза суммарных клеточных липидов крови, печени и селезенки крыс, содержащихся на диете с различным содержанием ненасыщенных жирных кислот. Тот или иной вид диеты в значительной степени влияет на содержание отдельных жирных кислот. На третий день после облучения жирнокислотный состав претерпевает изменения - уменьшается относительное содержание полеиновых жирных кислот -. предшественников биосинтеза эйкозаноидов и субстратов липоксигеназ (арахидоновой и линолевой кислоты), тогда как содержание моноековой (олеиновой) кислоты, наоборот, увеличивается.

Рис. 7а -Влияние индометацина на выживаемость крыс при облучении.

7в -Влияние ФГВ на выживаемость крыс при КРТИ А - контроль, В - 12,5 мг/кг, С - 25 мг/кг.

Эти данные подтверждают сделанное нами предположение о том, что, активация липоксигеназ при облучении требует расхода поленовьк кислот и не связана с моноеновыми, которые не являются субстратами липоксигеназ при синтезе эйкозаноидов.

Полученные результаты дают также- возможность судить о физологи-ческой роли липоксигеназ, как об адаптивной системе ферментов - естественных переносчиков активных форм кислородов на "ловушки" - по-линенасыщенние жирные кислота Образовавшиеся продукты могут играть важную роль в процессах роста, старения и созревания клеток, как это известно для липоксигеназы ретикулоцитов, функция которой связана с

процессом созревания ретикулоцитов,их превращением в эритроциты, с деградацией митохондрий и подавлением активности ферментов дыхательной цепи С Sehe we Т. etc., 1986].

Таблица 1

Влияние различных по составу жиров на выживаемость крыс приоблучении

Серия Группа Режим диеты Выживаемость,- Средняя

опыта ДО после % к контролю продолотт.

обл. обл. хтж, дни

- С С 21,2 16

I - в В 44,4 19,2

- в В 57,0 22

а А В 30 16,2

II в А В 50 19,2

а В В 26,6 16, J

в В в 44,4 19,8

б А А 10 12,3

в А А 22,2 16,4

III г А А 23,1 15,2

*) Указан жировой компонент калорйности рациона А,В и С - низкожировой рацион без добавки жиров, 17% калорий от жиров. *) Средняя продолжительность жизни контрольной группы неаблученных крыс принята за 30 дней (продолжительность опьгга) Практическая ценность этих опытов может состоять в рекомендациях диеты с растительными маслами для повышения радиорезистентности организма.

Обобщя вышеизложенное можно заключить, что наблюдаемая в ранние сроки радиационного поражения и КРТП активация биосинтеза эйкозанои-дов является адаптивной, реакцией организма в ответ на "окоидативный стресс". Такого рода заключение об этом явлении впервые было сделано нами СПаносян А. Г. и др., 1989, Паносян А. Г. и до, ¿ 1987, Ланосян А. Г. и др., 1888].

Подтверждением этого заключения могут служить сообщения о радиопротекторном действии лейкотриенов [Waiden Т.L. etc., 1987, Waiden Т. L. etc. , 1986, Waiden Т. L. etc. , 1983, Waiden JR. etc., 1988) и о том, что ингибиторы липоксигеназ подавляют мизлопоэз и зриторопозз, влияя на клетки костного мозга £ Snyder D.S. etc., 1986].

Таким образом, эйкозаноиды. представляют собой систему посредников клеточного отклика на действие ионизирующего излучения:

- посредников адаптационной (защитной) реакции организма, проявляющих радиозащитный эффект в дозах в тысячи раз меньших,чем классические радиопротекторы,

- посредников развития лучеЕОй болезни, в частности,воспалительной реакции организма.

Это можно сравнить с откликом организма на действие антигенов: активация функции лейкоцитов - защитная реакция организма, которую необходимо вовремя погасить естественным! "гасителями" - кортикосте-роидами, или несероидными противовоспалительными препаратами.

Действие радиации нарушает существующий баланс, базальный уровень 0)Т\ активность биосинтеза эйкоааноидов. Это сказывается на работе всех других регуляторных систем на всех уровнях регуляции гоме-сстаза.

Практическим аспектом исследуемой проблемы является обнаружение новых возможностей з изыскании новых препаратов для профилактики и лечения лучзиой болезни и I(FTH Они заключаются в фармакологоичеасой коррекции клскзда ерахидоновой кислоты гак индивидуальными соедине-ппми, так и смесью ¡сомлонентоп влияющих на различные ступени каскада, что даст больший эффект, чем одно вещество.

