Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антигенов аденовирусов и разработка иммуноферментной диагностики аденовирусных инфекций сельскохозяйственных животных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антигенов аденовирусов и разработка иммуноферментной диагностики аденовирусных инфекций сельскохозяйственных животных"

Ешязетм ашшези сшаюювшЗсгпшвш: Í-sk

m сгжсгайоэ^отззшоЗ юти э.тогкя

На првоаг руаезпгп

ОЕ5СШШ1 гщсш ШСТСРОША

ПЗШШЗ ШШТНОЗ АЯШ0ЕЯР7С03 П PASPAS OÏÎÎA Г.гПЕОТ.т.ШШО'Л

дпаггосшот щжсшршйа иизящя сашзшсзя*х1ш2шнх штйжш.

Спггдзяыжггь 03.CO.33 - бзотэжпзяогаз

iB^ejKj^aptr? ^-ог^ргптл гш свгсзмшо зтгггоЗ стгжсЕа ttr.-wv.vra (trxmtsrmseras карт

tierna - 1Г31 г.

Рсбота вшюявапз s

ЕО ВСОООЗШОИ 1КГ1®>-ЕССЛЗДСШтеДЬСКШ ШйЯЕ5УТй COBbOJÍOXOSllñCÍEOEsIKÍ бК&1-а2ВОЯО!ГШ ВУЗШЗЦ Еаг«гаД ргководшгсяьг шюЕ-го*дасвсадзш? ßÄCSaaü, msci-aeecp, доггер бааглгочссяза авук ï.K.îiaosan:^) ífcjwC поизулыгегам кахдедакг 0йОйэпкзс:аз: cajú и.П.Г^^ш»

с£зс?зшю сзвсоэюш

Лаг,гор ба>загкч«ОЕГ2 пау» Еемякки и.Ф.

tac.гжлоогш ее«»; ' Карлова 0.В.

y-íps^osraí ЕИЗВ кк.Я.Р.Ковалснко

Ш^агз cwîv-гоа я "___1С31 г. о__пасов

гз си{<х5»гаглг.ва»1»го ессготад 020.4CPIQF: D23S

cd.','' (127253, !.'зсгта,

".t. Lv.ouviiiuit ¿игр::,'.",;,

<:тл: Ozoíossiíxsvux B!J2WJl,

¿хщ-t ргсоькш " "______ 1 C-ííi r.

Гг-;1.1г:Г: сокрггчзрь

CCSOSß,

пандах йхйоютвюж ваг»*.

ОБЩАЯ ХАРАКХЕРКСЕЗИ РАЕОЗИ.

АЕгуглтлосп» проблока. '

В условиях промшалэнного содэрзания кявотшх зхшзоотачаскиэ велика ваболеваниЭ, вызываемые аденовирусной япфэюдиой, наносят большой вконшвгеэскиг ущерб. Адзноинфекцня особенно тягзло поражает молодняк с оттоготе2 рвспирзторао-йвяэчзш: заболэзанкй и оолоепязтся птЬричвши бактериальными гоафзкцшоа. В связи с в там, дарвостэпэняов значевиз приобретает углублзкзэ представления о патогенной ролл аденоЕпруссв, разработка Енсокочузствлтэльшх сиспрэсс-г.:о тодэв даагЕостккп и спвцп&гчдсплх сртдстз яроТалактакя. Современное нацразлонав пммугоой бзотохпологаа прэдшлагавт ооЕэртзнстЕозгшиэ дааглостичостш; прэппрзтоз, es создашэ на сспоеэ очгг,энных адбповнруснга автагоноз евк шобгодавй атсп, бхлотпэт п:~йт.ологстсcirjíl я фягаяо-хптесплЗ шалпз эдоноваруспшс болтав, изучоншэ пх ентагошоЯ структура.

Напбодор ппроко проешшкыа в taccosca дкагноотако вэрпант состоит в шявлзпзз антптол спецг-С'ппо: пзруссшу аятагону, етлойишвозятсглу на тввргоЗ фзоэ ( всэго полистирол), п

дотэтаия ешжрэл за «это? зксортдаЗ рзекцга с кэтешнка фзрглзятсм шивтолскя проит Егдувотеобулагоэ гада, у которого проводят дзапюстаку. ' Гагсэ протарзта . изчгшпа ентлтэл ( шп жмуЕоффкзгаяуз гссзькгата ) является втсрги после кзруся»го антигена клзпагглм кекпозэшш ПМ-дяагаостшс^гоз. Уйпгорсвяьшоть врг^зээягя ' ¡srnsrcoEits гг2*уЕсфзр:зн5шх ксяеьзгптоз для лзпгн&отшш разлггшх Есйхапошшх бэяэггай соо7гетс?зуг?.ого щда rrrr.ctror-o п одашо! гостекщпяшгьтаго ■ жг-суштета впгпнтолыго сблзгегзт задач? нзезтгбЕсго производства сшцафгчэсжя: рэагаков.

Дэльэ пастогг,зй работа яишось rosjprema шггпгопоп ccwcnirpjcca, iss sópsxtT9irarrnita ■ я разработка адпюфзрьяптпш: тзст-спстз?! дм дяпгепстекя адапсгшрусшзз: заболеваний.

В Рабата гтостегжзш слщтгнпо палата: 1. Отрйботать -у слоем ездэязния и очистки ссцоЕншг структуртшх егл;сз гдзпогзруеоз о^дуггзг сорог ахов: гоксст адаловяруса такосэгса (Ай5), гзг.сооз адокопзруса птиц. ( EDST6 ), гшссопа

аденовируса собак ( CAVI ); отростков пептона аденовирусов чзловека подгруппы "С"; кашидшх белков аденовируса EDS76.

2. Методами олекгрофоратаческого н имауноферментного анализа охарактеризовать получаняыв препараты.

3. Разработать уни&щированну» технологии получения ипдуношроксвдазгйс: кошстатав для использования в 1Ш:

3.1. Стандартизировать условия вздчлешхя и очис.йК с^муноглобу лилов класса G от разлагшшс вадов илвкоштаицш и лпщ.

3.2. Синтезировать азщрсорбвжш , разработать и/Хбэктншуи -ыотодяку и получить сз^эдноочцдешше препарата »адашздошх (штл-IgG) антител.

