Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение антибактериального иммунитета лесных насекомых-филлофагов Dendrolimus pini L. и Lymantria dispar L.

ВАК РФ 03.00.09, Энтомология

Автореферат диссертации по теме "Изучение антибактериального иммунитета лесных насекомых-филлофагов Dendrolimus pini L. и Lymantria dispar L."

2 0 m $р5

академия аграрных наук республики Беларусь

белорусский научно-исслеловательш® институт защты растений

На правах рукописи УДК 630*4:632.787.097.3:632.937.16

гслубева татьяна викторовна

изучение антибактериального иммунитета лесных касек0мнх-$5ш&агсв dendrolimus pini l. и lymantria dispar l.

03.00.09 - ЭНТОМОЛОГИЯ

Автореферат' диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Прилуки, Минской области - 1995г.

Работа выполнена в институте леса Академии наук Беларуси.

Научные руководители: доктор естественных наук, профессор

Яроз Я. (Полька)

кандидат сельскохозяйственных наук, старший научкый сотрудник Марченко Я. И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук.

. Хотько Э.р.

кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Король И.Т.

Ведущее учреждение: Гомельский государственный

университет им. О.Скорииы

Защита состоится " " ^и^Окид 1дд5 г_ в_«азоз

ка еаседакии специализированного совета К 020.75.01 в Белорусском научно-исследовательском институте ааыиты растений ( 223011, п. Придуки, Минской области ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БелНШЗР.

Автореферат разослан 1935 года.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор сельскохозяйственных наук

Вуга с.Ф.

ЗБПДЯ Х-,.г.д!.;ТШ,.:-Т:'С,Л ГЛГСГ.'

¿кг/аяьиссть -<:•.•; ''-¿-слояряпД. Згапта ргстедпй ст орфизмов - олкз из г--£«ке'пих npcöÄsji's области сельаяго а лесного хозяйства. Згхьш гзсяекгсч-бяологического коктрсяя с« вредными насекомыил является исяодьзоаакиа патогенез. Однс;® эффективность их применения ие всегда Сигает уепезяоЯ, так как насекомые сбдадаэт целым рядом залзтщх кзхаяязмсг, гкгечагет; аяатс?/о-$иэиологнческке барьеру, клеточка? и гуксралыж-; Фактора (Glínski,. Jarc52, 1992).

Йссглдоваяяе клеточного лм^нигета, в освоэкоч гемооятгрЕого •гсстазз, с успехом проводили такие стечестаенше. учен:'.'?, Лаппа H.B.Í1954), Сирогкка М.й. (19S5), Батурин В.В., Earyp-nu Л.И., (1983), Чкоидзе М.С. (1938; 1931) и др. Оажюсть прсбл-з'.а иммунитета насекомых к иж£екц::сют<н и инвазионном зсбслеЕйннгл обсукдали з своих работах Полтев В.И. (1255). Алексеев А.Н. (1971), Талалаез Е.В. и Дзаясв H.H. (1978; 1579). Заслужив:*! внимания работы по изучен!» rytcpatbiioro rcßiymrrera, прсгедеиныз Еобрищгой A.A. (1972) И Глупозим В.В. (1532, 1993).

К ссгсаяеняю, наиболее ннтексквнка исследсЕДЧНЛ так клеточного, так гуморального иммунитета яасенюгггх гедутся за руйс-гсг. Число исследуеш вигов насекомых постоянно растет. Однако знания та зтсму вопросу все ец-з чрезвычайно наш. Сулественжи кэ-дсстатком является й тот факт, чго в списке изучаемых видов весьма скудно представлены насекомые - вредители леса, йзучеккз же прстивоинфекциоикых imмункых механизмов способствует разните более успешной агщиты растений и создает сснозу для оСосноеслкл новых стратегий биологической борьбу с греднымя насека-шл!.

Цель и задачи исследований. Основной целью нягэй работы было изучение механизмов внутренней протявоинФекционной взоиты у насекомых- вредителей леса соснового седкспряда Dsndrollcius plni L. и непарного селколряда Lynantrla dispar L.

Предусматривалось реЕсние следугилх задачи:

1. Исследовать систему клеточного кмунитета, предсгавленяуи форменным» элементами крови насекомых - гемоцитамя.

2. Изучить антибактериальные факторы врожденного гушральпо-го иммунитета природных и лабораторных популяций вредителей.

3. Определить бактерицидные фактору индуцированной прогиво-инфшшснной гуморальной вгаиты у исслэдуемнх ь.дов насекомых,

4. Изучить вопросы индукции, кинетика и янгибиоования гуморального '.генного ответа»

- г -

5. Провести эдектрофорегическкй анализ бактерицидных компонентов гемолимфы.

Научная новизна результатов исследований. Впервые исследуются вопросы антибактериального иммунитета опасных вредителей леса непарного и соснового шелкопрядов ка клеточном и молекулярном уровне. Установлены факторы врожденной и индуцированной протиьо-инфекционкой гуморальной защиты насекошх. Определены количественные показателя дизоцимной активности гемолимфы природных и лабораторных' популяций, выявлен новый индуцированный бактерицидный фактор цекропинподобного типа. Впервые для данных видов насекомых изучены процессы индукции и кинетики антибактериальной активности, исследованы вопросы ингибирования гуморального индуцированного иммунитета метаболическими ингибиторами. Впервые у исследуемых видов вредителей проведена идентификация бактерицидных иммунных белков методом электрофореза и микробиологического анализа.

