Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение адгезивных свойств полиморфноядерных лейкоцитов при кардиомиопатии

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Изучение адгезивных свойств полиморфноядерных лейкоцитов при кардиомиопатии"

министерство здравоохранения российской федерации московский государственный медицинский

университет

На правах рукописи

УДК 616.155.34-008.13.-092-07

НАУМОВ

Олег Германович

ИЗУЧЕНИЕ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ПОЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ КАРДИОЛ1ИОПАТИИ

03.00.02 — биофизика 03.00.04 — биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицииских наук

Москва 1992

Работа выполнена на кафедре биофизики Российского государственного медицинского университета.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Ю. А. Владимиров,

кандидат химических наук, доцент Г. И. Клебанов. Официальные оппоненты:

доктор медицинских паук Л. Г. Коркина,

доктор биологических наук, профессор А. Я. Потапенко.

Ведущее учреждение — Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ.

Защита диссертации состоится « . . . » . . . 1992 г.

в 14.00 часов на заседании специализированного совета К-084.14.04 при РГМУ по адресу: 117869, г. Москва, ул. Островитянова, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РГМУ.

Автореферат разослан « . . . »..... 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат медицинских наук

доцент И. В. Буромский

Wnh'<f) /

. ^ 'i . ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

"" Актуальность проблемы. Данные литературы последних лет убедительно доказывают, что гранулоциты крови являются наиболее мощным звеном неспецифического клеточного иммунитета fwpír D.M. et-ai. Вместе с тем, показано, что

увели? нив функциональной активности полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови. (ПМЛ) является одним из пусковых механизмов каскадах реакций, обеспечивающих развитие воспаления сМаянс^еий ДН., 1991 з и проявляется в увеличении способности клеток к к продукции активных форм кислорода (АФК), хемотаксису, секреторной дегрну^яции, фагоцитозу и т.д. Исследование механизмов изменения их функциональной активности при патологии в настоящее вр^я остается актуальной задачей целенаправленной работы отечественных и зарубежных исследователей.

Известно, что ПМЛ, по сравнению с другими клетками крови, в болылей таттпнт^лтюявлятлт апгяпутную активность к поверхности, Изменение адгезивных свойств циркулируших ПМЛ является одной из ранних реакций гранулоцятов крови, имеющей место при развитии заболеваний, протекающих по типу воспаления с Бахов Н.И. и соавт., 1988 i . Обнаружено, что при кардиологических заболеваниях, развивающихся вследствие ишемических и реперфузионных нарушений И сопровождающихся развитием неспецифического воспалительного процесса, наблюдается' внутрисосу чстая агрегация ПШГ в микроцирхуляторном русле и изменение их адгезии к эндотелию

СОСУДОВ CMuUane К.М., . . ЭТИ ПрОЦ€ССЫ ПРИВОДЯТ К

нарушению микроциркулящш, что способствует ' развитию воспаления. Однако, механизмы изменения адгезивных и агрьгационшх свойств ШАЛ при патологии изучены недсотаточнп. Исследование механизма Дчгезту ГШ! позволяет рь^работать метойШ целенаправленного рпп пяйг>ттстп ^ г^роциркуля^ю. В этой связи особой значк с.а ггреоСретает исследование изменения таких сеойс в ШАЛ как способность к артерии, агрегации и продукции АФК, определяют«* эф^екторный потенциал ШШ, яри активации kj" ток in vitro и in vivo , при кардиомиопатиях различного генеза.

Шль и задачи исследования. Цель работы: изучение адгезивных и аграгационных' свойств потаюрфноадерншс лейкоцитов крови при кардие&иопатш. Зедачи исследования:

1. Исследовать характер изменения агрегации ШЛ и их способности к продукции $ФК при остром клиническом кифар 'те миокарда.

2. Исследовать механизм влияния аршиядоновой кислота на на развитие аграгациошого ответа ПШГ in vitro .

3. Оценить щ^энеше. адгезивных свойств ПМЛ ь модели изопреналин- индуцированной кардаомиопатш $ крас.

Научная новизна работы-

Впервые „обнаружено повышение арахидонат 'тимулировашой аг^эгации 1ШЛ в остром периоде клинического инфаркта миокарда.

Исследованы условия агрэгационногС взаимодействия 1Ш ir. vitr^ при стимуляции арйгидоновой кислотой.

Показано цовшенда функциональных свойств ШУЕ в динамике развития изопренулин- швдгвдрдвашой кардаошопатиг у крыс.

Обнаружено увеличение адгеаизнос® циркулирующих лейкоцитов эндотелию мякрососудов действии изоцреншша

in vivo И in situ .

Практическая значимость.

Полученые результаты свидетельствуют ; о повышнии способности ШЛ к АФК-продукщш, возрастании -их адгези^шх свойств на ранних этапах .развитая. ггораяеаия миокарда, что безусловно имеет патогенетическое значение.

Оценка функциональной активности , лейкоцитов крови, основангая на измерений арахидонат- стимулированной агрэгашк и люминал- зависимой хешлюминесценции может . быть использована в клинической практике в качестве юполнительного метода контроля за правильностью Выборг коррегарущей терапии при' сердечно- сосудистых заболеваниях, сопро&зждаюцлхся ишемич^сщми и реперфузионными нарушениям! (хронической иш'гмича.ской болезни- сердца и ее осложнениях).

Внедрение результатов исследования в практику.

Метод оценки функциональной дктившсти полиморфноядерних лейкоцитов 1фови, основанный на измерении их арахидоиат-стимулированой агрегации и люминол- зависимой хемилшишсценции внедрен: для совершенствования научных исследований - в отделе электронной микроскопии и мшсровдркуляции МЛК РГМУ, на кафэдре иммунологии РГМУ ; для клинического применения - в больнице ЖЗ г.Москвы, на кафедре внутренних болезней M РГМУ.