3.3. Синчовировйть серкэ слтавпдоЕыа ( анта-IgG ) ь~:унопероксядазньк коньэгатое и отработать уело вал т. ездбялизгидав в раст-уорц п суспензгш с сограпашюы шстиьнэста в 53чошш нескольких лет.

4. разработать' метод ^¡..¡уно$зр;:ы1гаого опрэдолашш шлется к гоксоау CAVI дум диагностик ввфзкцшпиого гепатита шютоядшгх.

Пзучаоэ с црагл^чьсиоо взэтга^а работа.

Шиг.оша 1юзка£шс-тъ ей^ктивеого пршонешя для шдалояал п Оннсиа: структуры:-.:?. балков адововдрусов шшх гплрсАоШ.'Ш^ сорбентов Бутил- i: БмсгЮгШЗ í ИБл, Ш СССР ).

lie ' озкоьо усовордекстЕоиалиг ызтодов гаарофобаод %г iaíioaocji.'viwoü зрждоогрзфШ ош;ошг осиопыэ аггаз^па (давдсгрусод чолоеэко в иеотхш. ( гексои адгшоЕнрусов собе:; CAVI» чгловзка .'.dS, ш'лц EDS76, отростки гсиашоз едзшшгрусов чодоазка .Vil, Aó2, А (15, Айб ), и провадеиа aop^vass ;:йржтсриотш;а o;.:i3íxi;o-.ui:,:.i-:sc;ar¿ к ан-дсонвых сеоНотй оолучогагах яр-эпарагов.

Штодеиг oíoui'ptx/opjaa к Едауиобйо-ййП'а охарктер.юовгш бойазшй соотаа кавща адекошрусов пхащ cepoauno Ш7Г6. Иаучана сйгдшпмосп. гяоюрсёорздэтосвоП хгодшизосяг гокскш, вашоиоягсв шатена к структурного содки 401í от оброботш г- доватурарукща

УСЛОВИЯХ.

Гааработшт и i-кодроаа в производство уш^здгровашая EuijaozonxH подучош;л ашшздошх мадждароксэдашпс кашзгатов душ оцрздолошш к^нсгйобуяшзш класса G шюкотютаадах с птиц.

Научно-техшпеская документация утверадена ГУВ Госагропромз СССР от 12.04.90.

На основе препарата высокоочищенвого гексона CAVI разработан дамувоферментннЯ мэтод определений антител к вирусу инфекционного гепатита плотоядных.

Апрсбацая ребога.

Результата работы долошны на мзалабораторшх кояфэрзнциях п копфэренцкн молодых ученых ВНИИ СБ (1988, 1989), Республиканской научно-практической конференции "Современные катода даагностякл таруешх н бактериальных инфекций" (Алувта, 1990),

Структура я объец дзссортацгщ.

Диссертация изложена на 1Б2 стр. мапшвотисного текста я пслэтает 21 рисунок, 7 таблиц, 154 бзгбдкогрзфэтосгаэ ссылки. Работа состоит тгз введения, обзора литература, глав результатов собствошшх исследований к обсуждения результатов.

тшжлыти шхлтшгй

1. ctamta п спаязэ mRSsxs&ümxsi ашагашз адзнеетрусоэ.

1.1. Очистка гоксона аданозт^русов Ай5 и EDS76 с использованием ношх гвдрофобшк сорбэятов.

Метода тд^лэтт и очястая осношого ашгагона и гслмупогопз аденовирусов - гоксона шз Ег^шдарованшх шиз тон прэдусаатрававт применение аияопообйзнпоЗ хро^атогроГгк в качества клшевого зтапа процедура. Использование гидрофобной аромотогрвфш из предварительно« этапа позволяет значительно сократить и упростить гатодшсу вдделошш, шбэготь процедур концентрирования и обэссояЕшшш, гоэнсить шкод делового продукта» а такгя концетрзровать гогсссш - одекощрусов млааоготаадпх нз больштп объемов культур эдыхсЗ гэдкостя (20 - 50 объеиэп колонки) прт одоагрзмэхгпсм оуг,э<ггсзшюа сбогс?,оши таксонов я осаосоздмшд от щзпкзсшя 6SJ2C03. Поскоякк7 ЙЛЩ2Я гексовсш при такой хро»зтагрз£ст достигоэгся розбавлзшшмя слабощэлсяпши буферными расторгая, олэзта боз допололгалтай обработает прзгодш для

Рис. 1. ЭJiaKTprecipeтчоскиЯ анализ фракций хроматогра<1мчеакой очистки гекеонов AOS (д> a EDS76 (Б).

j J---Т_3--1

4- -.+ - + -+-

It ' p S3

т

L f <г— т

1 <• « W

> a

T~

■К, *b-

...У......j

\ " t

n-rfi

1

Г€Н

u

"L.

A - едемрсфрегряша хроматографа reitcoua AdS на Бутап-ШС: 1-пасорсЗирйвштя фракция; г-фракция культурадызой издкостп до хро&ш$отр£фзк; З-шаша- fO мЫ ГОГСО^ рН 0,0; 4-wsoa* 10 Ш lC^COg р1Г 9,6 с пзолроаанола.

Б - олоктрсфорегрЕмгла хроматографа® гексона EDS7S на Вутд-ШС : 1- фракция олантоисной гядкосш до хроштографид;- 2- та so фрисцня посла подклслшшя до рН 4,0; 3- вдюат 10 ¡¿Д ацетатом калия рН 4- елшг !0 им КНСОд рН 8,0 о 102 нзоирошнола.

Обработка образцов: - кипячение в диссоциирующем буфере

Лш,-мй1, трок -шпуОэдш в зои ss буфера при 20°С. Стрелки

укаштште us шнюкзниа «он иоиойэров <И) л -грвшроа <f) гвксоа&.