Практическая значимость. Результаты исследований расширяют современные представления, связанные с вопросами иммунитета насекомых. При проведении мероприятий по надзору sa размножением опасных вредителей леса и обоснования микробиологических методов борьбы рекомендовало применять, с учетом других показателей (численность популяции, зараженность паразитами и пр.), гемоци-тарный анализ крови насекомых с использованием фиксированного и витального окрашивания, а также проводить анализ бактерицидной активности геыолимфы. Полученные результаты использовались службой лесоэалдаты МДХ РБ.

Апробация работы. Результаты работы представлены на X съезде Всесоюзного энтомологического общества (Ленинград, 1S89 г.), конференции молодых ученых (Гомель, 1990г.), Второй Всесоюзной научно-технической конференции (Москва, 1991), Second international symposium on molecular insect science (Arizona, USA, 1993), Научно-технической конференции (г.Минск, 1994), 3rd Westing of EFR5/I03C Biological and Integrated Forest Protection (Warsaw, Poland, Sept. 12-16, 1994).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 7 печатных работах.

Структура работ;;. Диссертация состоит ив введения, четырех глав, списка литературы и.словаря специальных терминов. Общий объем работы составляет 125 страниц, включая 10 таблиц,• 11 рисунков, 10 фотографий. Список литературы вклэчает 133 наиаенэва-um, Е том таж 95 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Изложены литературные данные, характеризующие степень изученности проблемы иммунитета насекомых. Констатируется, что довольно слабо изучены вопросы клеточной и особенно гуморальной противоинфекционной защиты лесных насекомых. Практически отсутствуют сведенья о противоинфекционном иммунитете у таких опасных вредителей, как непарный и сосновый шелкопряд.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований были гусеницы природных популяций соснового шелкопряда (Гомельская я Черкасская) и непарного сел-копряда (Ульяновская и Лсевская), а тагосе эти виды насекомых, культивируемые в инсектарии института.

С целью изучения гекоцигарного состава проводили окрашивание Фиксированных препаратов гемолимфы сложным красителем Романовс-кого-Гшза. Анализировали мазки с использованием микроскопа МЕИ-15 при объективе 40, окуляре 10. Исследовали гемоцитарную картину крови в норме и патологии, проводили фотографирование объектов.

При оценке физиологического состояния гемоцитов использовали модифицированный нами метод витальной окраски (Орехов, 1975). Вместо нейтрального красного мы применили метиленовый синий, что позволило получить более контрастное окрашивание клеток крови.

Изучение гуморального иммунитета основывалось на исследовании бактерицидных свойств гемолимфы. Лиэоцимподобная активность определялась по способности лизировать клетки грамположительных бактерий Micrococcus lysodelktlcus (Sigma). Для регистрации этого литического действия ислольвовали два метода: нефелометричес-кий, при котором оценивали изменения оптической плотности бактериальной суспензии (Hultmark et al.. 1980) и агарово-диффузный, в котором учитывали размер зон лизиса вокруг анализируемых проб гемолимфы (Hoffmann et al., 1S81). В качестве стандарта использовали кристаллический куриный лизоцим (Р.76.51..6 Мосмедпрепа-раты и ЕС 3.2.1.17 Merk).

Определение цекропинподобной активности оценивали агаро-во-диффузным методом по действию на грамотрпцательниэ бактерии Escherichia coli (стрептомицин-устойчивый мутант D31, коллекция Стокгольмского университета).

Инфицирование насекомых, с целью индукции иммунного ответа, проводили двумя способами: орально и парентерально. При оральном инфицировании корм обрабатывали биопрепаратами на основе бактерий Bacillus thurlnjiensis - гомэлином, битоксибациллином или лепидоцидом. ' Парентеральное инъецирование еыполняли при помощи микроиньектора фирмы Hamilton (USA), прокалывая кожные покроЕы у основания ложноножки гусеницы. Индукторами гуморального иммунного ответа служили стерильный' питательный бульон, суспензии бактерий Escherichia coll D31, Enterobacter cloacae B12, Pseudomonas aeruginosa. Перед инъецированием проводили стандартизацию методом подсчета бактериальных колоний на питательном агаре в чашках Петри.

В качестве ингибитора синтеза иммунных белков использовали актиномицин D и щклогексимид. Эти препараты растворяли в стерильной дистиллированной воде и затем вводили при помощи иньек-тора в гемоцель опытных насекомых.

Анализ белка проводили в соответствии с методом Лоури и др. (Lowry et al., 1951).

Для определения спектра бактерицидных белков применяли метод злектрофоретического фракционирования без денатурации, при кислом рН 4,5 (Relsfeld et al.. 1962).

Математическую обработку результатов проводили с использованием статистических программ на микрокалькуляторе "Епектроника МС 11СЗ".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ГЛАВА III. КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ НАСЕКОМЫХ

Систему клеточной противоинфекционной защиты насекомых, как известно, представляют СЕОбодноциркулирувдие клетки (гешциты) и органы кроветворения. Поэтому при оценке физиологичекого состояния насекомых является важным проведение гемоцитарного анализа.

Для гусениц соснового шелкопряда мы отметили 8 наиболее постоянных типов гемоцитов. Это - пролейкоциты, макронуклеоциты,,

микронуклеоцнты, Фагоциты, веретеновидные фагоциты, эозинэфнлы, энощгаы и эноцитоидм. Инфицирование бактериальна препаратом го-мелином ( 0,025 мг/мл) гусениц соснового иедк^пряда вызывало ряд характерных изменений в гемоцитарной |<артине крови, указывающих на наличие патологи. Происходила деформация структуры протоплазмы гаюцитов, ее вакуолизация, образование и отрьт почек, появление фагоцитирую-дих гемоцитов, образование ореола, смещение ядер к периферии и разрушение клеток. Были сделаны фотографии, позволяющие наглядно продемонстрировать результаты гемоцитарного анализа. Однако существует значительная трудность в точном определении типа гемоцитов, так как в гемолимфе присутствует много переходных форм кровяных клеток, число которых быстро возрастает в период заболевании.