Апробация работы. Осяовше положения диссертация доложена и обсукдеии на совместных научно- практических конференциях кафедр: биофизики- МВФ, медицинской и биологической физики лечебного и педиатрического факультетов, внутренних болезней M лечебного факультета РГМУ; отдала электронной микроскопии и жшроциркудяции МЛК РГМУ и лаборатории биофизических оьнов патологии отдела б^зфизт-т ИМ фгаико- химической медицины МЗ РФ (Москва I988-Ï99I), а такк на X Всесовзной конференции колодах учэнах "Синтез и исслэдогчние биологически активных соединений" (Рига, 1989), на 3 Съезде анатомов, гистологов, эмбриологов я топогрофоанатомов УССР "Актуальные Еопросы морфологии" (Черновцы, 1990), на Всесоюзном Симпозиуме с меяяунэродным участием "Система мршнукле ршх фагоцитов в норке и при патолопиэских состояниях" (Новосибирск, 1990).

Пуб^шации.

По материалам диссертация опубликовано S пег тшх pl.Jot.

Структура и объем работа.

.Диссертация состоит из введения, обзора л^ератур , описания материалов ис°методов исследования, изложения результатов собственных исследований, шс обсуждения, шводов и библиографического указа. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 16 рисунков, 3 схемы и 4 таблицы. Библиографический указатель содержит наименований отечественной и иностранной литературы.

"ОДЕРЯАШЕ РАБОТЫ

тчешт и методы исследования Клиническая характеристика больных. & работе обследовано 155 больных острым крупноочаговым инфантом шокарда (средний возраст в обследованной группе пациентов составлял - 52,4 * 9,8 года). Диагноз - инфаркт, миокарда (ММ) устанавливали на основании критериев ВОЗ и мето.чкеских рекомендация МЗ РСФСР. Контрольная группа включала 80 сдоровнх пациентов (средний возраст доноров составлял 48,7 + 8,4 года). Кровь доноров была предоставлена Центральной: станцией передавайся крови г.Москвы. Подбор группы больных для обследования проводили совг стно с сотрудниками кафедры внутренних бодезнзй M РГмаг на базе бдона йнтвысзевной терапии кардаолегического отделения больницы №13 г.Москрц.

Модели иэопреналин-индуцЕГровашой кардаошютхатш у коне . Эксперимента выполнены на 158 1есйороднчх белых крысах самцах весйл 200-256 г. Развитее кардиомкопаиш у зйшотннх вызывали р^тем подкожнего введения 1%-ного раствора изопрэнадкна (Щ) в физиологичэскс • раствора в дозе 80 шУкр веса животного с F зникоь И.И. и соавг-,19?5 . Дадев проводили забор крови из сердца живог.да через 2, 4, 6, 12, 2', 36 и 48 часов после иььекшш Ш и определяли количественное . содержание лейкоцитов. В лейкоцитарной фракции цельной крови определяли относительное содержание гранулоцитов рри помощи гематологического автоматического анализатора "mimos six» ( "Авх\ Франция). В контрольную группу зыли включены животные, которым вместо МП, веодили -одаогно соответствуишЗ объем физиологического раствора. •

Выдаленкв полинерфноадерных лейкоцитоз.. Полшорфноядернш лейкоцита (ПШ1) человека и крыс получали согласно методу (воуит а.. 1974) из периферической крови, стабилизированной гепарином, при помощи седиментации на градиенте плотности "иколла ("Pharmacia" . Швеция).и верографина ("Спофа", ЧССР)-. Суспензию m/' (IxIO7 кл. м. ) хранили в растворе Хенкса (рН=7,4 ) пр.. 4°С. ЖизнодаоФбнасть клеток, оцененная в тесте с трипан©&™ составляла не менее 97Ж гМеньшиков В.В.и

сравт., 1987 з -

Измерение лшипол-зашспной хс'лшюиинеопенцки ГОШ.

йзмере^е люминол- зависимой хемилюминесценции (ХЛ) ГШ крови человека или крнс, проводили на хемилтоинометре, собранном на базе ФЭУ-ЮО. Свечение клеток ретютрировг и в токовом режиме. В пробу для измерений вносили суспензию ШЛ (IxIO6 кл/мл) в растворе ЗСенкса (рН=7,4) и Ю_5М лкшнола (-serva". ФРГ). Измерения проводили в режиме постоянного пере^Шивания при 3?°С.

В качестве стимуляторов хемилюмшесценгного отЕета (ХЛ-отзета) ПМЛ использовали: суспензию частиц b¡?so, (0,8 мг/мл) в растворе Хенкса, раствор арахидоново* кислоты (АК)

(Ю~5-Ю~3 М, C^ Н СЦ "Serva", Фг'Г • )■• • -ИНТвНСИВНОСТЬ ХЛ

определяли как разность маэду максимальным - уровнем индуцированной ХЛ и урйвнем спонтанной ХЛ и о. живали в условных единицах.

Измерение арахлдона-г-стчмулирОвзшой агрегации ШЛ.

Для измерения агрегации ШАЛ использовали турбидиметрическую установку, собранную на базе концентрационного фотоколориматра 'КФК-2 (СССР). Измерения преходили при постоя, лом перемешивании (600 об/мин) в термостатируемом pesiBíe при 37°С. В пробу для измерений вносили суспензию ПМ в стандартном растворе Хенкса {IxIO6 кл/мл). Начальную ■¿онцентрацию клеток в проое контролировали по постоянному яефэлометрическому фону.

Для активации агрегации ГШ использовали раствор арахцюновой кислоты (в конечной концентрации 2,5хЮ~4М). Степень арахидоизт- стимулированной агрчтации ПМЛ Оценивали как р^ностъ г ,ящу максима.1" ними уровнями г менения ветопропускания суспензий0 ШЛ в присутствие л отсутствие активатора ри ,*=67С нм. Измерение светопропуска1*ця суспензии ПМЛ происходило за счет слипаний клеток между сО§>5й (агрегации).