" госледупаеЯ внионообменной хроматографии. В своей работа мы расширили рамки применения того же подхода за счет его распространения на очистку гексонов -¡аденовирусов птиц, выделяемых на алантоисной евдкости зараженных эмбрионов, я применения более удобных, хестких гидрофобных сорбентов, в том числе новых синтезированных сорбентов Бутил- и Бензил-ШС (ИБХ, АН СССР) Сравнение сорбвдонных свойств 6 видов носителей для гидрофобной хроматографии Butyl-Toyopearl, Phenyl-Toyopearl, Phenyl-Sepharoae, Octyl-SepharoBe, Бутил-МПС, Вензил-ШС проводили на примере гексона аденовируса человека (А65). Для вдентиЗикации гексонового ентягена в присутствии избытка примесных белков использовали шдаХицированшй "штос-минус" вариант электрофореза Laemll, при котором в 'Тшос"-треках (инкубация при 100°С - 5 кмн.) гексон появляется в виде зоны монокерного полипептада, а в "шпгу с "-треках (инкубация при 20°С - б ) - в виде серии зон натнвного трямэра с шньвей злехтрофоретической подппгяосты). Результата опыта обнаружили сходство картин разделения па блщюфобннх сорбентах, что свидетельствовало о сходной избирательности данных сорбентов й условиях выбранной схеш гидрофобной хроматограф® ( рИ-завкснмоя алэдяя ). .

Цродвмонстрировав прппцишальнуэ возможность очистки гексона шз Бутал- а Бэнвил-ШС, ш провали прспаратпвинй опыт по концентрированна н очистке гексона AdS вз хультуральной падкости путем гидрофобной хроштографш на Бутнл-ШС. В процессе- очпсткп гвкссношй ентиген, в прпсутствж! избытка нрзмесшх белков, пдентхфщзровзлл, используя модкфпрфованшй вариант электрофореза Laesali. В стате било достигнуто 20-кратлоэ обогащение гексона <табл.1) при црактачаскя полном внходе я одновременном газшузнтрпровагп'л в 10 раз. К недостатка данного разделения могяо отнести дробнуп элявпз гоксопл (рас. 1а) в 2 разлячпнх фракциях (рП 8,0 л рН 9,6), однако шдафяхацш схет злгадот (шшпошто 103 ЕЕопропаиола) позволила устранить это шудобство на .примере отосткп галсояа одэвоплруса птиц ED576 па том es сорбонте.

Для очпстхп гексона asoHonsspyca птиц EBS75 бнлп етдпфшщрозшш условия салзктшшоета гидрофобной хроматографии, поскольку оказалось, что а услотшх сорбщга гексонов аденовирусов

Таблица 1. Очистка гсксснов адэношрусов на колонке с БуталЧШО.

Шкфр фракции Эдаэнт Скорость ши 1111/4 ООЬШ.1 ш Количество бол¡ш ^280 Шишчао гексода

Ас15- псходная культур, шдаооть - - 200 40о +

Ас15~0 В: БОмМ ацетат калия рН 5,6 650 220 345 -

1(15-1 С: 1СШ ацетат калия рН 6,8 1С0 ББ Б,б -

ЛсШ-2 В: 10гй1 КНСО- ря 8,0 * 1С0 25 15 ++

Ш5-3 Б: 10мМ клх\ рН 9,6 ' 13 бй пзоцропаасла 100 30 4,5 +

ЕШ76 неходкая агаятовс. - - 130 370

ЕШ-0 В: 1 (>¿1 ацетат калия рЕ Б»Б 300 140 325 -

Е£В-1 0: 10иМ КНСОд ш а,о 10.; иаогфопщкнш 100 . 15 20 -н-

1Ж-2 И; 11,С0о & о рН 9,6 10^ пзопропшола 100 28 2,2

шюкопптвэдта рН 6,0 - в,Б на Phenyl -В ор.Чаго в о reitcon EDST6 по вздергивается па гидрофобном сорбенте. Путам подбора условий сорбщш.провэдэпного бэтч-ттолом, было выяснено, что гоксоп EDS7G !,;оЕэт быть избирательно сорбирован пз более кислых растворов (рН 4

5), прзчем всэ указанные вше гидрофобные сорбенты выявляют близкую ззбирательпость з отношении гексона EDS75 по дашпш элэктрофоротпчоского анализа. С помощью колпчествеппого титрования онтвгешоЯ активности гексоза EDS76 в элвзтах при такой очистка т сравнили оффоктивнув емкость сорбентов в условиях избытка белков. Оказалось, что максимальной емкостью обладал Бутил-МПС, а егжость Butyl-Toyopearl и Беязил-ШО была в 1,Б - 2 раза нияа.

Для препаративной 'очистки гоксоса EDS76 па Вутял-МПО гл ПрЕКЭШЛИ ту г,:о колонку я схему хромзтогргфяп с соотвотствукзщиз изменениями. В этсм опыте гоксоп полностью сорбировался па Вутид-ШЗ п полностью элгаровался в составе одной фракции (рте. 13). В той та фракция полностью визировался другой ептпгон EBS7S, пмэе^яй даагностзчоскоэ спачопяо - гомагглитшшн. Кратность очистки штагопов составила, по депним титрования s и^/ТЕофэрнэнтном ешышвв около 20 раз. Аналопгпшв результата получеш в ряде повторных • хралатогрофзй по тсЯ т схема, где за счет снетзтшя скорости зрсиатогрсфга па этапа алвцги дополшггвльпо достигнуто 4-кратноо ковдептрзровашм объема Фракщш гоксопа п генагглптяшша EDS7G при ссграпэшгл 20-1фатпого обогащения (табл.1).

Таккм сСразом. прзгзпэнпо гящрофобпоа зроматогргфга на Бутвя-шс шзасяпат быстро (в пределах. часов) ютнцентрзрошть п сусоствешю сбогспзть roitcosu адеповзрусоп птиц,и млвкопятохкда кз различных ясточшиов. 5,'этодака котт бнть лэпго масятабироваяп sa счет шгкэненяя колонок большего дис?:этря, что доловт оо пэрспзктшюЯ в отеосйяял пэрзой стадах очистка диагностических антигенов человека я гггеоттгх при производстве кешюпаптов этагпостппуков.

1.5. Очястуз гексода аденовируса собак CAVI л его пэрвпчппя жорактзрясгажа.

Для очистка гоксопа г.и ждагЕяцзроваяи условия деустадпйпого

Ряс.2. ЯЙЙЗЙЧЗГРАЬШ ЭТАПОВ НЧШТОГРА«ИЧ2КЖОа ОЧЕСТКИ ГЕ&США CAV1 ЕЗ IQfAbïiTiAbïïOÎ ЖИДКОСТИ.

ашхриховдн шк шгшчно очщшшго гассонд.