В дальнейших своих исследованиях для определения кизнеспо-собности гемоцитов использовали более простой и эффективный метод - витального окрашивания, основанный на способности твой щетки осуществлять процесс коацервации красителя. Важным моментом являлось то, что при этом нет необходимости устанавливать Тип гемоцитоз.

В результате никроскопирования ■ препаратов гемолимфы Установили, что геноциты различно реагируют на краситель. По интенсивности окрашивания нами были выделены 4 группы гемоцитов: I - неокраиеинме, клетки без гранул красителя, II - промежуточные, клетки, содер;!садае небольшое количество гранул, Ш - окрашенные, клетки полностью окрашенные красителем н IV - голубые, клетки окрашены в однотонный голубой цвет, характерный плазиэ гемолимфы. Это мертвые ге.чоциты, не способные к выборочной абсорбции красителя. Процентное соотношение неяду отдельными группам гемоцитов разлеталось по вариантам в зависимости от факторов воздейсгвугацих на насекомое (Табл.1). Количество голубых клеток возрастало с ухудшением состояния насекомых. Это происходило не только при инфицировании, но и при питании листьями разных древесных пород. Установлено, что смертность гусениц коррелирует с соотношением между процентом первой и четвертой группы гемоцитов. Этот показатель может служить, в определенней мере, критерием жизнеспособности, так, при его значении больше 1 -насекомые характеризовались, удовлетворительным )Тоянием, а ниле 1 - ослабленным.

Определение критерия жизнеспособности гусениц непарного иелкопряда на основании результатов прижизненной окраски гемолимфы

Вариант опыта Гранулоцитоз, % Отношение I: IV Смертность %

I ¡I III IV

1.Контроль 29,4 31,1 '29,3 10,2 2,88 1.3

2.Гусеницы на букетах дуба 38.8 13,6 22,2 25.4 1,53 20

3.Гусеницы на букетах осины 25,3 9,5 26.3 38,9 0,65 80

4.Гусеницы после обраб.бакпрепа-ратом в лесу 14,4 10,1 21,3 54,2 0.26 100

Б.Гусеницы после инфицирования в лаб. условиях 3,3 4,8 17,8 74,1 0,04 100

Таким образом, гемоцитаряый ачализ с использованием фиксирующих и витальных красителей позволяет оценить физиологическое состояние насекомых в популяция, что важно для прогноза развития вредителя.

ГЛАВА IV. ГУМОРАЛЬНЫЙ ИММУНИТЕТ 1. ВРОЗДЕННАЯ ГУМОРАЛЬНАЯ ЗАВДТА НАСЕКОМЫК

Одним из основных факторов врожденной гуморальной защиты насекомых является лизоциы. Это низкомолекулярный антибактериальный белок, физиологически присутствующий в гемолимфе, а также некоторых других органах ряда насекомых ( Boman, 1987).

Диализ гусениц соснового велкопряда Гомельской популяции показал присутствие лизоцимнсй активности в гемолимфе. Она бад гораздо выше у особей, которые активно писались (05,1 ± 11,4 мкг/мл), по сравнению с гусеницами, готовившимися к диапаузе (28,8 ± 6,5 мкг/мл). Более низкая активность лизоцима (24,1 ± 8,4 мкг/мл) наблюдалась также и при обработке корма антибиотиками. Вероятно, снижение уровня лизоцима в гемолимфе гусениц соснового шелкопряда было связано с уменьшением проникновения вредней микрофлоры в организм насекомого.

При исследовании гусениц соснового шелкопряда Черкасской популяции было показано, что уровень лизоцима в гемолимфе насекомых варьирует в зависимости от возраста, фазы градации, наличия патологии. Так, в 1990 году эта популяция вредителя была в начале эруптивной фазы своего развития. Гусеницы по возрастным категориям имели довольно стабильный уровень лизоцима в гемолимфе. Для гусениц младших возрастов он составлял 5,7 ± 0,5 мкг/мл, а для гусениц старших возрастов - 37,5 ± 4,0 мкг/мл. В 1991 году, в конце зр'/птивной фазы градации, Черкасская 'популяция достигла критического урозня численности вредителя, что привело к резкому уменьшению запасов корма. Происходило ослабление популяции, развитие заболеваний. В этот период около 20%. насекомых имели высокий (более 1000 шег/мл) уровень лизоцима в гемолимфе, основпат ла масса насекомых (66X) содержала от 20 до 40 мкг/мл. Интересно отметить, что гусеницы Черкасской популяции 1991 года послужили основой для создания здоровой лабораторной популяции. Проведение мер по дезинфекции, таких, как предварительная обработка корма антибиотика.^, ультрафиолетовое облучение помещения и другие, способствовало вылетанию наиболее здоровой части популяции. Уровень лизоцима у гусениц лабораторной популяции был очень стабильным и составлял 33,5 ± 5,6 мкг/мл, смертность практически отсутствовала, в то время как гибель природной поПуЛЯЦИИ Достигала 56%.