Метод оценки адгезивных свойств лейкоцитоз.

/

В экспериментах использовали белых баспородннх крыс сащов (весом 200-250 г). После не^уталового наркоза (50, мг/кг веса) ^вотныц делали лапаротомию, извлекали петлю тонко!, кишки с сегментам?' бры..зйки в области илеоцекальнрго угла и расправляли их на плексигласовом столике. Препарат постоянно орошали подогретым . до 37°С раствором • Хенкса (рН=7,4). Экспозиция брыжейки яэ превышала 30 мин, что позволило избежать зпонтанннх.нарушений ашкрохшркуляцфг.

Изучение адгезивных свойств лейкоцитов проводили с помодыо прижизненной микроскопии состояния микроциркуляции .брыжрйки тонкого кишечнника ирысь. сЗайцзВ'К-.Т. и соаЕт.,1988з-Оценку "оличества клеток, фиксированных на стенках чикрососудов, ПрОЕ'ЩЩ! при помоду большого микроскопа для прижизненных исследований Te.>ti" (ГДР) в проходящем света (объективы 220,Х55). ^аблздеешз явления регистрировали • на raie; се НК-2 с пометь» фотокамеры "Orthomat" (ГДЕ) ¿■¡зтоматериада проявляли в стаццартнкх условиях. Степень адгезш лейкоцитов к эндотелии сосудов оценивала в виде среднего количества клеток, адгезированных к произвольно выбранному участку вэнулы брыжейкй тонкого кишечника'длиной IOQ мнм.

Для изучения ' влияния дао^раналина (ИП) на адгезивные свойства лейкоцитов крови в'работе были проверены следующие эксперименты. В первой серии_8Кспериментов были использованы ясивоише, которым предварительно внутривенно вводили 1% раствор Ш (80 мг/кг 1,са). Опенку количества адгезированных к стенкам в< ул лейкоцитов проводили через 2, 4, 6 и 12 часов после внутривенной инъекции ИП. Другая группа экспериментов была проведена на брыжейке тонкого .кишечника " интактных животных. В этом случав проводили 5- минутную аппликацию 0,1%; 0,01%; или 0,001% раствора ИП непосредственно на поверхность брыжейки и оценивали изменение степени адгезии лейкоцитов к эндотелию микрососудов в течение 16 мин после апплк ации ,'Ш с интервала!/ - 5 мин.

б

Определение ЗЕК-активннх продуктов.

Для оценки содержания маждавото диальдягида (МДА) в плазме крови в работа использовали метод, предложенный

Asakawa Т. И С03ЕТ. ГАзаЬэ.иа Т. et.al., 1480] . ИЗМереШЯ проводили при А=532 нм на спектрофотометре СФ-46 (СССР). Определение содержания УДА проводила в плазме крови крыс в динамике Ш-индуцировзнной нардиомиопатш.

Статистическую обработку полученных в работе результатов проводили общепринятыми методами вариациошюй статистики с использованием стандартных программ на микроэвм (emg-666, ВНР).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСШДОВЛШШ И ИХ ОВСУ1ДЕПП5Е

I. ИЗУЧЕНИЕ /01ГЕ51ШЩ СЕОИСТВ ШШ ПЕРИЗ'ЕРИЧЕСШГ КРОВИ ЗДОРОВЕЕТ ЛИЦ И БОЛЬНЫХ OCTFHM ИНФАРКТОМ ЖОКАРДА.

I.I. Изучение а^ащонат-стлнулироиашюй агрегации ПЕЛ здоровы^ лиц.

Известно, что одшш из ракурс проявлений повыиенного функционального потенциала ШЛ ir, vivo при развитии неспецифяческого • воспалительного процесса является возрастание их способное лг к адгезии и агрегащш.

В данном раздела проведена оценка рДияшя различных концентраций АК на агрегацию ПШ1 доноров и произведен подбор оптимальных' условий ífflSi измерения АК~стюдулированной агрогешг ШЛ о учетом типа используемых инкубационных сред, 'рН шп-:убационной среда„ влияния на эти процежен ионов са2+ и ид2*, -а так:?© исследовано влияние на этог процесс.ингибитора кикроОилзкентов - щгаохалазина В, ингибиторов цшшхжсигеназы и лшгоокспгеназы- аспирина и нордигидрогуаяротовой кислоты.

С этой целью в работ§обнл иСдф]шзован турбормегрический метод* В качестве нэсшцкфичэского стимулятора агрегацианного отвага ШЛ применяли арахид£новую кислоту. Для исключения поверхностной адгезии щ>4 измерениях использовали пластиковые кюветы, в которые вносили I мл ШО6 НМЛ в стандартном раство|в Хенкса (рН- "*,4). Измерения проводили в термостатируемом режиме при 3?°С. Это является Необходимым

условием для измерения агрегации ПШ1, так как снижение температуры может приводить к уменьшению скорости агрегации и уровня агрегационного ответа клеток на стимулятор. Оптимальная скорость перемешивания суспензии ГШ составляла 600 об/мин. Цчми Сыл5 показано, что наиболее оптимальным для провесная оценки способности ПШГ к агрегации является использование в качестве инкубационной среда раствора Хенкса (рй=7,4). В этом случае обеспечивается уменьшение уровня спонтанной агрегаций клеток, сникенке скорости дезагрегационных процессов и наблюдается постепенное, хорошо контролируемое, развитие агрегационного ответа клеток, значение максимального уровня которого достаточно стабильно в плане воспроизводимости результатов.