в - шюдаошзшАЯ хрш&шгшдя ч&сетш очщшеого гексона

в лгшйиом тдашв Lid ад ш;о q.

ашш&оади плГ очздзшого гишаад.

хроматографического метода (piic.2). Культуральную пгщкость (рК 5,0), содераавшуп растворимый гексон, наносила па колонку Butyl-Toyopearl 6600, уравновепенную ацетапп,-?! буфором рН 5,0. Колонку промывала ацетатным буфером (рн 5,8) и влшровали частично очлг.еягшП гексон caví ивтатшидазол-HCl буфером (рН 8,0), содержащим 10% изопропанола. Полученный элват без обработки наносили на колонку анионообмонника мопод ввю/ю, уравновешенную трпс-HCi буфером (рН 7,8), промывали колонку и элетровапп белки слогшым градпенгом концентрации L1C1 на том га буфере с помощью системы PPLC ("Pharraaoia", Швеция). ЭлектрофоротаческпЯ анализ гексона в "плвс-шшус" модификации методики Laocmil позволял идентифицировать гексон п белковой evoси и оценивать его содержание во фракциях в процессе очистки (рпс.З). Прл таком анализе гексон CAV1 выявляется в "плюс"- троке (прогревание прл 100°С) в вздэ олектрофоретической оопн денатурированного îюно!,гарного полппептяда, а в "минус"- треке (без прогревания) в гада набора зон патавпих трнкердах молекул, что свпдзтольствует о стабильности структур! гоксопп CAY1в присутствии лодецпшеульфзта при комнатной тешерзтурэ. Ойкая кратность счлсткп гексона ca?i в папш опнти составила 400-500 раз, а полученное препарата гексона были гомогепнн я сохраняли сятаиншш сссЗсйза.

Для оцешея молэхулярной масса гексона СА71 m проведя элоктрофорэтачсскиз апаяшэ ого иопомэрпоа форкн. Поскольку известно, что для гоксоеоешс пояатаптцдов адэповпрусов зашсииость электрофоре ттшосг.сй шщгопостп от кошку лярноЗ мое ci i носит впсклвдьшЯ хврзктор, для ошшза Сила исгользовгш/шк вогоясапогао полеяоггпш о пзсостпоЯ sa дшпшх секшяироввшш первичной' структуроз, ток и ряд гексонов аденовирусов о известпоЯ псслэдователыгостьп. По лапше! олэктрофорйипеского анализа в ПАЛГ-ДСН ijoiïcvopaon поляпептллшя цопь гексона caví ядзцтачиа по олзхтроГорзтяпсс/МП подаетпостп гоксоповому шлшгоптаду сауэ, я^тону иол. г",ооу 1СЗ кДа по данным соквештроваштл.

Результата егшлкза онтзгогашх свойств гексона CAVI • методом ía~íyEo6íor¿Tira псхгяплп, что полгяслональшэ н дапоклонвлышо антатвлз с nepoîcpe сизой спвцвфтаюсть» против гоксспоз адонокфусоп взатагадвйствует о патавлоЯ тржэрпоЯ форг;оЯ гексона

Fas.' 3» Электрофоретическяй анализ очистки гексоне CAV1 в ПААГ-ДСН ( 10ST;0,6XC >. Окрашивание белков в геле сервером.

КаадД! образец вносился в гель после прогревания при 100°С ("+" трек) ; после шкубации при 20°С ("-" трек). Облаоть воа триыарню. гексонов обозначена ГЕКС3, зона иономерного гексонового полшвшада - ГЕК01. Обозначение пер образцов: К2 - культуральная издаооть клеток, еорааэнша варуоом CAV1; ВТ-0 - фракция, на сорбированная на Butyl-Foyopearl; ВТ-1 - алюаг

частично очещэиного гвксона с Butyl-Toyopearl; Q-0 - «фракция, носорбированная на Нсяю Q; Q-1 - пик очищенного гвксона CAV-1 с колошоа Попо

GAV1 и не реагируют с мономерным полттептидом. Полученные данные свидетельствуют о том, что в структуре гексона CAV1 родоспецифяческая детерминанта-а (выявляемая П0ликл0н8льяыми антителами) н ее конкретный эпитоп (выявляемый моноклональным антителом) присутствуют только в нативной (тримерной) форме бежа и, следовательно, имеют конформационную природу.

1.3. щ& по определению антител к гексову, аденовируса собак CAVI.

Гексон является основным структурным белком и главным антигенным psактантом аденовирусов, содержащим большое количество и широкий диапазон антигенных детерминант. Эти фактор! предполагают нммуноаяалив на гексоновый антиген и антитела против него в качестве основного средства диагностики аденовирусной инфекции. Нами разработана иммуноферментная тест-система для определения антител к аденовирусу собак 1 свротипа (CAV1), вызыващего инфекционный гепатит плотоядных (лис, песцов, собак). Для создания тест-системы были использованы высокоочшенный препарат гэксона СА71 п синтезированные на основе" аффяяно очщенных антител антивидовые гоялуношроксвдазпыз кгашзгаты, что повышает чувствительность" растеыы а позволяет на порядок снизить потребность в используемом антигене при проведения анализа. При разработке твердофазного ИФА на подистарольшх плашэтах учитывали нншшндуальпое свойство таксонов аденовирусов к максимальной сорбции в щелочных растворах, Предварительно, в системе с пэрзкрэстно- реагнруиЕзй гатарологичпой ентаенвороткой была определзпз сонснбплззпрупзая доза гексопа CAVI - 2,5 нкгЛи. По результатом ясслэдсванзй чувствительность метода для детегарзх антител прстга адопосируса собак 1 caponara была достаточной для их обяаругоипя у гявотшп в рэзудьтата окспорпнзнталыюго л остасгвешого заражения. В сэрлп опытов по вкспарямэнтэлыюлу зорзаэпия собак разработанный цотод 1Щ позвалло? определять антитела к вирусу на 7 день поело зарагопня л шязляот сороконвэрсг®, а у значительной дола естественно зорагэнгагх квотных, проявлтщзх клиничоекза сямптеш заболевания, в сыворотках кровя соддрзатся ояллгола против антигенов оа?1 и олуз. Параллелизм татров антител против даух саротагов аденовирусов

собак в индивидуальных сыворотках предполагает либо близкое антигенное сходство ые&ду гексоыани •СА71 я сжУ2, либо преобладание у всех животных инфекции 1 серотипа.