По сравнению с сосновым шелкопрядом исследуемые гусейИЦы непаркого иелкопряда природных популяций (Лоевской и Ульяновской) имели очень низкий врожденный уровень лизоцима в гемолимфе. У 40%-ов насекомых не удалось обнаружить лигсцимподобной активности. Среднее я® значение .составило 2,9 2 1,3 ;г/мл. При выращивании непарного иелкопряда на искуственной питательной среде

уровень лизоцима в гемолимфе гусениц был более высоким (17,7 ± 4,1 мет/мл), но менее стабильным. Он варьировал от Змкг/ил до 85мкг/мл.

Таким образом, очевидным является тот факт, что естественное (вровденное) содержание лизоцима заметно различается в разрезе исследуемых видов энтомовредителей и варьирует в зависимости от возраста, физиологического состояния, фазы градации вредителя, наличия диапаузы или активного питания.

2. индукция гуморального иммунного ответа при оральном инфицировании.

Заражение насекомых в естественной среде обитания обычно происходит во время питания. Поэтому для индукции защитного гуморального иммунного ответа мы провели оральное инфицирование биопрепаратами на основе В. И1иг1пе1епБ15.

Первой реакцией гусениц соснового шелкопряда Черкасской популяции (1990 г.) на заражение бакпрепаратом (БТБ в концентрации 0,125 мг/№) явился отказ от пищи, интенсивность которого снижалась в 6-6 раз по сравнении с контролем. После недельного голодания насекомые начинали питаться, что приводило к их заражению. В этот период появлялись мертвые особи с типичными проявлениями бактериального поражения. Содержание лизоцима в гемолимфе постепенно увеличивалось и на 4-е сутки достигало 102,4 л 19,3 мкт/мя, что в 2,9 раза превышало контроль (Р>0,999). Этот уровень лизоцима удерживался примерно в течении недели и затем плавно снижался, однако не достигал контрольного уровня. На 29-е сутки содержание лизоцима у инфицированных насекомых в 1,7 раза превышало контроль (Р>0,98). Через 2 недели после инфицирования смертность гусениц составляла 22,92, на контроле - 4,1%.

Несколько иную картину мы наблюдали при инфицировании гусениц соснового шелкопряда Черкасской популяции 1991 года. Естественная смертность гусениц, взятых для опыта и выращиваемых в лабораторных условиях, уже за первые четверо суток составляла 10%, а через две недели 15%. Инфицирование биопрепаратом (ГШ1 в концентрации 0,125 мг/шО привело к возрастанию гибели насекомых. Так, на 4-е сутки погибло 27,5%, а через неделю более половины особей.

У инфицировашш пасегсэмых наблюдалось значительное усиление бактерицидных свойств гемолимфы. Уровень лизсщша на 7-е сутки в Г-!.5 раза превшш контроль (Табл.2). Различие достоверно с ш-

Таблица 2

Индукция линошмной активности при оральном инфицировании энтомопатогенной бактерией В. Ш1г1пд1епз15 гусениц соснового шелкопряда

Варианты опыта

Инфицированные гусеницы

Контроль

после 7 суток

1620,6± 5,24 210,9

65,215,4

Содержанке лизоишз в

общем белке %

после 14 суток

сокой степенью вероятности (Р>0,999). Около 75% насекомых имели повышенное содержание (более 1000 мкг/мл) лизоцима, на контроле таких особей было 10%. Через 2 недели уровень лизоцима снизился, по юсе еде был довольно высоким и существенно различался с контролем (Р>0,95). Инфицирование привело к снижению общего синтеза белков в гемолимфе соснового шелкопряда, хотя доля лизоцима в общем количестве белков возросла и на 7-е сутки в 37 раз превышала контроль (Р> 0,999).

Более сильный синтез бактерицидной активности гемолимфы у соснового шелкопряда Черкасской популяции 1991 года объясняется тем, что популяция находилась в конце эруптивной фазы вспышки массового размножения, при этом гусеницы имели патологию и уже начали индукцию лизоцимной активности. Тогда к-: на более ранней стадии развития, в начале эруптивной фазы градации, эта популя-

цил довольно высокой жизнеспособностью и насе-

комые отличались стабильным уровнем лизоцима, составляющим 38,3 ± 3,7 мкг/мл. Тем не менее необходимо отметить, что повышенный уровень лизоцимной активности не мог противостоять гибели насекомых, так как лизоцим обладает слабым бактерицидным действием по отношению к энгомопатогенной бактерии B.thurlngiensis (Boman, Hultmark, 1987).

В отличие от соснового шелкопряда оральное инфицирование ВТ гусениц непарного шелкопряда не вызывало увеличения лизируюцей активности гемолимфы насекомых (Табл.3). Добавление димшша, гормоноподобного инсектицидного препарата, приводило к снижению уровня лизоцима и росту гибели насекомых.

Таблица 3

Индукция иммунного ответа при оральном инфицировании гусениц непарного шелкопряда лабораторной популяции

.Вариант Активность лизоцима, мкг/мл Смертность, %

Инфицированные гусеницы: Гомелин, 0,б25ыг/мл 18,2 ± 4,4 0

Гомелин, 0,125мг/мл 16,3 ± 7,8 0

Гомелин, 0,125мг/мл Димилин, 2 мг/мл 7.0 ± 1.4 20

Димилин, 2 мг/мл 8.2 ± 1,9 50

Контроль 17.7 ± 4,1 0

Таким образом, непарный и сосновый шелкопряды характеризуются различной способностью к индукции бактерицидной активности в ответ на оральное инфицирование патогенами ВТ. -

з. штцм ттрАмтги ¡^унпгетд ПРИ !ГАГ ЫИП'ЛЛЫЮМ ИНШШР0ВЛ1ПН!