На рис.1 представлении типичные кинетики развития агрегашкмного ответа НМЛ здоровых лиц, при стимуляции клеток различными концентрациями АК. Видно, что максимальное изменение светопропускания суспензии меток наблюдается при использовании АК в конечно^ концентрации 5хЮ"& М. При уменьшении концентрации стимулятора происходит • снижение максимального уровня и скорости агрегавдонкого ответа ПШ. Увеличение концентрации активатора также также приводит к снижению этого иоказдтеля за счет возникновения мутности из-за внесения избыточного количества АК в инкубационный раствор. Было такие показано, что внесение 'в суспензию ШЛ пальмитиновой кислоты <5хЮ~5М) не • вызывает развитие агрегациощаго ответа клеток. .

Наш было исследовано влияние различных концентраций ионрв са2+ к мд2н" на а^ахидонат-стимулированнуы агрегацию ШЛЯ доноров. Показано, что присутствие идыов С,2* и в среде опособстЕовует снижению АК-стимулированной агрегации ПШГ, особенно, при увеличении концентрации са2+/ма2+ в 2-4 раза, по сравнению с ш содержанием в стандартном растворе Хенкса. Исходя из полученных результатов и имеющихся в литературе данных, можно предположить, что при неспещфической ¿табуляции ПМЛ арахидоноЕой кислотой, а также -другими рецептор-независимыми активаторами (А23187, ЗМА) к_,ш в-..^ь, , развит^ агреганионного отЕета клеток

обеспечивается, по-видимому, сходными механизмами.

%

0 -I

5хЮ-5М Рис .1. Типичные кинетцки развития агрегационного ответа ПМЛ крови доноров при стимуляции клеток различными концентрациями арахидоновой кислоты.

Ю~4М

Ю"6),!

5хЮ~®М

пальмитиновая кислота

-т-1--

13 20 время, шш

1— 10

Для выяснения роли ш^тоскелета клеток в агрегэционном процессе ПМЛ наш было исследовано влияния ингибитора микрофиломентов - цитохалазина В на АК- стимулированную агрегацию ПМЛ доноров. Обнаружено, ито внесение цитохалазина-В в инкубационную среду в конечных концентрациях 5, 10, 50 шу/'т не влияло на уровнь аратидонат- стимулированной агрегации ПМЛ. Полученные рвзул>тагн, согласуются с имеющимися в литературе сообщениями о тоге, что присутствие шлохзлазина В не оказывает влияния на агрегацию ПМЛ, стимулирсьэнную рецептор- нр^ависишми

лигавдаМИ. ТаКИМИ, как А23178 и ФМА СНаг<1 и.о. е<;.аЬ, 1984 "i-

Известно, что стимуляция клеток экзогенной АК предполагает р^траивание этой кислоты я мембрану клетки. При это обмечено, что этот процесс является рн-зависюда гвагег-к.я.. 19-аьэ. В этой св;р®.1 наш .ало исследов .но влияние рН шэдЪацирячой среди на АК-отыулированную ^грегацию ПМЛ доноров. Показано, что уровень ар хидонат- стимулированной агрегации ПМЛ • использовании ту.уба^онной среда с рН менее 7,0 ,ниже, чем в щелочной области. По-видимому, это обусАбвленно умвнызениец встраивания АК г '¿ембраны ГШ в кислой среде гвагег р.г-.198в"!. В то ;ке время, ^слольгскзино

среды со значением рН в дйaпaзoi¿э 7-9, Б способствует созданию оптимальных условия для функционирования фзсфолипазы д2, а, следовательно,- для накопления эндогенной АК. . "

Возникает вопрос, не определяется ли степень агрегации 1Ш количестЕ и встроившейся в мембрэш клеток . арахидоновой вдолоты. Для выяснения этого -было исследовано вливаю различных концентраций гепарина (протеогликана, способного ингибировать захват клетками ¡¡¡ирных юШот свозг.ег к-з-1чв81 ) на агрегацию и лшинол- зависимую хемилшинесценцшо НМЛ, стимулировании*: АК. ■/'.'.

Результаты представлены на рис.. 2. Вдано, что гепарш окг?ивает ингибирукщее4 действие на- эти процессы.

дТ опыт

АТ контроль 100

. ■* (I)

50 ■

ОШХ

Х^д контроль 100

(2)

50

гепарина

Рис. 2. Влияние различных .концентраций гепарина (.ед.зкт -'мл инк.убаиигт<-;"й среда) на агрегацию СТ> х дш"чол- зашсго^к •хв'/ид/шяесявндаа) (2) .

!1')цотюв, -" гимудир:.

мнил АК

Следует отметить, что присутствие гепарина в инкубационной среде в диапазоне концентраций от 1 до 100 ед./мл не приводит к полному (более, чем 50%-ному) ингибировагага АК-стимулировашой агрегации ПШ1. Однако, при этих :ке условиях наблюдали практически полное подавление (около 90%) ЛК-стилуляровашюй ХЛ гранулоцитов. Полученные результаты свидетгистзукт в пользу того, что процесс встраивания АК в мембраш IT.il тлеет значение для развития агрег?,тионного ответа ГШ. • Однако, ингибирутоий эффект гепарина на АК-стшулкрованную ХЛ гранулоцитов обусловлен, по-видимому, не прямим его вяиятат на способность клеток к продукции АШ, а, возможно, проявлением его антиоксидаитных сесйств

В- 1937>

Известно, что при актив.вчш клеток происходит кыс образование эндогенной арахндоновой кислота, так и ее утилизация в процессах с участием цпкло- з липооксигеназ ггьв^ика у., В этой связи нами было исследовано

влияние аспярява (ингибитора простаглавдансинтетазы) к нордигадрогуаяротовоЛ кислота лнгкбитора липоксигенгзы) на агрегацию и ХЛ гранулоцитов, сищул.грованянх АК.