Дальнейшие углубленные исследования в этой области могут привести к созданию новых малотоксичных радиопротекторов с большим значением терапевтического индекса, чем известные. То ш вероятно, можно сказать и о перспективе создания нового поколения средств, предназначенных для лечения лучевой болезни и КРТП.

выводы

1. Метаболическая активность ферментов каскада арахидоновой кислоты в полиморфоядерных лейкоцитах кроликов и крыс резко возрастает в первый день облучения и КРТП, затем падает в период наивысшей смертности и восстанавливается в более поздние сроки.

2. Ингибиторы липоксигеназ, циклооксигеназы и высвобождения арахидоновой кислоты увеличивают смертность и уменьшают среднюю продолжительность жизни крыс при облучении и КРТП.

3. Активация метаболизма арахидоновой кислоты является компенсаторной реакцией организма в ответ на "оксидативный стресс", имеющий место при действии ионизирующего излучения

4. Исследование динамики изменения содержания лейкотриенов В4и С^ в сыворотке крови крыс при термическом ожоге, рентгеновском облучении и комбинированном радиационно-термическом поражении показанно, что Характер изменения содержания лейкотриенов В^? С^в сыворотке крови крыс при термическом ожэге отличается от характера кривых уровня лейкотриенов С^и В^при облучении и КРТП. Относительное повышение уровня лейкотриенов в сыворотке через 48 часов после воздействия, вероятно является адаптивным откликом организма на оксидативный стресс.

5. Показано, что через 30 сек после облучения суспензии изолированных гранулоцитов активируется биосинтез эйкозаноидов. Предварительная обработка клеток цистеамином стимулирует биосинтез радиопротекторного лейкотриена С^ , содержание которого в сыворотке крови после облучения и КРТП реако уменьшается.

6. Диета с ненасыщенными лирными кислотами (подсолнечным маслом и рыбьим жиром) увеличивает радиорезистентность крыс по сравнению с диетой, богатой насыщенными жирными кислотами (бараний и свиной жир).

Активация липоксигеназ при облучении требует расхода полиеновых кислот и не связана с моноеновыми, которые не является субстратами липоксигеназ и синтеза эйкозаноидов.

с

- 21 -

Список работ, опубликованных по теме диесертиции:

1. Паносян А. Г., Джинанян К О., Гевондяи К. а -Лебедева М, К, Вартанян Г. С. Шгосян Э. Г. Акопов С. 3. Габриелян Э. С. Активация метаболизма арахидоновой кислоты- защитная реакция организма при облучении и комбинированном термическом поражении. Радиобиология. -1937. - Т. 27. Вып. 6. с. 770-774.

2. Паносян А. Г., Джинанян к. О., Гевондян К. В. , Лебедева М. Е Вартанян Г. С. Погоспн Э. Г. Акопов С. Э. Габриелян 3. С. Комбинированные радиационные поражения. Обнинск, НИШР Ш СССР.-1983. т. 41, N. 2 с. 112-117.

3. Паносян А. Г., Петросян А. К , Вартанян Г. Г., Джинанян К О., Габри-злян Э. С. -Влияние диеты с различным содержанием ненасыщенных жирных кислот на выживаемость крыс и жирнокислотный состав печени, крови и селезенки при облучении. Дурнал экспериментальной и клинической медицины. 1939, т. 29, И. 1 с. 64-69.

4. Паносян А. Г., Джинанян К. О. Габриелян Э. С. Активация биосинтез зйгазаноидов - адаптационная реакция при окислительном стрессе. - Актуальные вопросы патогенеза, диагностики и лечения комбинированных радиационных поражений. Обнинск, АН СССР. 1989. с. 46-50.

5. Паносян А. Г. Джинанян ICO. Гевондян К. В. Вартанян Г.С. Габриэлян Э. С. - Активация метаболизма арахидоновой кислоты - защитная реакция организма на действие ионизирующего излучения. Тезисы, доклзкы, Всесоюзного симпозиума по биохими липидов. 1 Алма-Ата, 1987, с. 142.

6. Паносян А. Г. Джинанян К. О. Габриелян Э. С. -Биосинтез Зйкозаноидов при облучении и их влияние на радиочувствительность организма. Тезисы IV-ой Всесоюзной конференций "Синтез и иследование прос-тагландинов" Минск, 1989, с. 93.

7. Паносян А. Г., Джинанян К. О., Григорян Г. X , Мхитарян Г. С., Габриелян Э. С. - Уровень лейкотриенов В и С всыворотке крови крыс при термическом ожоге, рентгеновском облучении и КРТП. Радиобиология, 1990, т. 30, (3), с. 364-368.

Tuja %\oO

Отпечатано на ротапринтном участке ЦНИОН АН Армения Адрес: Ереван-I, ул.Абовяна,15.