Отросток пептона аденовирусов является вторим антигеном, Ездуцирузодим • сиптез влрус-нейтрализуицщ шть'тел 2 обдадаищш гоиагглзоткзшрукдши свойствами. Для очистки отростаов пентоаов аденовирусов человека подгруппы "С" соротшюв Ас11, Хй2, Ай5, ¿йэ ци применяли последовательное сочетание гидрофобной и шшонообшнной хроматографии. По данным олоктрофоретичекого анализа в "шхче-ьпшуе"' кодафгкашш методика 1лоил11 алщоя основных вирусных белков (гексона с отростка пептона) в условиях гидрофобной хроматографа! достигается слабо щелочными буферными растворами {рН 7,6-9,6) в то врет, как па этапо авпоноосненной хроыатографан отросток пептона олзшруется при рН 8,0 исходные буфером, а гексоа н примесные белзеи десорбнрутеся с увеличение« конной силы влшнта. При идонтЕфжедип в ПАЛГ-ДСН ыономэрной и нативной фарш г.-гроеясов пептонов показана устойчивость одигомерной фор,и сгростков к ДСН при комнатной тешэратурз (рис. 4а). По результатам блот-ш^гунофораентного анализа в сочетании с "плос-минус" кодафакацпой ол&ктрофорзза антигенная активность в реакции с цовоклонапышми антителам к отроспу А65 обнаруживается в электрофоретическнх вонах олигоыораой (но' но ыономераой) фор;,ш отростков Ай1, А62, Ас15, Айб (рас.46), что свидетельствует о ковфорыадионноА природа выявляемой антигенной детерминанта ( ее конкретного яштопа) в отростках аденовирусов подгруппы "С".

По данным злектрофоретпчзского анализа "шззс-шнус" модификации, термодепятураццд в ДСН праводат к диссоциации нативша ( олзхгомориш: ) форм отростков и гексодов на составдящие их субьеданпш С швошра ), но в отличие от гексона ( по результатам игдыуиоблстшга ) - частичная антигенная активность отростка Ай5 в цономерной форыо сохраняется. При изшпзшш температуры обработки оорааца ( ог 20°С до ¡С0°С ) ваиатгюо количественное увеличение ыоно<лерноА ©оран отростка в условиях дассоцаацпп сопровождается сохранением равномерной шпигенБой акгишостп.

Рло. Ь . Бло?-:™" г/тю-Тор'/оптаиЯ ядшпз спощфппоотп гдкгаялональшх аптптол, полученных к отростку поптопо Айб.

А<11 АЙВ Ай2 Айб А05-Г

"\ „ § ^ @ I — ™3

« Г— ГЕ1СС1

-* — еэ — ГЗ

Ай1 А&5 Ш Айб Айб-Г

I-1-1-1-1-1

ПЕКГз | - ( I ^ р, «— гакс3

ГЕКС1

ПЕНТ^

Элзктрофораа прэпаратов очищенных отростков пептона Ай1, АйБ, А(13, Айб част.очищен) з очицанпого гексона А65-Г проводили в "плзхяяшуо" варианте 1ШГ-ДСН (122Т; О.бЗЮ). Зона трззлера отростков обозначена - ГШНГ3; зона моноиэра отростков - ПЕНГ,; вопо трзмара таксона обооначена - ГЕКСд, 80на вдпомэра гексона -ГЕЕС1.

А-окршшввниэ суммарных болков в голо сэребром /олоктрофораграша/ Б пмллюрэплака Сэлков посла пораноса из галя на НС-фнльтр в реакции о ионоклошшашма антителами к отростку пентона Ай5.

1 .Б. Анализ структурных белков аденовируса птиц BDS76.

Поскольку вирус EDS-76 сильно отличается от группы типичных аденовирусов птиц по биологическим и иммунологическим свойствам, несомненный интерес представляет Вопрос о локализации и свойствах структурных белков вируса . Для изучения этого вопроса нами были выделены вирионн EDS-76 ультрацентрифутированием в градиенте плотности хлористого цезия ( р» 1,32 g/ml ) и проведен анализ структурных белков методом электрофореза в ПААГ-ДСН в "плюс-минус" модификации методики Laemmli. В составе вириона было выявлено 6 полипептидов в диапазоне 100-20 кДа. Для подробного изучения елвктрофоретических свойств структурных белков EDS76 - гексона, компонентов гонтона, внутреннего белка 40К использовали 4 варианта лизирупцего буфера Laenmli, меняя состав дополнительных диссоциирующих агентов. Результаты наша исследований показали (рис.5), что гексон EDS76, как и гексоны других аденовирусов, изменяет свою электрофоретическую подвижность в зависимости от температурной обработки проб. В случае обработки при 100°С наблюдается зона денатурированных мономерннх полшептндов (мол. масса около 100 кДа), а при мягком воздействии bds без кипячения наблюдается зона с замедленной подвижностью, содержащая трамерные (нэгаишэ ) молекулы гексона. Гексон внрионов EDS76, характеризуется устойчивостью к ДСН при комнатной температуре с сохранением натшшой структуры. • Кроме гексона, прн подобных обработках свою электрофоретическую подвйшость изменяют обе белковые зоны в диапазоне молекулярных масс 65-70 кДа, соответствуйте отростку и основанию понтона этого вируса, а тагам зона внутреннего белка внрконов EDS76 4QK, который поело кипяченая внрионов мигрирует как паяппептадаая цепь с молекулярной массой 40 кДа, а боз кипячения - как зона с подвижностью, соответствующий 1,:олокулярпой массе еокДаЛо аналогии с гексошм и гемагглютшшном (пентоногд) £Ш?б, ддл которых установлена прямыми оштамп н постулирована олигомэрноя структура, мокло полагать, что п внутренний белок 4СК способен к образовать олягомаров, устойчивых к SD3 прз низких температурах и миграрущах в области 60К, так как обнаруженная степень олигомзркзавдш (ила изменения коафорлащш) балка 40IC в цялщх условиях при обработке sos без прогревания

Рис.5 • Устойчивость трлмэрныт гексонов и олигомерных форм

экоторых структурных белков EDS76-K денатурации ДСН при 20 С.