показано шиз, nerinpntirt аелкопряд в отличие <л соснового имеет очень низкую лизопимнун активность гемолимфы, которая не возрастает при оральном инфицировании патогеном ВТ. Вероятно, ото обусловлено анатемо-Физиологическим строением кишечника насекомого, создающим непреодолимый барьер для инфегаши. Поэтому с целью изучения индукции гуморального иммунного отпета у соснового к непарного шелкопрядов ш использовали метод парентерального инфицирования, при которой патоген попадал непосредственно в ге-ксцель, минуя защитные структуры кишечника.

Инъецирование гусениц непарного пелкопряда (IV - V возраст) такими патогенами, как Е. coli D31, Е.cloacae В1Я и убитыми нагреванием P.aeruginosa привело к увеличению лигоцвккой активности в гемолимфе (Табл.4). С повышением дозы патогена уровень лизеци-ма Taicie вограстал. Отмечено появление бактерицидной акткгкости цекропинподобиого типа. Установлено, что наялучеим индуктором гуморального иммунного ответа являются бактерии Е.cloacae В 12. Максимальный уровень лизоцима достигал Солее 5000 ют/мл, при этом выявлена довольно высокая цекропинподобнзя активность гемолимфы.

Сосновый велкспряд оказался очень чувствительные к инъецированию. Введение стерильного питательного бульона привело к значительнее увеличению (в 33,9 раза) уровня лизоцима (Табл.5). Различие с контролен достоверно при Р>0,£5. Максимальное значение превышало 4000 мкг/мл. При этом на 3-й сутки погибло более половины насекомых. Инъецирование бактериальным патогеном Б.cloacae В12 также индуцировало значительный синтез лизоцима, концентрация которого возрастала с увеличением дозы бактерий. Через 72 часа после введения 10 ккл 1,5 х 10б лог-фазы суспензии живых бактерий Е.cloacae В12 все насекомые погибали. Снижение дозы патогена в 100 раз позволяло вижить большинству опытных гусениц соснового шелкопряда. Гемолимфа контрольных, не иммунизированных насекомых не проявляла литическую активность против E.coli D31. Инъекции, как питательным бульоном, так и бактериальным патогеном Г "loacae В12 не привели к индукции цекропинов. Исключение составляли лишь единичные случаи, когда активность цекропинов присутствовала липь в

Индукция иммунного ответа гусеницами непарного шелкопряда при парентеральном инъецировании бактериальными патогенами.

Индукторы Активность лизоцима, (мкг/мл) Цекропин-подобная активность, (мм) Смертность после 96ч. (X)

1. Инъекция Е.соН D31 10мкл, 5.2 х 104 б/г. 28,3*2,5 след* 0

2. Иньекция E.coli D31 Юмкл, 5,2 X 10б б/г. 539,31319,? след 0

3. Иньекция P.aeruginoza Юмкл, 2 х 105 б/г. 479,0±123,0¡ след . 0

4. Иньекция Е.cloacae Юмкл, 9,6 х 104 б/г. 698,8±257,8; 9,3±0,7 22.2

5. Контроль 14,0±2,9 0 0

* диаметр зоны лизиса менее 5 ым.

следоььк количествах ( диаметр боны лизиса меньше 5 им). В противоположность гусеницам все куколки соснового шелкопряда после инъекции Е.cloacae В12 (4 х 105 бактерий на куколку) тлели четкую литическую активность цекропинподобного типа, достигавшую у некоторых особей 13 ш.

Полагает, что на стадии куколки процессы метаболизма снижаются в несколько раз, поэтому при иммунизации их происходит стимуляция генов к синтезу иммунных белков без значительного влияния со стороны других биохимических реакций (Boman, Steiner, 1981).

Индукция гуморального иммунного ответа гусеницами соснового шелкопряда при парентеральном инъецировании.

Индуктор Активность лизоцима, (мкг/мл) Смертность, (Z)

24 ч. 72 Ч.

1. Иньекция пит.бульоном 15 мкл\гусеница 2. Иньекция Е.cloacae Big 15 мкл, 2,3 х 104 б/г. 3. Иньекция Е.cloacae В12 10 мкл, 1,5 х 10б б/г. 2954,3±746,3 185б,4±393,6 2358,8±388,9 •а 0 0 66,7 40,0 100

4. Контроль 87,0*47,0 0 0

Таким образом, парентеральное инфицирование по сравнению с оральным вызывает более активное включение гуморальной системы защиты, хотя часть насекомых все же погибает. Следовательно, обитая повсеместно, такие бактерия, как Е.cloacae и E.coll, часто попадают в киаечкый тракт при питании насекомого и составляют его естественную микрофлору, не вызывая при этом заболевания. Однако, прониказ в гемоцель в местах повреждения, сапрофитные бактерии могут ослабить состояние насекомого-хозяина, а иногда вызвать его гибель.

4. КИНЕТИКА ИНДУКЦИИ ГУМОРАЛЬНОГО Ю.МУНН0Г0 ОТВЕТА.

Нави исследования показали, что у гусениц непарного шелкопряда после парентерального инфицировании бактериальными патогенами значительное увеличение бактерицидной активности происходит через определенный промежуток времени - лаг период. Так, только через 8 часов после иньекции суспензии живых бактерий Е.cloacae В12 (2,8 х 104 О/г) обнаруживаются цекропины, хотя лишь в следовых количествах (Рис.1). Активность их быстро нарастала, достигая через 9 часов более чем 3-х кратного

ч 5000 I 4000 1 3000

О

о

§ гооо

л Е-О

н

О

fill Лизоцим. EIS Декропкны Рис.1. Индукция бактериолитичеасой активности в гемолимфе гусениц непарного шелкопряда, иммунизированных бактерией Е.cloacae В12.