• Из рио.З видно, что 5 минутная инкубация ГШ с ацетилсалициловой-кислотой в" диапазоне концентраций от 5хЮ~& до ю"1- й нртгодят ^ скдошга АК-стимулироеанной агрегации и ХЛ гранулоцитов. При-этом следует отметить, то кнгибированпе этих процессов закотяо проявляется -при концентрации аспирина - та"-;.!. Тулке би.ло показ^йо, что вдашш в инкубационную «роду клеток шгясйфуетвй аграгашпо концентрации аспирина на ракш стадиях , развитая, агрегацшшог. ответа ШЛ сопровождается дезагрегащюяшш процессами, т.е. шеет место обратимость ¿{-стигдуляровавной агрегации. Внесение ■ аспирина на' более лознкх ■ стадиях . (к ' ксмегсгу выхода крив© све'тспрсдускавия суспещда' ьй,еток" на плато, когда агрег.'ужонтю лровдсс.'. принимают необратимый характер , не оказывало • влияния йа АН-стада чф&вашг^о агрегацию ГШ.'

Проявление иягибиру того влияния аспиртгна на исследуемые свойства 1Ш при его. внесении в инкубационную среду на позних стадия активации клеток, по-видимому, связано с потерей его специфического 'действия* вследствие его возможного- окисления

¿T %

I 30 f

20 ■

10 -

0 I0~S 5xI0"u I0~* 10" конгевтрадая аспирина, Ы

Рис.3. Влияние различных концентраций аспирина на агрегацию . Ш) и- двдшол . - . зависимую ^ешшшнеиценцию (1хд) ПМЛ крови доноров при СТИМУЛЯЦИИ клеток АК Гп=22. р<0.05>.

I^JJ, усл.ед.

ж

П-5 ТП-4

20

10

активными формами кислорода, генерируемыми клеткими при активации es acor, A.L. et-al-, 1-?S71.

Далее нами было обнаружено, что предынкубация клетбк с нордигвдрогуаяретовой кислото!. приводит т. .ж к ингибированию АК-стимулированяой агрегации ПМЛ. но этот эффект был менее выражении по-сравнению с дэйстшем ^спиринз на этот .процесс. Показало, что присутствие нордигидрогуаяретовой кислоты в концентрации Ю-4 М сопровождается снижением агрегационного ответа ШЛ не более, чем на 15%. Также было обнарукено, что присутствие в инкубационной среде азида натрия, к^талазы или супероксидди .лутазы не . . оказывает '. 'влияния ' ffa . АК-стимулировданую агрегэ^йз ПМД.

1'зШл образом, изменение метаболизма АК в ,n?«UT безусловно, оказывает влияние на •дк-стшулирозаннук'. агрегациьоклетрк.. '-"'•.

Г2

лт %

30 ■ 20 • 10 •

0 -

О

1хл' усл,ед#

- 20

■ 10

10

—,-!-

• 15 20

время, мин

Рис.4. Типичные кинетики развития лшинол-зависимой хемилюминесцецции и агрегации 1Ш крови доноров при стимуляции вд^ток арахидоновой кисцотой <бхЮ~5М). По оси абсцисс - время, мин. По оси ординат -слева' - изменение светопропускания сусньнзии ШЛ (АТ %), справа - интенсивность хемилюминесцежош (1хд,усл.ед).

В литературе ралеются сообщения о взаимосвязи между собой аких процессов, как продукция . АФК агрегация ПШГ, нтенсгафикация'котерых наблюдается при активации клеток. $чло оказано,что■ при использовании в качестве стимуляторов ПМЛ ецептор- зависимых дигандов кинетические характэристцкй роцессов продукции АФК клетками и кх агрегации практически овпадают гишг» л-э. ОДако, ДРИ использовании

зстгецифических • стимулов сравнительного анализа этих эрактеристик проведено не было.

В -%той связи нами были исследованы кинетики ХЛ и грзгациенного ответа клеток при их стимуляции АК. Результаты редстав^ены на рис.4. Видно, что при стимуляции ПМЛ

арзхидоновой кислотой максимум интенсивности хемилгшнесцешом совпадает с моусЦтом уменьшения скорости агрегация, а продукция АФК клетками практически заканчивается после развития их максимального агрегацвднного ответ . По-видимому, развитие агрегашюкного ответа Ш,Ш совпадает по времени с гтэоцессом дегрьнулящн ИМЯ при ш;'стимуляция АК.-

1.2, Изучение аранздонат-ствдулпрованной агрегации ГОЛ,® в данашкс строго клинического инфаркта миокарда.

Известно, что развитие острого клинического инфаркта миокарда (Ш) сопровождается повышением функциональной активности циркулирующих ШЛ отношении продукции АФК, экспрессии поверхностных рецепторов и фагоцитозу гКлебанов Г.И. я соавтд 1538 1- Однако, вопрос об изменении адгезивных свойств клеток при развитии ЯМ является в настоящее время недостаточно изучении.

В этой связи нами было исследовано - изменение АК-сткмулироваиной агрегации О,И периферической крови в дшЯдаю острого клинического Ш (рис .5)

Д'Г % 50 •

40 •

,30 •

20 •

•1С

!

о I-

докорт Г 2-3 5-7 14 21 28-30 дни заболевания

Рис.5.

Изменение АК- гл'имулироЕэкно] агрегации ШУ1 в динамике острого юшшзского ки$арк' миокарда <п=7з. р<о.05>.

Показано, что в первые сутки острого периода развития , Ш ЛК-стшулированный агрегацяонный ответ клеток >1/л максимальным. В динамика заболевания обнаружено снижение этого показателя, которое достигало практически исходного уровня к 23-30 дню пребывания пациентов в стационаре.

Полученные результаты свидетельствуют о повышении агрегациошшх свойстз 1ГМ в острой периоде 1-М. Следует также отметить, что при благоприятном течении заболевания ' наблюдается нормаяслащ^ данного показателя, что может быть связано не только с улучионжзм клинического состояния пациентов, не и ■являться следствием проводимой при данном заболевании кедшшентозной терапии.