+ + + + +■ А

+ + + +

да

UKBA 100°С

ГЕ^

120К

ГЕК03 ГЕКО,

40К,

1

»« от CJ

"I—г—I—-—I

да

UREA 100°0

+ - 1+ - '+ -14-

яа га г* 3 Ü

у О ш

®> «» О ЕЭ сэ т е®

-120К

-ГЕК03 -ГЕКС,

!<—«ж.

-ГШ.

А - Злэктрофоре грамма разделения в ПААГ-ДСН (8-16ÄT;0,6$0) э чищенного гексона (1), част.очзщ.гэмагглютишша (3), белка 4OK (3-4)г очшц.нирионов ECS76 <5-6). Окраска серебром.

_Б_^ Элэктрофореграмыа ревдэления в ПААГ-ДСН (12%Т;0,БЖ0)

зтруктурных белков очищенных вирзонов EDS76 в условиях шдифинации зостава лизврущего буфера Лемшш. Окраска серебром. ГЕКС^- денатурированный мошшерашЯ гексон; ГЕКС3~

ештившй тршершя гексш

icat1— цономер белка 4Ш; 4Шг- дпмер; 12GK - олитомэр белка 40К; га^- натинныа гемагглвтишн; Ш^- денатурированный геыагглютшшн

еависит от присутствия добавочных дшссоциирувэах агентов (датиотрейтол, мочевина). Ксклвчеше последних приводит к переходу части белкового материала из зонн 6Ш в зону 12QK.

По данным иммуноблотинга, при сравнении электрофоротячеекюс зон структурных белков eds-76, реагирующих с антителаш (т.е. антигенных и шмуногеншх), с суммарным окрашиванием тех гл белков в 1ШГ-ДСН выявляется преимущественная реакция наружных капсидних компонентов - гексона и компонентов пентона (геиагглвтишша). Внутренние белга с меньшими колекул»фташ массами (вклотая 4ШС) окрашваотся поликлоналышми антителами непропорционально слабео, по сравнению с их окрашиванием серэброи, что свидетельствует об их ослабленной кммувогенности.

Сравнение реакции с антитела1« различных алектрофорвтпчвских форл гексояа, понтона и болка 4СЖ выявляет слодуюдз закономерности. Тра.:ор гексона реагирует с штителемп наглого интенсивнее соотвзтствущего мономера, что коррелирует с данниш о конформаццошой (а т линейной) природе большинства епитопов в гексоно. Антитела к коыпозент&ч пэятона выявляет обе его форш (моыомаршз пэллпагггкдц и олигокер) с врзморао одинаковой интенсивность», что согласуется с линейной природой большинства онитопов в структуре пентова . Всо трз Форш белка 40К одшшково реагирует с аититодама, что предполагает линейный' характер большинства антигенных впатопов в его составе.

2, ПшГ-£ЩфоЕаш8в тохеожопш подучекзя шпивкдосах (икк-Зф») кязгвшорскаядашах коаъогггбз.

В связи с боладш спзкчром сельскохозяйственных к лабораторных хашоишх, у которых трзбуотся определение антител против одигошрусншс ентсгошв, а такгл антигенов других' груш варусоз, одкой so юостовдошах зедач лвдялась разработка уккфащровашгаа тохиологиа получения вмаунсфрйэнтйых (в дашноа случае 1а;гдаодарокс11даз1шт.) коаьюгатов для дотокщш тгуноглобулинов наиболее распространенного класса G.

11аз впрлант такой тезтояогш вклхчает известные принципа шдолзшя 1'sO из сыворотки крош швогшх, получения ентнЕпдоетх ( taira-IgG } штгая, ш: -¡sssyao&Wsmpa очистку и ковалентноо

связывание с окисленными нериодато« углеводными грушами маркерного фермента - пероксидазы.

Наряду с этим, особенности ' разработанной технологии заключаются в следующем: с помощью преципитации, анионсюСмегаюй и катионообменной хроматографии определены и стандартизированы условия ввделения гомогенных препаратов от 12 видов

млекопитающих. Аналогичные условия подобраны для выделения 1в0 курицы из селтка яиц. В обоих вариантах выделение занимает один день. Разработана модифицированная методика аффинной очистки антивидовых (анти-З^а). антител с максимальным выходом на колонках о ишуно сорбентами иммобилизованными на Тоуореаг1 Ш?65), в

том числе способ выделения антивидовых антител из гелтка яиц гаперимунизированных кур. Отработаны условия стабилизации синтезированных иммунопероксидазннх конъюгатов в растворе ила суспензии для использования в лабораторных условиях и выпуска пммуноферментных диагностикуыов.

При получении всей серии антивздошх иммунопероксидазннх конъюгатов была использована единая схема (рис.6), вклотавдая 4 зтапа:

1) выделение п очистка иммуноглобулинов класса о;

2) синтез тмуносорбентов и получение антивидовых гипериммунных сыворток на основе очищенных

3) аффганое выделение внтивядовых антител ( анта - );

4) синтез ишунотроксидвзшх котсгатов, их очистка, стабилизация и хранение.

При этом, ряд модификаций и оптимизация методик на каядом этапе определяли эффективность п технологичность схеш.

Выделение иммуноглобулинов класса в из сывороток млекопитающих а гэлтка яиц курицы, предварительно обработанных хлороформом, про во доли осаздением сульфатом аммония до БО% от насыщения. Необходимая процедура диализа после осаздения сульфатом ашония бала заменена методически простим и быстрин обессоливанием на колонке с сефадексом С-25. Для оптимизации и ушфпсацнп метода выделения от разных видов гзтопшх на стадаи анионообменной хроматографии мы применяли один вид многократно используемого сорбента, одни над буфгра п определяли условия олюцил

PEO. 6

стаи ПОЛУЧЕНИЯ ашзшяжоещ ■ <д£гш~1£0> шаэтопЕРшецдшш ксгагтлгов для т.

CHBOPÛÏiîA { ШШ )

(îffi4)2S04

DEAE-ÏOÏOPEAHI ,, SP-ÏOYDPEàRL

Ш^ШШ IgG -:

czmmâmn.