увеличения. Литическая активность гемолимфы иммунизированных н&зекомих через 1Б часов по отношению к тест-бактерии E.coli D31 составляла 14,5 ± 0,5 мм. Накбольвая активность лизоцима у гусениц непарного шелкопряда наблюдалась также через 8 часов после икьекции бактерий Е.cloacae В12. В интервале с 8 до 9 часов этот показатель увеличивался в 8,5 раз, тогда как в период от 0 до 8 часов концентрация лизоцима возросла лишь в 1,2 раза. Через 15 часов после иньекции уровень лизоцима достигал 16-ти кратного увеличения по сравнению с контрольным»! кек;»шувизированными гусеницами.

Таким образом, в течение лаг-периода, составляющего около 8 часов, происходит подготовка к интенсивному синтезу бактерицидных имглушж белков.

5. ПОДАВЛЕНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ ИНГИБИТОРАМИ СИНТЕЗА БЕЖ0В

Больше значение при изучении иммунитета насекомых имеет использование метаболических ингибиторов синтеза белков (Crolsler G., Croizier L. ,1980; Jarcsz, 1935; 1993). Их применение попьет-

¡.¡г ислучн/ь аоьую информацию о биохимической и молекулярной основе защитных реакций V насекомых. С другой стороны, понимание природы защитных механизмов является основой эффективного применения энтомопатогенных микроорганизмов в биологическом контроле ?а вредными насекомьши (Bulla , 1973).

В наших экспериментах для подавления иммунного ответа у гусениц соснового и непарного шелкопрядов мы применил'! актиномицин D и циклогексимид. Причем, известно, что актиномицин ингибирует транскрипцию мРНК на матрице ДНК, а циклогексимид подавляет процесс биосинтеза рибосомальных белков в организме эукариот (Jarosz, Glinski, 1991).

Исследования проводили в лаборатории патологии насекомых под руководством профессора Я.Яроша ( Университет им Марии-Кюри Складовской, Польша). В эксперименте использовали гусениц соснового шелкопряда (V-VI возраст), доставленных из Беларуси. Насекомые испытали определенный стресс после транспортировки и имели довольно высокий уровень лизоцима в гемолимфе (500 мкг/мл). Парентеральное инъецирование стимулировало у них синтез иммунных белков, хотя наблюдались значительные различия в содержании лизоцима и цекрошшов у разных особей. Антибактериальная активность индуцировалась как сапрофитной бактерий Е.cloacae В12 (10 мкл в концентрации 3 х 104 б/г), так и неживым материалом -питательным бульоном (10 мкл). Довольно высокий начальный тичр лизоцима повышался более чем в 8 раз в течение 24 часов при бак-тетльном инъецировании (Р>0,95). Питательный бульон был более сл. -л индуктором, так как уровень лизоцима увеличился лишь в 3 раза по сравнению с контролем.

Иньекции актиномивдном (4 мкг на гусеницу) и циклогексимидом (10 мкг на гусеницу), вводимые в ранний период (через 3 часа) после иммунизации бактериями Е.cloacae В12, значительно снижали активность лизоцима в гемолимфе опытных насека; чх и ингибпровали синтез цекропинов.

Исследования по ингибированию антибактериального иммунитета проводили также и на гусеницах непарного шелкопряда (IV-V возраст), выращенных из яйцекладок природной Лоевской популяции. Иммунный ответ стимулировали инъекцией 1,9 х 105 суспензией живых бактерий Е.cloacae В12. После иммунизации гусеницам через 3, 6, 7, 3 и 9 вводили по 20 мкл водного стерильного раствора содержащего 160 мкг циклогексииида. После 24 часов анализировали бактерицидную активность гемолимфы и смертность гусениц.

- IQ -

Большинство насекомых (72%) после инфицирования такой до-ьильно высокой дозой (1,9 х Ю5) живых бактерий Е.cloacae В12 выживало. Ояиако введение циклогексимида приводило к резкому уве личешио гибели насекомых. Причем зто отмечалось только в тех случаях, когда антибиотик был введен через 3, 6, 7 и 8 часов после иммунизации. Смертность гусениц непарного шелкопряда, учитываемая на вторые сутки, составляла 70%. При инъекции циклогексимида в более поздний период времени (уже через 9 часов после иммунизации) количество мертвых особей было значительно меньшим (28%). Это указывало на то, что примерно через 8 часов после бактериальной иммунизации начинался процесс индукции факторов, обуславливающих иммунную защиту насекомых.

Таким образом, бактерицидная активность гемолимфы иммунизированных насекомых обусловлена de novo синтезом иммунных мРНК и биосинтезом рибосоыальных белков.

6.- ПОДАВЛЕНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА ИММУННЫМИ ИНГИБИТОРАМИ ТИПА А

Исследования, проведенные in vitro, показали высокую чувствительность цекропинов Dendrolimus plni к экзопротеиназам, продуцируемым бактериями B.thuringiensis subsp. alestl и Р.aeruginosa. Так, добавление в гемолимфу смыва с бактериальных культур, растущих на питательном агаре, полностью ингибировало активность цекропинов. Ингибирувщвя активность была довольно высокой, даме при 5-ти, 10-ти кратном, как было показано для бактерий P. aeruginosa, разведении исходного раствора. Только после снижения концентрации в 2С раз можно было наблюдать активность цекропинов, хотя и более низком, чем на контроле уровне.