2. ИЗУЧЕНИЕ ФШЩОЩЫШ СВОЙСТВ ШЛ ПЕРМЕИШСКОЙ КРОВИ В ДВДШШ РАЗШИИ ШЧЙЩУЩРОВАННОИ КАРДШШМИШ У КРЬ^. •

Изменение функциональной активности ШЛ во время .разбития .яекрозз адокарда, .особенно в первые часа, тлеет важное значение в патогенезе КМ сЕгмхег и. еь-ак 193&э Использование экспериментальной. тадэл/; изопроналин (Ш) -..индуцирозаняой , кярдаомиопагии позволяло нам всесторонне ... исследовать фушшональные свойства 1Ш такйе, как способность клеток к агрегации и продукция 'ФК в динамике развития патологического процесса. Адгезия ШЛ на эндотелий сосудов - г,икроцирчул.-горного. русла явлаатся первым этапом лнфыьтрацш" этих клеток в очаг воспаления сБахоз Н.И. и соевт. , 1987 з. ВнутрисосудЦстая агрегация ГШ обуславливает .закупорку мелки сосудов и, способствуем прогрессированив ишлизацда.тканей гвегИпег з- »ъа!.. Тагам образом,

изменение адгезивных свойств ПМЛ является пусковым механизмом для. функционального вовлечения этих клеток в : атологический процесс.

В этой связи наш! была проведена оценка АК-, стикулированной агрегации ГШ в динамике развития ИП-Индуцпрованной кардиомиопатии у крыс г Яворский О.Г. и соавт., 1983 1.! Результаты экспериментов приставлены на рйо.6. Обмечено, что в первые часы развития ИП-индуцируемой карлмемяолатии у крыс нр.блкщаатся значительное увеличение

лт.а

20 •

Рис.6. Динавдда изменения АК-с.лмудир'занной агрегации ПМЛ в модели Ш1-иняуШфованной кардиомиопатиг у крыс ,

<п=20, Р<0.05).

10

I-1-1-1-.

О 12 24 36 48

вреня, часы

О

Рис.7. Динамика изменения лшинол - зависимой хемилюминесценщш < 1хд) НМЛ крови при и- стимуляции ваво (I) и опс.зимозаном(2) в модели Ш-индуцированной кардиомиопатии у крнс

<г.=20, р<0.05).

<!-—-I-(-Г

О 12 24 36 4'<?

вреия, часы

фахидонат- стимулированной агрегации ПШГ. Черзз 4 часа после гаъенции ИП животным в дозе 80 мг/кг веса, яимулированная агрегация клеток была ::зкстальнсй и 1рзвкгзла исходный уровень в 3-4 раза. Из лктерзтур:.; известно, цго данный угаркод времени характеризуется юзшпсновенкем очагов ишемия с гослвдузиим форюрсввнк&к юкротических изменень! в миокарде гМеерсон 0.3., ISS-r. lo еле организации (завершения) н^ротическжс процессов гаокарде (через б часов после введения МП) настлали. агрегацконногс ответа 1АЯ и постепенную его норкглг к гонцу вторых суток эксперимента.

Д л оценки функционального состояния ШИ з осяоквнкг их люсобнооФи продуцировать Ш" юр* развитии Ш-кндуьирогапкоЛ шрдЕС&копаии наки била црослекона динамика изкэнзнкя таяшолг зависимой хб.лштнесцеяции Ш1 при их акгавззд: ^специфическим (кристаллы Baso )■ и спец^ОДчесю::.: (опсонпзиров#вшй зкмозан) стимулами. Результаты прздстз&»ш: га ркс.7. Обнаружено, что какскмальныГ уровень YJÏ при жмуляции клеток вазо4 достигается через 4 чаез после зведения Щ животным, Д при стимуляции гранулец/лов зцеонизированным зимозаном - через 6 часов. При этом интенсивность ХЛ превышала исходный vposeab : пернем случаэ с 5 раз,а во втором - в 2 - раза. Отмечено также, что зрздварительНэя инкубация интзктных НМЛ крыс & среде с 0,001, 3,01 и 0,1% 'содержанием ЮТ, не приводило к изменение функциональных свойств клеток,' что исключает прямое участие Щ в модулировании функционального ответа клеток.

Далее наш была проведена количественная оценка общего удержания леЯкоцгтов и продантно: содержания разлив:; тх гигов лейкоцитов в периферической крови -в динамике развитая ffl-индушфуемой кардиомиопатш у крыс. Резулуг^ц тредставлеш на рис.8 . Отмечено нарастание лейкоцитоза ко 3-4 часу после инъекции Щ шшотнш. Показано, что на фс?:э увеличения общего количества лейкоцитсс, в периферической. :фови наблюдается гоъышеняе относительного коятве-..® 1Ш, т.е. наб. задается лейкоцитоз со сдвигом формулы крови влезо. 1о-видимому, такой количественный сдвиг ъ сэдорюмяа ses '"оцит.-в свидетельствует о еозможзости еоябдзййл &

N % Юо п

80

60

40

20

0

30 .1 г> 1 ^

20 •

10 • 1 0 Г 1

У 1.

¡¡0

шАл

К 2 4 6 12 24 36 48 время, часы

... II

гис.8. Измг юкка общего количества лейкоцитов (Е-) ц проектного содерад,-ния <м> различных типе лей/эцитов в крови.(А) в динамике ИП- индуцированной кардиомиопати

У Крас Сп=30,р<0,05>.

Щ - гракулсщйы ц - яшфоциты

ё - «оноцкти

контроль 2

время эксперимента, часы циркуляции ПУЛ, обладающих повышенными - функщюнальшш свойства;®. Это в свою. очередь может вносить значительный вклад в. интегральное увеличение функционального потенциала всех циркулируицих ШЯ.