ВгСИ-TOYOPEAHL

tmmocoPESS «-

ГЕШРЕ^ЭТШД CICOPOIM (ЕЕШК)

IgG-TOÏOPEAHL ОЛВДПЯ (СНдСООН)

ÄZ-ZdlSO 0МШИ£Ж ( mmi-lgß )

IEP0¡tCST4SA

DEAE-ïOYOPEâH,

oscsaaüíi шжссшаь

líalo,

0КШШШШ1 ШРОКСИДйВД

Г.ОНЪПГАЗ,*

I КаВНд

Еоссшгоагщпщ ЕС¿ESTAS'

(1Ш4)2Б04

О iÀ ICC/I'lü.'ii

ГЛИЦЕРИН

(№4)2S04 ИНЕРТНЫЙ ЕЕЯОК

салшшш ксшаяг (-во01« стиимш ияаюиг (+4°с>

шл5уноглобулипов класса в. Растворенную фракции наносила па колонку ДЕАЕ-Тоуорег1 650С, уравновешенную 0,02 М калий-фосфатши буфэрсм рН 8,0. Элвдин проводила ступэнчатга градиентом концентрации ПаС1 па том га буфере. Модифщировапный "плюс-минус" ввряант электрофореза ЬаеттИ в ПААГ-ДСН позволил одноврэыенно (в параллельных треках) идентифицировать в процессе очистки в

получении «фракциях полную кодэкулу иммуноглобулина й п оа структурнвд компоненты - тяяелув н легкую цепи. Иммуноглобулины класса й гомогенного состава элщруются 0,02 М калий-фосфатным буфером рН 8,0 бэз соли а 0,02 И калий-фосфатным бугром рН 8,0 о 0,06 ¡3 ¡ТаС1. . Згот вывод ш подтвердили для следущих влдов шгекошгаащзх: человек, кролик, собака, лошадь, овца, коза, морская свинка, норка, крыса, 1лшаь, крс, свинья.

Отработка и оптимизация условий ' выделения н очистки пялуноглобулинов класса в позволили сократить методику езпонообгетой хроматографии до одноступенчатой влюцпл. Шобходшгаз копцентрзрованиа очищенных препаратов 103 проводили кодЕфпрфорзннш одностадийным методом катионообменной хршотогра$аи па 8Р-Тоуореаг1, пспольэуя изменение рН и полной схш олвэнта. Концентрация в полученных препаратах оставляла 3-12 ЦгЛ'. л.

Препарата очидепши концентрированных использовала на этапа синтеза пммуносорбентов и получения гипериимунних антавидовых (антя-1са) сывороток. Активность ц специфичность антнвндоЕых антител определяла в непрямом ®А.

Для видэлеппл шсокоаф&тпых активных антивидовых антител па синтезированных игмуносорбентах , иммобилизованные па

ТоуореаП Ш765) ш .модифицировала методику вффшшой очистки, Езмэшт условия сорбция антител и применив новнЯ вид олштрувщэго раствора, теи сеа.ош рззко- оннзлв неспецифаявскае взаимодействия и повысив внход коночного продукта до 96й. По результатам ПФА, получонше вфХгашо очщошшэ антитела против 1$} 11 видов гзхеопшх, человека и курицц были высоко акишпы и сгоцкфзчнп (титр 1:4000 - 1:128000 в ША). В элшруокях фракциях концентрация антител составляла 1-Б мгЛля. Првдлоаешая шдафзкация аффзнпой громачографаи позволила непосредственно элват - очшценшо

внтиввдовыв антитела без дополнительной обработки использовать на финальном этапе синтеза иммуногорокскдазных-конъюгатов.

Эффективным методом синтеза иммуноферментных конъюгатов с использованием в качестве ферментной метки пероксвдазы является периодатный метод Nalcane в модификации Tljseen et all /1984/. Метод синтеза предполагает очистку перойсидазы на

анионообменнике, мягкое ее окисление пераодатом при нейтральном рН и реакцию конъюгирования при рН 9,6 с антителами без предварительного удаления периодата.' Эффективность конъюгирования данным методом составляет 95SS.

Сравнение чувствительности конъюгатов в USA, синтезируемых в различных условиях, и количества доз синтезированных конъюгатов, приходящихся на нг антител, показало что оптимальный вариант синтеза проходит при следухвдих условиях:- предпочтительнее больший объем конъюгируемой смеси ( концентрация IgG <2 мг/мл ) и время инкубации 16-20 часов. Активность и специфичность серии синтезированных конъюгатов определяли в ИМ. -Антивидовые иммунопероксидазные конъвгаты (анги-IgG) титровали на панели, сенсибилизированной очищенными IgG соответствующего вида гзгоогного, против которнх получен аятивадовой конъвгат, в в качестве отрицательного контроля использовали IgG того вида кивотного, из сыворотки которого выделена антиввдовые антитела. Синтезированные конъпгаты были • высоко активны (рабочий титр 1:4000 - 1:266000) и специфичны в ИФА. Основные характеристики синтезированных конъюгатов приведены в таблице г: количество антител ( «г ),используемых при конъюгации; работай титр и объем конъюгатов, количество полученных доз конъюгатов; еффэкгпввость синтеза (количество доз, приходящихся на ttr антител). Дозой конъюгата считали его количество, необходимое для црпготовлешя рабочего разведения при проведении исследований на одной 96-дуночноы планшете.

Результата исследования со пзучепшэ специфичности шшшндовыг конъюгатов в отношения IgG гетеролагнчшх видов ешеотнпх обдаругшвают перекрестно реагирукааэ дзюрешшт! в составе IgG кс ко торах вздов шашштшщах, что позволяет использовать

Ш1ТНБЗДОШв liOBbBTOTU ДЛЯ ОГфЭДеЛЭШШ ЁЕЖГеЛ (IgG) В CSISOpOTKSX

гайлгщэ Я. Осповнш дорзеторасгшш прсцосса синтеза кояъйгатсв.