Аналогичную картину наблюдали и в случае с непарным шелкопрядом. Цекропинподобиая активность исчезала после обработки экзопротеиназами бактерий B.thurlngiensis subsp. alesti, P.aeruginosa и S.marcescens, тогда как смывы с бактериальных культур с E.coll, Е.cloacae, X.nematophilus (вторая диморфная форма ) не оказывали такого действия.

Таким образом, присутствие ингибируюших протеиназ является одной из причин, обуславливающих высокую знтомопатогенность ряда бактерий.

7. РАЗДЕЛЕНИЕ АНТИБАКТЕРЛЛЪНЫХ ФАКТОРОВ В ГПЮШИЕ ттПЗИРОВАННИХ НАСЕКОМЫХ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА

Сравнительный анализ полученных электрофореграмм, а также микробиологическое тестирование показали присутствие белковой Фракции, соответствующей низкомолекулярному белку лизоциму (Рис.2). Было отмечено появление v иммунизированных насекомых новых белковых фракций с цекропинподобной активностью, детальная характеристика которых требует проведения дальнейших исследований.

Таким образом, злектрофоретические исследования позволили разделить бактерицидные факторы и установить группы белков, отвечающих за лиаоцим-.и цекропинподобную активность.

Им. Им. к. Им.

КЛ D. р. D.p. D. р. L.d. L.d.

КЛ Н.с.

-48kD-

-24kD-

-15kD-- 4kD-

P4

•Аттацины

■Лизоцим ■Цекропины

КЛ - куриный дизоцим.

D.p. - гусешшы Dendrolimus plnl.

Им.D.p. - иммунизированные гусеницы D.p.,

Им.к.D.p. - технизированные куколки D.p.,

L.d. - гусеницу Lynantria dispar,

Им.L.d. - иммунизированные гусеницы L.d.,

Н.с. - иммунизированные куколки Hyalophora ceórcpla (Цнт. rio Gllnskl, Jarosz, 1992).

Рис.2. Электрофореграмш гемолимфы контрольных й иммунизированных бактерией Е. с]оасае насекой

выводы

1. Изучение антибактериального иммунитета у соснового и непарного келкопрядов, одних из наиболее опасных хвое- листогрызу-цмх вредителей леса, позволило выявить защитные реакции клеточного и гуморального типа.

2. Выделено 8 типов гемоцитов, обуславливающих клеточный иммунитет исследуемых насекомых: пролейкоциты, макронуклеоциты, микронуклеоциты, фагоциты, веретеновидные фагоциты. зноцитоиды, зернистые пары (эозинофилы) и эноциты. Показано, что бактериальное инфицирование гусениц вызывает появление характерных морфологических изменений в гемоцитарной картине крови, позволяющих говорить о наличии патологии у насекомых.

3. Надежным и простым способом оценки жизнеспособности насекомых является метод витального окрашивания, основанный на способности живой клетки осущгствлять процесс коацервации красителя. По интенсивности окрашивания выделено четыре группы гемоци-тов. Установлено экспериментально, что по соотношению между 1 и 4-ой группами можно судить о кизнеспособности иасеко'а^х исследуемой популяции. При его значений больше 1 - гусеницы характеризуются удовлетворительным состоянием, а ниже 1 - ослабленным.

4. Определены количественные показатели лизоцимйой активности гемолимфы, характеризующее врожденный гуморальный 1йшуийге? насекомых. Наибольший уровень лизоцима отмечен для гусениц соснового шелкопряда, который значительно варьирует (от 5-10 до 1000 мкг/мл и более) в зависимости от возрасту, физиологического состояния, фазы градации вредителя, наличия-диаааувы или активного питания.

Гусеницу непарного шелкопряда природной популяция шали довольно низкую - следовую лизоцимную активность гемолимфа (2,9 ± 1,3 мкг/мл); в токе время уровень лизоцтла повышается (до 17,7 ± 4,1 мкг/мл) при культивировании на Ш1С.

5. Показано, что у гусениц сосноеого шелкопряда, в отличие от непарного, индуцируется гуморальный иммунный ответ при оральном инфицировании бактериальными препаратами на основе В. Ш)г1п-й1епБ1з. Этот ответ выражается в значительном повипеиии уровня лизоцима в гемолимфе (в 24,5 раза). В связи с зтш наличие особен соскового шелкопряда с высоким уровнем лизоцима указывает на нестабильное и ослабленное состояние популяции, . что мскет клеть значение при составлении прогноза размножения вредителя.

6. Обнаружено значительное повышение лизоцимяой активности iсак у гусениц соснового, так и непарного шелкопрядов в ответ на парентеральное инъецирование бактериальными патогенами. При этом происходит синтез новой группы бактерицидных белков с цекропин-подобной активностью. Синтез бактерицидных компонентов зависит от вида индуктора, его дозы, а также фазы развития и физиологического состояния самого насекомого. Наилучшим индуктором цекро-пинподобной активности являются бактерии Е.cloacae.

7. Установлено, что для начала индукции иммунного ответа, появления de novo цекропинов и увеличения синтеза лизоцима при паретеральном инъецировании необходим определенный промежуток времени - лаг период, составляющий для гусениц соснового и непарного шелкопрядов около 8 часов.

8. Антибактериальная активность лизоцима значительно умень-калась, а цекропинов полностью исчезала в гемолизе исследуемых насешш после инъецирования иммунными ингибиторами актиномици-ксм D и циилогексинидом в ранний ( до 8 часов) постиммунизацион-ньш период. Это уюззывает на то, что для появления ачтибактери-алыгай активности необходимо образование специфической мРНК, которая управляет de novo синтезом шинных бежев.