Известно, что увеличение продукции гранулоциташ АШ при юс акг гвациц способствует активизация одного . из фундаментальных процессов развитая тканевого и клеточного повреждения - яишдяой пероксядации гиашап? д.з., 1<ээээ .Нами было оценено содержала продуктов ПОЛ в плазме крови крыс в-динамике . развития ИП-зшдуцированной кардаомвшатип.' Максимальное повышение количества ЯВК-активних продуктов в плазме крови крыс было отмечено через часов после введения ИП животным с последующа! постепенным шиканием.

' Ъ^гам образом, полученные результаты свидетельствуют' о повышении ■ футщдодДльннзс свойств _ шф^лирушлх ГЩ, и возможней участия гранулоцнтов в штёйсификацк^ липидной пероксидации в плазме крови при развитии Ш-индуцировашюй кардаомиопатии.

а

3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИИ ИЗОПШШШНА НА АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ЛЕЙКОЦИТОВ.

Для выяснения влияния 'УЛ на адгезивность лейкоцитов было . проведено прижизненное исследование состояния мшроэдгряуляторного руг та брыкейки тонкого югшечкика крыс при. пери- и инравасгсулярном воздействии КП.

Шло обнар'тсено, что адгезид лейкоцитов к эндотелию * венул при действии ЙП in situ зависала от его', концентрации Показано, что в случав аппликащт 0,01% раствора Ш, количество' фиксированных клеток на эндотелии венул взрастало и преьи'иало .контрольный показатель к 15-20 мал наблюдения. При использовании 0.0QIS раствора МП, через 15-20 Минут после пренраиения его ггогасации, наблюдали снижение числа лейкоцитов на стенках сосудов практически до исходного уровня. Отмечено, что количество адгезированшх лейкоцитов и обратимость адгезивной реакции при действии 0,01% раствора Ш зависит от диаметра наблюдаемого сосуда: с увеличением диаметра сосуда наблюдается повшиениз количества адгезированннх лейкоцитов и возрастает степень необратимости адгезии.

N Рис.9. Влияние инфузии Ш (60 мг/кг

го -i

веса рвотного) на адгезию лейкоцитов к эндотелию венул брыжейки тонкого кишечника крыс <№<-0, Г.С0.05).

По оси абсцисс - Bpt :я наблюдения, часы.

По оси орл-рат - количество лейкоцитов <№ , адгезировашшх к рро^звольно выбранному участку сОЗуда длиной 100 мкм.

О 2 А 6 8 10 12 вреыя, часы

Далзе было исследовано влияние икфузии изопреналина н; .-¡дгезж лейкоцдтов к эндотелию венул брыжейки тонкогс кгыочнпка крыс. Обнаружено, что после внутривенного введет« препарата также пр юходат увеличение . числа клеток, ^жгзрсваяйых к стенкам венул. Через 4-6 ч&сов после введен® ижогпкй V. число адгезирозаншх к эндотелию венул лейкоцито! возрастало в 2-3 раза по сравнению с исходны!« уровнем.

Результаты проведенного анализа показывают, что Щ щя згадша в кровоток а таю» при аппдакации на говерхьосп брезейкк может индуцировать увеличение адгезионно* способности лейкоцитов, что выракаесся в увеличении числг клеток, фиксированных'к стенкам сосудов.

заключение

Полученные з работе результаты и имеющиеся в литература данные позволили определить патогенетическую роль адгезии Щ при развитии острого клинического инфаркта миокарда.

Основными причинами, приводящими к развитию ишемическш н-арукений в миокарде, являются усиление потребления кислород? :сг.рхисад:оцктами и нарушение микроциркулямяк. йвемия, обусловленная эиши цричияа\и, развивается как прв ¡(/гжкчесздм инфаркте миокарда, ток и при Ш- ивдуцированно! ксрджа/копатая У жйвотнй/С. При этом ваш роль в развит-дзнядй процессов лринадлеккт 1Ш.

На ранних этапах развития Ш на фоне извемических г репефузионных нарушений наблюдается, с одной стороны, изменение количества ПМЛ в циркуляции вследствие развктде лежоетоза со сдвигом формулы крови влево сЗахария е.а. i: соавт., 198^ > С другой сторону, происходит увеличение функционального потенциала ИМ, проявляющееся в во заст^чии сг" сооностк клеток продукции А®, экспрессии яс'/-рецелторо! 'на „х поверхн ста [Иванов Д.И. и соавт., 1983, Клебанов г.К. и ооавт.,1988 з. Йамк было ' обнаружено увеличение агрегацконных свойств ПУЛ при остром клиническом ИМ г поагление .дгезивности лейкоцитов к эндотелии сосудов при Ш1-пндуцйроваяноа кардиомиопатии. Причины эвшения адгезивности

ШЛ до конца не изучены.' Важное значение в' этих процессах гринадоегкит ЛК и ее метаболитам гЛипкан Г.Н., 1987 >

Увеличение адгезивных свойств' циркулирующих 1Ж фоявляется в возрастании маргинального пула лейкоцитов в лякрососудах ииешзкрованной зоны миокарда и образованием в фовотоке агрегатов юг ток (фенокен лэйкергии). По-видимому, зовншенке адгеэивности ГШ обусловлено их предстимуляцией в циркуляции. Так, например, было обнаружу но,что предстимуляцкя ' ЗМЛ in vitro сопровождается экспрессией '.спецвфкчрских говархностши. адгезивных белков . (интегринов) на ¿летках гкиурег- T.W. л-. 19893. Вместе с тем, показьйо, что при активации in ' vitro ■ стимулами, зкзывахжши их

аегрануляцию, и, по-видимому, йпособствувдими -'экспрессик поверхностпкх адгезивных белков на клетках, происходит увеличение их агрегащкшнх свойств.