Исяшпгат Кол-во д? ТИТр 0 КЭА Лоза V (О!) ' . кол-во Кол-во

(КЗ) прз воаъегата кохгшгата коньпгата ДОЗ доз пв

ЕШЬПГаЦ2Л ¿492 * °'9 (Ш£1) Еопъигата ( У/Лову) 1 ид Ач

1. чолспотса 14,4 изгосю 0,32 1.0 6260 432

2. ПУрТЩ! 7,3 ■ 1:16000 0,64 1.0 1687 220

О. ЯрОЛЯКЗ 9,1 1:32000 . 0,32 1.4 4375 481

4. соба.::л а,о 1:64СОО 0,16 1.0 62Б0 (042

0. «етакз 9,1 1:3£ОСО 0,32 2,0 62Б0 687

С. лопадя 10,1 1:128000 0,03 3,0 2Б000 247Б

7. крс 15,0 1:4000 2,5 2,0 еоо 63

0. коза 7,2 1:32 (ЮО 0,32 1.0 3030 421

0. оввд 6,0 1:32000 0,32 1,0 Ебгв оза

10. 17,0 1:2Б8000 0,04 2,0 60000 2941

11. 10,0 1:160Ш 0,64 1,4 2188 137

13. 13. мореной СЕПЖИ норгст с « *я шея») 8,0 С>,0 1:32000 1:16000 0,32 0,64 0,5 1,0 1Э6Э 1560 240 260

нескольких видов завотных. При разработке'. отдельных тест-систем применение двойной твдуногффядной . очистке на соответствующих сорбентах устраняет перекрестив взаимодействия.

Финальная стадия технологии получения кояъагатов вшшчает приготовление стабилизирующей формы конъвгага для хранения и использования. Для применения в лабораторных исследованиях п возможности выпуска диагностических .наборов нш.пг были проанализированы несколько вариантов стабилизации: 1) в 503 растворе глицерина, хранение прп -20°С; 2) в раствора, содэрсачэн равный объем насшцешого сульфата ашоння, ранение при 4°С; 3) для диагностических наборов - в го-кратнои разведении, стабилизированном равным объемом насвдзнного раствора ■ сульфата аммония, содержащем 20л. инертного балка ( бычьей сыворотки или яичного белка ), хранение при 4°С. По результате^! ИйА показано, что во всех формах стабилизации конъюгаты сохраняют активность в течении всего срока анализа. По стабильности ра^водешшэ суспензии конъюгатов ., храт&иа прп 4°С , полностью соответствует осталыш:: формам, а прп использовании в качестве шзртного кошононта для предотвращэння пзспацкфдческой агрегации и протеолпза бзлка-куриного яйца - чувствительность коаъзгага тшэ. По данные КМ, конъкгатк, стабилизированные глицораноу, сохраняют постоянную активность в точения 2-х лет. .

В результате • провзданных- исследований ' разработана унпфидаровашал технология а получена •. сэрпя шншидовах шалуногороксндазпых 1кзнъкгагов для ешпшэшзя е^даоглоОулшюв класса С 12 видов гксогпшс и чоловига.

. Днтивидоецэ конъгсгаты ешш использованы в данной работе для создания И1глутфэрцо1шш. систем'дэтекцаи сдэновирусшх антигенов п шшггаи.

1. Усовершенствован i-этод очистки основных антигенов аденовирусов человека и гпвотних. С помощью гидрофобной п анпонообмонной громатографни очещонн гоксош аденознрусов собак CAV1, птиц EDS76 п отростка пептонов аденовирусов человека Adl, Ad2, Ad5, Айв.

2. Показана стабильность тршдорпой фор,и отростка пептонов аденовирусов человека Adl, Ad2, Д05, Айб в присутствии додэцалсульфгата натряя. Ыоноклоналыше антитела (7Н2) к отростку ¿65 пдентгфщяруит втггоп, присутствующий в тримерных ( но не г!ояо!'.зрш1х) формах отростков Adl, Ad2, Ad5, Ad6.

3. Охарактеризовал белковый состав капсида•аденовируса птиц EDST6. Гексся и отросток иэнтсна вирпоков EDS76 сохраняют трикорнуо структуру в условиях электрофореза в ПАДГ-ДСН. Внутренний белок 40IC сб.чаруглн в куда но скольких структурных форм в зависимости от

услшй дэнатуравда.

4. /налип структурных форм гзксона аденовируса собак 1 сероиша показал, что гюнонар гвксопа CAVI по электрофорэтлчвской подезгхпсстл идентичен гексоновсму полипоптпду BAV3, нмэящецу !!ол.:.'.пссу 103 дПа по данным секвашрования. В составе гвксопа CAVI ролосппц;т.ф:!чос7^п дотврлянаята - сх (выявляемая полпклоналышш гитзтзле'й:) я so конкрэтша оштоп (вштляешЛ шяокдоналыш гшйиэ.лом) прюутстэупт только в патанной -(трылряой) форм Солка г. яксаг коифоргтациснпуа пряроду-.

Б. Рояработая ч апробвравйя a аебзргжрярз дояшэях п'лут?9р»мтз*й гетод определяйся яяввтл .и датррзу "гЗ-г-тгтташого гмттга гонж^лпух -с татдоого'эт?»« тссусгг^'Рюто reneona п.тапсглгрупаес^б.т:1 ¡ ессроетпа.

G. Рсорлботтзп s i" -»-шодрана га '-ррокзводство унпфодарованпая технология иолучюкш •.щтшнщовцг * тмуяошрокаадашшх коггьюгатоп дм оароделвтм глнэтол. класса iIgG • 12 зшдов солъскохоэяйстсогашх и лебораторанх гдтотшп. Научто-тохипчоскал документация утверждена ГУВ Госагропрс:.'л СССР от 12.a4.00 г.

Список работ, ^

опубликованных по гекз дассортацпп.

1. Верховская Л.В., Хилько С.Н., Уласов В Л!., Тнхоненко T.II. Очистка и свойства гексовдвого антигена аденовируса собак сэротппа CAVI.// Енохидая, 1990, Т.Б5 (11), стр. 1996-2002.

2. Иванов А.Е., Вэрховская Л.В., Хилъко С. И. Твэрдокаркасша пцрокопористне сорбенты для гидрофобной хроматографии белков.// Бпоорг.ХЕ.ШЯ, 1990, Т.16 (8), стр.1028-1039.

3. Трзтышова М.В., Вэлоуоова Р.В., Лобова Т.П., Вэрховская Л.В. Использовшшэ 1Ш для серодиагностики аденовирусной инфекции

крупного рогатого скота.// Вз^ершарпя, 1939, КЗ, стр.28-32.

** ■ / ¿¿L-'+iK*

Подписано е начата 2 8 £2.91г. Занай 651

. Оо-рмат 60x90/16 Пипах ТОО_

Москва. Типография ЗЛСЛШ . ; .. -