9. Показано ингибирование активности цекропиноз зкзопротеи-иазаш, продуцируемыми такими бактериями, как В.thurlngiensis, S.narcescens и P.aeruginosa. Это объясняет, в частности, высокую патогениость этих бактерий, приводящую к гибели насекомых.

10. Подтверждено, методом электрофореза с последующей идентификацией микробиологическими методами, что бактерицидный агент, присутствующий в гемолимфе непарного и соснового шелкопрядов и действующий против тест-бактерии !,'. lyscdeikticus, действительно относится к группе лизоцимов; кроме того, Еыявлен ряд новых белковых фракций с цекрошшподобной активностью.

Основные положения диссертации изложены в работах:

1. Голубела Т.В., Орехов Д.Л. Определение ташнеспособности гусениц непарного шеисопряда методом прижизненной окраски гемолимфы // Успехи энтомолог, в СССР: лес.знтомол.: Матер. 10 Всес.съезда энтомол. о-ва, Ленинград, 11-15 сент. 1989. - JI. -1990. - С.£9-31.

2. Голубева Т.В. Содержание лизоцииа в гемолимфе гусениц соснового келкопряда// Интекс. леек. хоз. в Зап. регионе СССР: Конф. молодых ученых Запад, отд. ВАСХНЙЛ. Гомель. 15-16 марта 1990. - Гомэль. - 1990. - С.173-175.

3. Голубева Г.В. Действие бактерий Bacillus thuringlensis ка динамику лизоцима в гемолимфе соснового шелкопряда// Охрана лосн. экосистем и рац. исп. лесн. ресурсов.: Втор. всес. н.-т. 1-снф. 4.1. Тез. докл. М. - 1991. - С.116-117.

4. Голубева Г.В. Некоторые аспекты гуморального иммунитета насекомых - лесных фнлофагов// Лесовост. и лесопольз. в Беларуси.: Науч. тр. Ин-т леса АН Беларуси. Гомель. - 1992. - Вып.36. - С.84-90.

5. Golubleva T.V., Jarosz J. Irrarme proteins conditioning antibacterial activity in larvae of Dendrolimus pinl (Lepidoptera: Lasiocarapidae)// Second International symposium on molecular, insect science. July 17-22. - 1993. Flagstaff. Arizona. USA. 67.

6. Голубева Т.В., Марченко Я.И. Индукция иммунного ответа при оральном инфицировании энгомопатогенной бактерией Bacillus thuringlensis гусениц соснового шелкопряда// Проблемы лесоведения и лесоводства: Науч. тр. Ин-т леса АН Беларуси. - 1993. -Еып.37. - С.186-193.

7. Golubeva T.V., Marchenko Y.l Induction of humoral imriunity while oral infection of pine moth (Dendrolimus pinl L.) larvae v/ith entomopathogene bacterium of Bacilus thuringlensis// 3rd Meetitig of EPRS/IOBC Biological and Integrated Forest Protection. Warsaw. Poland. Sept. 12-16. 1994 (в печати).

РЕЗЮМЕ

Голубева Т. В. Изучение антибактериального иммунитета лесных насексшх-филлофагов Dendrolímus pini L. и Lymantrla dispar L.

Диссертационная работа посвящена изучению механизмов внутренней противоинфекционной зашиты у насекомых - опасных вредителей леса соскового и непарного шелкопрядов. Большое внимание уделяется ¡щеточному и гуморальному иммунитету. Установлены факторы ьрозденного и индуцированного противоинфекцнонного гуморального иммунитета насекомых, изучены процессы индукции, кинетики и ингкбировашш антибактериальной активности лизоции- и цекрошшподобного типа.

Полученные результаты имеют как теоретическое, так и практическое значение, позволяют поставить закиту растений от вредителей на более высокий научный уровень.

Р Э 3 Ю М Е

Голубева Т.В. Вывучэнне антыбактэрыяльнага 1мун1тэта лясных насякомых-ф!лафагау Dendrolimus pini L. i Lymantria dispar L.

Дысергацьйная работа прысвечана вывучзнш механ1змау унут-ранай процИнфекцыйнай абароны у насякомых апасных шкодн1кау лесу сасновага 1 непарнага шаукапрадау. Вял1кая увага удзяляецца клетачначу 1 гумаральнаму 1мун1тэту. Установлены фактары прыро-дканага i 1ндуцыраванага гумаральнага 1мун1тэту насякомых, выву-чаны працэсы 1ндукцы1, к1нетык1, 1нг1б1равання антыбактзрыяльнай актыунасц1 л1зацым- 1 цэкрап! нпадобнага тына. -

Атриманыя вын1к! маиць як тзарэтычнае, так 1 практычнае значение, даэваляюць пастав1ць абарону расл1н ад шкодникау на больш высок1 навуковы узровень.

SUMMARY

Golubeva T.V. Investigation of antibacterial Immunity of forest phyllophages Dendrolimus pinl L. and Lymantrla dispar L.

The dissertation is devoted to the study of mechanisms of internal antiinfectlve protection In injurious forest pest, pine moths and gypsy moths. Much attention is paid to the investigation of cell and humoral immunities. Factors of innate and induced antiinfectlve humoral immunities in the insects are ascertained. Processes of induction, kinetics, and Inhibition of antibacterial lysozyme and cecropin-like activities are studied.

The results obtained are of both theoretical and practical importance. They permit to place plant protection from pests on a higher scientific level.