Ожечошг$в нами, повышение 'адгезии ПИЛ к эндотелию сосудов обеспечивает быструю миграцию ШШ и реализации зф$еторнах функций клеткат в зоне альтерациигБахов Н.И. у. соаву.,1988 j. Однако, интенсивное проявление цитотоксических ceoIíctb лейкоцитами не всегда споео?етвует благоприятному развитию репарационных процессов в миокарде cBuuiev g.b.. lit. i- Т.е.' существует пределэнкы: уровень функциональной активности клеток, обеспечивающий э®ективнс проявление их защитного потенциала гМаянскяй А.К., I9SO з.

Повышение ^кгвсзшшк свойств Ш/Г •» vivo приводит к нарушению микроциркуляши и способствует прогрессированию шемкзашш ткани, в частности, миокарда reouv R-. 19903. В этой связи на ранних стадиях развит^/} ИМ безусловно целесообразно применение в терапии фармакологиче тах препаратов, сникающих агрегацию ПЫЛ cward p.a., i9S4 ?.

Таким образом, не визывает сомнений значим?£ть адгезиьшх свойств ШЛ в патогенезе кардкомиолэтяи. Изучение механизма адгезии й разработка методов регуляции адгезивных свойств ПМД отк^нвает переспективн для использования ^овнх средств в коррвгируюией терапии при данных заболеваниях.

выводы

1. Показано, что арзхидоыат-сткыули^юваннад агрегация ПМЛ in vitro наиболее эффективно протекает в среде при рН=8,5-Э,5 и в пр;гсуг.стБИЗ 0,4иМ са^'4" и 0,2?лМ мо2*.

2. Показано, что арахидонат - стимулированный агрегационный ответ"и лзс-инол-завискная хеглилвминесценци:. ПЫЛ подавляется в присутствие Ю"4-Ю~3М аспирина. Ингибирующего действия .на •АК- стимулированную агрегацию азида натрия, каталазы и суперокскдиксмутазы обнаружено не бщб.

3. ООкарузено, что в остром периоде клиническою- инфаркта миокарда наблюдается увеличение араадонат- стимулированной ггрегавяа 1Ш в 1,5-2 ра«а и практически сникается до исходного уровня к 28-30 суткам.

4. На коде ли изопрена люн- индуцированной кардт,оюгог"тии у крыс обнару^но увеличение АК~стимулированной агрегации и лг;м;шол~ .зависимой хемилшшесцекош ШЛ через 4 часа после' введения iffi, сопровождающееся накоплением ТБК-активных продуктов в плазме крови через 12 часов после инъекции ЙП крцсам. Отмечено, что изменение функциональных свойств ПМЛ оп' екамт развитие процессов липидной пероксидации в плазме крови в динамике кардкоышвдш.

5. Используя метод прижизненной микроскопии мшросос-удов брыжейки тонкого даочника крыс, обнаружбао увеличение ядгбзия лейкоцитоз к эндотелию венул в 2-2,5 раза при иериваскулярком (in situ ) и внутрисосудистом присутствие изопр ^нзжша. ...

Практически рекомендации.

Сценка функциональной активности лейкоцитов крови, основанная на измерении арахидонат- стимулированной агрегации и лкминол- зависим^ хемялшинесценции может быть использована в клшчезкой практике ■ в качестве дополнительного метода контроля за правильность!) выоора ксрузгируюцей терапии при сердечно- сосудистых заболеваниях, сопровождающие.' ишемическими и реперфузионшш нарушениями (хронической шемической болезни сердца и ее осложнениях), а также, в экспериментальной работе для изучения механизма действия на ПШГ противовоспалительных веществ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕЖ ДИССЕРТАЦИИ,

I. Наумов О.Г., Климшша О.А. Влияние арахидоковоЯ кислозы на ' функциональную активноеть и агрегации подиморфноядерных лейкоцитов периферической крови // Синтез и исследование биологически активных соединений: 'Гез.дскл. 10 Всесоюзной конференции колодах ученых - Рига, 1989.- С.82.

2» Зайцев !(.?., Наумов О.Г. Дкнамк^а изменения функционального состояния лейкоцитов, ишцгцир^згшппс изопреналивом V Актуальные вопросы морфологии: 'Гоз.докл. 3 Съезда анатомов, гистологов, эмбриологов и топогрсфсанатс .ов УССР - Черновцн, 1990.- СЛ03-10'

3. Клебанов Г.И., Наумов О.Г., Владимиров 10.А., рибаров С.Р.» Пенева В. Функциональная активность полиморфкоядерных лейкоцитов крови при иэолреаалиЕовой кардкоиюпагии крыс // Балл. зкеп. биол. и мед.- 1990.- ТЛЮ.- 112.- С.592-594.-

4. Корочюш Й.М., Чукаевэ Й.И., Капустина Г.М., Клебанов Г.И., Теселккн В.О., Наумов О.Г., Боркшбаев О.Ф., -Халзсех И., Виноградова И.В., Рачнова Н.П. Глияние низкоинтенсивного лазерного излучения на функциональную активность лейкоцитов к еыткокелдаятяую систем плазмы крови при остром инфаркте глиокарда // Сов. ад. пина.-- 1990.- Ji5.- 0..36-39.

5. Klebanov С- Kreinii .. M-U., Naumov O-G.. Aotsiauri N-E-, Kovalchuk L-U-. Uladirairov Vu-A. Phagocv criming mechanisms // Mononuclear phagocyte system in norms: and ohatelogicai states: Abstracts, All Union symposium with the participation of foreign scientists.- Novosibirsk. "990.-P-bd-65-

6. Наумов О.Г., Клебанов Г.И., Зайцев ",.Т., Банин В.В., Борисова Л.В., Рабаров С., Пенева В., Владимиров Ю.А. Влияние изапреналина на агрегацкенше и адгезивттне свойства циркулирующих нейгоофилов крыс У/ Бюлл. эксп^ биол. и мед.-1991.- ЪСХП.- МО.- С.371-374.